Ancaman Sunyi: Daya Tersembunyi Virus BIV pada Sapi

 

Bovine Immunodeficiency Virus (BIV)

 

Abstrak

Bovine immunodeficiency virus (BIV) merupakan lentivirus yang menginfeksi sapi dan kerbau di berbagai wilayah dunia. Virus ini memiliki kekerabatan genetik dan antigenik yang erat dengan Jembrana disease virus (JDV) serta human immunodeficiency virus (HIV). Meskipun demikian, hingga kini BIV umumnya dianggap nonpatogen karena tidak menimbulkan gejala klinis yang jelas pada hewan yang terinfeksi. Walaupun efek klinisnya ringan, sejumlah bukti menunjukkan bahwa BIV dapat mengganggu fungsi sistem imun dan meningkatkan kerentanan terhadap infeksi sekunder. Tulisan ini mengulas sejarah penemuan, struktur genom, keragaman genetik, mekanisme infeksi, respons imun, serta metode diagnostik yang digunakan untuk mendeteksi BIV pada populasi sapi di berbagai negara.

 

1. Pendahuluan

 

Bovine immunodeficiency virus (BIV) merupakan anggota genus Lentivirus dalam famili Retroviridae, subfamili Orthoretrovirinae, ordo Ortervirales. Virus ini pertama kali diisolasi dari sapi yang menunjukkan limfadenopati persisten dan penurunan kondisi tubuh di Amerika Serikat pada tahun 1969. Penemuan ini menarik perhatian karena kemiripan BIV dengan virus lentivirus lain yang bersifat imunotropik, seperti human immunodeficiency virus (HIV) pada manusia dan feline immunodeficiency virus (FIV) pada kucing.

 

Hingga saat ini, dampak BIV terhadap kesehatan sapi masih belum sepenuhnya dipahami. Sebagian besar infeksi bersifat subklinis, meskipun beberapa penelitian melaporkan adanya perubahan hematologis dan imunosupresi ringan. Penularan BIV diduga terjadi melalui kontak darah, cairan tubuh, atau melalui transmisi vertikal dari induk ke anak.

 

2. Sejarah Penemuan dan Klasifikasi Taksonomi

 

BIV pertama kali dilaporkan oleh Van der Maaten dan Colleagues pada tahun 1972 dari kasus sapi dengan limfadenopati kronis. Secara taksonomi, BIV dikelompokkan dalam genus Lentivirus bersama dengan JDV, HIV, feline immunodeficiency virus (FIV), caprine arthritis encephalitis virus (CAEV), dan maedi-visna virus (MVV).

 

Analisis filogenetik menunjukkan bahwa BIV memiliki hubungan yang sangat erat dengan JDV, yang menyebabkan penyakit Jembrana pada sapi Bali di Indonesia. Kedua virus ini memiliki struktur genom yang serupa dan membentuk satu klad lentivirus sapi (bovine lentivirus group).

 

3. Hubungan Filogenetik dengan Lentivirus Lain

 

BIV memiliki kemiripan tinggi dengan JDV dalam hal struktur genom, organisasi gen, dan urutan nukleotida. Namun, JDV menunjukkan virulensi tinggi yang menyebabkan penyakit akut dengan tingkat mortalitas tinggi pada sapi Bali, sedangkan BIV umumnya tidak menimbulkan gejala klinis yang berat. Perbedaan tingkat patogenisitas ini menarik perhatian ilmuwan dalam memahami mekanisme evolusi lentivirus serta faktor-faktor yang mempengaruhi virulensi antarspesies.

 

4. Struktur dan Fungsi Genomik

 

Genom BIV tersusun dari RNA untai tunggal positif dengan panjang sekitar 8,7 kilobasa. Virus ini memiliki gen utama gag, pol, dan env, serta gen tambahan vif, tat, dan rev yang berperan dalam regulasi replikasi virus dan penghindaran respons imun inang.

 

Gen gag mengode protein struktural kapsid (CA), matriks (MA), dan nukleokapsid (NC), sedangkan gen pol mengode enzim penting seperti reverse transcriptase, integrase, dan protease. Gen env mengode glikoprotein amplop (gp120/gp41) yang berperan dalam pengikatan reseptor dan fusi membran sel inang.

 

Analisis sekuens menunjukkan bahwa variasi genetik terutama terjadi pada gen env, yang menjadi target utama dalam diferensiasi strain dan pengembangan metode diagnostik molekuler.

 

5. Siklus Replikasi dan Infeksi BIV

 

Infeksi dimulai ketika glikoprotein amplop virus berikatan dengan reseptor spesifik pada permukaan sel target, terutama sel monosit dan limfosit T. Setelah proses fusi, RNA virus dilepaskan ke dalam sitoplasma dan dikonversi menjadi DNA melalui aktivitas reverse transcriptase. DNA virus kemudian diintegrasikan ke dalam genom inang dalam bentuk provirus.

 

Dalam kondisi normal, provirus dapat bertahan dalam keadaan laten. Namun, faktor-faktor seperti stres, infeksi sekunder, atau perubahan hormonal dapat menginduksi aktivasi kembali provirus menjadi virus RNA yang infeksius. Hal ini menjelaskan sifat kronis dan laten infeksi BIV pada sapi.

 

6. Keragaman Genetik dan Evolusi Virus

 

Studi molekuler menunjukkan bahwa BIV memiliki variasi genetik yang cukup luas antarisolat, mencerminkan adaptasi terhadap populasi inang dan tekanan seleksi lingkungan. Analisis filogenetik terhadap gen pol dan env mengindikasikan adanya beberapa kluster genetik berdasarkan wilayah geografis, seperti isolat dari Amerika Serikat, Jepang, dan Eropa.

 

Keragaman genetik ini berimplikasi terhadap sensitivitas uji diagnostik serta kemungkinan adanya perbedaan tingkat replikasi dan virulensi antarstrain.

 

7. Patogenesis dan Efek Klinis pada Sapi

 

Sebagian besar sapi yang terinfeksi BIV tidak menunjukkan tanda-tanda klinis yang khas. Namun, penelitian eksperimental memperlihatkan adanya limfadenopati, penurunan berat badan, serta perubahan hematologis berupa limfositosis atau anemia ringan.

