Kandidat Vaksin ompA-rekombinan Feline Chalmydiosis

Respons Pembentukan Antibodi pada Tikus Putih Terhadap Vaksin ompA rekombinan F eline Chalmydiosis

 

 

PUDJIATMOKO
Balai Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan

(National Veterinary Drug Assay Laboratory)

Gunungsindur, Bogor 16340, Indonesia

ABSTRACT

The ompA-recombinant protein produced by E. coli BL21 (DE3)plysS containing pRSETA/ompA gene of feline Chlamydia psittaci B 166 strain was purified using method of Xpress system protein purification (Invitrogen BV, The Netherlands). To eliminate guanidine hydrochloride, the suspension of ompA-recombinant protein was dialyzed in 20 mM Tris pH 7.8, glycerol 10% and phenylmethylsulfonyl fluoride containing 0,1 M MgCI2 CaCl2, NaCI or KCI. To prepare the vaccines, the purified proteins were emulsified with oil adjuvant. One ml of each vaccine was injected intramuscularly to 4 spesific pathogen free rats 8-week-old. The second vaccination was performed at 3 weeks post first vaccination. IgG antibody titer against feline Chlamydia psittaci was measured using microimmunofluorescence test at a week post second vaccination. Vaccination using ompA-recombinant could initiate IgG antibody in 21 of 24 vaccinated rats. IgG antibody titer or rats vaccinated with materials dialyzed in dialysis buffer containing KCl has highest titer ranged from 1:16 to 1:64, and its geometric mean titer is 1 :38. The results of the present study indicate that the ompA-recombinant protein of chlamydia used for main component of vaccine may initiate antibody against feline C. psittaci in rats.

Key words: Chlamydia, cat, ompA, rat, vaccine

ABSTRAK

Protein ompA-recombinan yang dihasilkan oleh E. coli BL21(DE3)plysS yang mengandung rekombinan plasmid pRSETA/gen ompA feline Chlamydia psittaci galur B 166 dimurnikan dengan cara Xpress system protein purification (Invitrogen BV, The Netherlands). Untuk menghilangkan guanidine hydrochloride, suspensi ompA-rekombinan didialisis dengan larutan dapar 20 mM Tris pH 7,8, glycerol 10% dan phenylmethylsulfonyl fluoride yang mengandung 0, I M MgCI2, CaCI2, NaCI atau KCI. Tiap-tiap protein yang telah dimurnikan tersebut diemulsikan dengan adjuvan minyak untuk dijadikan vaksin. Satu ml tiap-tiap vaksin tersebut disuntikan secara intramuskular pada 4 ekor tikus putih specific pathogen free (SPF) umur 8 minggu. Vaksinasi kedua dilakukan 3 minggu setelah vaksinasi pertama. Seminggu setelah penyuntikan kedua titer antibodi IgG diukur dengan microimmunofluorescence test. Vaksinasi menggunakan protein ompA-rekombinan feline C. psittaci ini bisa merangsang terbentuk antibodi IgG pada 21 dari 24 tikus yang divaksin. Titer antibodi IgG tikus yang divaksin dengan material yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung KCl mempunyai titer tertinggi berkisar antara 1:6 dan 1:64 dengan geometric mean titer 1:38. Dari hasil-hasil penelitian ini menunjukkan bahwa protein ompA-rekombinan Chlamydia yang digunakan sebagai komponen utama vaksin bisa merangsang timbulnya antibodi terhadap C. psittaci pada tikus putih.

Kata kunci : Chlamydia, kucing, ompA, tikus, vaksin

PENDAHULUAN

Feline Chlamydia psittaci adalah bakteri Gram negative yang merupakan parasit obligate intracellular yang menyerang kucing (Moulder et aI., 1984) yang menyebabkan conjuctivitis, rhinitis dan pneumonia (Hoover et aI., 1978, Johnson, 1984, Baker et aI., 1942). Organisme tersebut merupakan salah satu kelompok genetik genus Chlamydia yang diajukan sebagai spesies baru (Pudjiatmoko et aI., 1997) dan kemudian dinamakan Chlamydophyla felis (Everett et aI., 1999).

Dalam menanggulangi penyakit Chlamydiosis pada manusia telah digunakan chlamydia utuh sebagai vaksin inaktif yang diberikan secara intramuskuler, .tetapi masa proteksi yang diperoleh singkat dan vaksinasi dengan cara ini bisa menimbulkan sakit yang lebih parah selama masa infeksi berikutnya, hal ini mungkin disebabkan reaksi patogen terhadap antigen Chlamydia tertentu (Grayston dan Wang, 1978; Grasyton dan Wang, 1975).

Pada studi sebelumnya menunjukan bahwa E. coli BL21(DE3)plysS yang mengandung rekombinan ompA-­pRSETA bisa memproduksi protein ompA-rekombinan 40 kDa yang bisa bereaksi dengan antibodi monoclonal major outer membrane protein (MOMP) C. psittaci G-IB6 dan protein rekombinan tersebut diusulkan untuk digunakan sebagai salah satu komponen utama vaksin chlamydiosis pada kucing (Pudjiatmoko, 1999a).

Vaksin menggunakan immunogene ompA- rekombinan diharapkan akan lebih cepat, mudah dan ekonomis dalam mempersiapkan immunogene dan bisa menghindari efek samping vaksin Chlamydia utuh. Penelitian kali ini bertujuan mempelajari respon immunigenisitas vaksin ompA-rekombinan feline C. psittaci pada tikus putih.

BAHAN DAN METODE

Ekspresi Protein ompA-rekombinan
Prosedur untuk memproduksi protein ompA ­rekombinan dilakukan seperti pada studi awal pembuatan vaksin feline chlamydiosis sebelumnya (Pudjiatmoko, 1999a), gen ompA feline C. psittaci galur B166

(Gambar 1) disisipkan pada vektor plasmid pRSETA yang mengandung 6 tandem residu histidine (invitrogen BV, The Netherland) (Gambar 2) pada tempat restriksi antara enzim BamHI dan XhoI. Plasmid rekombinan pRSETA/gen ompA feline C. psittaci ditransformasikan ke dalam E. coli BL21 (DE3)plysS dengan ciri-ciri genotipe F, ompT hsdSB (rB mB) gal dcm (DE3) plysS (CamR). E. coli yang telah memperoleh rekombinan pRSETA-ompA tersebut dibiakan pada media Terrific broth (TB) yang mengandung 10 µg/ml Carbenicillin dan 34 µg/ml Chloramphenicol. Ekspresi gen ompA diinduksi dengan cara menambahkan 1,0 mM Isopropyl-ß-D-­thiogalactopyranoside (IPTG) ke dalam biakan tersebut pada suhu 37 C. Sebelum dilakukan pengecekan protein ompA-rekombinan, E. coli BL21(DE3)plysS dilisis dengan menggunakan French pressure cell yang dioperasikan pada tekanan 16.000 - 18.000 Lb/inz (Hopkins, 1992).

Pembuatan Vaksin
Protein ompA-rekombinan dimurnikan dengan column yang berisi resin ProBondTM menggunakan Xpress system protein purification (Invitrogen BV, The Netherlands). Sel E. coli BL21(DE3)plysS yang telah dipanen dilisis dengan 10 ml guanidium lysis buffer (6M guanidine hydrochloride, 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 7,8) selama 10 menit. Untuk menguraikan DNA dan RNA, suspensi sel E. coli disonikasi dengan frekuensi tinggi selama 10 detik tiga kali. Supematan dikumpulkan setelah pemusingan pada 3.000 x g selama 15 menit.

Sepuluh ml supernatan tersebut diaplikasikan pada column yang telah dialiri dengan denaturing binding buffer (8M urea, 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 7,8). Protein ompA-rekombinan dipisahkan dengan denaturing elution buffer (8M urea, 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 4,0) setelah dilakukan pencucian terlebih dahulu dengan denaturing washing buffer (8M urea, 20 mM sodium phosphate, 500 mM sodium chloride, pH 6,0 dan pH 5,3).

Protein ompA-rekombinan ini dibagi menjadi 4 bagian dengan volume yang sarna, masing-masing bagian dimasukkan ke dalam seamless cellulose tube (Viskase sales corp., Japan) dan didialisis menggunakan larutan dapar 20 mM Tris pH 7,8, glycerol 10% dan phenylmethylsulfonyl fluoride (PMFS) dimana setiap larutan dapar terse but mengandung 0,1 M MgCI2, CaCl2, NaCI atau KCl. Setelah dialisis, material dipusing 10.000 x g selama 10 menit. Pelet dan supematan dipisahkan dan disuspensikan dengan larutan dapar yang sama sehingga mengandung protein 1 µg/ml.

Untuk kontrol positif digunakan Feline C. psittaci galur Fe/145. Chlamydia dibiakan pada sel SL pada suhu 37°C selama 4 hari, setelah dipanen Chlamydia diencerkan dengan sucrose-phosphate-glutamic acid (SPG) sehingga diperoleh suspensi chlamydia 10 pangkat 7,0 ELD50 per ml. Chlamydia diinaktifkan dengan formalin sehingga konsentrasi akhir 0.1 % selama 3 hari pada suhu 37°C.

Chlamydia yang telah diinaktifkan atau suspensi protein OmpA-rekombinan yang telah dimurnikan tersebut diemulsikan dengan adjuvan minyak yang terdiri dari minyak mineral (parafin cair) dan emulgator sorbitan mono-oleat. Vaksin disimpan pada suhu 4°C sampai dengan saatnya digunakan.

Vaksinasi pada Tikus Putih
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini tikus putih bebas patogen tertentu (specific pathogen free,SPF') umur 8 minggu diperoleh dari Kyoto Biken Laboratories, Jepang. Tigapuluh dua ekor tikus dibagi menjadi 8 kelompok (Kelompok A, B, C, D, E, F, G, dan H) sehingga tiap kelompok terdiri dari 4 ekor. Setiap ekor tikus disuntik secara intramuskuler dengan 1,0 ml vaksin yang mengandung immunogen seperti tertulis pada Tabel I. Penyuntikan diulang pada tiga minggu setelah penyuntikan pertama. Tikus dari kelompok A divaksin dengan vaksin yang mengandung protein ompA-­rekombinan dari supematan yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung 0,1 M MgCl2 (supematan MgCl2), kelompok B divaksin dengan vaksin yang mengandung protein ompA-rekombinan dari supernatan yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung 0,1 M NaCI (supernatan-NaCl), kelompok C divaksin dengan vaksin yang mengandung protein ompA-rekombinan dari supernatan yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung 0,1 M KCI (supernatan-KCl), kelompok D divaksin dengan vaksin yang mengandung protein ompA-­rekombinan dari pelet yang didialisis dengan larutan dapat yang mengandung 0,1 M MgCl2 (Pelet-MgCl2), kelompok E divaksin dengan vaksin yang mengandung protein ompA-rekombinan dari pelet yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung 0,1 M NaCl (Pelet-NaCl), kelompok F divaksin dengan vaksin yang mengandung protein ompA-rekombinan dari pelet yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung 0,1 M KCl (pelet­-KCl), dan Kelompok G divaksin dengan feline Chlamydia galur Fe/145 sebagai kontrol positif. Sedangkan kelompok H disuntik secara intramuskuler dengan campuran E. coli BL21(DE3)plysS tanpa ompA-rekombinan dan adjuvan sebagai kontrol negatif.

