Distribusi Global Chlamydia pada Burung Liar

 

Burung liar yang tampak bebas beterbangan di langit ternyata bisa menjadi pembawa senyap bakteri Chlamydia—penyebab penyakit yang bukan hanya menyerang manusia dan hewan peliharaan, tetapi juga menyebar luas di alam liar di berbagai belahan dunia. Sejumlah penelitian telah mengungkap bahwa infeksi Chlamydia pada burung liar memiliki pola distribusi yang sangat luas, dengan variasi spesies dan tingkat prevalensi yang berbeda antarwilayah. Berikut gambaran persebarannya di berbagai benua.

 

Eropa: Pusat Penelitian dengan Keragaman Tinggi

 

Eropa menjadi salah satu kawasan dengan penelitian paling intensif mengenai keberadaan Chlamydia pada burung liar. Surveilans multispecies yang dilakukan di Swiss dan Polandia berhasil mendeteksi infeksi pada berbagai kelompok burung, mulai dari merpati liar hingga burung pemangsa dan burung laut.

 

Sebagian besar laporan menyebutkan Chlamydia psittaci sebagai spesies yang paling sering ditemukan, terutama pada merpati. Namun, beberapa spesies Chlamydia lain juga telah diidentifikasi, seperti C. avium pada merpati di Swiss, Italia, dan Belanda, serta pada burung parkit cincin di Prancis. Di Polandia, bakteri ini bahkan ditemukan pada itik liar (Anas platyrhynchos).

 

Spesies C. gallinacea yang umum dijumpai pada unggas peliharaan di Eropa belum terdeteksi pada burung liar. Menariknya, spesies baru seperti C. buteonis telah mulai disaring di Swiss, dan Candidatus C. ibidis pertama kali diisolasi dari ibis sakral liar. Temuan-temuan ini menunjukkan tingginya keanekaragaman Chlamydiales di Eropa, sekaligus pentingnya penelitian lintas spesies untuk memahami potensi penyebarannya.

 

Asia: Bukti Awal dan Potensi yang Belum Tergali

 

Di Asia, penelitian tentang Chlamydia pada burung liar sebagian besar berfokus pada merpati dan beberapa jenis burung perkotaan lainnya. Di Thailand, India, Jepang, Korea, dan Iran, prevalensi C. psittaci pada merpati liar bervariasi antara 1% hingga 25%. Selain itu, infeksi juga ditemukan pada parkit cincin, gagak, dan burung gereja rumah.

Beberapa spesies Chlamydia lain turut teridentifikasi, seperti C. pecorum dan C. gallinacea, meskipun data pengujian masih terbatas. Di India dan Korea, spesies yang belum terkarakterisasi namun berkerabat dekat dengan C. avium ditemukan pada merpati.

 

Menariknya, meskipun banyak studi di Tiongkok meneliti Chlamydia pada burung penangkaran, data tentang burung liar masih sangat sedikit. Hal ini menunjukkan adanya potensi besar untuk menemukan jenis-jenis Chlamydia baru yang mungkin beredar di burung liar Asia, seiring dengan meningkatnya penggunaan teknologi molekuler dalam surveilans penyakit satwa.

 

Amerika Utara: Kasus Epizootik dan Variasi Spesies

 

Di Amerika Utara, sejumlah kasus epizootik psittacosis telah tercatat. Di Texas, wabah C. psittaci dilaporkan pada merpati putih muda, sementara di Dakota Utara bakteri ini ditemukan pada burung camar. Kasus kematian massal burung cinta di Arizona juga mendorong penelitian lebih lanjut, yang mengungkap adanya infeksi pada berbagai spesies burung liar di sekitar pemukiman manusia.

 

Penelitian pada burung pemangsa menemukan prevalensi Chlamydiaceae sekitar 1,4%, dengan identifikasi C. buteonis pada elang genus Buteo. Selain itu, C. psittaci dan anggota ordo Chlamydiales lain, seperti Candidatus Rhabdochlamydia spp., juga terdeteksi pada elang ekor merah dan osprey.

 

Hingga kini, C. gallinacea dan C. avium belum ditemukan pada burung liar di Amerika Utara. Namun, karena spesies ini telah dilaporkan pada unggas domestik di wilayah tersebut, kemungkinan besar ketidakhadirannya hanya mencerminkan kurangnya pengujian, bukan ketiadaan sebenarnya.

 

Amerika Selatan: Fokus pada Burung Beo dan Merpati

Penelitian di Amerika Selatan sebagian besar berfokus pada burung beo liar, karena tingginya prevalensi C. psittaci pada burung peliharaan dan riwayat psittacosis pada manusia akibat perdagangan burung eksotik. Studi di Brasil menemukan infeksi pada anak burung Amazona dengan tingkat prevalensi yang bervariasi antar spesies, dari 1% hingga 26%.

 

Sebaliknya, pengujian pada burung beo dewasa liar di Peru dan Bolivia belum menunjukkan adanya antibodi terhadap Chlamydia. Namun, pada burung peliharaan, terutama yang diselamatkan dari perdagangan liar, C. psittaci dilaporkan menyebabkan kematian anak burung hingga 97%.

 

Selain burung beo, penelitian pada merpati liar di Brasil menunjukkan prevalensi C. psittaci antara 11% hingga 37%, tergantung lokasi pengambilan sampel. Di luar itu, temuan menarik datang dari Kepulauan Galapagos, di mana C. psittaci ditemukan pada burung merpati endemik (Zenaida galapageoensis). Data ini memperlihatkan bahwa infeksi Chlamydia juga meluas hingga wilayah kepulauan terpencil.

 

Australasia dan Oseania: Evolusi Pengetahuan dari Masa ke Masa

 

Laporan infeksi Chlamydia pada burung liar di Australia telah ada sejak 1930-an, terutama pada burung beo. Meskipun prevalensi saat ini cenderung rendah (0–2%), beberapa spesies seperti galah dan crimson rosella menunjukkan angka infeksi yang lebih tinggi.

 

Selain burung beo, survei pada burung air dan spesies lain sebagian besar negatif, kecuali satu kasus pada superb lyrebird. Di Selandia Baru, infeksi C. psittaci ditemukan pada merpati liar, burung asli hihi, dan beberapa spesies itik liar di pusat rehabilitasi.

 

Penelitian terbaru di Australia menunjukkan bahwa keragaman Chlamydiales mungkin lebih luas dari yang diperkirakan sebelumnya. Selain C. psittaci, ditemukan pula C. gallinacea dan kelompok lain seperti Parachlamydiaceae. Dengan meningkatnya penggunaan teknologi next-generation sequencing (NGS), para ilmuwan memperkirakan akan ada lebih banyak jenis Chlamydia yang diidentifikasi di masa mendatang.

 

Afrika dan Antartika: Data Terbatas, Temuan Menarik

 

Di Afrika, data tentang Chlamydia pada burung liar masih sangat terbatas. Studi pada pelikan di Afrika Selatan tidak menemukan kasus positif, dan hanya ada laporan terbatas dari Mesir. Namun, hasil berbeda ditemukan di benua beku Antartika.

 

Di sana, Chlamydiales terdeteksi pada penguin chinstrap dan burung laut lain dengan prevalensi sekitar 18%. Menariknya, C. psittaci tidak ditemukan pada sampel tersebut, menandakan kemungkinan keberadaan spesies Chlamydia lain yang khas untuk lingkungan ekstrem.

 

Kesimpulan

 

Distribusi global Chlamydia pada burung liar menunjukkan pola yang kompleks dan bervariasi antar wilayah. Eropa dan Amerika Utara menjadi pusat penelitian dengan dokumentasi paling lengkap, sementara Asia, Amerika Selatan, dan Afrika masih menyimpan potensi besar untuk penemuan baru. Dengan kemajuan teknologi deteksi molekuler, terutama next-generation sequencing, pemahaman tentang keanekaragaman Chlamydia di alam liar diperkirakan akan semakin berkembang—memberikan wawasan penting bagi kesehatan satwa, lingkungan, dan manusia dalam kerangka One Health.