 

Virus ini menyerang sistem kekebalan tubuh, terutama sel T dan monosit, sehingga berpotensi menurunkan respons imun terhadap infeksi lain. Pada beberapa kasus, infeksi BIV dilaporkan memperberat penyakit yang disebabkan oleh patogen lain, seperti Bovine leukemia virus (BLV) atau Mycobacterium bovis.

 

8. Respons Imun terhadap Infeksi BIV

 

a. Respons Kekebalan Humoral

Hewan yang terinfeksi BIV mengembangkan antibodi spesifik terhadap protein struktural dan nonstruktural virus. Antibodi ini biasanya terdeteksi dalam waktu 3–6 minggu pascainfeksi dan dapat bertahan dalam jangka panjang, meskipun tidak selalu bersifat protektif.

b. Respons Kekebalan Seluler

Respons seluler terhadap BIV melibatkan aktivasi sel T CD4+ dan CD8+, serta produksi sitokin yang memengaruhi dinamika infeksi. Namun, infeksi kronis dapat menurunkan fungsi imun, serupa dengan mekanisme imunosupresi pada lentivirus lain.

 

9. Metode Diagnostik

 

a. Isolasi Virus

Isolasi BIV dapat dilakukan menggunakan kultur sel monosit atau limfosit dari sapi, meskipun metode ini memerlukan waktu lama dan fasilitas biosafety memadai.

 

b. Deteksi Molekuler

PCR dan nested PCR merupakan metode utama untuk mendeteksi DNA provirus BIV pada jaringan atau darah. Primer biasanya menargetkan gen pol atau gag, yang bersifat konservatif. Pengembangan quantitative PCR (qPCR) telah meningkatkan sensitivitas deteksi terutama untuk surveilans epidemiologis.

 

c. Diagnostik Serologis

Uji enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) dan Western blot digunakan untuk mendeteksi antibodi terhadap BIV. Uji serologis sering digunakan dalam studi prevalensi karena efisien dan dapat diaplikasikan pada populasi besar.

 

10. Kesimpulan dan Arah Penelitian Masa Depan

BIV merupakan lentivirus sapi yang unik karena memiliki kesamaan genetik dengan virus lentivirus patogen, tetapi menunjukkan patogenisitas yang rendah. Walaupun infeksi biasanya bersifat subklinis, potensi gangguan imun yang diakibatkannya tetap perlu diperhatikan, terutama pada sistem pemeliharaan intensif atau pada hewan dengan komorbiditas.

 

Ke depan, penelitian diarahkan pada pemahaman hubungan molekuler antara BIV dan JDV, potensi rekombinasi antarlentivirus, serta peran BIV dalam evolusi lentivirus mamalia. Pengembangan metode diagnostik yang lebih sensitif dan studi longitudinal pada populasi sapi di berbagai negara juga diperlukan untuk memperjelas dampak biologis dan epidemiologis infeksi BIV.

 

SUMBER:

Sandeep Bhatia, S.S. Patil, and R. Sood. 2013. Bovine immunodeficiency virus: a lentiviral infection. Indian J Virol. V.24(3) 2013.

 

Terungkap! Teknologi Genotipe Online Paling Canggih untuk Deteksi Cepat Pasteurella multocida—Wajib Dibaca Pembuat Kebijakan!

 

POLICY BRIEF: 
PENGEMBANGAN PLATFORM DIGITAL UNTUK GENOTIPING PASTEURELLA MULTOCIDA

 

1. RINGKASAN EKSEKUTIF

 

Disini dibahas Policy Brief Hasil Studi tentang "Pengembangan Platform Digital untuk Genotiping Pasteurella multocida dari Inang Berbeda untuk Mendukung Wilayah yang Terkendali dari Penyakit Septicemia Epizootica."

 

Pasteurella multocida adalah patogen zoonosis yang penting. Berbagai sistem telah diterapkan pada tipe P. multocida dari berbagai penyakit pada inang yang berbeda. Baru-baru ini, kami menemukan bahwa menetapkan strain P. multocida dengan menggabungkan genotipe kapsuler, lipopolisakarida, dan MLST (ditandai sebagai kapsuler: lipopolisakarida: genotipe MLST) dapat membantu mengatasi karakteristik biologis sirkulasi P. multocida di inang yang berbeda. Namun, masih kurangnya piranti yang cepat dan efisien untuk mendiagnosis P. multocida menurut sistem ini. Di sini, dikembangkan platform genotipe cerdas PmGT untuk strain P. multocida menurut seluruh rangkaian genomnya menggunakan teknologi web 2.0. Dengan menggunakan PmGT, telah ditenentukan genotipe kapsuler, genotipe LPS, dan genotipe MLST serta gen faktor virulensi utama (VFGs) dari isolat P. multocida dari spesies inang yang berbeda berdasarkan seluruh urutan genom yang dipublikasikan di NCBI. Hasilnya menunjukkan adanya hubungan yang lebih erat antara genotipe dan pasteurellosis dibandingkan antara genotipe dan spesies inang. Dengan munculnya urutan DNA berkualitas tinggi dan murah, PmGT mewakili piranti yang lebih efisien untuk diagnosis P. multocida baik dalam studi epidemiologi dan manajemen klinis.

 

2. PENDAHULUAN

 

Septicaemia epizootica (Penyakit ngorok) adalah penyakit yang disebabkan oleh Pasturella multocida B2, menyerang ternak sapi dan kerbau, bersifat akut dan sangat fatal. Penyakit ini tersebar di Asia Selatan dan Asia Tenggara termasuk Indonesia, Filipina, Thailand, Malaysia.  Basis data GenBank dirancang untuk menyediakan dan mendorong akses komunitas ilmiah terhadap informasi urutan DNA terkini dan komprehensif. Oleh karena itu, Lembaga GenBank tidak membatasi penggunaan atau distribusi data GenBank. Namun, beberapa pengirim mungkin mengklaim hak paten, hak cipta, atau hak kekayaan intelektual lainnya atas seluruh atau sebagian data yang telah mereka kirimkan.  Terdapat permasalahan karena masih kurangnya piranti yang cepat dan efisien untuk mendiagnosis P. multocida berdasarkan genotipenya maka perlu dikembangkan platform genotipe cerdas PmGT untuk strain P. multocida berdasarkan seluruh urutan genomnya menggunakan teknologi web 2.0.