Microimmunofluorescence Test
Sampel serum tikus putih dikumpulkan pada saat sebelum vaksinasi dan seminggu setelah vaksinasi kedua (booster). Microimmunofluorescence test dilakukan mengikuti prosedur penelitian sebelumnya (Pudjiatmoko et al., 1996). Ringkasnya, 1µl antigen (feline C. psittaci galur Fe/145 dan Cello) diulaskan pada 12-well teflon­coated slide (Cell-line Associated Inc., Newfield, N.J., US) dan dikeringkan dalam suhu kamar dan difiksasi dengan methanol dingin selama 10 menit, dan 10 µl serum yang telah diencerkan (pengenceran secara seri kelipatan dua, dimulai dari 1 :4) diteteskan pada setiap lubang dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 60 menit. Setelah inkubasi slide dicuci tiga kali dengan PBS(-) selama 5 menit. Kemudian direaksikan dengan 10 µl fluorescence­isothiocyanate-conjugated goat anti-rat IgG (Cappel, conchraville, Pa., USA) yang telah diencerkan 20 kali dengan PBS(-) pada suhu 37° C selama 60 menit, dilanjutkan dengan pencucian tiga kali menggunakan PBS(-) selama 5 menit. Titer antibodi ditunjukan dari pengenceran serum tertinggi yang memperlihatkan perpendaran Chlamydia berwarna hijau. Kontrol positif diperoleh dari hyperimmune serum tikus putih yang disuntik dengan galur Fe/145. Serum tikus putih SPF yang tidak mengandung antibodi Chlamydia pada complement fixation test dan ELISA digunakan sebagai kontrol negatif.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada proses ekspresi protein ompA-rekombinan, kondisi optimum yang diperoleh adalah sebagai berikut: setelah pembiakan awal dalam 3 ml TB pada suhu 37°C selama 6 jam, E. coli yang mengandung plasmid pRSETA­gen ompA dibiakan kembali pada suhu yang sama dalam 50 ml TB selama 100 menit sehingga densitas-optiknya pada pembacaan OD 600 mencapai 0,4 saat yang paling tepat untuk dimulainya induksi dengan 1 mM IPTG. Protein ompA-rekombinan terbanya~ diperoleh setelah diinduksi pada suhu 37° C selama 180 menit.

Pada pemurnian bahan immunogen, protein ompA-­rekombinan berikatan dengan resin ProBond™ dalam 20 mM larutan dapar fosfat, 500 mM NaCl pH 7,8, sedangkan sebagian besar protein sel induk semang (E. coli) tidak berikatan dengan resin ProBondTM. Sebagian kecil protein sel induk semang yang bisa berikatan dengan resin pada pH tersebut bisa dilepaskan dari resin ProBond™ dengan mudah menggunakan larutan dapat pH 6,0. Protein ompA­rekombinan dilepaskan dari resin ProBond™ dengan pencucian menggunakan larutan dapar pH 4,0.

Karena protein ompA-rekombinan yang dihasilkan insoluble (terdapat pada pelet setelah pelisisan sel) maka pemurnian protein dilakukan dalam kondisi denature dimana pada proses pelisisan sel digunakan guanidine hydrochloride. Untuk protein refolding dan mengem­balikan kemampuan aktifitas protein tersebut, perlu dilakukan penyingkiran guanidine hydrochloride dalam suspensi ompA-rekombinan. Cara untuk menyingkirkan guanidine hydrochloride diIakukan dengan cara men­dialisis suspensi ompA-rekombinan pada larutan dapat yang mengandung MgCI2, NaCl, KCl atau CaCI2

Dialisis dengan larutan dapar yang mengandung CaCl2 menyebabkan timbulnya banyak agregasi protein ompA-rekombinan sehingga protein yang dihasilkannya tidak baik untuk immunogen sehingga tidak digunakan sebagai vaksin. Dialisis menggunakan larutan dapar yang mengandung MgCl2 dan NaCl menimbulkan sedikit agregasi protein ompA-rekombinan. Sedangkan ompA-­rekombinan sedikit sekali mengalami agregasi ketika didialisis menggunakan larutan dapar yang mengandung KCl. Hasil ini sesuai dengan hasil analisis immunobloting, band protein ompA-rekombinan yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung KCl terlihat lebih jelas dibanding dengan ompA-rekombinan yang didialisis dengan larutan dapar yang mengandung MgCl2 dan NaCl. Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa larutan dapar yang mengandung KCl bisa dengan baik menyingkirkan guanidine hydrocloride dalam proses protein refolding sehingga protein ompA-rekombinan tidak rusak, bisa bereaksi dengan monoclonal antibody G-IB6 yang khas terhadap outer membrane protein C. psittaci dan bisa digunakan sebagai immunogen. Dialisis dengan larutan dapar 20 mM Tris pH 7,8 10% glycerol, 1 mM PMFS yang mengandung KCl bisa dipergunakan dalam pemurnian ompA-rekombinan.

Untuk mengetahui immunogenisitas ompA-rekom­binan, titer antibodi IgG serum tikus yang divaksin diukur dengan menggunakan microimmunofluorescence test. Sebelum dilakukan vaksinasi yang pertama semua tikus tidak mempunyai antibodi terhadap C. psittaci. Pada seminggu setelah vaksinasi kedua, tikus kelompok kontrol negatif tidak seekorpun yang mempunyai titer antibodi terhadap C. psittaci, sedangkan tikus dari kelompok C mempunyai geometric mean titer (GMT) tertinggi yaitu 1 :38, titer bervariasi antara 1: 16 dan 1 :64 (TabeI2). GMT yang kedua, tikus dari kelompok F yaitu 1:23 dengan kisaran titer antara 1:16 dan 1:32, diikuti kelompok D dengan GMT 1:13, dengan kisaran titer 1:8 dan 1:16, kemudian kelompok E dengan GMT 1: 10 dengan kisaran titer 1:8dan 1:16. Sedangkan kelopok A dan B mempunyai GMT masing-masing 1:4 dan 1 :8. Titer antibodi kelompok kontrol positif yang divaksin dengan vaksin yang mengandung Chlamydia utuh berkisar antara 1:32 dan 1:64 dengan GMT 1:45. Keberagaman titer kelompok satu dengan kelompok yang lain ini menunjukkan bahwa larutan dapar yang digunakan untuk dialisis mempengarui kwalitas immunogen yang dihasilkan.

Seminggu setelah vaksinasi kedua, 21 ekor dari 24 ekor yang divaksin dengan vaksin ompA-rekombinan mempunyai titer antibodi IgG terhadap feline C. psittaci.

Titer antibodi tersebut berkisar antara 1:8 sampai dengan 1:64. Baik material yang berasal dari pelet maupun dari supernatan bisa merangsang timbulnya antibodi IgG pada tikus. Tikus kelompok C yang divaksin dengan konsentrasi ompA-rekombinan tertinggi menunjukkan titer antibodi IgG yang tertinggi kemudian diikuti oleh tikus yang berasal dari kelompok F. Kedua kelompok C dan F tersebut merupakan kelompok yang divaksin dengan ompA­-rekombinan yang didialisis dalam larutan dapar yang mengandung 0,1 M KCI. Tikus kelompok C divaksin dengan ompA-rekombinan yang berasal dari supernatan, sedangkan tikus dari kelompok F divaksin dengan ompA-­rekombinan yang berasal dari pelet. Dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa vaksin ompA-rekombinan bisa menginduksi antibodi IgG terhadap feline C. psittaci.

Vaksin yang dibuat dari immunogen ompA-rekom­binan yang didialisis dengan MgCl2 dan NaCl menim­bulkan antibodi degan GMT kurang dari 1: 14. Sedangkan vaksin yang diperoleh dari protein yang didialisis dengan menggunakan KCl memperlihatkan kemampuan untuk menimbulkan terbentuknya IgG pada tikus cukup tinggi. Immunogen ompA-rekombinan yang berasal dari super­natan lebih banyak dari pada yang berasal dari pelet. Hal ini memperlihatkan bahwa protein ompA-rekombinan larut dalam denaturing elution buffer. Dari hasil-hasil ini menunjukkan larutan dapar dialisis yang mengandung KCl bisa digunakan dalam dialisis sehingga ompA-rekombinan bisa digunakan sebagai immunogen.

Pada studi kali ini vaksin yang mengandung Chlamydia 10 pangkat 7,0 ELD50 yang bisa merangsang terbentuk antibodi IgG cukup tinggi pada kelompok G. Hasil ini sesuai dengan hasil studi terdahulu tentang respon dosis vaksin inaktif yang menyatakan bahwa untuk memperoleh kekebalan yang cukup terhadap infeksi Chlamydia pada kucing, sebaiknya vaksin inaktif yang diberikan mengandung Chlamydia lebih besar lO pangkat 5,5ELD50 (Pudjiatmoko, 1999b). Titer antibodi yang diperoleh cukup tinggi pada kelompok C menunjukkan bahwa immunogen ompA-rekombinan bisa digunakan sebagai komponen utama vaksin Chlamydosis pada kucing. Untuk mengetahui potensi vaksin tersebut perlu dilakukan uji potensi menggunakan hewan percobaan kucing yang ditantang dengan Chlamydia hidup untuk mengetahui kekebalan yang ditimbulkan oleh vaksin ompA­-rekombinan tersebut.

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa: (1) protein ompA-rekombinan Chlamydia yang digunakan sebagai komponen utama vaksin bisa merangsang timbulnya antibodi pada tikus putih. (2) Protein ompA-­rekombinan feline Chlamydia dapat dimurnikan dengan Xpress system protein purification (Invitrogen BV, The Netherlands) menggunakan kolom resin ProBond™, (3) Larutan dapar 20 mM Tris pH 7,8 10% glycerol, 1 mM PMFS yang mengandung KCl bisa digunakan untuk dialisis ompA-rekombinan dalam mengeliminasi guanidine hydrochloride,dan (4) untuk menguji potensi vaksin ompA-rekombinasi Chlamydia perlu dilakukan studi respon immungenisitas ompA-rekombinan Chlamydia pada kucing dengan menggunakan tantangan Chlamydia hidup.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis sampaikan terimakasih kepada Dr. Masubuchi Katsuo dan Dr. Iwamoto Kayo atas bantuan teknis yang diberikan dalam penelitian ini. Penelitian ini dibiayai oleh Society of Techno-inovation for Agriculture, Forestry and Fisheries (STAFF) Jepang.