 

SUMBER REFERENSI:

1.Ulasan Infeksi Chlamydia Pada Burung Liar: Jurnal Atani Tokyo. https://www.blogger.com/blog/post/edit/7660215345650741072/2765275256831646529

2. Helena S Stokes, Mathew L Berg, Andrew T D Bennet. A Review of Chlamydial Infections in Wild Birds. Pathogens. 2021 Jul 28;10(8):948.

Rahasia Sembuhkan Psittacosis Terbongkar!

 

Doksisiklin untuk Pengobatan Ornithosis dan Psittacosis pada Burung

 

Infeksi Chlamydia psittaci, yang menyebabkan penyakit ornithosis atau psittacosis, masih menjadi tantangan utama dalam praktik kedokteran hewan unggas, khususnya pada burung peliharaan seperti burung beo, finch, merpati, dan ayam pekarangan. Penyakit ini bersifat zoonosis, dapat menimbulkan gangguan pernapasan kronis dan menyebar melalui sekret pernapasan dan feses. Penanganan yang tepat sangat penting untuk melindungi kesehatan burung dan mencegah potensi risiko bagi manusia.

 

Salah satu pendekatan yang telah digunakan secara luas dalam pengobatan infeksi C. psittaci adalah terapi antibiotik menggunakan doksisiklin. Di antara berbagai bentuk sediaan, sediaan injeksi sering kali menjadi pilihan pada kasus infeksi kronis atau ketika burung mengalami penurunan nafsu makan, sehingga sulit diberikan obat melalui pakan atau air minum.

 

Psittavet Suntik, yang mengandung 50 mg/mL doksisiklin hidroklorida, merupakan sediaan injeksi intramuskular yang dirancang khusus untuk pengobatan infeksi bakteri sensitif, termasuk C. psittaci. Keunggulan utama produk ini terletak pada kemampuan absorpsinya yang cepat melalui sirkulasi darah, sehingga dapat segera mencapai jaringan target tempat bakteri berkoloni. Ini menjadikannya pilihan ideal terutama dalam penanganan kasus psittacosis yang memerlukan intervensi sistemik.

 

Penggunaan Psittavet cukup praktis, karena hanya membutuhkan satu kali suntikan per minggu selama enam minggu. Dosis yang dianjurkan adalah 0,1 mL per 100gram berat badan, dengan rotasi titik suntik untuk mencegah iritasi lokal. Sebagai contoh, seekor burung beo dengan berat 400gram memerlukan dosis sekitar 0,4 mL per kali penyuntikan.

 

Pengalaman lapangan menunjukkan bahwa sediaan ini telah digunakan di berbagai kebun binatang dan lembaga konservasi burung, khususnya pada satwa koleksi yang tidak memungkinkan pengobatan oral jangka panjang. Formulasinya dikembangkan oleh dokter hewan unggas berpengalaman, dan meskipun tersedia secara impor, produk ini tetap memperhatikan standar keselamatan dan kualitas yang ketat.

 

Meskipun demikian, perlu diingat bahwa produk ini tidak diperuntukkan bagi hewan yang hasil ternaknya dikonsumsi manusia. Oleh karena itu, penggunaan pada ayam atau unggas konsumsi harus dihindari. Penggunaan oleh paramedik veteriner dan pengelola satwa sebaiknya selalu dilakukan di bawah pengawasan dokter hewan, khususnya untuk memastikan teknik injeksi yang benar serta mencegah efek samping yang tidak diinginkan.

 

Dengan pemahaman yang baik tentang karakteristik penyakit dan cara kerja doksisiklin, diharapkan para praktisi veteriner dapat mengambil keputusan terapi yang tepat, demi menjaga kesehatan burung peliharaan sekaligus menekan risiko penularan zoonosis ke manusia.

Vaksin DNA Plasmid C. psittaci

 

Imunitas Protektif terhadap Infeksi Paru-paru Chlamydia psittaci yang Diinduksi dengan Vaksin Plasmid DNA Membawa Gen CPSIT_p7 Menghambat Penyebaran pada Tikus BALB/c

 

ABSTRAK

Chlamydia psittaci (C. psittaci), patogen zoonotik, merupakan ancaman potensial terhadap keamanan kesehatan masyarakat dan perkembangan peternakan. Langkah pencegahan berbasis vaksin menunjukkan prospek yang menjanjikan dalam penanganan penyakit menular. Vaksin DNA, dengan berbagai keunggulan, telah menjadi salah satu strategi kandidat utama untuk mencegah dan mengendalikan infeksi Chlamydia. Studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa protein CPSIT_p7 adalah kandidat efektif untuk vaksin melawan C. psittaci. Oleh karena itu, penelitian ini mengevaluasi imunitas protektif dari pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 terhadap infeksi C. psittaci pada tikus BALB/c. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 mampu menginduksi respons imun humoral dan seluler yang kuat. Kadar IFN-γ dan IL-6 pada paru-paru tikus yang diimunisasi dengan pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan terinfeksi C. psittaci menurun secara signifikan. Selain itu, vaksin pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 mengurangi lesi patologis paru-paru dan menurunkan jumlah bakteri C. psittaci di paru-paru tikus yang terinfeksi. Perlu dicatat bahwa pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 menekan penyebaran C. psittaci pada tikus BALB/c. Singkatnya, hasil ini menunjukkan bahwa vaksin DNA pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 memiliki imunogenisitas dan efektivitas perlindungan imun yang baik terhadap infeksi C. psittaci, khususnya infeksi paru-paru, dan memberikan pengalaman praktis serta wawasan penting untuk pengembangan vaksin DNA melawan infeksi Chlamydia.

 

1. PENDAHULUAN

Penyakit yang disebabkan oleh Chlamydia tersebar luas pada hewan dan manusia. Dalam kondisi tertentu, Chlamydia dapat menular ke hewan atau manusia. Selain itu, infeksi silang antar inang juga dapat terjadi, menyebabkan dampak serius pada kesehatan masyarakat, pertanian, dan peternakan [1,2]. Vaksin yang aktif dan efektif adalah solusi terbaik untuk mencegah penyebaran luas penyakit Chlamydia [3]. Penelitian vaksin Chlamydia telah berlangsung selama ratusan tahun. Dalam beberapa dekade terakhir, pengembangan telah berkembang secara signifikan dari vaksin bakteri utuh menjadi vaksin subunit [4,5]. Sebagai jenis vaksin Chlamydia yang berkembang selama dua dekade terakhir, vaksin DNA memiliki keunggulan dalam hal keamanan dan kemudahan, serta dapat merangsang ekspresi antigen secara in vivo [6].

 

Urutan nukleotida antigen vaksin eksogen, terutama antigen vaksin subunit, saat ini dimasukkan ke dalam plasmid vektor ekspresi eukariotik yang mengandung promoter sel eukariotik yang kuat untuk menginduksi ekspresi antigen terkait [6,7]. Penelitian tentang vaksin DNA Chlamydia dimulai pada tahun 1997 [8], dengan target utama gen ompA, Pgp3, dan HSP60 [9–13]. Zhang et al. mengonstruksi plasmid ekspresi eukariotik MOMP/pcDNA3.1 dan menemukan bahwa vaksin DNA-MOMP dapat meningkatkan perlindungan terhadap infeksi Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) pada tikus yang diimunisasi dengan antigen subunit [14]. Temuan ini juga memberikan ide baru untuk pengembangan vaksin DNA Chlamydia di masa depan.

 

Vaksin berbasis plasmid Chlamydia juga mengikuti tren pengembangan vaksin yang tersedia, terutama mencakup vaksin hidup yang dilemahkan, vaksin rekombinan subunit, dan vaksin DNA [15]. Strain yang kekurangan plasmid biasanya digunakan sebagai vaksin hidup yang dilemahkan karena toksisitasnya rendah sebagai vaksin subunit dengan imunogenisitas yang baik [16]. Protein plasmid Pgp3 dan Pgp4 telah banyak dilaporkan dalam eksperimen anti-infeksi C. trachomatis dan Chlamydia muridarum (C. muridarum) [17]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa protein plasmid C. psittaci CPSIT_p7 dan CPSIT_p8 memiliki imunogenisitas yang baik. Antigen vaksin peptida CPSIT_p7 telah dikonstruksi lebih lanjut, dan eksperimen pada hewan menunjukkan perlindungan yang baik terhadap infeksi [18,19].