 

a.   Tujuan umum dan motivasi yang mendasari Risalah

  Pasteurella multocida adalah patogen zoonosis yang penting dan dapat berkolonisasi serta menyebabkan infeksi pada berbagai hewan domestik dan liar termasuk hewan penghasil makanan (misalnya unggas, babi, sapi, domba) dan hewan pendamping (misalnya kucing dan anjing).

   Diagnosis sumber infeksi yang cepat dan akurat sangat penting bagi kegiatan medis dan kedokteran hewan, dan penting untuk meningkatkan pemahaman tentang mekanisme penyakit dan langkah-langkah untuk mengendalikan penyakit.

   Penentuan tipe mikroba merupakan metode penting untuk diagnosis patogen yang berhubungan dengan penyakit.

   Metode penentuan tipe yang paling banyak digunakan terdiri dari sistem penentuan tipe serologis dan metode penentuan tipe molekuler berbasis PCR

   Pembentukan sistem penentuan tipe yang diskriminatif membantu pemahaman dan pengendalian patogen, terutama patogen yang memiliki banyak serovar dan/atau genotipe dari lingkungan atau sumber inang yang berbeda.

b.  Pengembangan berdasarkan pemikiran historis dan konteks isu

  Urutan seluruh genom yang dikombinasikan dengan teknologi komputasi terbaru merupakan pendekatan baru untuk diagnosis mikroba

  Dengan menggunakan teknologi urutan seluruh genom, agen penyebab penyakit menular dapat ditentukan dengan cepat dan akurat, termasuk penyakit yang baru muncul

c.   Tujuan akhir

  Interpretasi hasil urutan untuk merumuskan peneguhan diagnosis memerlukan tenaga ahli teknis yang memiliki kemampuan komputasi dan bioinformatika.

   Platform praktis dan otomatis yang menggabungkan urutan seluruh genom dengan teknologi komputasi untuk memberikan hasil diagnostik akan bermanfaat dalam memajukan bidang ini.

d.  Keputusan untuk melanjutkan kajian

    Untuk kesempurnaan hasil kajian ini perlu dikembangkan lebih lanjut.

e.   Teori perubahan yang disarankan

  Dengan menerapkan hasil kajian ini akan bisa digunanakan untuk mendukung wilayah yang terkendali dari penyakit Septicemia Epizootica.

 

3. METODOLOGI

 

Kajian ini menggunakan studi kasus dan praktik terbaik yang telah dilaksanakan di Amerika Serikat yaitu pengembangan piranti online untuk genotipe pasteurella multocida dari inang berbeda dan selanjutnya datanya disimpan dalam di GenBank.

 

Strain Bakteri dan Urutan Nukleotida

Strain P. multocida yang digunakan pada kajian ini antara lain satu isolat asal sapi (strain HB01), satu isolat asal unggas (strain HB02), dan 50 isolat asal babi (strain HB03, HN04, HN05, HN06, HN07, HNA01~HNA22 , HND01~HND21, HNF01 dan HNF02) (Tabel Tambahan S1). Semua strain ini berasal dari koleksi laboratorium kami, yang sebelumnya kami telah mengurutkan seluruh rangkaian genomnya [27-30].

 

Urutan nukleotida spesifik untuk penentuan strain P. multocida (KMT1, 460 bp), dan lima genotipe kapsulernya (A, 1044 bp; B, 760 bp; D, 657 bp; E, 511 bp; F, 851 bp) ; serta delapan genotipe LPS mereka (L1, 1307 bp; L2, 810 bp; L3, 474 bp; L4, 550 bp; L5, 1175 bp; L6, 668 bp; L7, 931 bp; L8, 255 bp) diekstraksi dari urutan genom strain P. multocida yang berbeda sesuai dengan posisi yang didokumentasikan dalam publikasi sebelumnya [18, 19] dan disimpan di GenBank dengan nomor tambahan MT570166, MN938443~MN938455.

 

Urutan nukleotida dari 23 jenis gen virulensi yang umum terdeteksi dalam studi epidemiologi P. multocida, termasuk gen yang mengkode fimbriae dan adhesin lainnya (ptfA, fimA, hsf-1, hsf-2, pfhA, dan tadD), toksin (toxA), besi protein akuisisi (exbB, exbD, tonB, hgbA, hgbB, fur, dan tbpA), sialidase (nanB dan nanH), hyaluronidase (pmHAS), protein membran luar (OMP) (ompA, ompH, oma87, dan plpB), dan superoksida dismutase (sodA dan sodC), diamplifikasi dari DNA genom P. multocida HN06 dan HB01 melalui uji PCR menggunakan protokol yang didokumentasikan di tempat lain (23, 31). Urutan nukleotida ini disimpan di GenBank dengan nomor tambahan MT570167~ MT570189.

 

Seluruh urutan genom yang tersedia untuk umum dari 262 strain P. multocida dari spesies sapi [n = 106; termasuk kasus septikemia hemoragik sapi (32)], spesies unggas (n = 39), spesies babi (n = 66), spesies leporine (n = 20), spesies ovine (n = 6), manusia (n = 13) , gigi taring (n = 3), spesies murine (n = 2), kuda (n = 2), kucing (n = 2), alpaka (n = 2) dan 1 urutan DNA sintetik dalam database genom NCBI diunduh untuk digunakan.