DAFTAR PUSTAKA

Baker, J.A.A. 1942. A virus obtained from pneumonia of cats and its possible relation to the cause of atypical pneumonia in man. Science 96: 475-476.

Cello, R.M. 1967. Ocular infections in animal with PLT (Bedsonia) group agents. Am. J. Opthhalmol. 64: 1270-1273.

Everett, K.D.E., R.M. Bush, A.A. Andersen. 1999.
Emended description of the order Chlamydiales. proposal of Parachlamydiaceae fam. novo and Simkaniaceae fam. nov., each contammg one monotypic genus, revised taxonomy of the family chlamydiaceae, including a new genus and five new speies,and standards for the identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 415-440.

Hoover, E.A., D.E. Kahn, and J.M. Langloss. 1978. Experimentally induced feline chlamydia infection. Am. J. Vet. Res. 39: 541-547.

Hopkins, T.R. 1991. Physical and chemical cell discription for the recovery intercellular proteins. in: Purification and analysis of recombinant proteins (R. Seetharam and S.K. Sharma, eds.) pp 57-83. Marcell Dekker, New York.

Johnson, F.W.A. 1984. Isolation of Chlamydia psittaci from nasal and conjuctival exudate of a domestic cats. Vet. Rec. 114: 342--344.

Moulder, J. W., T.P. Hatch, C.-C. Kuo, J. Schachter, and J. Storz. 1984. Genus 1. Chlamydia Jones, Rake and Stearns 1945,55 AL. In: Krieg, N.R. and J.G. Holt (eds.) bargey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 1, pp. 729-739. Williams and Wilkins. Baltimore.

Pudjiatmoko, H. Fukushi, Y. Ochiai, T. Yamaguchi, and K. Hirai. 1996. Seroepidemiology of feline Chlamydiosis by microimmunofluorescence assay with multipe strains as antigen. Microbiol. Immunol. 40:755-759.

Pudjiatmoko, H. Fukushi, Y. Ochiai, T. Yamaguchi, and K. Hirai. 1997. Phylogenie analysis of the genus Chlamydia based on 16S rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 425-431.
Pudjiatmoko. 1999a. Studi awal pembuatan vaksin feline Chlamydiosis menggunakan protein rekombinan outer membrane protein A (ompA). Inovasi 8: 46-58.

Pudjiatmoko. 1999b. Respon dosis vaksin inaktif Chlamydiosis galur Fe/145 pada kucing. pp. 269-272. In: Proceeding of The 8th Scientific meeting of Indonesian Student Association, Osaka, Japan.

Sumber : Buletin Pengujian Mutu Obat Hewan nomor 8 tahun 2001

Identifikasi Virus AI Isolat Legok Dengan PCR

 

 Identifikasi Subtipe Virus Avian Influenza Isolat Legok Menggunakan Polymerase Chain Reaction

 

PUDJIATMOKO, BAHRUDDIN SYAHRONI HASIBUAN, SRI MURNI ASTUTI, EMILIA DAN ENUH RAHARJO JUSA

Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan

(National Veterinary Drug Assay Laboratory), Gunungsindur, Bogar 16340, Indonesia

ABSTRACT

The virology laboratory of Veterinary Drug Assay Laboratory isolated a virus which caused respiratory clinical signs in chicken from a layer farm, in Legok, Tangerang. The clinical signs of the disease were very similar to the avian influenza. The virus isolate was then identified by RT-PCR using Primer NP-1200f and NP-1529r that amplified nucleoprotein gene of all influenza virus of poultry, man, pig and horse, and using 15 pair of HI­-15 primer that amplified haemagglutinin antigen (HA) of avian subtype. The result of RT-PCR showed that both of the genes of Legok isolate were amplified with NP-1200f and NP-1529r pair and H5-131f and H5-580r pair primers. The result indicated that the Legok isolate was an avian influenza subtype H5Nl.

Key word: Avian influenza, RT-PCR, Nucleoprotein, hemagglutinin, Legok isolate.

ABSTRAK

Laboratorium virologi Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan telah mengisolasi virus avian influenza yang berasal dari ayam dengan gejala klinis kelainan saluran pernafasan, dari peternakan ayam layer di Legok, Tangerang. Gejala penyakit yang ditimbulkan menyerupai penyakit avian influenza. Isolat virus diidentifikasi menggunakan RT-PCR dengan sepasang primer NP-1200f dan NP-1529r yang dapat mengamplifikasi gen Nucleoprotein (NP) dari semua virus influenza dari unggas, manusia, babi dan kuda serta menggunakan 15 pasang primer HI-15 yang dapat mengamplifikasi gen Hemagglutinin (HA) dari subtipe virus avian influenza. Hasil RT-PCR memperlihatkan kedua gen dari virus isolat Legok tersebut dapat teramplifikasi menggunakan pasangan primer NP-1200f dan NP-1529r, dan dengan pasangan primer H5-131f dan H5-580r. Hasil ini menunjukkan bahwa isolat Legok termasuk virus AI subtipe H5N I.

Kata kunci: Avian influenza, RT-PCR, Nucleoprotein, Hemagglutinin, isolat Legok

PENDAHULUAN

Avian influenza (AI) adalah penyakit sangat menular disebabkan oleh virus influenza tipe A, termasuk dalam famili Orthomyxoviridae (Lamb and Krug, 1996). Virus avian influenza dibagi menjadi 15 subtipe HA (H1-H15) dan 9 subtipe NA (N1-N9) (Rohm et al., 1996). Diantara 15 subtipe HA, hanya H5 dan H7 yang tergolong sangat virulen pada unggas. Perbedaan asam amino di antara subtipe HA tersebut sebesar 20%-74%, sedangkan perbedaan asam amino dalam subtipe HA yang sama hanya 0%-9% (Air, 1981). Berdasarkan perbedaan asam amino ini, Lee, et al. (2001) telah merancang primer yang digunakan dalam RT-PCR untuk identifikasi cepat subtipe HA virus avian influenza.

Pada bulan Oktober 2003 telah diisolasi pertama kali di Indonesia virus AI dari ayam layer di Legok Tangerang dengan gejala kelainan pada saluran pernapasan. Untuk mengetahui subtipe virus avian influenza tersebut dilakukan identifikasi dengan metoda RT-PCR menggunakan 15 pasang primer yang ditargetkan pada gen Hemagglutinin (HA) virus. Dari hasil identifikasi ini dapat dilaporkan bahwa cDNA dari isolat tersebut teramplifikasi dengan menggunakan sepasang primer khusus subtipe H5N1.

BAHAN DAN METODA

1. Isolat Virus
Spesimen isolat virus yang diidentifikasi merupakan isolat virus AI strain Legok dalam cairan allantois yang diperoleh dari laboratorium virologi Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan (BBPMSOH).

2. Ekstraksi RNA virus berasal dari cairan allantois
RNA diekstraksi menggunakan TRIZOLLSREAGENT (INVITROGEN). Prosedur secara singkat sebagai berikut, 250 µl suspensi virus isolat dicampur dengan 750 µl trizol dalam micro tube hingga rata. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu kamar (25-30°C) selama 5 menit untuk memisahkan nucleoprotein. Setelah ditambahkan dengan 200 µl chloroform, campuran dikocok dengan tangan selama 15 detik, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama 10 menit. Campuran dipusing 12.000 rpm pada suhu 2-8°C selama 15 menit. Lima ratus µl fase cair pada supernatan dipindahkan ke microtube baru. Selanjutnya ditambahkan dengan 500 µl isoprophil alkohol. Kemudian disimpan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah dipusing 12.000 rpm pada suhu 2 - 8°C selama 10 menit supernatannya dibuang. Endapan RNA dicuci dengan 1.000 µl ethanol 75% dan dipusing 12.000 rpm suhu 2 - 8 C selama 5 menit. RNA dikeringkan selama 7 menit dan dilarutkan dengan 10 µl air suling bebas RNAse.

3. Pembuatan cDNA
Pembuatan cDNA menggunakan metoda SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Prosedur ringkasnya adalah sebagai berikut, ke dalam 0,5 ml microtube dibuat campuran RNA/primer yang berisi 3 µl RNA contoh, 1 µl 10 mM dNTP mix, 1 µl antisense primer, 5 µl air suling bebas RNase. Campuran ini dipanaskan pada suhu 65°C selama 5 menit, kemudian didinginkan di atas es sekurang - kurangnya selama 1 menit. Pada saat pemanasan campuran diatas, disiapkan pula 9 µl pereaksi yang terdiri dari 2 µl 10X RT buffer, 4 µl 25 mM MgC12, 0,2 µl 0,1 M DTT dan 1 µl RNaseOut (RNase inhibitor). Campuran RNA/primer dicampur dengan pereaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 42°C selama 2 menit. Satu µl SuperScript II RT ditambahkan ke dalam campuran tersebut, dan inkubasi dilanjutkan lagi selama 50 menit. Reaksi ini diakhiri dengan pemanasan 70°C selama 15 menit dan pendinginan di atas es. Kedalam campuran RNA, primer dan pereaksi ditambahkan 1 µl RNAse H dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit.

4. Primer
Untuk identifikasi virus influenza dipergunakan sepasang primer yang dapat mengamplifikasi 329 bp fragmen gen nucleoprotein, NP-1200f [5'CAG(A/G)TACTGGGC(A/T/C)ATAAG(A/G)AC-3] dan NP­1529r [5' -GCATTGTCTCCGAAGAAATAAG-3 ']. Untuk mengidentifikasi subtipe virus avian influenza digunakan 15 pasang primer seperti pada Tabel 1.

5. Amplifikasi cDNA
Amplifikasi cDNA dilakukan berdasarkan metoda Super Script First-Stand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Amplifikasi cDNA dilakukan dalam 50 µl campuran reaksi yang mengandung 5 µl 10X PCR reaction buffer tanpa Mg, 1,5 µl 50 mM MgC12, 1 µl 10 mM dNTP mix, 0,5 µl 50 µM primer (forward), 50 µM primer (reverse), 0,4 µl (2 unit) Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen), 2 fl1 cDNA dan 38,1 µl air suling yang telah diautoclave. Amplifikasi cDNA dilakukan menggunakan Astec Program temperature control system PC-800, dengan urutan perputaran suhu, 95°C selama 3 menit (denaturasi awal) , 35 kali putaran 95°C selama 30 detik (denaturasi), 50°C selama 40 detik (annealing), noc selama 40 detik (ekstensi), dan diakhiri dengan ekstensi noc selama 10 menit.