 

Donati et al. [20] mengonstruksi vektor eukariotik pCMV-KA-Pgp3 dan kemudian mengimunisasi tikus C3H/HeN untuk mengevaluasi efek perlindungan terhadap infeksi vagina C. trachomatis. Vaksin DNA menghambat infeksi C. trachomatis dan penyebaran Chlamydia dari saluran genital bawah ke atas. Tikus yang diinokulasi hanya dengan pembawa kosong tidak memiliki efek perlindungan serupa. Semua tikus yang divaksinasi DNA tetap resisten terhadap infeksi ulang Chlamydia. Li et al. [21] juga menemukan bahwa vaksin DNA yang menargetkan gen Pgp3 dapat menghambat infeksi menaik C. trachomatis pada tikus setelah imunisasi.

 

Namun, belum banyak laporan tentang vaksin DNA C. psittaci Pgp3. Protein Pgp3, sebagai salah satu faktor virulensi Chlamydia, memiliki imunogenisitas yang baik dan merupakan antigen imun yang unggul. Perlindungan imun yang baik telah dikonfirmasi dalam eksperimen hewan [17,22]. Berdasarkan studi sebelumnya, kami memanfaatkan Pgp3 untuk merancang vaksin DNA untuk C. psittaci.

 

Dalam studi ini, pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 pertama kali dikonstruksi. Imunogenisitas dan efek perlindungan imun dari suntikan intramuskular dengan pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 terhadap infeksi intranasal C. psittaci pada tikus BALB/c dievaluasi. Penelitian ini juga mengevaluasi apakah vaksin DNA dapat menghambat kemampuan C. psittaci untuk menyebar ke berbagai jaringan dan organ. Studi ini diharapkan memberikan dasar eksperimental untuk pencegahan dan pengobatan vaksin DNA anti-infeksi C. psittaci.

 

2. HASIL

 

2.1. Plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 Berhasil Dikonstruksi dan Mengekspresikan Protein CPSIT_p7 dalam Sel HeLa

Secara singkat, metode konstruksi plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 adalah dengan memasukkan gen target CPSIT_p7 (795 bp) ke dalam vektor kosong pcDNA3.1(+) yang telah dicerna menggunakan enzim restriksi BamHI dan XhoI (Gambar 1A). Dengan menggunakan sepasang primer spesifik yang sesuai, DNA genomik C. psittaci 6BC dan DNA yang diekstraksi dari E. coli JM 109 yang mengandung plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 sebagai template, kami melakukan PCR untuk mengamplifikasi gen target. Gen CPSIT_p7 (795 bp) terdeteksi pada elektroforesis gel agarosa 1,5% dari produk amplifikasi PCR (Gambar 1B,C).

 

Untuk menilai fungsi plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7, kami mengidentifikasi ekspresi protein CPSIT_p7 dalam sel HeLa menggunakan Western blot dengan antibodi primer kelinci anti-C. psittaci dan antibodi sekunder IgG kambing berlabel HRP anti-kelinci. Hasilnya menunjukkan bahwa terdapat protein dengan berat molekul 28 kDa baik pada kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 maupun kelompok protein rekombinan CPSIT_p7, sementara kelompok vektor kosong pcDNA3.1(+) dan kelompok PBS tidak menunjukkan zona hibridisasi pada posisi yang sesuai (Gambar 1D). Hasil Western blot mengonfirmasi bahwa plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dapat mengekspresikan protein CPSIT_p7 dalam sel eukariotik.

 

Gambar 1. Diagram yang menunjukkan struktur plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 serta identifikasi konstruksi dan fungsinya melalui amplifikasi PCR dan Western blot.

(A) Diagram struktur plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7. (B) Amplifikasi PCR gen CPSIT_p7. Gen CPSIT_p7 (795 bp) dan penanda DNA 2000 bp terlihat masing-masing pada jalur satu dan M. (C) Amplifikasi PCR bakteri dari pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7. Penanda DNA 2000 bp dimuat pada jalur M, dan fragmen DNA pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 (795 bp) terlihat pada jalur satu hingga lima. (D) Analisis Western blot menunjukkan ekspresi protein CPSIT_p7 dalam sel HeLa. Plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 ditransfeksi ke dalam sel HeLa menggunakan Lipofectamine 3000. Setelah 48 jam, sel-sel ini dilisis dan direaksikan secara imunologis dengan antibodi kelinci anti-C. psittaci. Jalur satu, sel HeLa yang tidak ditransfeksi (PBS); jalur dua, protein rekombinan CPSIT_p7; jalur tiga, sel HeLa yang ditransfeksi dengan vektor kosong pcDNA3.1(+); jalur empat, sel HeLa yang ditransfeksi dengan plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 (1).

 

2.2. Vaksin pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 Menginduksi Respon Antibodi Spesifik yang Kuat pada Tikus BALB/c

Dengan menggunakan uji ELISA, kami mendeteksi titer antibodi IgG spesifik terhadap protein rekombinan CPSIT_p7 yang diinduksi pada berbagai waktu setelah imunisasi masing-masing dengan pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7, vektor pcDNA3.1(+), protein rekombinan CPSIT_p7, atau PBS. Gambar 2 menunjukkan bahwa tingkat antibodi IgG spesifik pada tikus kelompok pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 meningkat secara signifikan pada minggu kedua. Titer tertinggi muncul pada minggu keenam, sementara tikus pada kelompok protein rekombinan CPSIT_p7 menginduksi tingkat titer yang lebih tinggi. Sebaliknya, hanya sedikit antibodi IgG spesifik yang dapat ditemukan pada kelompok vektor pcDNA3.1(+) dan PBS.

 

Gambar 2. ELISA Menunjukkan Tingkat Antibodi pada Tikus yang Diimunisasi dengan Berbagai Jenis Vaksin

Tikus diimunisasi secara intramuskular sebanyak tiga kali dengan interval dua minggu menggunakan masing-masing 100 μg plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7, 100 μg vektor pcDNA3.1(+), 30 μg protein rekombinan CPSIT_p7, atau 100 μL PBS. Sampel serum dikumpulkan, dan tingkat IgG serum dianalisis menggunakan ELISA. Rata-rata dan standar deviasi tingkat antibodi dihitung dari lima tikus. *** p < 0,001.

 

2.3. Vaksinasi dengan Plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 Secara Efektif Menurunkan Beban C. psittaci di Paru-Paru Tikus BALB/c

 

Untuk mengevaluasi efektivitas proteksi imun dari vaksin, supernatan homogenat paru-paru dari semua tikus dikumpulkan pada hari ke-10 setelah tantangan intranasal dengan 5 × 10⁵ IFU C. psittaci. Beban C. psittaci ditentukan menggunakan IFA. Inklusi diamati melalui uji mikroskop fluoresensi (Gambar 3A), dan jumlah inklusi dihitung berdasarkan area dan pengenceran, lalu dinyatakan sebagai IFU (Gambar 3B). Jumlah inklusi di paru-paru kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 ((5,93 ± 2,05) × 10⁵ IFU) serta kelompok protein CPSIT_p7 ((5,43 ± 1,35) × 10⁵ IFU) secara signifikan lebih rendah dibandingkan kelompok vektor pcDNA3.1(+) ((19,30 ± 7,89) × 10⁵ IFU) dan kelompok PBS ((21,40 ± 6,89) × 10⁵ IFU). Namun, tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan kelompok protein CPSIT_p7.

 

Gambar 3. Beban C. psittaci di paru-paru tikus yang disuntik dengan berbagai vaksin setelah tantangan C. psittaci.

Supernatan homogenat paru-paru dari tikus yang diimunisasi dikumpulkan 10 hari setelah tantangan intranasal dengan 5 × 10⁵ IFU C. psittaci. (A) Gambar imunofluoresen sel HeLa yang diinkubasi dengan supernatan homogenat paru-paru. Untuk memvisualisasikan inklusi C. psittaci, sampel diwarnai dengan sera anti-C. psittaci kelinci (hijau). (B) Jumlah inklusi yang dinyatakan sebagai IFU. Setiap batang menunjukkan rata-rata ± deviasi standar titer C. psittaci (IFU/paru-paru) dalam homogenat paru-paru dari enam tikus per kelompok berdasarkan tiga titik data independen. p < 0,05.