 

Implementasi Sistem

Platform PmGT terintegrasi pada server CentOS, terutama menyediakan dua jenis layanan online: piranti genotiping, serta kueri dan tampilan data. Untuk membuat layanan genotipe online, pertama-tama kami menggunakan Apache (https://www.apache.org) sebagai wadah web. Kemudian, kami mengunduh paket BLAST (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST/) dari NCBI, yang kemudian diinstal dan dikonfigurasi pada wadah web. PHP digunakan sebagai bahasa sisi server dan skrip sisi browser menggunakan jQuery, yang merupakan pustaka JavaScript yang cepat, kecil, dan kaya fitur. Halaman tampilan dibuat dengan Hypertext Markup Language (HTML) dan Cascading Style Sheets (CSS). Untuk strain target, format sequence terlebih dahulu diverifikasi oleh web user interface kemudian data sequence diunggah ke server melalui program PHP yang selanjutnya disebut localized BLAST untuk menyelaraskan sequence yang diunggah dengan database referensi. Urutan nukleotida spesifik untuk penentuan strain P. multocida, genotipe kapsuler, genotipe LPS, dan 23 jenis gen faktor virulensi (VFGs) dikemas dan digunakan sebagai database referensi untuk penyelarasan urutan. Terakhir, hasilnya dikembalikan dan ditampilkan di halaman web. Selain itu, jika pengguna memilih opsi “genotipe MLST,” fungsi permintaan http “curl_setopt” di PHP digunakan untuk meminta antarmuka RESTful PubMLST (http://rest.pubmlst.org/db/pubmlst_Pmultocida_seqdef/sequence) dan fungsi “curl_exec” digunakan untuk menangkap respon yang kemudian diurai menjadi hasil dan ditampilkan di halaman genotipe.

 

Deteksi PCR Genotipe Kapsul, Genotipe LPS, Genotipe MLST, dan Gen Virulensi Strain P. multocida Dari Babi

Genotipe kapsuler dan genotipe LPS dari strain P. multocida dari koleksi laboratorium kami ditentukan dengan menggunakan pengujian berbasis PCR multipleks, seperti yang didokumentasikan di tempat lain [18, 19]. Profil dari 23 jenis gen virulensi yang disebutkan di atas ditentukan dengan uji PCR, seperti dijelaskan sebelumnya [23]. Jenis urutan (ST) ditentukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan dalam database MLST Pasteurella multocida (//pubmlst.org/organisms/pasteurella-multocida/multi-host).

 

Ketersediaan Data

Urutan nukleotida spesifik untuk P. multocida dan genotipe kapsulernya, genotipe LPS, serta VFG tersedia untuk umum di GenBank dengan nomor tambahan MN938443-MN938455 dan MT570167~MT570189. Sistem pengetikan yang dikembangkan dalam penelitian ini tersedia di: http://vetinfo.hzau.edu.cn/PmGT.

 

4. TINJAUAN PUSTAKA

 

Pada tahun 2001, metode berbasis PCR multipleks didirikan untuk mengetikkan lima serogrup menjadi lima genotipe kapsuler (A, B, D, E, F) [18], dan pada tahun 2015, metode berbasis PCR multipleks lainnya juga dikembangkan untuk diklasifikasikan 16 serovar menjadi delapan genotipe LPS (L1~L8) [19]. Pada tahun 2004 dan 2010, dua sistem typing urutan multilokus juga dikembangkan untuk genotipe strain P. multocida (https://pubmlst.org/pmultocida/) masing-masing dari beberapa inang mamalia dan burung [20, 21]. Pada tahun 2017, sistem genotipe virulensi berdasarkan deteksi profil gen faktor virulensi (VFG) yang berbeda juga dilaporkan untuk membedakan strain P. multocida dari inang yang berbeda (22). Dibandingkan dengan metode pengetikan serologis tradisional, sistem pengetikan berbasis DNA molekuler ini memang sangat efektif dan akurat, dan kini banyak digunakan untuk menentukan karakteristik epidemiologi dan genetik dari isolat klinis [23-27].

 

Meskipun penelitian telah dilakukan selama lebih dari 135 tahun, perbedaan karakteristik biologis molekuler dari prevalensi P. multocida pada spesies inang yang berbeda masih harus diatasi. Misalnya, strain P. multocida tipe A telah ditemukan dari spesies unggas, babi, spesies sapi, dan banyak spesies inang lainnya (8, 9), namun sedikit yang diketahui tentang perbedaan isolat tipe A tersebut dari inang yang berbeda. Baru-baru ini, kami mengembangkan sistem untuk menetapkan strain P. multocida dari spesies inang yang berbeda dengan menggabungkan genotipe kapsuler, LPS, dan MLST (ditandai sebagai genotipe kapsuler: genotipe LPS: genotipe MLST), serta menentukan profil VFG, yang berkontribusi terhadap mengatasi karakteristik biologis molekuler prevalensi P. multocida pada spesies inang yang berbeda [7, 23, 27]. Namun, strategi ini memerlukan ahli bioinformatika untuk analisis dan interpretasi data. Di sini, kami melaporkan pengembangan platform otomatis untuk mengetikkan strain P. multocida dari beberapa inang yang menggabungkan penggunaan pengurutan seluruh genom.

 

5. AMALISIS STUDI KASUS DAN PRAKTIK TERBAIK

 

Pengembangan dan Implementasi PmGT

Proses umum genotipe diringkas sebagai berikut: ketika urutan kueri dikirimkan melalui antarmuka pengguna web, urutan ini kemudian akan dikirimkan ke server CentOS melalui protokol HTTP. Setelah itu, urutan tersebut dievaluasi oleh program PHP, dan urutan yang lolos akan diBLAST terhadap database genotipe untuk mendapatkan hasil, yang akan dikembalikan ke halaman web melalui program PHP (Gambar 1A,B). Melalui prosedur di atas, modul genotipe PmGT (http://vetinfo.hzau.edu.cn/PmGT) dikembangkan (Gambar 1).

 

Saat ini, PmGT menyediakan layanan di atas yang mencakup lima menu: (1) halaman “Beranda” memberikan pengenalan singkat tentang karakteristik etiologi P. multocida untuk membantu pengguna memahami bakteri; (2) halaman “Isolat” menampilkan genotipe strain P. multocida berdasarkan seluruh rangkaian genomnya yang tersedia untuk umum di NCBI; halaman ini juga menyediakan tautan bagi pengguna untuk mengunduh genom strain P. multocida dari NCBI; (3) halaman “Genotipe” memungkinkan pengguna untuk menentukan apakah isolat yang diduga merupakan strain P. multocida dan genotipe P. multocida dengan menggunakan seluruh rangkaian genom yang dirangkai dari pembacaan urutan (Gambar 1C); (4) halaman “Tentang” merangkum pedoman penggunaan piranti web ini; (5) halaman “Kontak” menyediakan informasi kontak pengembang.