6. Elektroforesis
Hasil RT-PCR dielektroforesis menggunakan Mupid-2 pada 2% agarose (Promega) dengan running buffer TBE selama 60 menit. Band DNA diwarnai dengan ethidium bromide, dan gambarnya didokumentasikan menggunakan kamera digital (Fuji FinePix, A202).

HASIL DAN PEMBAHASAN

cDNA yang dipero1eh dari isolat virus AI dari Legok, Tangerang dapat menghasilkan band gen Nucleoprotein sekitar 330 bp pada RT-PCR menggunakan primer pasangan NP1200f dan NP1529r (Tabel 2). Pasangan primer tersebut dapat mengamplifikasi gen Nucleoprotein yang berasal dari virus influenza yang berasal dari unggas, babi dan kuda (Altmuller et al., 1989; Gorman et al., 1990; Shu et al., 1993; Lee et al., 2001). Pada elektroforesis, contoh sampel dari virus AI isolat Legok dapat menghasilkan band DNA tersebut berarti gen Nucleoproteinnya dapat teramplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa virus isolat Legok benar sebagai virus influenza.

Untuk mendukung hasil RT-PCR menggunakan primer umum virus influenza, cDNA isolat Legok juga diuji menggunakan 15 primer HA yang dapat digunakan untuk deteksi subtipe HA virus avian influenza. Terdapat satu pasang primer yang dapat mengamplifikasi gen hemagglutinin virus tersebut yaitu pasangan primer H5­-131f dan H5-580r (Tabel 2), produk PCR yang dihasilkan sekitar 450 bp. Hal ini menunjukkan bahwa virus AI isolat Legok yang diidentifikasi virus avian influenza merupakan subtipe H5N1.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terimakasih ditujukan kepada Antonius dan Ratnawati atas bantuan reagen serta kepada Deden Amijaya atas bantuan pengambilan gambar menggunakan digital kamera.

DAFTAR PUSTAKA

Air, G.M. 1981. Sequence relationship among the hemagglutination gene of 12 subtype of influenza a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,7639-7643.

Altmuller, A., W.M. Fitch, C. Scholtissek. 1989.
Biological and genetic evolution of the nucleoprotein gene of human influenza A viruses. 1. Gen. Virol. 70, 2111 - 2119.

Gorman, O.T., W.J. Bean, Y. Kawaoka, W.G. Webster. 1990. Evolution of the nucleoprotein gene of influenza A virus. 1. Virol. 64.1487 -1497.

Lamb, R.A., R. M. Krug. 1996. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. In: B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, R.M. Chanoek, J.L. Melnick, T.P. Momath, B. Roizman Teds.), Field Virology, 3rd ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, PA.

Lee, M.S., P.C. Chang, J.H. Shien, M.C. Cheng, H.K.
Shieh. 2001. Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR. J. Virol. Met. 97, 13-32.

Rohm, c., N. Zhou, J. Suss, J. Mackenzie, R. G.
Webster. 1996. Characterization of a novel influenza hemagglutinin, H15: criteria for determination of influenza A subtypes. Virology 15, 508 -516.

Shu, L.L., W.J. Bean, R.G. Webster. 1993. Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990. J. Virol. 67,2723-2729.

Sumber : Buletin Pengujian Mutu Obat Hewan no. 10 tahun 2004.

Detection of Chlamydophila by Multiplex PCR

 

 Detection of Chlamydophila by Multiplex Polymerase Chain Reaction

 

 

PUDJIATMOKO, DVM., Ph.D

Veterinary Drug Assay Laboratory
(Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat hewan)
Gunung sindur, Bogor 16340

ABSTRACT

Molecular identification of 6 species of family Chlamydiaceae carried out by nested polymerase chain reaction (PCR) with species-specific primers derived from 16S rRNA gene was investigated. The 16SA and 16SB primers were used for amplification of 1,473 bp 16S rRNA gene fragments of 25 strains of Chlamydiaceae in the first PCR. A set of family-specific primer and 5 sets of species-specific primer were used for amplification of fragments of 16S rRNA gene in the nested PCR. The family-specific primers amplified all the 16S rRNA gene of Chlamvdophila spp. used. The species­specific primers were shown to be specific for each species. Multiplex PCR calTied out using 3 primers (2 sense primers and I antisense primer) in a single tube was applicable for detection of Chlamydophila felis, Chlamydophila caviae and Chlamydophila psittaci. C. psittaci-specific primers could be used for detection of Chlamydophila DNA extracted from 1 throat swab of human, 1 liver specimen of a parakeet and 2 fecal specimens of crows. C. felis ­specific primers could be used for detection of Chlamydophila DNA extracted from 4 throat swabs of humans and 2 conjunctival swabs of cats.

Key words: Chlamydiaceae, Chlamydophila, multiplex PCR

ABSTRAK

Identifikasi molekul 6 spesies famili Chlamydiaceae dengan cara nested polymerase chain reaction (PCR) telah dilakukan dengan menggunakan primer spesifik-spesies berasal dari gen 16S rRNA. Primer 16SA dan 16SB digunakan untuk mengamplifikasi 1.473 bp gen 16S rRNA dari 25 galur Chlamydiaceae pada PCR pertama. Satu set primer spesiflk-famili dan 5 set primer spesiflk-spesies digunakan untuk mengampliflkasi sebagian gen 16S rRNA pada nested PCR. Plimer spesiflk-famili dapat mengamplifikasi semua gen 16S rRNA dari Chlamlydophila spp. yang digunakan. Primer spesifik spesies menunjukkan spesifik untuk setiap spesies. PCR multiplek menggunakan 3 primer (2 primer sense clan I primer antisense) dalam satu tabung dapat diaplikasikan untuk mendeteksi Chlamydophila felis, Chlamydophila caviae dan Chlamydophila psittaci. Primer spesifik-C. psittaci dapat digunakan untuk mendeteksi DNA Chlamydophila yang diekstraksi clari I swab tenggorokan manusia, I spesimen hati burung pal'kit, clan 2 spesimen feses gagak. Primer spesifik-C. felis dapat digunakan untuk mendeteksi DNA Chlamydophila yang diekstraksi dari 4 swab tenggorokan manusia dan 2 swab selaput kelopak mata kucing.

Kata kunci : Chlamydiaceae, Chlamydophila, PCR multipleks

INTRODUCTION

Chlamydophila causes a wide variety of diseases in animals and humans (Fukushiand Hirai, 1992; Fukushi and Hirai, 1993a; Grayston et al., 1989; Moulder et al., 1984). The genetic diversity of Chlamydophila is well recognized by chromosomal DNA finger printings (Fukushi and Hirai, 1989), restriction fragment length polymorphism (RFLP) of rRNA gene loci (Fukushi and Hirai, 1993b), RFLP of ompA and groEL genes (Fukushi and Hirai, 1994), and random amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis (Pudjiatmoko et at., 1996). Chlamydophila classified into several genetic groups based on the ompA gene sequence (Kaltenboeck et at., 1993). The previous phylogenetic analysis of the genus Chlamydophila based on 16S rRNA gene sequences showed 6 genetic groups (Pudjiatmoko et aI., 1997). In 1999 the genus Chlamydophila was classified into 6 species: Chlamydophila psittaci, C. felis, C. caviae, C. abortus, C. pecorum and C. pneumoniae (Everett et aI., 1999). A practical method for genotyping Chlamydophila is not available yet.

Typing of Chlamydophila isolates has traditionally been done by immunological methods including fluorescent antibody and enzyme immunoassays (Fukushi and Hirai, 1989; Stamm et at., 1988; Storz and Krauss, 1985; Thomas et aI, 1990). Recently, m9lecular methods using gene amplification, LCR, and DNA sequencing have been employed for identification of isolates (Campbell et aI., 1993; Domeika et aI., 1994; Gaydos et aI., 1992; Holland et aI., 1990; Kaltenboeck et aI., 1991; Kaltenboeck et al., 1993; Kaltenboeck and Storz, 1992; Mahony et aI., 1993). This report describes a simple method of genetic typing of Chlamydophila by PCR using species-specific primer sets. Multiplex PCR carried out using 3 primers (2 sense primers and 1 antisense primer) in a single tube was applicable for detection of C. felis, C. caviae and C. psittaci. Furthermore, this method was applied for PCR and genetic typing of Chlamydophila spp. from clinical samples of human and animal.

 

MATERIALS AND METHODS

Microorganisms

Chlamydophila strains used in this study included 5 strains (Frt-Hu/Cal 10, Hu/Borg, Prk/6BCT, Prk/ Daruma, Prt/GCPI) of C. psittaci, 1 strain (Gp/Ie) of C. caviae, 7 strains (Fe/Pnl, Fe/ 145, Fe/Cello, Fe/B 166, Fe/C 164, Fe/C429, Fe/C454) of C. felis, 5 strains (Bo/ESST, Bo/Maeda, Bo/Shizuoka, Koala (type 2), Ov/IPA) of C. pecorum, 1 strain (TW/83T) of C. pneumoniae and 6 strains (A/Har-l T, B/TW-5/0T, C/ TW-3/0T, DfUW-3/Cx, EfUW-5/Cx, L2/434/Bu) of C. trachomatis (Pudjiatmoko et aI., 1997). To confirm the specificity of PCR, the following agents were tested: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae (Gifu 8766 strain), Bordetella bronchoseptica (Gifu 1127 strain), Mycoplasma pneumoniae, Escherichia coli (C600 strain), Haemophilus influenzae (Gifu 3191 strain), Klebsiella pneumoniae (Gifu 2929 strain), Leginella pneumophila (SL94-1 strain), Leginella pneumophila (SL94-2 strain), Coxiella burnetii (Nine Mile ATCC YR 615 strain), Orientia tsutsugamushi (Gilliam Strain), Orientia tsutsugamushi (Karp strain) and Orientia tsutsugamushi (Kato strain). These strains were kindly provided by Dr. T. Ezaki of Gifu University, Japan and Dr. A. Tamura of Niigata College of Pharmacy, Japan.

Clinical samples

One hundred and forty throat swabs were collected from junior high school students with respiratory diseases. Eleven conjunctival swabs were collected from cats suffering conjunctivitis at the animal hospital of Gifu University and Tokyo Metropolitan Institute. Thirty-three fecal samples from crows and ten liver tissue samples from parakeets with systemic infections were also tested.