 

2.4. Vaksin pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 Mengatur Produksi IL-6 dan IFN-γ pada Tikus BALB/c

Berbagai sitokin penting dalam mengatur respons imun dan inflamasi inang selama infeksi C. psittaci. Untuk mengevaluasi regulasi vaksinasi terkait sitokin, kami mengumpulkan supernatan homogenat paru-paru 10 hari setelah tantangan intranasal, untuk mengukur tingkat IL-6 dan IFN-γ menggunakan ELISA. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4A, B, kandungan IL-6 dan IFN-γ di paru-paru kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan kelompok protein CPSIT_p7 keduanya secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok vektor pcDNA3.1(+) dan kelompok PBS. Namun, tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan kelompok protein CPSIT_p7.

 

Gambar 4. Tingkat sitokin di paru-paru dari tikus yang terinfeksi C. psittaci pada masing-masing kelompok. Supernatan homogenat paru-paru dikumpulkan 10 hari setelah tantangan intranasal dengan 5 × 10^5 IFU C. psittaci. Produksi IL-6 (A) dan IFN-γ (B) dalam supernatan paru-paru dideteksi dengan ELISA. Nilai yang ditunjukkan adalah rata-rata ± deviasi standar dari lima paru-paru tikus dalam tiga percobaan independen. * p < 0,05. ** p < 0,01.

 

2.5. Vaksin pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 Mengurangi Lesi Patologis Paru-Paru dan Menurunkan Beban C. psittaci di Paru-Paru Tikus BALB/c yang Terinfeksi

C. psittaci terutama menyebabkan penyakit sistem pernapasan dan patologi inflamasi. Pewarnaan imunohistokimia S–P pada jaringan paru-paru pada hari ke-10 setelah infeksi diamati dengan analisis H&E dan IHC untuk evaluasi lebih lanjut mengenai efektivitas perlindungan imun vaksin. Hasilnya menunjukkan bahwa baik kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 maupun kelompok protein CPSIT_p7 pada tikus mempertahankan integritas relatif dari struktur jaringan paru-paru, meskipun beberapa struktur alveolus menunjukkan sedikit pembengkakan paru dan peradangan yang lebih ringan. Sebaliknya, beberapa lesi berat muncul pada jaringan paru-paru kelompok vektor pcDNA3.1(+) dan kelompok PBS, termasuk penebalan septa alveolar dan interstitium, kongesti alveolar, serta infiltrasi sel inflamasi dalam jumlah besar, seperti yang terlihat pada observasi mikroskop cahaya (Gambar 5A). Selanjutnya, imunisasi dengan vaksin pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan vaksin protein CPSIT_p7 mengurangi beban C. psittaci di paru-paru dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif dan kelompok kosong (Gambar 5B).

 

Gambar 5. Patologi inflamasi dan imunohistokimia S–P pada jaringan paru-paru yang terinfeksi C. psittaci.

(A) Hasil representatif pewarnaan hematoksilin–eosin (H&E) pada paru-paru tikus kontrol dan yang diimunisasi 10 hari setelah infeksi dengan C. psittaci.

(B) Foto ilustratif imunohistokimia pada potongan jaringan dari berbagai kelompok tikus yang terinfeksi. Kit imunohistokimia Streptavidin–Peroksidase (S–P) dengan antibodi pertama anti-C. psittaci 6BC dari kelinci digunakan untuk mendeteksi inklusi C. psittaci. Granula coklat mewakili infiltrasi inklusi C. psittaci.

 

2.6. Vaksin pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 Menekan Penyebaran C. psittaci pada Tikus BALB/c

Untuk memahami lebih baik penyebaran C. psittaci pada tikus yang terinfeksi setelah vaksinasi, kami mendeteksi muatan C. psittaci pada jantung, hati, limpa, ginjal, dan otak tikus yang terinfeksi melalui RT-PCR. Kami menemukan bahwa muatan pada jantung, hati, dan ginjal tikus pada kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan kelompok protein CPSIT_p7 secara signifikan berkurang dibandingkan dengan kelompok vektor pcDNA3.1(+) dan kelompok PBS (Gambar 6A, B, D). Secara signifikan, kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 memiliki muatan yang lebih rendah pada hati dibandingkan dengan kelompok protein CPSIT_p7 (Gambar 7B). Tidak ada perbedaan signifikan pada muatan di limpa di semua kelompok (Gambar 6C). Hasil dari uji PCR dan imunohistokimia adalah sama, bahwa muatan di otak tikus pada kelompok plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan kelompok PBS keduanya rendah (Gambar 6E, F). Selain itu, kelompok PBS memiliki muatan yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7, namun tidak ada perbedaan signifikan secara statistik antara keduanya (Gambar 6F).

 

Gambar 6. Deteksi muatan C. psittaci pada berbagai organ tikus yang terinfeksi. PCR kuantitatif waktu nyata digunakan untuk mengukur konsentrasi DNA 16s rRNA di (A) jantung, (B) hati, (C) limpa, (D) ginjal, dan (F) otak tikus pada setiap kelompok. Hasilnya dinormalisasi terhadap konsentrasi DNA tikus menggunakan uji Mann–Whitney. Titik-titik menunjukkan tiga sampel yang diekstraksi secara terpisah dari setiap tikus. Garis horizontal mewakili nilai rata-rata (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, NS = tidak signifikan). (E) Foto ilustratif imunohistokimia dari otak tikus yang terinfeksi setelah vaksinasi.

 

Gambar 7. Garis waktu imunisasi dan keseluruhan pekerjaan in vivo hingga titik terminal pada hari ke-52.

 

3. DISKUSI

Penelitian vaksin telah menjadi cara yang sangat efektif untuk mencegah dan mengobati infeksi serta penularan Chlamydia. Vaksin DNA sejalan dengan tren perkembangan penelitian vaksin klamidia karena keamanannya, kemudahan operasional, dan keunggulan uniknya dalam meniru bentuk ekspresi antigen di dalam tubuh [6,7]. Penelitian ini membangun vektor ekspresi eukariotik plasmid protein C. psittaci pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7, yang dapat diekspresikan secara stabil di sel eukariotik. Penyuntikan intramuskular pada tikus menghasilkan tingkat antibodi spesifik terhadap protein plasmid yang tinggi. Percobaan perlindungan anti-infeksi menunjukkan bahwa pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dapat secara efektif mempercepat penghapusan Chlamydia di lokasi infeksi, mengurangi faktor inflamasi, dan menghambat penyebaran C. psittaci ke jaringan dan organ distal. Hasil ini menunjukkan bahwa pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dapat menghasilkan perlindungan kekebalan terhadap infeksi.

 

Karakteristik autoimunitas dari protein plasmid Pgp3 dan perannya dalam patogenesis klamidia menentukan bahwa vaksin DNA berbasis protein juga dapat digunakan sebagai kandidat antigen untuk penelitian vaksin terhadap infeksi klamidia [23,24,25]. Kami membangun pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7. Urutan KOZAK, GCCACC, dimasukkan setelah situs pemotongan enzim restriksi BamHI untuk meningkatkan ekspresi vektor eukariotik. Setelah beberapa imunisasi, vektor eukariotik dapat memicu produksi antibodi spesifik, tetapi tingkat antibodi tersebut jauh lebih rendah dibandingkan dengan antigen subunit CPSIT_p7. Meskipun urutan KOZAK telah dimasukkan, imunogenisitas dan efek imunologisnya berbeda. Meskipun tingkat antibodi yang diinduksi berbeda, percobaan anti-infeksi berikut menunjukkan efek yang berlawanan. pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dapat menginduksi perlindungan kekebalan terhadap infeksi yang setara dengan antigen subunit, yang secara efektif mempercepat penghapusan Chlamydia di paru-paru dan menghambat penyebaran C. psittaci ke jaringan dan organ distal. Meskipun tingkat antibodi spesifik yang diinduksi oleh vektor eukariotik rendah, vektor ini mungkin mengandung banyak antibodi pelindung. Selain itu, adjuvan Freund digunakan untuk meningkatkan imunogenisitas antigen protein CPSIT_p7, yang juga sangat meningkatkan imunogenisitas dan efek imunologis antigen protein, yang konsisten dengan hasil penelitian sebelumnya [12,13]. Namun, kami masih perlu mempelajari cara meningkatkan imunogenisitas dan efek vaksin DNA dalam percobaan berikutnya, termasuk meningkatkan ekspresi gen target oleh plasmid, meningkatkan efek pengiriman plasmid, dan menggunakan adjuvan [6]. Saat ini kami sedang melakukan percobaan sintesis urutan basa CpG ODN1826 sebagai adjuvan; yang dicampur dengan vektor eukariotik, diberikan untuk mengimunisasi tikus, dan menghasilkan hasil yang baik.