 

PmGT Menunjukkan Akurasi yang Sama Dengan Metode PCR dalam Genotipe Strain P. multocida

Untuk menguji keakuratan PmGT, kami menggunakan dua metode untuk mengetik 52 isolat P. multocida (HB01, HB02, HB03, HN04, HN05, HN06, HN07, HNA01~HNA22, HND01~HND21, HNF01, dan HNF02) dari koleksi laboratorium kami (27). Pertama, kami mengirimkan seluruh urutan genom mereka ke PmGT untuk genotipe. Sebagai perbandingan, kami juga menentukan genotipe kapsuler, genotipe LPS, tipe sekuens, serta profil dari 23 jenis gen virulensi tersebut di atas dengan menggunakan uji PCR. Ke-52 strain ini di-genotipe dengan PmGT dan melalui platform genotipe online ini (Tabel 1). Genotipe dengan tes PCR mengkonfirmasi genotipe kapsuler, LPS, dan MLST ini.

 

Penentuan 23 jenis gen virulensi untuk masing-masing 52 strain dengan menggunakan sistem online ini mengungkapkan bahwa beberapa gen (ptfA, fimA, oma87, dan sodC) disajikan secara luas dalam urutan genom yang di-genotipe (Gambar 2). Namun, beberapa gen (hsf-1, hsf-2, pfhA, dan tadD) terdistribusi secara heterogen, dan khususnya, tidak satu pun dari 52 sekuens yang di-genotipe membawa gen toxA atau tbpA (Gambar 2).

 

Genotipe P. multocida Dari Inang Berbeda

Untuk memahami sirkulasi genotipe strain P. multocida pada spesies inang yang berbeda, 262 seluruh rangkaian genom strain P. multocida di-genotipe oleh PmGT. Hasilnya menunjukkan bahwa isolat P. multocida dari inang yang berbeda menunjukkan preferensi tertentu untuk “genotipe kapsuler/LPS/MLST” (Gambar 3). Misalnya, sebagian besar strain babi ditentukan sebagai genotipe kapsuler A (52%) dan D (39%), genotipe LPS L3 (36%) dan L6 (61%), tipe sekuens ST3 (29%), ST11 (22%). %), dan ST10 (34%), masing-masing; sedangkan sebagian besar strain sapi yang di-genotipe ditentukan sebagai genotipe kapsuler A (72%) dan B (28%), genotipe LPS L3 (67%) dan L2 (27%), dan tipe sekuens ST1 (59%) dan ST44 (25%). %), masing-masing (Gambar 3). Saat menggabungkan genotipe kapsuler dan genotipe LPS, terungkap bahwa sebagian besar unggas P. multocida yang di-genotipe bertipe A:L1 dan A:L3, sedangkan sebagian besar sapi P. multocida yang di-genotipe bertipe A:L3 dan B: L2; babi yang di-genotipe P. multocida sebagian besar berasal dari D:L6, A:L3, dan A:L6; sedangkan leporin P. multocida yang di-genotipe sebagian besar berasal dari A:L3; sebagian besar P. multocida manusia yang di-genotip diketik sebagai A:L3 dan A:L1 (Gambar 4A). Jika genotipe kapsuler, genotipe LPS, dan genotipe MLST digabungkan, sebagian besar unggas P. multocida yang di-genotipe bertipe A:L1:ST128, sedangkan sebagian besar P. multocida sapi yang di-genotipe bertipe A:L3:ST1 dan B :L2:ST44; babi yang di-genotipe P. multocida sebagian besar berasal dari D:L6:ST11, A:L3:ST3, dan A:L6:ST10; sedangkan leporin P. multocida yang di-genotipe sebagian besar berasal dari A:L3:ST12 (Gambar 4).

 

Genotipe virulensi menggunakan sistem yang dikembangkan di sini mengungkapkan bahwa keberadaan beberapa VFG, termasuk ptfA, fimA, hsf-2, exbB, exbD, tonB, hgbA, hgbB, fur, nanB, nanH, ompA, ompH, oma87, plpB, sodA, dan sodC, merupakan karakteristik luas dari strain P. multocida dari berbagai spesies inang (Gambar 5). Namun, beberapa VFG hanya ditentukan pada urutan genom P. multocida dari inang tertentu. Misalnya, toxA, sebuah gen yang mengkode toksin dermonekrotik, hanya ditemukan pada strain dari babi, domba, dan alpaka, sedangkan tbpA, sebuah gen pengkode protein pengikat transferrin, hanya ditemukan pada strain dari sapi, domba, dan alpaka (Gambar 5 ).

 

6. PILIHAN DAN REKOMENDASI KEBIJAKAN

 

P. multocida adalah agen penyebab berbagai penyakit dengan spektrum spesies inang yang luas, termasuk manusia dan primata lainnya [7–9]. Selain itu, isolat P. multocida yang diperoleh dari inang berbeda dengan penyakit berbeda dapat diklasifikasikan dalam banyak serovar/genotipe berbeda menurut sistem pengetikan berbeda [7, 9].

 

Mengandalkan hanya satu atau dua sistem penentuan tipe, sulit untuk mengatasi karakteristik isolat P. multocida dari spesies inang yang berbeda dan/atau hubungannya dengan penyakit yang berbeda. Misalnya, isolat P. multocida dari spesies inang yang berbeda mungkin memiliki genotipe kapsuler yang sama tetapi memiliki genotipe LPS dan/atau genotipe MLST yang berbeda; bahkan spesies inang berbeda yang memiliki genotipe kapsul, LPS, dan MLST yang sama mungkin membawa VFG berbeda [27, 33]. Oleh karena itu, telah diusulkan sistem genotipe gabungan “kapsul: LPS: MLST” yang mencakup genotipe virulensi untuk membedakan isolat P. multocida dari spesies inang yang berbeda dan/atau yang terkait dengan penyakit yang berbeda [7]. Namun, sistem genotipe gabungan ini berbasis PCR multipleks dan melelahkan serta memakan waktu.

 

Kemajuan dalam bioinformatika dan piranti bioinformatika memungkinkan penerapan data sekuens seluruh genom untuk memasukkan berbagai informasi demografis untuk karakterisasi bakteri, seperti genotipe kapsuler dan LPS; adanya adhesin, racun, atau faktor virulensi lainnya [34]. Dalam studi ini, dilaporkan pengembangan platform genotipe untuk membedakan isolat P. multocida menurut seluruh rangkaian genom bakteri.