Preparation of chlamydial DNA

Procedures for preparation of Chlamydophila DNA have been described previously (Fukushi and Hirai, 1989). Extraction of chlamydial DNA from throat swabs, sera and fecal samples was performed according to the protocol of Higuchi (Higuchi, 1989). Briefly, all the samples were suspended in 1 ml of PBS in a 1.5 ml Eppendorf micro centrifuge tube, and centrifuged at 13,000 x g for 20 sec. The pellet was resuspended in 1 ml of washing buffer (10 mM Tris­HCI (pH 8.3), 50 mM KCI, 1.5 mM MgC12), and centrifuged at 13,000 x g for 20 sec. The pellet was resuspended in 1 ml lysis buffer (0.32 M sucrose, 10 mM tris-HCI (pH 7.5), 1 % Triton X-lOO), and centrifuged at 13,000 x g for 20 sec. DNA was released from the pellet by adding PCR buffer with nonionic detergents (50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 2.5 mM MgCI2, 0.1 mg/mi gelatin, 0.45 % NP40 and 0.45 % Tween 20), and proteinase K (120 pg/ml) to the washed pellet. The mixture was incubated for 1 h at 55° C, boiled for 10 min, and then chilled on ice.

Nucleotide primers

For amplifying chlaniydial 16S rRNA gene, a pair of primer 16SA-16SB, was constructed from the 16S rRNA sequences of the family Chlamydiaceae (Pudjiatmoko et at., 1997). Internal primers were prepared from the 16S rRNA gene from the C. felis, C. psittaci, C. pecorum, C. pneumoniae and C. trachomatis for the nested PCR. The primers were designated as ChFeA-ChFeB, ChPsA-ChPsB, ChPeA-ChPeB, ChPnA-ChPnB, and ChTrA-ChTrB primers for the C. felis, C. psittaci, C. pecorum, C. pneumoniae and C. trachomatis, respectively (Table 1). The combination of ChFeA-ChPsA-ChPsB primers was used in a one-step reaction carried out in a single tube for genotyping of C. caviae, C. felis and C. psittaci. The length of the DNA fragments generated in the PCRs are shown in Table 2.

PCR amplification of clinical samples

Chlamydopila 16S rRNA genes were amplified by using a pair of 16SA and 16SB primers in the first PCR. The PCR was performed with 5 ul of throat swab, fecal, cell culture samples or chromosomal DNA of Chlamydopila extracts in a total volume of 50 ul. Five ul of the first PCR product was submitted to the nested PCR using a pair of family- and species-specific DNA primer. The final reaction mixture contained 40 pmol of each primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KC1, 1.0-2.0 mM MgCI2, 200 pM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 0.01 % gelatin, and 2.5 units of Taq polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) in 50 ul. Concentration of MgCl2 was 1.0 mM for ChPsA-ChPsB, ChFeA-CbPsB and ChTrA-ChTrB primers, 1.5 mM for 16SA-16SB, ChA-ChB, and ChPnA-ChPnB primers, and 2.0 mM for ChPeA­ChPeB primers. The components and procedure for the multiplex PCR were described above except 2 sense primers for C. felis (ChFeA) and C. psittaci (ChPsA) and an antisense primer for C. psittaci (ChPsB) was used in the method. The thermal cycle amplification program for the first PCR was as follows: initial melting at 94°C for 3 min and then 35 cycles with denaturation at 94°C for 1 min, annealing at 55°C for 1 min and extension at 72°C for 2 min and the last extension for 7 min follow by holding at 4°C. The program for nested PCR was as follows: initial melting at 94°C for 3 min and then 35 cycles with denaturation at 94°C for 30 see, annealing at 55°C for 30 sec and extension at 72°C for 2 min and the last extension for 7 min follow by holding at 4 C. Five ul PCR products were electrophoresed in 2 % agarose gel. DNA was stained with ethidium bromide and visualized by UV light.

Table 2. Specificity of peR test of 5 species-spesific primer sets of Chlamydophila

Isolation of Chlamydophila

Clinical specimens were ground to make a 10 % emulsion in SPG containing 500 ug/ml streptomycin and Kanamycin. The mixtures were clarified by centrifugation. The supernatant fluid was inoculated into yolk sac of specific pathogen-free embryonated chicken eggs that had been incubated at 37°C for 6­7 days. The inoculated eggs were incubated at 37°C for 3 - 7 days, and yolk sac smears were microscopically examined for viable Chlamydiae after staining by the Gimenez method (Schachter, 1988).

RESULTS

Specificity of PCR amplification

To evaluate the specificity of our primer sets, 25 Chlamydophila and 2 Gram-negative and 7 Gram­positive bacterial and 4 Rickettsial strains were tested in this study. In the first PCR, the 16S rRNA gene fragment of all Chlamydophila strains was amplified by the family-specific primer set of 16SA-16SB, and the size of PCR product was about 1470 bp (Figure 1). In the second PCR, the 16S rRNA gene fragment of all Chlamydophila DNA was examined by amplification with the family specific-primer set, ChA-ChB. The size of PCR product was about 390 bp (Figure 1). A DNA product of approximately 820 bp in size was observed with C. pneumoniae DNA with the primer set ChPnA-ChPnB. DNA products with approximately 200 bp and 250 bp were observed with the C. feils and C. psittaci DNA with the primer sets of ChFeA-ChFeB and ChPsA-ChPsB, respectively (Figure 2). DNA products with approximately 420 bp and 160 bp were observed with C. pecorum and C. trachomatis DNA with the primer sets of ChPeA-ChPeB and ChTrA-ChTrB, respectively (Figure 3). The 16S rRNA gene fragments of C. caviae were amplified by primer sets of ChFeA­ChFeB and ChPsA-ChPsB, or ChFeA-ChPsB. The 16S rRNA gene fragment of C. felis was also amplified by primer set of ChFeA-ChPsB. Thus the species specific sets were specific for each species except guinea pig (Table 2). All 2 Gram-positive and 7 Gram-negative bacterial and 4 Rickettsial strains tested yielded no PCR product with all primer pairs used in both the first and second PCR.

Multiplex PCR

To simplify PCR reaction, co-amplification was carried out by simultaneous use of three primers (ChFeA, ChPsA and ChPsB) ina single tube. In this reaction, the ChFeA-ChPsB primer pair produced about 410 bp of the fragment of , C. felis strains, while ChPsA-ChPsB primer pair produced about 250 bp fragment of C. psittaci strains (Figure 4). These primer pairs produced two previously identified fragments with C. caviae strain. However, Chlamydophila strains from other genetic groups did not produce any PCR products.

Sensitivity of PCR amplification

The sensitivity of the PCR method developed in the present work was evaluated by testing serial dilution of purified DNA from 25 Chlamydophila strains. In the first PCR, PCR signals from 0.5 pg to 50 ug of template DNA could be detected in 50 ul aliquots of reaction. When the first PCR products were submitted to nested PCR, detectable levels were from 5 fg to 50 ng of the original template Chlamydophila DNA (Figure 4).

Direct detection of Chlamydophila from clinical specimens

After the specificity and sensitivity of the PCR method were determined, the evaluation of direct detection and genotyping of Chlamydophila from clinical samples was done simultaneously. Chlamydophila organisms were detected by multiplex PCR in 1 liver specimen from 10 parakeets, 2 conjunctival swabs from 11 cats, 2 fecal specimens from 33 crows, and 5 throat swabs from 140 humans. PCR results in parakeets and cats were confirmed by isolation. Isolation was not attempted with crow and human specimens. The species o~ these ten positive PCR amplified DNAs were determined to be a C. psittaci from parakeet, two C. psittaci from crows, a C. psittaci from human, a C. felis from cat, a C. felis from parakeet, and four C. felis from humans. The genotype of isolates from parakeets and cats confirmed the PCR typing results.

DISCUSSION

The PCR using primers targeted to the 16S rRNA gene were developed for direct identification of Chlamydophila spp. in the present study. The specificity of the amplifications was confirmed by sequencing of DNA from PCR amplified products and isolates from clinical samples. Using a primer set for the family Chlamydiaceae in combination with five primer sets for the existing species C. caviae, C. felis, C. psittaci, C. pecorum, C. pneumoniae, and C. trachomatis, each designated chlamydial species was able to be differentiated. The method was applied for detection and direct typing of Chlamydophila for clinical samples from humans and animals. The results of the study demonstrated that this method may be useful for laboratory diagnosis.

The sensitivity of our method that detect 1 to 50 IFU or 5 to 50 fg is equivalent to other method that use the MOMP gene (Campbell et al., 1992; Valassina et al., 1995), l6S rRNA gene (Gaydos et al., 1992) and plasmid (Valassina et al., 1995). The PCR with species-specific primer pairs could identified species of Chlamydophila. However, no amplification was observed with other bacteria in both of the PCR. The results indicated that the PCR methods revealed specific to detect family Chlamydiaceae and identify genetic groups of Chlamydophila.

Currently 3 genetic groups are recognized for C. Caviae, C. felis and C. psittaci (Pudjiatmoko et al., 1997; Everett et aI., 1999). Differentiation ofthese 3 genetic groups requires 6 primers (3 sense and 3 antisense primers) using 3 sets of tubes. In method of this study, PCR was carried out using three primers (two sense primers and an antisense primer) in a single tube for both detect and identify species C. caviae, C. felis, and C. psittaci simultaneously. This multiplex PCR method uses less reagent, time and labor. The multiplex PCR technique appears to be suitable method for a rapid detection and genotyping of Chlamydophila isolates.

No case of feline chlamydiosis in human has been reported in Japan. It is also rare in other countries. A human case of feline pneumonitis was reported in 1969 (Schachter et al., 1969). Our study found 4 out of 140 high school children have feline pneumonitis. This result indicate that transmission of feline pneumonitis from cats to human is not rare and infection is often subclinical.

ACKNOWLEDGMENT

This study was supported by grants-in-aid for Scientific Research from the Japanese Ministry of Education, Science, Sports and Culture.

REFERENCES

Campbell, L.A., M.P. Melgosa, D.J. Hamilton and C.-C. Kuo. 1992. Detection of Chlamydia pneumoniae by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 30: 434439.

Campbell, L.A., D.L. Patton, D.E. Moore, A.L.

Cappuccio, B.A. Mueller and S.-P. Wang. 1993. Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility. Fertil. Steril. 59: 45-50.

Domeika, M., A. Ganusauskas, M. Bassiri, G.

Froman and P.-A. Mardh. 1994. Comparison of polymerase chain reaction, direct immunofluorescence, cell culture and enzyme immunoassay for detection of Chlamydia psittaci in bull semen. Vet. Microbiol. 42: 273-280.

Everett, K.D.E., R.M. Bush and A.A. Andersen. 1999. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fain. novo and Simkaniaceae fain. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. I. Syst. Bacteriol. 49: 415-440.

Fukushi, H. and K. Hirai. 1989. Genetic diversity of avian and mammalian Chlamydia psittaci strains and relation to host origin. J. Bacteriol. 171: 2850-2855.