 

Sayangnya, kami tidak mempelajari respon imun seluler yang diinduksi oleh imunisasi pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7. Deteksi vektor eukariotik melalui tingkat antibodi dapat menginduksi respon imun humoral yang kuat. Kami mengisolasi limpa tikus untuk analisis periodik respon imun seluler. Kami menduga bahwa sel-sel limpa berada dalam keadaan non-pertumbuhan karena waktu perlakuan yang lama dengan larutan lisis sel darah merah. Liang et al. juga gagal mengevaluasi respon imun seluler yang diinduksi oleh antigen protein [26]. Namun, studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa CD4+ T sel terbatas pada kompleks histokompatibilitas utama kelas II (MHC-II) diperlukan untuk kekebalan perlindungan oleh vaksin, yang meningkatkan penghapusan infeksi klamidia dengan menghasilkan IFN-γ [27,28]. Setelah vaksinasi, beberapa limfosit Th1 sirkulasi menjadi sel memori jaringan mukosa yang dengan cepat mengurangi muatan klamidia setelah reinfeksi [27]. Untuk perlindungan optimal, vaksin klamidia harus menginduksi sel CD4+ T yang bias terhadap sitokin Th1, terutama IFN-γ, dan respon humoral [17,29,30]. Penelitian kami sebelumnya juga menemukan bahwa baik antigen subunit maupun antigen polipeptida dapat menginduksi sekresi sitokin yang bias terhadap Th1 dan menghasilkan efek pelindung [19,31]. Selain itu, kami juga mendeteksi perbedaan signifikan dalam penurunan kadar IFN-γ di jaringan paru-paru setelah infeksi C. psittaci. Kami berhipotesis bahwa vektor eukariotik pcDNA3/CPSIT_p7 mungkin menginduksi respon imun seluler yang bias terhadap Th1, yang perlu diteliti lebih lanjut.

 

Evaluasi jaringan paru-paru tikus yang terinfeksi C. psittaci setelah imunisasi dapat secara efektif mempercepat penghapusan C. psittaci di lokasi suntikan. Antigen subunit CPSIT_p7 telah terbukti memiliki efek pelindung terhadap penyakit karena imunogenisitas yang sangat baik dan kombinasi dengan adjuvan [19]. Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 menghasilkan potensi imun yang setara dengan antigen subunit, dengan pengurangan muatan klamidia di lokasi infeksi, lesi yang lebih ringan, dan kadar faktor inflamasi yang lebih rendah. Namun, kadar Chlamydia dan IFN-γ di jaringan paru-paru berbeda dengan yang ditemukan dalam penelitian sebelumnya. Kami menduga ada dua alasan yang mungkin: pertama, jumlah passage C. psittaci yang berbeda dan latar belakang genetik serta kultur yang berbeda dari setiap kelompok tikus yang terinfeksi menyebabkan perbedaan ini; kedua, perbedaan ini disebabkan oleh karakteristik antigen imun itu sendiri, spesifisitas antigen DNA dan antigen subunit itu sendiri, yang mungkin diekspresikan dalam bentuk yang berbeda di dalam tubuh. Telah disarankan bahwa antibodi terhadap protein plasmid hanya memberikan perlindungan sebagian selama infeksi C. psittaci [19,32], dan hasil kami konsisten dengan pemikiran tersebut.

 

C. psittaci adalah patogen yang sangat menular dan patogenik yang dapat ditularkan dari burung yang sakit ke manusia melalui saluran pernapasan. Dengan menginvasi organ atau jaringan distal melalui darah, infeksi C. psittaci dapat menyebabkan reaksi sistemik, termasuk pada paru-paru, jantung, hati, limpa, ginjal, dan organ serta jaringan lainnya, yang dapat mengakibatkan penyakit sistemik seperti pneumonia, miokarditis, hepatitis, nefritis, dan bahkan ensefalitis serta kematian jika tidak diobati tepat waktu [33]. Oleh karena itu, kami lebih lanjut mengevaluasi apakah vaksin DNA dapat menghambat kemampuan C. psittaci untuk menyebar ke berbagai jaringan dan organ. Pgp3 adalah faktor virulensi, dan vaksin DNA terkait juga memainkan peran penting [20]. Penelitian kami menemukan bahwa pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dapat memperbaiki tingkat lesi yang disebabkan oleh C. psittaci. Vaksin ini dapat mengurangi beban C. psittaci di setiap jaringan, menghambat penyebaran C. psittaci ke organ distal, dan secara efektif memperkuat pembersihan C. psittaci. Penelitian sebelumnya juga menunjukkan bahwa infeksi C. psittaci pada tikus menyebabkan gejala infeksi klamidia di berbagai jaringan dan organ di seluruh tubuh, terutama di paru-paru. Donati [20] dan Li et al. [21] juga menemukan bahwa vaksin DNA yang menargetkan gen Pgp3 dapat menghambat infeksi naik C. trachomatis setelah imunisasi tikus, secara signifikan mengurangi beban klamidia pada tikus yang divaksinasi dan mempercepat pembersihan infeksi. Penelitian kami menemukan hasil yang sama. Perlu dicatat bahwa limpa, organ imun perifer yang penting, memainkan peran penting dalam respons imun tubuh terhadap infeksi patogen. Ada berbagai sel imun yang mendukung penangkapan dan pengendalian patogen di limpa, terutama makrofag [34,35,36]. Jika eliminasi intraseluler gagal, Chlamydia dapat bertahan dalam makrofag. Dengan demikian, Chlamydia dapat disebarkan dari lokasi infeksi ke visera atau situs jauh melalui darah dan sirkulasi limfatik dalam makrofag, yang dianggap sebagai pembawa pengantar [37,38,39]. Namun, ada penghalang anatomi untuk infeksi di sistem saraf pusat, seperti penghalang darah-otak, yang dapat membatasi masuknya patogen ke otak [40]. Diperkirakan bahwa beban infeksi yang lebih rendah di jaringan otak disebabkan oleh penghalang darah-otak. Oleh karena itu, beban infeksi lebih sedikit di limpa dan otak dibandingkan dengan jaringan lainnya.

 

Selain itu, infeksi C. psittaci dapat menyebabkan ensefalitis [1]. Penelitian kami tentang perilaku tikus yang terinfeksi menemukan bahwa beberapa individu dalam kelompok kontrol menunjukkan fenomena manik setelah infeksi. Aktivitas mereka sangat meningkat, kadang-kadang menggigit diri mereka sendiri dan pasangan mereka. Namun, tidak ada tikus pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 yang menunjukkan fenomena terkait. Perbedaan beban C. psittaci di jaringan otak mungkin menyebabkan perbedaan perilaku ini. Oleh karena itu, kami mencoba mempelajari jaringan otak tikus dalam kelompok PBS dan kelompok pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7. Hasil imunohistokimia menunjukkan jumlah kecil beban C. psittaci di jaringan otak setiap kelompok. Hasil RT-PCR menunjukkan bahwa beban C. psittaci di jaringan otak tikus yang diimunisasi dengan PBS mungkin lebih tinggi, tetapi perbedaan statistiknya tidak signifikan. Kami berspekulasi bahwa C. psittaci sulit melewati penghalang darah-otak, dan Chlamydia sebagian besar telah dibersihkan ketika C. psittaci menyebar ke jaringan otak. Selain itu, infeksi jarak pendek C. psittaci juga dapat membatasi difusi. Efek inhibisi pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 terhadap difusi C. psittaci masih perlu dievaluasi lebih lanjut.