 

Validasi platform PmGT dilakukan pada koleksi isolat P. multocida yang diperoleh dari laboratorium. Hasil penelitian mengungkapkan bahwa sistem genotipe ini memberikan hasil yang konsisten dalam menentukan genotipe kapsular, LPS-, MLST, dan VFG, dibandingkan dengan yang diperoleh dengan menggunakan sistem pengetikan berbasis PCR multipleks.

 

Dibandingkan dengan sistem pengetikan berbasis PCR multipleks [18, 19, 21, 22] dan sistem pengetikan serologis tradisional [13, 16], sistem genotipe ini membutuhkan lebih sedikit waktu untuk memberikan hasil dan tidak memerlukan antisera berkualitas tinggi, yang mewakili piranti yang lebih efisien dan hemat biaya untuk mengkarakterisasi isolat P. multocida baik dalam studi epidemiologi maupun manajemen klinis.

 

Dengan menggunakan PmGT, genotipe kapsuler, LPS-, MLST, dan VFG dari strain P. multocida dari inang yang berbeda ditentukan berdasarkan seluruh urutan genom. Hasil ini sesuai dengan penelitian epidemiologi [23, 24, 26, 35].  Misalnya, strain P. multocida serovar B: 2 dan A: 3 masing-masing sering dikaitkan dengan septikemia hemoragik sapi dan penyakit pernapasan [36, 37].

 

Diketahui bahwa serogrup P. multocida A dan B masing-masing ditugaskan ke genotipe kapsuler A dan B dengan PCR multipleks [18]; sedangkan serovar P. multocida Heddleston 2 dan 3 ditugaskan ke genotipe LPS L2 dan L3 masing-masing dengan PCR multipleks (19). Itulah sebabnya genotipe kapsuler: LPS dari sebagian besar strain sapi ditentukan masing-masing sebagai A: L3 dan B: L2. Selain itu, strain P. multocida yang diisolasi dari septikemia hemoragik sapi umumnya ditentukan sebagai ST122 [38], jenis urutan ini dapat ditetapkan kembali ke ST44 dengan menggunakan database MLST multihost [27].

 

Temuan ini dapat menjelaskan mengapa strain P. multocida yang terkait dengan septikemia hemoragik sapi diketik sebagai kapsular: LPS: MLST genotipe B: L2: ST44. Temuan serupa juga diamati pada strain P. multocida dari spesies inang lainnya. Secara khusus, sebagian besar strain P. multocida dari babi ditentukan sebagai genotipe kapsuler: LPS: MLST D: L6: ST11, A: L3: ST3, dan A: L6: ST10. Hasil ini juga sesuai dengan hasil penelitian epidemiologi sebelumnya [23], yang menunjukkan bahwa ketiga genotipe ini, khususnya genotipe D/L6/ST11, kemungkinan besar terkait erat dengan penyakit pernapasan babi. Namun, selama pengujian kami, kami juga menemukan genotipe kapsuler, LPS, dan/atau MLST dari beberapa strain tidak dapat ditentukan oleh PmGT berdasarkan seluruh rangkaian genom.

 

Setelah memeriksa data, dapat dikemukakan beberapa alasan untuk menjelaskan hasil ini:

(1) Sebagian besar genom yang tidak dapat ditentukan tipe ini diurutkan dan dirakit menggunakan teknologi pengurutan generasi kedua dan kualitas genom ini tidak tinggi, beberapa gen digunakan untuk genotipe kapsuler/LPS/MLST berada dalam kesenjangan antara urutan genom dalam perakitan [7];

(2) urutan genom mungkin berasal dari strain kapsular nontypeable yang dilaporkan [23, 39];

(3) beberapa strain termasuk dalam tipe sekuens baru dan database MLST Pasteurella multocida saat ini tidak menyertakan tipe sekuens ini.

Secara keseluruhan, disarankan sistem ini (platform online untuk genotipe P. multocida (platform PmGT), yang menggabungkan piranti analisis sekuens seluruh genom dengan teknologi web 2.0.) dapat mewakili piranti yang lebih mudah untuk diagnosis P. multocida baik dalam studi epidemiologi maupun pengaturan klinis.

 

7. IMPLEMENTASI DAN LANGKAH SELANJUTNYA

 

·  Telah dapat dikembangkan platform online untuk genotipe P. multocida (platform PmGT), yang menggabungkan piranti analisis sekuens seluruh genom dengan teknologi web 2.0.

·  Dengan menggunakan sistem ini, telah dapat diketahui genotipe isolat P. multocida dari spesies inang yang berbeda.

· Secara keseluruhan, disarankan sistem ini (platform online untuk genotiping P. multocida (platform PmGT), yang menggabungkan piranti analisis sekuens seluruh genom dengan teknologi web 2.0.) dapat mewakili piranti yang lebih mudah untuk diagnosis P. multocida baik dalam studi epidemiologi maupun pengaturan klinis.

 

8. KESIMPULAN

 

·  Telah dapat dikembangkan platform online untuk genotipe P. multocida (platform PmGT), yang menggabungkan piranti analisis sekuens seluruh genom dengan teknologi web 2.0.

·  Dengan menggunakan sistem ini, telah dapat diketahui genotipe isolat P. multocida dari spesies inang yang berbeda.

· Secara keseluruhan, disarankan sistem ini (platform online untuk genotiping P. multocida (platform PmGT), yang menggabungkan piranti analisis sekuens seluruh genom dengan teknologi web 2.0.) dapat mewakili piranti yang lebih mudah untuk diagnosis P. multocida baik dalam studi epidemiologi maupun pengaturan klinis.

·  Hasil kajian ini telah memberikan contoh untuk mengembangkan piranti yang cepat dan efisien untuk diagnosis bakteri dengan menggunakan seluruh rangkaian genomnya di era kecerdasan buatan pada waktu mendatang.

·  Kumpulan data yang disajikan dalam kajian ini dapat ditemukan di repositori online.  Nama repositori dan nomor aksesi dapat ditemukan pada alamat sebagai berikut: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, MN938443-MN938455 dan MT570166~ MT570166.