Fukushi, H. and K. Hirai. 1992. Proposal of Chlamydia pecorum sp. novo for Chlamydia strains derived from ruminants. Int. J. System. Bacteriol. 42: 306-308.

Fukushi, H. and K. Hirai. 1993a. Chlamydia pecorum - The forth species of genus Chlamydia Microbiol. Immunol. 37: 5 15-522.

Fukushi, H. and K. Hirai. 1993b. Restriction fragment length polymorphisms of rRNA as genetic markers to differentiate Chlamydia spp. Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 613-617.

Fukushi, H. and K. Hirai. 1994. Heterogeneity and homogeneity of ompA (the major outer membrane protein) and GroEL-homolog genes of avian and mammalian Chlamydia psittaci by PCR-based RFLP analysis. In: Orfila, J., G.I. Byrne, M.A. Cherne sky, J.T. Grayston, R.B. Jones, G.L. Ridgway, P. Saikku, J. Schachter, W.E. Stamm and R.S. Stephens (eds.). Eighth International Symposium on Human Chlamydial Infections. pp. 589-592.Societa Editrice Esculapio, Bologna.

Gaydos, e.A., T.e. Quinn and J.J. Eiden. 1992 ..

Identification of Chlamydia pneumoniae by DNA amplification of the 16S rRNA gene. J. Clin. Microbiol. 30: 796-800.

Grayston, 1. T., e.~C. Kuo, L. A. Campbell, and S.

Wang. 1989. Chlamydiapneumoniae sp. novo for Chlamydia sp. strain TWAR. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 88-90.

Higuchi, R. 1989. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In: Erlich, H.A. (ed.) PCR Technology: Principles and applications for DNA amplification. pp. 31-38. Stockton Press, New York, London, Tokyo, Melbourne, Hongkong.

Holland, S.M., e.A. Gaydos and C. Quinn. 1990.

Detection and differentiation of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification. J. Infect. Dis. 162: 984-987.

Kaltenboeck, B., K.G. Kousoulas and J. Storz. 1991. Detection and strain differentiation of C. psittaci mediated by two-step polymerase chain reaction. Clin. Microbiol. 29: 1969-1975.

Kaltenboeck, B., K.G. Kousoulas and J. Storz. 1993. Structures of allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the four chlamydial species. J. Bacteriol. 175: 487-502.

Kaltenboeck, B. and 1. Storz. 1992. Biological properties and genetic analysis ofthe ompA locus in chlamydiae isolated from swine. Am. J. Vet. Res. 53: 1482-1487.

Mahony, J. B., K. E. Luinstra, 1. W. Sellors and M.A. Chernesky. 1993. Comparison of plasmid­and chromosome- based polymerase chain reaction assay for detecting Chlamydia trachomatis nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 31: 1753-1758.

Moulder, J. W., Hatch, T. P., Kuo, C.-C., Schachter, J. and Storz, J. 1984. Genus I. Chlamydia. Jones, Rake and Stearns 1945, 55AL. In : Krieg, N. R. and Holt, J. G. [eds.] Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. voLl. pp. 729-739. Williams & Wilkins. Baltimore.

Pudjiatmoko, H. Fukushi, Y. Ochiai, Y. Yamaguchi and K. Hirai. 1996. Diversity of feline Chlamydia psittaci revealed by random amplification of polymorphic DNA. Vet. Microbiol. 54: 73-83.

Pudjiatmoko, H. Fukushi, Y. Ochiai, T. Yamaguchi and K. Hirai. 1997. Phylogenetic analysis of the genus Chlamydia based on 16S rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:425-431.

Schachter, J., H.B. Ostler and K.F. Meyer. 1969.

Human infection with the agent of feline pneumonitis. Lancet 1, 1063-1065.

Schachter, J. 1988. Chlamydiaceae: The Chlamydiae., p. 847-863. In : Lennette, E., P. Halonen, and F. A. Murphy (Eds.), Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases. Principles and Practice, Vol. II: Viral, Rickettsial and Chlamydia I Diseases. Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, London, Paris, Tokyo.

Stamm, W.E. 1988. Diagnosis of Chlamydia trachomatis genitourinary infections. Ann. Intern. Med. 108: 710-717.

Storz, J. and H. Krauss. 1985. Chlamydia. In: BIobel, H. and T. Schlieser (eds.). Handbuch der Bakteriellen Infektionen bei Tieren. pp. 446-531. VEB Gustav Fisher Verlag, Jena, Jena.
Thomas, R., H.C. Davison and AI. Wilsmore. 1990.

Use of the IDEL4 ELISA to detect Chlamydia psittaci (ovis) in material from aborted fetal membranes and milk from ewes affected by ovine enzootic abortion. Br. Vet. 1. 146: 364-367.
Valassina, M., M.G. Cusi, D. Corsaro, C. Buffi, G.

Piazzesi and V.P.E. 1995. Detection by multiplex polymerase chain reaction and typing of Chlamydia trachomatis isolates. FEMS Microbiol. Lett. 130: 205-2 10.

Terapi hormon Estradiol-17β dan Tiroksin untuk Peningkatan Tingkat Kematangan Gonad (TKG) Induk Ikan Patin (Pangasius pangasius) Sebagai Plasma Nutfah

Oleh: MUHAMMAD FIQRIE RAHMAN (B04104108)

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2008

Sumberdaya Alam Hayati dan Plasma Nutfah Indonesia
Indonesia merupakan negara yang memiliki kekayaan keanekaragaman hayati yang tinggi. Pemanfaatan keanekaragaman hayati telah digunakan untuk memenuhi kebutuhan pangan, papan, sandang, dan obat-obatan. Kecukupan pangan akan tergantung pada ketersediaan varietas unggul yang berproduksi tinggi dan tahan cekaman biotik dan abiotik. Pada dasarnya varietas unggul itu adalah kumpulan dari keanekaragaman genetik spesifik yang diinginkan dan dapat diekspresikan. Keanekaragaman genetik spesifik tersebut ada pada plasma nutfah komoditi yang bersangkutan. Jadi plasma nutfah adalah keanekaragaman genetik di dalam jenis. Keanekaragaman genetik tersebut harus dipertahankan keberadaannya, bahkan harus diperluas agar selalu tersedia bahan untuk pembentukan varietas unggul (Somantri 2005).

Pemanfaatan Plasma Nutfah
Plasma nutfah yang kita miliki tidaklah berarti tanpa pemanfaatan untuk kesejahteraan. Pemanfaatan plasma nutfah dapat dilakukan dengan berbagai cara, tergantung pada tujuan yang ingin dicapai. Pemanfaatan plasma nutfah bisa secara langsung atau melalui proses pemuliaan. Pemanfaatan plasma nutfah melalui pemuliaan lebih membutuhkan dasar-dasar ilmiah daripada pemanfaatan plasma nutfah secara langsung. Di dalam teknik pemuliaan saat ini dikenal dengan istilah pemuliaan secara konvensional dan pemuliaan secara in-konvensional melalui bioteknologi (Somantri 2005).

Potensi Sumberdaya Ikan
Sebagai sumber plasma nutfah dan genetik, perairan umum daratan Indonesia memiliki keanekaragaman jenis ikan yang tinggi, sehingga tercatat sebagai salah satu perairan dengan ”mega biodiversity” di dunia. Komisi Nasional Plasma Nutfah Indonesia melaporkan bahwa perairan umum daratan Indonesia mengandung kekayaan plasma nutfah ikan yang jenisnya sangat banyak mencapai 25% dari jumlah jenis ikan yang ada di dunia. Di perairan umum daratan Indonesia yang meliputi Sumatera, Jawa, Kalimantan dan Sulawesi saja, dihuni oleh lebih dari 1000 jenis ikan, bahkan menurut FAO, perairan umum daratan Indonesia dihuni oleh sekitar 2000 jenis ikan. Banyak diantara jenis ikan yang ada belum tercatat atau belum teridentifikasi sehingga jumah jenisnya dari tahun ke tahun selalu bertambah (Kartamihardja et al 2008).

Peran Sektor Perikanan Darat
Ditinjau dari sektor perikanan, perairan umum daratan sebagai salah satu wilayah pengelolaan perikanan Republik Indonesia berperanan penting dalam hal sebagai berikut: (1) sumber protein dan ketahanan pangan; (2) sumber ekonomi masyarakat; (3) sumber lapangan kerja; (4) sumber plasma nutfah dan genetik, (5) sumber devisa dan pendapatan asli daerah, dan (6) obyek wisata alam (eco-turism).

Dewasa ini, kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi identifikasi dengan menggunakan DNA telah menambah catatan kekayaan jenis ikan di Indonesia. Sebagai contoh, jenis ikan yang termasuk famili Pangasidae (jenis-jenis patin/catfish) yang semula hanya dikenal 6 jenis, kini dengan menggunakan identifikasi DNA ternyata jenis-jenis ikan patin tersebut diketahui menjadi 12 jenis (Kartamihardja et al 2008).

Budidaya Ikan Patin
Banyak cara untuk memanfaatkan plasma nutfah yang begitu berlimpah di negeri ini. Salah satu cara pemanfaatannya adalah melalui budidaya ikan patin. Ikan patin djambal (Pangasius pangasius) merupakan ikan asli Indonesia yang berhasil didomestikasikan dan dipijahkan secara buatan pada tahun 1999. (Anonim 2008)

Ikan patin merupakan jenis ikan konsumsi air tawar, berbadan panjang berwarna putih perak dengan punggung berwarna kebiru-biruan. Ikan patin dikenal sebagai komoditi yang berprospek cerah, karena memiliki harga jual yang tinggi. Hal inilah yang menyebabkan ikan patin mendapat perhatian dan diminati oleh para pengusaha untuk membudidayakannya. Ikan ini cukup responsif terhadap pemberian makanan tambahan. Pada pembudidayaan, dalam usia enam bulan ikan patin bisa mencapai panjang 35-40 cm (Susanto 1997).

Pedoman Teknis Budidaya Ikan Patin
Budidaya ikan patin meliputi beberapa kegiatan, secara garis besar dibagi menjadi 2 kegiatan yaitu pembenihan dan pembesaran. Kegiatan pembenihan merupakan upaya untuk menghasilkan benih pada ukuran tertentu. Produk akhirnya berupa benih berukuran tertentu, yang umumnya adalah benih selepas masa pendederan.

Secara garis besar kegiatan usaha pembenihan ikan patin secara berurutan meliputi: Pemilihan calon induk siap pijah, persiapan hormon perangsang/kelenjar hipofise dari ikan donor, kawin suntik (induce breeding), pengurutan (stripping), penetasan telur, dan perawatan larva (Hernowo 2005).