 

Penelitian sebelumnya juga menemukan bahwa baik vaksin subunit dengan antigen atau antigen polipeptida berbasis protein CPSIT_p7 dapat menghasilkan perlindungan imun yang baik terhadap infeksi klamidia. Namun, ada tantangan dalam ekspresi dan pemurnian vaksin subunit terkait protein target. Dalam penelitian kami, kami menggunakan vaksin DNA pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 sebagai kelompok percobaan dan vaksin subunit protein rekombinan CPSIT_p7 sebagai kelompok kontrol positif. Beberapa hasil menunjukkan bahwa kedua vaksin ini menghasilkan perlindungan imun yang serupa terhadap infeksi C. psittaci. Meskipun vaksin DNA ini memiliki potensi besar, masih perlu mengatasi serangkaian keterbatasan dan tantangan. Imunogenisitas rendah adalah kelemahan potensial; namun, berbagai jenis adjuvan termasuk sitokin, faktor koloni stimulasi granulosit-makrofag, oligonukleotida CpG, dll., telah terbukti membantu meningkatkan imunogenisitas vaksin DNA [41,42,43]. Dibandingkan dengan vektor virus, sistem pengantaran vaksin DNA lebih aman, tetapi risiko mutagenesis penyisipan masih ada [44,45,46]. Sampai saat ini, sulit untuk mengevaluasi keamanan vaksin DNA dengan menentukan risiko mutagenesis penyisipan secara akurat. Mengoptimalkan instrumen dan teknik deteksi gen, seperti qPCR, qRT-PCR, atau uji berbasis fluoresensi, kemungkinan besar akan sangat berguna untuk penilaian keamanan vaksin DNA [47]. Studi lebih lanjut tentang keamanan vaksin DNA sangat penting dan krusial sebelum digunakan pada manusia.

 

Kesimpulannya, evaluasi terhadap kekebalan perlindungan vaksinasi pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 pada tikus menunjukkan bahwa vaksin DNA pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 memiliki imunogenisitas yang baik dan efektivitas perlindungan kekebalan yang efektif terhadap infeksi C. psittaci pada tikus BALB/c, serta dapat menekan penyebaran C. psittaci. Penelitian kami membuka jalan yang menjanjikan untuk pengembangan vaksin DNA anti-Chlamydia yang efektif dan memberikan kontribusi bagi pengembangan vaksin DNA terhadap infeksi klamidia dan patogen intraseluler lainnya.

 

4.  BAHAN DAN METODE

4.1. Konstruksi dan Identifikasi Plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7

Berdasarkan gen CPSIT_p7 yang dilaporkan oleh basis data GenBank (No. CP002550.1), kami merancang primer forward spesifik (5′-CGCGGATCCATGGGTAATTCTGGTTTTTAC-3′) dan primer reverse (5′-CCGCTCGAGTTAACCATTTGTTTGTTGTTTT-3′). Gen CPSIT_p7 sepanjang penuh diperoleh dengan amplifikasi PCR dari DNA genom C. psittaci 6BC (NCBI Reference Sequence: NC_017288) dan dimasukkan ke dalam plasmid pcDNA3.1(+) menggunakan situs pembatas BamHI dan XhoI. Setelah verifikasi melalui amplifikasi PCR, elektroforesis gel agarosa, dan penentuan urutan DNA, plasmid rekombinan pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 ditransformasikan ke dalam E. coli BL21 (DE3). Gen CPSIT_p7 yang teramplifikasi dalam E. coli BL21 diekstraksi dan dimurnikan menggunakan Endo-Free Plasmid Maxi Kit (Omega, Norcross, GA, USA), kemudian disimpan pada suhu 4 °C sebelum digunakan.

 

4.2. Transfeksi

Sel HeLa disemai pada kepadatan 1 × 10^6 sel/well pada pelat kultur 6-well dengan DMEM yang dilengkapi dengan 10% serum fetal sapi (Gibco, Grand Island, NY, USA), dan dikultur pada 37 °C dalam keberadaan 5% CO2 sampai mencapai konfluensi 80–90%. Langkah-langkah transfeksi dilakukan sesuai dengan petunjuk reagen Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Secara singkat, campuran lipofectamine 3000/pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan lipofectamine 3000/pcDNA3.1(+) dengan rasio volume/berat 10 μL/5 μg ditambahkan ke dalam sumur yang sesuai. Vektor pcDNA3.1(+) kosong digunakan sebagai kontrol negatif, dan PBS sebagai kontrol kosong. Ekspresi protein dianalisis 48 jam setelah transfeksi.

 

4.3. Analisis Western Blot

Setelah 48 jam, sel HeLa yang ditransfeksi dengan pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7, vektor pcDNA3.1(+) kosong, dan PBS dianalisis dengan teknik Western blot. Sampel protein diambil untuk SDS-PAGE 12% dan dipindahkan ke membran poliviniliden fluorida (PVDF). Membran direndam dalam larutan susu skim 5% selama 2 jam pada 37 °C, kemudian diinokulasi dengan dilusi 1:500 serum anti-C. psittaci kelinci (hadiah dari Zhong G, University of Texas Health Science Center at San Antonio, TX, USA) pada suhu 4 °C semalam. Membran yang telah dicuci diinokulasi dengan HRP-konjugat anti-IgG kelinci (Abcam, MA, USA) dengan dilusi 1:2000 selama 1 jam pada 37 °C. Protein divisualisasikan menggunakan Omni-ECL™Pico Light Chemiluminescence Kit (Epizyme Biotech, Shanghai, China).

 

4.4. Perawatan dan Imunisasi Tikus

Semua imunisasi dan penelitian dilakukan pada tikus betina BALB/c berusia enam minggu yang bebas patogen khusus (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Changsha, China). Hewan-hewan tersebut dipelihara dalam kondisi bebas patogen khusus pada suhu 26 °C, diberi makanan dan air steril satu kali sehari, dan diakomodasi selama satu minggu sebelum eksperimen. Empat puluh tikus dibagi secara acak menjadi empat kelompok (sepuluh tikus per kelompok): kelompok plasmid ekspresi eukariotik pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 (eksperimental), kelompok vektor pcDNA3.1(+) kosong (kontrol negatif), kelompok protein rekombinan CPSIT_p7 (kontrol positif), dan kelompok PBS (kontrol kosong). Semua kelompok diimunisasi tiga kali, dengan interval dua minggu antara imunisasi. Setiap tikus di kelompok eksperimen dan kontrol negatif diberi injeksi intramuskular sebanyak 100 μg plasmid pcDNA3.1(+)/CPSIT_p7 dan vektor pcDNA3.1(+) kosong (dilarutkan dalam 100 μL larutan PBS steril), masing-masing. Pada kelompok kontrol positif, setiap tikus diberikan 30 μg protein CPSIT_p7 yang diekspresikan dalam volume setara FA (lengkap untuk injeksi pertama dan tidak lengkap untuk dua injeksi selanjutnya) dalam volume 100 μL. Pada waktu yang sama, kelompok kontrol kosong menerima larutan PBS sebanyak 100 μL. Darah diambil melalui pemotongan ekor sebelum setiap imunisasi. Sampel darah disimpan semalam (4 °C) dan serum dipisahkan kemudian melalui sentrifugasi (4000× g, 20 menit, 4 °C). Serum disiapkan dan disimpan pada −80 °C. Dua minggu setelah imunisasi terakhir, empat tikus per kelompok disembelih untuk evaluasi kekebalan humoral dan kekebalan seluler yang diinduksi oleh vaksin, kemudian tikus sisanya diinokulasi secara intranasal dengan 5 × 10⁵ IFU C. psittaci dan disembelih pada hari ke-10 pasca infeksi, untuk mengevaluasi efektivitas perlindungan imun dari vaksin (Gambar 7).