 

9. LAMPIRAN

Gambar 1. Pengembangan platform genotipe dan prediksi inang P. multocida. (A) Flowchart yang menunjukkan desain sistem; (B) Fungsi utama platform web; (C) Gambaran umum sistem genotipe P. multocida.

 

Tabel 1. Genotipe 52 strain P. multocida ditentukan melalui Platform PmGT.

 

Gambar 2. Peta panas yang menunjukkan distribusi 23 jenis gen virulensi (VFG) di antara 52 strain P. multocida dari babi. Kotak berwarna merah menunjukkan adanya VFG pada strain, sedangkan kotak berwarna hijau menunjukkan VFG hilang pada strain.

Gambar 3. Peta panas yang mengungkapkan hubungan antara genotipe kapsuler/LPS/MLST dan strain P. multocida dari spesies inang berbeda yang ditentukan oleh PmGT. (A) Peta panas yang mengungkapkan hubungan antara genotipe kapsuler dan strain P. multocida dari spesies inang yang berbeda; (B) Peta panas yang mengungkapkan hubungan antara genotipe LPS dan strain P. multocida dari spesies inang yang berbeda; (C) Peta panas mengungkapkan hubungan antara genotipe MLST dan strain P. multocida dari spesies inang yang berbeda. Persentase urutan yang diketik ditampilkan dengan warna berbeda yang ditampilkan di sudut kanan.

Gambar 4. Diagram kolom dan lingkaran yang menunjukkan distribusi genotipe kapsul: LPS dan/atau genotipe kapsul: LPS: MLST dari strain P. multocida dari spesies inang berbeda yang ditentukan oleh PmGT dengan menggunakan seluruh rangkaian genom. (A) Bagan kolom yang menunjukkan distribusi genotipe kapsul: LPS dari strain P. multocida dari spesies inang yang berbeda; (B – K) Diagram lingkaran yang menunjukkan distribusi kapsuler: LPS: genotipe MLST dari strain P. multocida dari spesies unggas, spesies sapi, anjing, kucing, manusia, kuda, spesies leporine, babi, spesies ovine, dan hewan pengerat.

 

Gambar 5. Peta panas yang mengungkapkan hubungan antara gen virulensi dan strain P. multocida dari spesies inang yang berbeda.

 

10. DAFTAR PUSTAKA

 

1.Kessel M. Why microbial diagnostics need more than money. Nat Biotechnol. (2015) 33:898–900. doi: 10.1038/nbt.3328

2.Peng Z, Ling L, Stratton CW, Li C, Polage CR, Wu B, et al. Advances in the diagnosis and treatment of Clostridium difficile infections. Emerg Microbes Infect. (2018) 7:15. doi: 10.1038/s41426-017-0019-4

3.Schmitz JE, Tang YW. The GenMark ePlex((R)): another weapon in the syndromic arsenal for infection diagnosis. Future Microbiol. (2018) 13:1697–708. doi: 10.2217/fmb-2018-0258

4.Lecuit M, Eloit M. The diagnosis of infectious diseases by whole genome next generation sequencing: a new era is opening. Front Cell Infect Microbiol. (2014) 4:25. doi: 10.3389/fcimb.2014.00025

5.Zhang YZ, Holmes EC. A genomic perspective on the origin and emergence of SARS-CoV-2. Cell. (2020) 181:223–7. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.035

6.Török ME, Peacock SJ. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory–pipe dream or reality? J Antimicrob Chemother. (2012) 67:2307–8. doi: 10.1093/jac/dks247

7.Peng Z, Wang X, Zhou R, Chen H, Wilson BA, Wu B. Pasteurella multocida: genotypes and genomics. Microbiol Mol Biol Rev. (2019) 83:e00014–9. doi: 10.1128/MMBR.00014-19

8.Wilkie IW, Harper M, Boyce JD, Adler B. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. (2012) 361:1–22. doi: 10.1007/82_2012_216

9.Wilson BA, Ho M. Pasteurella multocida: from zoonosis to cellular microbiology. Clin Microbiol Rev. (2013) 26:631–55. doi: 10.1128/CMR.00024-13

10.Ryan JM, Feder HM Jr. Dog licks baby Baby gets Pasteurella multocida meningitis. Lancet. (2019) 393:e41. doi: 10.1016/S0140-6736(19)30953-5

11.Dryden MS, Dalgliesh D. Pasteurella multocida from a dog causing Ludwig's angina. Lancet. (1996) 347:123. doi: 10.1016/S0140-6736(96)90250-0

12.Godey B, Morandi X, Bourdinière J, Heurtin C. Beware of dogs licking ears. Lancet. (1999) 354:1267–8. doi: 10.1016/S0140-6736(99)04197-5

13.Carter GR. Studies on Pasteurella multocida. I A hemagglutination test for the identification of serological types. Am J Vet Res. (1955) 16:481–4.

14.Carter GR. A new serological type of Pasteurella multocida from Central Africa. Veterinary Record. (1961) 73:1052.

15.Rimler RB, Rhoades KR. Serogroup F. A new capsule serogroup of Pasteurella multocida. J Clin Microbiol. (1987) 25:615–8. doi: 10.1128/jcm.25.4.615-618.1987

16.Heddleston KL, Gallagher JE, Rebers PA. Fowl cholera: gel diffusion precipitin test for serotyping Pasteruella multocida from avian species. Avian Dis. (1972) 16:925–36. doi: 10.2307/1588773

17.Peng Z, Liang W, Wu B. Molecular typing methods for Pasteurella multocida-a review. Wei Sheng Wu Xue Bao. (2016) 56:1521–9. doi: 10.13343/j.cnki.wsxb.20160002

18.Townsend KM, Boyce JD, Chung JY, Frost AJ, Adler B. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. J Clin Microbiol. (2001) 39:924–9. doi: 10.1128/JCM.39.3.924-929.2001

19.Harper M, John M, Turni C, Edmunds M, St Michael F, Adler B, et al. Development of a rapid multiplex PCR assay to genotype Pasteurella multocida strains by use of the lipopolysaccharide outer core biosynthesis locus. J Clin Microbiol. (2015) 53:477–85. doi: 10.1128/JCM.02824-14

20.Davies RL, MacCorquodale R, Reilly S. Characterisation of bovine strains of Pasteurella multocida and comparison with isolates of avian, ovine and porcine origin. Vet Microbiol. (2004) 99:145–58. doi: 10.1016/j.vetmic.2003.11.013