Setelah dilakukan pemanenan pada usaha pembenihan, kegiatan budidaya dilanjutkan dengan pemeliharaan pembesaran. Secara garis besar, usaha pembesaran ikan patin meliputi empat hal mendasar, yaitu: pemupukan, pemberian pakan, pemeliharaan kolam, dan pemanenan. (Anonim 2008).

Permasalahan yang Dihadapi Petani Ikan Patin
Suatu kegiatan usaha pastinya tidak akan terlepas dari adanya berbagai permasalahan. Jika ditinjau berdasarkan tingkat perkembangan ikan patin, permasalahan yang timbul diantaranya adalah permasalahan mengenai induk, telur dan larva. Sedangkan berdasakan penyebabnya, permasalahan dapat timbul akibat hama dan penyakit.

Menurut salah satu petani pembenihan patin di daerah Cikampak, Ciampea Bogor, permasalahan yang kerap kali muncul adalah Lambatnya Tingkat Kematangan Gonad (TKG) pada indukan. Masalah yang satu ini tidak dapat dianggap sepele karena posisi TKG berada pada bagian hulu dari usaha budidaya. Manajemen budidaya merupakan kegiatan yang dilakukan secara berurutan sehingga segala aspek yang berada pada bagian hulu akan mempengaruhi kualitas produk di bagian hilir usaha.

Solusi
Ikan adalah biota yang tidak terlepas dari berbagai proses fisiologis tubuh. Kondisi lingkungan yang buruk di sekitar tempat budidaya menyebabkan perubahan kondisi fisiologis tubuh menjadi tidak seimbang (physiological imbalanced). Kondisi yang tidak seimbang ini berpengaruh pada seluruh sistem fisiologis tubuh, tak terkecuali sistem reproduksi. Permasalahan yang dihadapi petani ikan adalah lambatnya TKG yang dipengaruhi oleh berbagai macam faktor yang salah satunya adalah hormon reproduksi. Hormon reproduksi yang berperan pada TKG adalah Estradiol-17β (E2) dan Tiroksin (T4).

E2 merupakan hormon yang sangat penting yang dihasilkan oleh ovarium terutama pada ikan betina yang sedang mengalami vitelogenesis. E2 mengalami peningkatan secara bertahap pada fase vitelogenesis sejalan dengan meningkatnya ukuran diameter oosit. Adanya peningkatan konsentrasi E2 dalam darah akan memacu hati melakukan proses vitelogenesis dan selanjutnya akan mempercepat proses pematangan gonad.
T4 adalah hormon yang diproduksi oleh kelenjar tiroid. Hormon T4 membantu proses penyerapan vitelogenin oleh telur. Selain itu T4 juga berperan dalam meningkatkan sintesa protein melalui peningkatan transkripsi RNA. Interaksi hormon tiroid dan reseptor pada inti akan menyebabkan peningkatan aktifitas enzim polymerase sehingga aktifitas pembentukan RNA pun meningkat. Dengan meningkatnya proses transkripsi RNA yang dilanjutkan dengan sintesis protein, berarti dengan penyuntikan hormon T4 juga akan meningkatkan protein vitelogenin.

Implantasi E2 dapat meningkatkan kadar hormone dalam plasma darah. Beberapa penelitian melaporkan bahwa pemberian hormone E2 dapat secara efektif meningkatkan kadar E2 plasma darah ikan. Peningkatan kadar E2 darah pada induk patin/djambal siam terjadi pada hari ke-14 post injeksi LHRH dan E2 (Sularto 2002, diacu dalam Utiah 2006).

Menurut penelitian yang telah dilakukan pada ikan baung, tinggiya kadar E2 plasma dapat memperepat proses pematangan gonad. Pada kondisi seperti ini, lama waktu matang gonad dan ukuran diameter sel telur menunjukkan hasil yang terbaik (maksimum), akan tetapi derajat tetas telur yang dihasilkan rendah.

Pemberian hormon T4 pada dosis yang tinggi bersifat katabolic. Pengaruh T4 terhadap sintesis protein bersifat biphasic yaitu pada dosis yang rendah bersifat anabolic sedangkan pada dosis yang tinggi bersifat katabolic (Matty 1985, diacu dalam Utiah 2006). Adanya sifat biphasic T4 ini, dapat menyebabkan turunnya kadar protein vitelogenin yang diserap oleh telur dan pengaruhnya berlanjut pada proses embryogenesis. Selain menghambat sintesis protein, T4 yang terlalu tinggi dapat menyebabkan cepatnya turnover lemak dan karbohidrat (shahib 1989, diacu dalam Utiah 2006). Penelitian Nacario (1983) menunjukkan bahwa pemberian dosis T4 yang terlalu tinggi dapat menyebabkan terjadinya perkembangan yang tidak normal dari larva seperti kerusakan jaringan punggung (bengkok) dan pada bagian perut terjadi sklerosis.

Pemberian hormon T4 yang dikombinasikan dengan hormone E2 dapat mempercepat tingkat kematangan gonad (TKG). Selain mempengaruhi TKG, pemberian kombinasi hormon ini juga dapat meningkatkan derajat tetas telur dan total larva yang dihasilkan. Adanya fungsi T4 yang dapat meningkatkan sintesis protein menyebabkan jumlah protein pada vitelogenin lebih baik (Utiah 2006).

Kesimpulan
• Ikan patin merupakan plasma nutfah Indonesia yang harus dimanfaatkan sebagai basis pembangunan Negara dari sektor perikanan, karena ikan patin dikenal sebagai komoditi yang berprospek cerah.
• Pada proses budidaya pembenihan, rendahnya Tingkat Kematangan Gonad (TKG) induk ikan patin merupakan kendala utama budidaya.
• Pemberian hormon Tiroksin (T4) yang dikombinasikan dengan hormon Estradiol-17β (E2) dapat mempercepat TKG induk. Selain mempengaruhi TKG, pemberian kombinasi hormon ini juga dapat meningkatkan derajat tetas telur dan total larva yang dihasilkan.

Saran
• Krisis multidimensi yang terjadi di Indonesia disebabkan oleh melemahnya daya produksi bangsa. Sebagai salah satu upaya pengentasan krisis adalah melakukan kegiatan usaha yang bergerak pada sector real seperti pembudidayaan ikan patin.
• Untuk mendapatkan hasil produk yang baik, diperlukan sistem manajemen budidaya yang baik pula.
• Dengan diterapkannya terapi hormonal, harapannya para petani budidaya pembenihan ikan patin dapat mengatasi permasalahan rendahnya TKG. Dengan demikian satu permasalahan terpecahkan yang akan meningkatkan produksi para petani patin, dan akan berpengaruh pada peningkatan perekonomian bangsa dan negara melalui sektor perikanan darat.

Daftar Pustaka
Anonim. 2008. Budidaya Ikan Patin (Pangasius pangasius). http://www.iptek.net.id/ind/warintek/Bu ... hp?doc=3a7. [19 April 2008].
Hernowo. 2005. Pembenihan Patin. Jakarta : PT. Penebar Swadaya.
Kartamihardja ES, Purnomo K, Umar C. 2008. Sumberdaya Ikan Perairan Umum Daratan di Indonesia-Terabaikan. http://www.apsordkp.com/files/sumber_da ... baikan.pdf.
Somantri IH, Hasanah M, Kurniawan H. 2005. Teknik Konservasi Ex-Situ, Rejuvenasi, Karakterisasi, Evaluasi, Dokumentasi, dan Pemanfaatan Plasma Nutfah. http://indoplasma.or.id/artikel/artikel ... ervasi.htm. [19 April 2008]
Susanto H, Amri K. 1997. Budi Daya Ikan Patin. Jakarta : PT. Penebar Swadaya.
Utiah H. 2006. Penampilan Reproduksi Induk Ikan Baung(Hemibagrus nemurus blkr) dengan Pemberian Pakan Buatan yang Ditambahkan Asam LemakN-6 dan N-3 dan dengan Implantasi Estradiol-17 dan Tiroksin [Disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana Institut Pertaian Bogor.

Analisis Permintaan Kedelai Indonesia

Kedelai merupakan sumber protein nabati yang tinggi serta sumber lemak, vitamin dan mineral yang sering dikonsumsi masyarakat dalam negeri. Angka konsumsi kedelai dalam negeri cukup besar. Kebutuhan kedelai tahun 2002 mencapai 1,2 juta ton. Untuk memenuhi kebutuhan dalam negeri, Indonesia masih harus terus melakukan impor yang rata-rata sebesar 40% dari kebutuhan kedelai nasional meningkat dari tahun ke tahun, produksi dalam negeri masih relatif rendah dan memiliki kecenderungan terus menurun. Hal ini menyebabkan ketergantungan akan kedelai impor terus berlangsung dan memiliki kecenderungan terus meningkat. Berdasarkan latar belakang tersebut muncul beberapa permasalahan. Faktor apa saja yang mempengaruhi permintaan kedelai impor dan kedelai domestik. Bagaimana hubungan permintaan kedelai domestik dengan kedelai impor. Bagaimana kinerja produksi kedelai domestik dan permintaan kedelai dari tahun ketahun.

Adapun tujuan diadakannya penelitian ini adalah mengidentifikasi variabel variabel yang mempengaruhi permintaan kedelai impor dan kedelai domestik. Mengidentifikasi hubungan permintaan kedelai domestik dengan kedelai impor. Mengetahui proyeksi kinerja produksi kedelai domestik, impor dan permintaan kedelai dari tahun ketahun
Hipotesis penelitian ini (1) Diduga permintaan kedelai domestik dan permintaan kedelai impor dipengaruhi oleh harga kedelai domestik, harga kedelai impor, jumlah penduduk dan pendapatan penduduk. (2) Diduga elastisitas harga kedelai domestik terhadap permintaan kedelai domestik bernilai negatip. Elastisitas harga silang kedelai domestik terhadap permintaan kedelai impor bernilai positif untuk barang substitusi. Elastisitas pendapatan penduduk terhadap permintaan kedelai bernilai positif untuk barang normal. (3) Diduga kinerja produksi kedelai domestik dan permintaan kedelai dari tahun ke tahun mengalami peningkatan.

Jenis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data sekunder yang meliputi data produksi kedelai domestik, jumlah kedelai impor, harga kedelai domestik dan harga kedelai impor, kurs tengah Dolar terhadap Rupiah, pendapatan penduduk dan jumlah penduduk. Data tersebut diambil dari Biro Pusat Statistik (BPS) dan Food Organitation (FAO).