 

4.5. Analisis ELISA Tingkat Antibodi

Untuk mengevaluasi respons humoral yang diinduksi oleh vaksin, tingkat IgG serum spesifik antigen tikus anti-C. psittaci diperiksa menggunakan uji imunosorben berhubungan enzim (ELISA). Secara singkat, pelat ELISA 96-well dilapisi dengan protein rekombinan CPSIT_p7 (1 μg/well) dalam buffer bikarbonat (0,05 mol/L, pH 9,6) dan diinkubasi semalam pada suhu 4 °C. Setelah dicuci dengan larutan PBS yang mengandung 0,05% Tween 20 (PBST), pelat diblokir dengan buffer pemblokir (PBST yang mengandung 5% susu skim, 200 μL/well) pada suhu 37 °C selama 2 jam. Selanjutnya, sampel serum, seperti yang disebutkan di atas, diencerkan dengan perbandingan 1:200 dalam buffer pemblokir, dan dilusi ganda dilakukan secara berturut-turut. Setelah inkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam dan pencucian, 100 μL konjugat horseradish peroksidase (HRP) kambing anti-IgG tikus yang diencerkan 1:10.000 dalam buffer pemblokir ditambahkan ke setiap sumur selama 1 jam pada suhu 37 °C. Setelah pencucian, setiap sumur diinkubasi dengan 100 μL substrat 3, 3′, 5, 5′-tetrametilbenzidina pada suhu 37 °C selama 15 menit, kemudian volume yang sama dari 2 M H₂SO₄ ditambahkan untuk menghentikan reaksi warna. Akhirnya, absorbansi diukur pada 450 nm.

 

4.6. Persiapan C. psittaci dan Tantangan Intranasal

Strain C. psittaci 6BC (ATCC VR-125) dikembangkan melalui kultur sel HeLa 229 (ATCC CCL-2.1), seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Elementary bodies (EB) dipanen dengan sentrifugasi gradien kepadatan dan disimpan pada suhu −80 °C. Kemudian, jumlah EB dihitung menggunakan uji imunofluoresensensi tidak langsung (IFA), dan titer EB dilaporkan sebagai unit pembentuk inklusi/mL (IFU/mL). Untuk mengevaluasi efikasi perlindungan imun vaksin, tikus yang telah diinokulasi dari setiap kelompok diberi infeksi intranasal dengan 5 × 105 IFU C. psittaci dua minggu setelah imunisasi terakhir (Gambar 1).

 

4.7. Uji Imunofluoresensensi Tidak Langsung

Sel HeLa 229 dibudidayakan pada pelat kultur 24-well dan diinfeksi dengan supernatan homogenat paru. Setelah 48 jam pasca infeksi, sel diperbaiki dengan 4% paraformaldehida, dipermabilkan dengan 0,3% TritonX-100, dan diwarnai dengan antibodi primer dan sekunder untuk memvisualisasikan C. psittaci. Inklusi diamati dengan mikroskop fluoresensi, dan jumlah inklusi dihitung berdasarkan area dan dilusi serta dilaporkan sebagai IFU.

 

4.8. Deteksi Tingkat Sitokin di Paru

Homogenat jaringan paru dari tikus yang terinfeksi C. psittaci dari setiap kelompok dipersiapkan dan disentrifugasi pada 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Produksi sitokin IL-6 dan IFN-γ ditentukan menggunakan kit ELISA yang tersedia secara komersial (eBioscience, San Diego, CA, USA), secara terpisah, sesuai dengan petunjuk dari produsen.

 

4.9. Histopatologi

Jaringan paru yang diisolasi dari tikus setelah euthanasia diperbaiki dengan 4% paraformaldehida, dibenamkan dalam parafin, dipotong secara serial, dan diwarnai dengan hematoxylin–eosin (H&E). Untuk mendeteksi C. psittaci, digunakan UltraSensitive™SP (Rabbit) IHC Kit (Maixin, Fuzhou, China) untuk imunohistokimia streptavidin–peroksidase (S–P). Hasilnya diamati menggunakan mikroskop cahaya.

 

4.10. PCR Kuantitatif

DNA diekstraksi dari jaringan jantung, hati, limpa, ginjal, dan otak menggunakan TIANamp Genomic DNA Kit (TIANGEN BIOTECH, Beijing, China), dan digunakan sebagai template untuk amplifikasi PCR kuantitatif dari urutan 16S rRNA C. psittaci dan urutan β-actin tikus. Primer untuk amplifikasi urutan 16S rRNA C. psittaci adalah: primer maju, 5′-TCCGCAAGGACAGATACACA-3′ dan primer balik, 5′-ACCCAGGCAGTCTCGTTAGA-3′. Primer maju untuk amplifikasi urutan β-actin tikus adalah 5′-CCTTCCTTCTTGGGTATGGA-3′, dan primer balik adalah 5′-ACGGATGTCAACGTCACACT-3′.

 

4.11. Pernyataan Etika

Hewan Tikus betina BALB/c bebas patogen khusus berusia enam minggu diperoleh dari Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd. (Changsha, China, Lisensi Produksi Hewan No. SYXK 2021-0002) dan dipelihara di Pusat Penelitian Eksperimen Hewan di Universitas China Selatan. Semua protokol eksperimen yang melibatkan hewan disetujui oleh Komite Etik dari Pusat Penelitian Eksperimen Hewan di Universitas China Selatan. Operasi pada tikus dilakukan sesuai dengan Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium Nasional.

4.12. Analisis Statistik

Perbedaan statistik antara kelompok untuk beban C. psittaci, titer antibodi, dan tingkat sitokin dianalisis menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) dengan uji Student–Newman–Keuls. Hasil dianggap signifikan secara statistik pada p < 0,05, dan semua analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak SPSS 18.0.

 

REFERENSI

1.Knittler M.R., Sachse K. Chlamydia psittaci: Update on an underestimated zoonotic agent. Pathog. Dis. 2015;73:1–15.

2.Liebler-Tenorio E.M., Lambertz J., Ostermann C., Sachse K., Reinhold P. Regeneration of Pulmonary Tissue in a Calf Model of Fibrinonecrotic Bronchopneumonia Induced by Experimental Infection with Chlamydia Psittaci. Int. J. Mol. Sci. 2020;21:2817.

3.Brunham R.C. Problems with Understanding Chlamydia trachomatis Immunology. J. Infect. Dis. 2022;225:2043–2049.

4.de la Maza L.M., Zhong G., Brunham R.C. Update on Chlamydia trachomatis Vaccinology. Clin. Vaccine Immunol. CVI. 2017;24:e00543-16.

5.Poston T.B., Darville T. Chlamydia trachomatis: Protective Adaptive Responses and Prospects for a Vaccine. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2018;412:217–237.

6.Li L., Saade F., Petrovsky N. The future of human DNA vaccines. J. Biotechnol. 2012;162:171–182.

7.Rajcani J., Mosko T., Rezuchova I. Current developments in viral DNA vaccines: Shall they solve the unsolved? Rev. Med. Virol. 2005;15:303–325.

8.Zhang D., Yang X., Berry J., Shen C., McClarty G., Brunham R.C. DNA vaccination with the major outer-membrane protein gene induces acquired immunity to Chlamydia trachomatis (mouse pneumonitis) infection. J. Infect. Dis. 1997;176:1035–1040.

9.Verminnen K., Loock M.V., Cox E., Goddeeris B.M., Vanrompay D. Protection of turkeys against Chlamydophila psittaci challenge by DNA and rMOMP vaccination and evaluation of the immunomodulating effect of 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D(3) Vaccine. 2005;23:4509–4516.

10.Svanholm C., Bandholtz L., Castanos-Velez E., Wigzell H., Rottenberg M.E. Protective DNA immunization against Chlamydia pneumoniae. Scand. J. Immunol. 2000;51:345–353.

11.Hechard C., Grepinet O., Rodolakis A. Proteic boost enhances humoral response induced by DNA vaccination with the dnaK gene of Chlamydophila abortus but fails to protect pregnant mice against a virulence challenge. Vet. Res. 2003;34:119–125.

12.Schautteet K., De Clercq E., Jonsson Y., Lagae S., Chiers K., Cox E., Vanrompay D. Protection of pigs against genital Chlamydia trachomatis challenge by parenteral or mucosal DNA immunization. Vaccine. 2012;30:2869–2881.

13.Ou C., Tian D., Ling Y., Pan Q., He Q., Eko F.O., He C. Evaluation of an ompA-based phage-mediated DNA vaccine against Chlamydia abortus in piglets. Int. Immunopharmacol. 2013;16:505–510.

14.Clarridge J.E., 3rd Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:840–862.

15.Zhong G. Chlamydial Plasmid-Dependent Pathogenicity. Trends Microbiol. 2017;25:141–152.