21.Subaaharan S, Blackall LL, Blackall PJ. Development of a multi-locus sequence typing scheme for avian isolates of Pasteurella multocida. Vet Microbiol. (2010) 141:354–61. doi: 10.1016/j.vetmic.2010.01.017

22.Garcia-Alvarez A, Vela AI, San Martin E, Chaves F, Fernandez-Garayzabal JF, Lucas D, et al. Characterization of Pasteurella multocida associated with ovine pneumonia using multi-locus sequence typing (MLST) and virulence-associated gene profile analysis and comparison with porcine isolates. Vet Microbiol. (2017) 204:180–7. doi: 10.1016/j.vetmic.2017.04.015

23.Peng Z, Wang H, Liang W, Chen Y, Tang X, Chen H, et al. A capsule/lipopolysaccharide/MLST genotype D/L6/ST11 of Pasteurella multocida is likely to be strongly associated with swine respiratory disease in China. Arch Microbiol. (2018) 200:107–18. doi: 10.1007/s00203-017-1421-y

24.Li Z, Cheng F, Lan S, Guo J, Liu W, Li X, et al. Investigation of genetic diversity and epidemiological characteristics of Pasteurella multocida isolates from poultry in southwest China by population structure, multi-locus sequence typing and virulence-associated gene profile analysis. J Vet Med Sci. (2018) 80:921–9. doi: 10.1292/jvms.18-0049

25.Devi LB, Bora DP, Das SK, Sharma RK, Mukherjee S, Hazarika RA. Virulence gene profiling of porcine Pasteurella multocida isolates of Assam. Vet World. (2018) 11:348–54. doi: 10.14202/vetworld.2018.348-354

26.Massacci FR, Magistrali CF, Cucco L, Curcio L, Bano L, Mangili P, et al. Characterization of Pasteurella multocida involved in rabbit infections. Vet Microbiol. (2018) 213:66–72. doi: 10.1016/j.vetmic.2017.11.023

27.Peng Z, Liang W, Wang F, Xu Z, Xie Z, Lian Z, et al. Genetic and phylogenetic characteristics of Pasteurella multocida isolates from different host species. Front Microbiol. (2018) 9:1408. doi: 10.3389/fmicb.2018.01408

28.Peng Z, Liang W, Liu W, Wu B, Tang B, Tan C, et al. Genomic characterization of Pasteurella multocida HB01, a serotype A bovine isolate from China. Gene. (2016) 581:85–93. doi: 10.1016/j.gene.2016.01.041

29.Liu W, Yang M, Xu Z, Zheng H, Liang W, Zhou R, et al. Complete genome sequence of Pasteurella multocida HN06, a toxigenic strain of serogroup D. J Bacteriol. (2012) 194:3292–3. doi: 10.1128/JB.00215-12

30.Peng Z, Liang W, Wang Y, Liu W, Zhang H, Yu T, et al. Experimental pathogenicity and complete genome characterization of a pig origin Pasteurella multocida serogroup F isolate HN07. Vet Microbiol. (2017) 198:23–33. doi: 10.1016/j.vetmic.2016.11.028

31.Khamesipour F, Momtaz H, Azhdary Mamoreh M. Occurrence of virulence factors and antimicrobial resistance in Pasteurella multocida strains isolated from slaughter cattle in Iran. Front Microbiol. (2014) 5:536. doi: 10.3389/fmicb.2014.00536

32.Moustafa AM, Seemann T, Gladman S, Adler B, Harper M, Boyce JD, et al. Comparative genomic analysis of Asian Haemorrhagic Septicaemia-associated strains of Pasteurella multocida identifies more than 90 Haemorrhagic Septicaemia-specific genes. PLoS One. (2015) 10:e0130296. doi: 10.1371/journal.pone.0130296

33.Ujvári B, Makrai L, Magyar T. Virulence gene profiling and ompA sequence analysis of Pasteurella multocida and their correlation with host species. Vet Microbiol. (2019) 233:190–5. doi: 10.1016/j.vetmic.2019.05.005

34.Stoesser N, Sheppard AE, Pankhurst L, De Maio N, Moore CE, Sebra R, et al. Evolutionary history of the global emergence of the escherichia coli epidemic clone ST131. MBio. (2016) 7:e02162. doi: 10.1128/mBio.02162-15

35.Ewers C, Lübke-Becker A, Bethe A, Kiebling S, Filter M, Wieler LH. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status. Vet Microbiol. (2006) 114:304–17. doi: 10.1016/j.vetmic.2005.12.012

36.Shivachandra SB, Viswas KN, Kumar AA. A review of hemorrhagic septicemia in cattle and buffalo. Anim Health Res Rev. (2011) 12:67–82. doi: 10.1017/S146625231100003X

37.Welsh RD, Dye LB, Payton ME, Confer AW. Isolation and antimicrobial susceptibilities of bacterial pathogens from bovine pneumonia: 1994–2002. J Vet Diagn Invest. (2004) 16:426–31. doi: 10.1177/104063870401600510

38.Hotchkiss EJ, Hodgson JC, Lainson FA, Zadoks RN. Multilocus sequence typing of a global collection of Pasteurella multocida isolates from cattle and other host species demonstrates niche association. BMC Microbiol. (2011) 11:115. doi: 10.1186/1471-2180-11-115

39.Tang X, Zhao Z, Hu J, Wu B, Cai X, He Q, et al. Isolation, antimicrobial resistance, and virulence genes of Pasteurella multocida strains from swine in China. J Clin Microbiol. (2009) 47:951–8. doi: 10.1128/JCM.02029-08

 

SUMBER

Pudjiatmoko, Medik Veteriner Ahli Utama. Februari 2024. Memberikan Rekomendasi Hasil Analisis Data: Pengembangan Alat Online untuk Genotiping Pasteurella multocida dari Inang Berbeda untuk Mendukung Wilayah yang Terkendali dari Penyakit Septicemia Epizootica. Direktorat Kesehatan Hewan, Ditjen PKH, Kementerian Pertanian.

#PolicyBrief 

#Bioinformatika 

#GenotipingOnline 

#PasteurellaMultocida 

#KesehatanHewan