Dalam menganalisis data digunakan tiga metode analisis (1) Untuk menentukan faktor-faktor yang mempengaruhi permintaan dalam analisis statistik, digunakan fungsi bentuk Regresi linear berganda yang menggunakan persamaan Y=a+ bX+ bX+bX + bX + εi. Dimana; Y = Jumlah permintaan kedelai, X = Harga kedelai domestik, X= Harga kedelai impor, X= Pendapatan penduduk, X= Jumlah penduduk, a= Konstanta, b- b= Nilai koefesien, εi = Error term. (2) Untuk mengetahui keterkaitan permintaan kedelai impor dan kedelai domestik maka digunakan model elastisitas permintaan yang meliputi:
(a) Elastisitas harga barang itu sendiri E= .
(b) Elastisitas harga silang terhadap permintaan E= .
(c) Elastisitas pendapatan terhadap permintaan E= . ,
(3) Untuk memproyeksi kinerja produksi kedelai domestik, volume impor dan permintaan kedelai dari tahun ke tahun maka digunakan analisa trend. Y = a + bx. Dimana; x = Periode waktu, Y = Permintaan kedelai, a = Nilai Y apabila x = 0, b= Besarnya perubahan variabel Y yang terjadi pada setiap perubahan satu unit variabel x.

Dari hasil penelitian dan pembahasan didapatkan 5 hal penting yaitu

(1) Variabel yang mempengaruhi permintaan kedelai domestik adalah variabel harga kedelai domestik (X1) sebesar 0,501 berarti bahwa setiap penambahan Rp.1,- per ton harga kedelai domestik akan meningkatkan permintaan kedelai domestik sebesar 0,501 ton.

Variabel harga kedelai impor (X2) sebesar 4.759,670, berarti bahwa setiap penambahan $ 1,- per ton harga kedelai impor akan menyebabkan penurunan permintaan kedelai domestik sebesar 4759,670 ton.

Variabel pendapatan penduduk (X3) sebesar 0,665 berarti bahwa setiap penambahan pendapatan penduduk sebesar Rp. 1,- perkapita pertahun maka permintaan kedelai domestik akan turun sebesar 0,665 ton.

Variabel jumlah penduduk (X4) sebesar 64,317 menyatakan bahwa setiap penambahan jumlah penduduk sebanyak 1000 jiwa maka akan meningkatkan permintaan kedelai domestik sebesar 64,317 ton.

(2) Variabel yang mempengaruhi permintaan kedelai impor adalah variabel harga kedelai impor (X2) sebesar 5.773,237 berarti bahwa setiap penambahan $ 1,- per ton harga kedelai impor akan menyebabkan penambahan permintaan kedelai impor sebesar 5.773,237 ton .

(3) Nilai elastisitas harga kedelai domestik terhadap permintaan kedelai domestik adalah -0,880. Hal tersebut berarti apabila harga kedelai domestik bertambah sebesar1% maka permintaan kedelai domestik akan menurun sebesar 0,880% per tahun. Nilai elastisitas harga kedelai impor terhadap permintaan kedelai domestik adalah 0,984. Hal tersebut berarti apabila harga kedelai impor meningkat sebesar 1% maka permintaan kedelai domestik akan naik sebesar 0,984% per tahun. Karena E adalah positif maka hubungan antara kedelai domestik dan kedelai impor adalah subtitusi. Nilai elastisits pendapatan penduduk terhadap permintaan kedelai domestik bernilai 2,684. Hal tersebut berarti apabila pendapatan penduduk meningkat sebesar 1% maka permintaan kedelai domestik akan naik sebesar 2,684% (karena En>0) maka kedelai domestik disebut barang normal.

(4) Nilai elastisitas harga kedelai impor terhadap permintaan kedelai impor adalah –2,446. Hal tersebut berarti apabila harga kedelai impor meningkat sebesar1% maka permintaan kedelai impor akan turun sebesar 2,446%. Nilai elastisitas pendapatan penduduk terhadap permintaan kedelai impor bernilai -3,611. Hal tersebut berarti apabila pendapatan penduduk naik sebesar 1% maka permintaan kedelai domestik akan turun sebesar 3,611% (karena En<0>).

Respon Dosis Vaksin Inaktif Chlamydosis

Proceedings of Temu Ilmiah VIII, 1999: 269
Pub. ISSN : 0918-7685

Pudjiatmoko

National Veterinary Drug Assay Laboratory , Gunungsindur, Bogor 162340

Nine 12-week-old specific-pathogen-free (SPF) cats were randomly divided into three groups. Groups A and B were vaccinated with an experimental vaccine derived from the Fe/145 strain of feline Chlamydia psittaci. Cats of group A were injected intramuscularly with vaccine containing 10^5.5ELD50 of Chlamydia and those of the group B were vaccinated with 10^4.5ELD50 of Chlamydia. Cats of group C were injected with suspension of sucrose-phosphate-glutamic acid and adjuvant as control. Vaccinations were performed twice. The second vaccination was done on 3 weeks post first vaccination. One week post second vaccination, cats were challenged intraocular with live feline C. psittaci B166 strain. Two cats of group A showed clinical signs of Chlamydiosis. All cats of the groups B and C showed the clinical signs. IgG antibody titer was determined by using microimmunofluorescence test. On the day of challenge, IgG antibody titers of cats of group A were 1:128 to 1:256, while those of group B were 1:64 to 1:128. The results indicate that cats should be injected with the vaccine containing Chlamydia more than 10^5.5ELD50 to give good protection against infection of Chlamydia.

In vitro susceptibility of C. pecorum to Antibiotics

 

 

In vitro susceptibility of Chlamydia pecorum to macrolides, tetracyclines, quinolones and beta-lactam.

 

Microbiol Immunol. 1998; 42(1): 61-3. 

 

Pudjiatmoko, Fukushi H, Ochiai Y, Yamaguchi T, and Hirai K.

Department of Veterinary Microbiology, Faculty of Agriculture, Gifu University,

Yanagido, Japan.

 

The in vitro susceptibility of Chlamydia pecorum to two macrolides (clarithromycin and erythromycin), two tetracyclines (doxycycline and minocycline), two quinolones (ofloxacin and ciprofloxacin) and one beta-lactam (ampicillin) was determined. The MICs were 0.004 to 0.008 microg/ml for clarithromycin, 0.008 to 0.031 microg/ml for doxycycline and minocycline, 0.063 to 0.125 microg/ml for erythromycin, 0.25 to 0.5 microg/ml for ofloxacin and 0.25 to 1.0 microg/ml for ciprofloxacin. The MIC for ampicillin was greater than 1,024 microg/ml. The results show clarithromycin and doxycycline are the two most effective drugs against C. pecorum.

Seroepidemiology of feline chlamydiosis

 

Seroepidemiology of feline chlamydiosis by microimmunofluorescence assay with multiple strains as antigens.

 

Microbiol Immunol. 1996 ;40 (10):755-9

Pudjiatmoko, Hideto Fukushi, Yoshitsugu Ochiai, Tsuyoshi Yamaguchi and Katsuya Hirai

Department of Veterinary Microbiology, Faculty of Agriculture, Gifu University, Yanagido 1-1, Gifu 50I-11, Japan

 

Abstract

The prevalence of anti-chlamydia antibodies was examined in 232 cat sera collected in 1985 and from 1993 to 1995 from laboratories and veterinary hospitals located in 11 prefectures of Japan. The antibodies were determined by an indirect microimmunofluorescence test using six strains of feline Chlamydia: one strain each of avian- and guinea pig-derived C. psittaci and one strain each of C.pecorum, C.pneumoniae and C.trachomatis. Positive rates of IgG antibodies to chlamydiae were 34.4% in 1985 and 16.5-21.4% from 1993 to 1995. Positive rates of IgM antibodies to chlamydiae were 8.2% in 1985 and 6.6-14.3% from 1993 to 1995. Variations in antibody reactivity to the different feline strains were observed. The results suggest the wide prevalence of chlamydial infection in cats in Japan, and antigenic diversity in the feline strains of C.psittaci.

Diversity of feline Chlamydia psittaci

 

Diversity of feline Chlamydia psittaci revealed by random amplification of polymorphic DNA

 

Veterinary Microbiology
Volume 54, Issue 1, January 1997, Pages 73-83

 

Pudjiatmoko, Hideto Fukushi, Yoshitsugu Ochiai, Tsuyoshi Yamaguchi and Katsuya Hirai

Department of Veterinary Microbiology, Faculty of Agriculture, Gifu University, Yanagido 1-1, Gifu 50I-11, Japan
 

Received 25 April 1996; accepted 5 August 1996. ; Available online 9 December 1997.

Abstract

DNA samples from C. psittaci including 6 strains of feline origin, 10 strains of avian origin, 1 strain of ovine origin and 1 strain of guinea pig origin were amplified each with three 10-nucleotide (nt) primers and four > 18-nt primers. Amplified products were separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Eight patterns were recognized by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting of C. psittaci: 2 patterns of feline origin, 5 patterns of avian origin and 1 pattern of guinea pig origin. DNA of feline or guinea pig origin was clearly distinguished from the other strains of C. psittaci by RAPD analysis, as shown by the absence of any common fragments in electrophoresis. The RAPD analysis indicated at least 2 types of feline C. psittaci. The RAPD typing is suggested as a convenient tool for molecular epidemiology of chlamydial infection.

Author Keywords: Chlamydia psittaci; Cat; Polymerase chain reaction; DNA amplification

Phylogenetic Analysis of the Genus Chlamydia

 

Phylogenetic analysis of the genus Chlamydia based on 16S rRNA gene sequences

 

International Journal of Systematic Bacteriology, Vol 47, 425-431 

 

Pudjiatmoko, H Fukushi, Y Ochiai, T Yamaguchi and K Hirai
Department of Veterinary Microbiology, Faculty of Agriculture, Gifu University, Japan.

 

 Abstract

The phylogenetic relationships among Chlamydia spp. were investigated by comparing 16S rRNA gene sequences. In this analysis we used 14 strains of Chlamydia psittaci, including seven feline isolates, two avian isolates, two human isolates, one bovine isolates, one ovine isolate, and one koala isolate; and nine strains of Chlamydia trachomatis, including six human isolates, two swine isolates, and one mouse isolate. A phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequences of these organisms and seven previously published sequences revealed eight genetic groups which formed two clusters. The first cluster was composed of C. pecorum, Chlamydia pneumoniae, and C. psittaci and included three genetic groups (one group containing avian, human, and ovine strains, one group containing feline strains, and one group containing guinea pig strains). The second cluster was composed of C. trachomatis and also included three genetic groups (one group containing human strains, one group containing swine isolates, and one group containing rodent strains). The strains in each genetic group exhibited similar genetic distances. The results of the phylogenetic analysis agreed with the results of previous genomic DNA, ompA gene allele, and biotyping studies. Therefore, the genetic groups based on genetic distances may be considered a criterion for species identification.