16.Kari L., Whitmire W.M., Olivares-Zavaleta N., Goheen M.M., Taylor L.D., Carlson J.H., Sturdevant G.L., Lu C., Bakios L.E., Randall L.B., et al. A live-attenuated chlamydial vaccine protects against trachoma in nonhuman primates. J. Exp. Med. 2011;208:2217–2223.

17.Mosolygo T., Szabo A.M., Balogh E.P., Faludi I., Virok D.P., Endresz V., Samu A., Krenacs T., Burian K. Protection promoted by pGP3 or pGP4 against Chlamydia muridarum is mediated by CD4(+) cells in C57BL/6N mice. Vaccine. 2014;32:5228–5233.

18.Wang C., Li Y., Wang S., Yan X., Xiao J., Chen Y., Zheng K., Tan Y., Yu J., Lu C., et al. Evaluation of a tandem Chlamydia psittaci Pgp3 multiepitope peptide vaccine against a pulmonary chlamydial challenge in mice. Microb. Pathog. 2020;147:104256.

19.Tan Y., Li Y., Zhang Y., Yu J., Wen Y., Wang C., Xu M., Chen Q., Lu C., Wu Y. Immunization with Chlamydia psittaci plasmid-encoded protein CPSIT_p7 induces partial protective immunity against chlamydia lung infection in mice. Immunol. Res. 2018;66:471–479.

20.Donati M., Sambri V., Comanducci M., Di Leo K., Storni E., Giacani L., Ratti G., Cevenini R. DNA immunization with pgp3 gene of Chlamydia trachomatis inhibits the spread of chlamydial infection from the lower to the upper genital tract in C3H/HeN mice. Vaccine. 2003;21:1089–1093.

21.Li Z., Wang S., Wu Y., Zhong G., Chen D. Immunization with chlamydial plasmid protein pORF5 DNA vaccine induces protective immunity against genital chlamydial infection in mice. Sci. China. Ser. C Life Sci. 2008;51:973–980.

22.Peng B., Zhong S., Hua Y., Luo Q., Dong W., Wang C., Li Z., Yang C., Lei A., Lu C. Efficacy of Pgp3 vaccination for Chlamydia urogenital tract infection depends on its native conformation. Front. Immunol. 2022;13:1018774.

23.Galaleldeen A., Taylor A.B., Chen D., Schuermann J.P., Holloway S.P., Hou S., Gong S., Zhong G., Hart P.J. Structure of the Chlamydia trachomatis immunodominant antigen Pgp3. J. Biol. Chem. 2013;288:22068–22079.

24.Chen D., Lei L., Lu C., Galaleldeen A., Hart P.J., Zhong G. Characterization of Pgp3, a Chlamydia trachomatis plasmid-encoded immunodominant antigen. J. Bacteriol. 2010;192:6017–6024.

25.Donati M., Laroucau K., Storni E., Mazzeo C., Magnino S., Di Francesco A., Baldelli R., Ceglie L., Renzi M., Cevenini R. Serological response to pgp3 protein in animal and human chlamydial infections. Vet. Microbiol. 2009;135:181–185.

26.Liang M., Wen Y., Ran O., Chen L., Wang C., Li L., Xie Y., Zhang Y., Chen C., Wu Y. Protective immunity induced by recombinant protein CPSIT_p8 of Chlamydia psittaci. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016;100:6385–6393.

27.Labuda J.C., Pham O.H., Depew C.E., Fong K.D., Lee B.S., Rixon J.A., McSorley S.J. Circulating immunity protects the female reproductive tract from Chlamydia infection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2021;118:e2104407118.

28.Helble J.D., Gonzalez R.J., von Andrian U.H., Starnbach M.N. Gamma Interferon Is Required for Chlamydia Clearance but Is Dispensable for T Cell Homing to the Genital Tract. mBio. 2020;11:e00191-20.

29.Farris C.M., Morrison S.G., Morrison R.P. CD4+ T cells and antibody are required for optimal major outer membrane protein vaccine-induced immunity to Chlamydia muridarum genital infection. Infect. Immun. 2010;78:4374–4383.

30.Powell H.J., Cong Y., Yu J.J., Guentzel M.N., Berton M.T., Klose K.E., Murthy A.K., Arulanandam B.P. CD4+ T cells are required during priming but not the effector phase of antibody-mediated IFN-gamma-dependent protective immunity against pulmonary Francisella novicida infection. Immunol. Cell Biol. 2008;86:515–522.

31.Li Y., Zheng K., Tan Y., Wen Y., Wang C., Chen Q., Yu J., Xu M., Tan M., Wu Y. A recombinant multi-epitope peptide vaccine based on MOMP and CPSIT_p6 protein protects against Chlamydia psittaci lung infection. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019;103:941–952.

32.Olivares-Zavaleta N., Whitmire W., Gardner D., Caldwell H.D. Immunization with the attenuated plasmidless Chlamydia trachomatis L2(25667R) strain provides partial protection in a murine model of female genitourinary tract infection. Vaccine. 2010;28:1454–1462.

33.Kaleta E.F., Taday E.M. Avian host range of Chlamydophila spp. based on isolation, antigen detection and serology. Avian Pathol. 2003;32:435–461.

34.Kashimura M. The human spleen as the center of the blood defense system. Int. J. Hematol. 2020;112:147–158.

35.Aoshi T., Carrero J.A., Konjufca V., Koide Y., Unanue E.R., Miller M.J. The cellular niche of Listeria monocytogenes infection changes rapidly in the spleen. Eur. J. Immunol. 2009;39:417–425.

36.Ghosh D., Stumhofer J.S. The spleen: “epicenter” in malaria infection and immunity. J. Leukoc. Biol. 2021;110:753–769.

37.Herweg J.A., Rudel T. Interaction of Chlamydiae with human macrophages. FEBS J. 2016;283:608–618.

38.Lausen M., Christiansen G., Bouet Guldbæk Poulsen T., Birkelund S. Immunobiology of monocytes and macrophages during Chlamydia trachomatis infection. Microbes Infect. 2019;21:73–84.

39.Beagley K.W., Huston W.M., Hansbro P.M., Timms P. Chlamydial infection of immune cells: Altered function and implications for disease. Crit. Rev. Immunol. 2009;29:275–305.

40.Kessell A.E., Finnie J.W., Windsor P.A. Neurological diseases of ruminant livestock in Australia. III: Bacterial and protozoal infections. Aust. Vet. J. 2011;89:289–296.

41.Kalams S.A., Parker S., Jin X., Elizaga M., Metch B., Wang M., Hural J., Lubeck M., Eldridge J., Cardinali M., et al. Safety and immunogenicity of an HIV-1 gag DNA vaccine with or without IL-12 and/or IL-15 plasmid cytokine adjuvant in healthy, HIV-1 uninfected adults. PLoS ONE. 2012;7:e29231.

42.Yu Y.Z., Ma Y., Xu W.H., Wang S., Sun Z.W. Combinations of various CpG motifs cloned into plasmid backbone modulate and enhance protective immunity of viral replicon DNA anthrax vaccines. Med. Microbiol. Immunol. 2015;204:481–491.

43.He Z., Xu J., Tao W., Fu T., He F., Hu R., Jia L., Hong Y. A recombinant plasmid containing CpG motifs as a novel vaccine adjuvant for immune protection against herpes simplex virus 2. Mol. Med. Rep. 2016;14:1823–1828.

44.Würtele H., Little K.C., Chartrand P. Illegitimate DNA integration in mammalian cells. Gene Ther. 2003;10:1791–1799.

45.Li L., Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016;15:313–329.

46.Hobernik D., Bros M. DNA Vaccines-How Far From Clinical Use? Int. J. Mol. Sci. 2018;19:3605.

47.Lee J., Arun Kumar S., Jhan Y.Y., Bishop C.J. Engineering DNA vaccines against infectious diseases. Acta Biomater. 2018;80:31–47.

 

SUMBER:

Chuan Wang, Yingqi Jin, Jiewen Wang, Kang Zheng, Aihua Lei, Chunxue Lu, Shuzhi Wang, Yimou Wu. Protective Immunity against Chlamydia psittaci Lung Infection Induced by a DNA Plasmid Vaccine Carrying CPSIT_p7 Gene Inhibits Dissemination in BALB/c Mice. Int J Mol Sci. 2023 Apr 10;24(8):7013.