CRISPR sebagai sistem kekebalan tubuh bagi bakteri

CRISPR adalah singkatan dari Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, yakni suatu sekuens DNA dengan repitisi pendek dan tiap repitisi tersebut diikuti dengan segmen pendek lainnya yakni DNA Spacer sehingga tersusun secara selang-seling yang terdapat pada genom bakteri. Secara alami, CRISPR berfungsi sebagai sistem kekebalan tubuh bagi bakteri terhadap invasi materi genetik asing.

CRISPR-Cas9 merupakan alat pengeditan genom yang menciptakan buzz di dunia sains. Cara ini lebih cepat, lebih murah dan lebih akurat daripada teknik pengeditan DNA sebelumnya dan memiliki berbagai aplikasi yang potensi.

 

Makna CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 adalah teknologi unik yang memungkinkan ahli genetika dan peneliti medis mengedit bagian genom dengan menghapus, menambah atau mengubah bagian urutan DNA.

Saat ini metode manipulasi genetik yang paling sederhana, paling serbaguna dan tepat dan karena itu menyebabkan issue utama di dunia sains.

 

Cara Kerja CRISPR-Cas9

·  Sistem CRISPR-Cas9 terdiri dari dua molekul kunci yang memperkenalkan perubahan (mutasi) ke dalam DNA. Ini adalah:

1.    Sebuah enzim disebut Cas9

Ini bertindak sebagai sepasang 'gunting molekuler' yang dapat memotong dua untai DNA di lokasi tertentu dalam genom sehingga potongan DNA kemudian dapat ditambahkan atau dihilangkan.

2.    Sepotong RNA disebut guide RNA (gRNA).

Ini terdiri dari sepotong kecil urutan RNA yang telah dirancang sebelumnya (panjang sekitar 20 basa) yang terletak di dalam perancah RNA yang lebih panjang. Bagian perancah mengikat DNA dan urutan pra-desain 'membimbing' Cas9 ke bagian kanan genom. Ini memastikan bahwa enzim Cas9 memotong pada titik yang tepat dalam genom.

 

· Panduan RNA dirancang untuk menemukan dan mengikat urutan tertentu dalam DNA. Panduan RNA memiliki basa RNA? yang saling melengkapi? dengan urutan DNA target dalam genom. Ini berarti bahwa, setidaknya secara teori, RNA pemandu hanya akan mengikat pada urutan target dan tidak ada wilayah lain dari genom.

· Cas9 mengikuti panduan RNA ke lokasi yang sama dalam urutan DNA dan memotong kedua untai DNA.

· Pada tahap ini sel? mengenali bahwa DNA rusak dan mencoba memperbaikinya.

· Ilmuwan dapat menggunakan mesin perbaikan DNA untuk memperkenalkan perubahan pada satu atau lebih gen? dalam genom sel yang diinginkan.

Diagram yang menunjukkan cara kerja alat pengeditan CRISPR-Cas9. Image credit: Genome Research Limited.

 

                              Cara kerja CRISPR untuk mengedit gen

Pengenbangan Metode ini

Beberapa bakteri memiliki sistem pengeditan gen bawaan yang serupa dengan sistem CRISPR-Cas9 yang mereka gunakan untuk merespons patogen yang menyerang? seperti virus,? sangat mirip dengan sistem kekebalan tubuh.

Dengan menggunakan CRISPR, bakteri memotong bagian-bagian DNA virus dan menyimpannya sedikit di belakang untuk membantu mereka mengenali dan bertahan melawan virus saat menyerang lagi.

Para ilmuwan mengadaptasi sistem ini sehingga dapat digunakan di sel lain dari hewan, termasuk tikus dan manusia.

 

Teknik lain yang ada untuk mengubah gen

·  Selama bertahun-tahun para ilmuwan telah belajar tentang genetika dan fungsi gen dengan mempelajari efek perubahan DNA.

·  Jika Anda dapat membuat perubahan pada gen, baik dalam garis sel atau seluruh organisme, maka Anda dapat mempelajari efek perubahan itu untuk memahami apa fungsi gen itu.

· Untuk waktu yang lama ahli genetika menggunakan bahan kimia atau radiasi untuk menyebabkan mutasi. Namun, mereka tidak memiliki cara untuk mengontrol di mana mutasi akan terjadi dalam genom.

· Selama beberapa tahun para ilmuwan telah menggunakan 'penargetan gen' untuk memperkenalkan perubahan di tempat-tempat tertentu dalam genom, dengan menghapus atau menambahkan baik seluruh gen atau basa tunggal.

·  Penargetan gen tradisional telah sangat berharga untuk mempelajari gen dan genetika, namun butuh waktu lama untuk membuat mutasi dan cukup mahal.

·  Beberapa teknologi 'pengeditan gen' baru-baru ini dikembangkan untuk meningkatkan metode penargetan gen, termasuk sistem CRISPR-Cas, nuklease efektor seperti aktivator transkripsi (TALENs) dan nuklease jari-seng (ZFNs).

·  Sistem CRISPR-Cas9 saat ini menonjol sebagai sistem tercepat, termurah, dan paling andal untuk 'mengedit' gen.

 

Aplikasi dan implikasinya

·   CRISPR-Cas9 memiliki banyak potensi sebagai alat untuk mengobati berbagai kondisi medis yang memiliki komponen genetik, termasuk kanker, hepatitis B atau bahkan kolesterol tinggi.

· Banyak dari aplikasi yang diusulkan melibatkan pengeditan genom somatik (non-reproduksi) sel tetapi ada banyak minat dan perdebatan tentang potensi untuk mengedit cell germline (reproduksi).

·     Karena setiap perubahan yang dibuat pada cell germline akan diturunkan dari generasi ke generasi, hal itu memiliki implikasi etis yang penting.

·   Melakukan pengeditan gen dalam cell germline saat ini ilegal di Inggris dan sebagian besar negara lain.

·    Sebaliknya, penggunaan CRISPR-Cas9 dan teknologi pengeditan gen lainnya dalam sel somatik tidak kontroversial. Memang mereka telah digunakan untuk mengobati penyakit manusia pada sejumlah kecil kasus luar biasa dan/atau mengancam jiwa.

 

Sel sperma dan sel telur. Melakukan pengeditan gen dalam sel germline saat ini ilegal di Inggris. Kredit gambar: Shutterstock

 

Masa depan CRISPR-Cas9

·   Mungkin perlu bertahun-tahun sebelum CRISPR-Cas9 digunakan secara rutin pada manusia.

·  Banyak penelitian masih berfokus pada penggunaannya pada model hewan atau sel manusia yang diisolasi, dengan tujuan untuk akhirnya menggunakan teknologi tersebut untuk secara rutin mengobati penyakit pada manusia.

·    Ada banyak pekerjaan yang berfokus pada menghilangkan 'off-efek target, di mana sistem CRISPR-Cas9 memotong gen yang berbeda dengan gen yang dimaksudkan untuk diedit.

 

Penargetan CRISPR-Cas9 yang lebih baik

1. Dalam kebanyakan kasus, RNA pemandu terdiri dari urutan spesifik 20 basa. Ini melengkapi urutan target dalam gen yang akan diedit. Namun, tidak semua 20 basa harus cocok agar RNA pemandu dapat mengikat.

2. Masalah dengan ini adalah bahwa urutan dengan, misalnya, 19 dari 20 basa komplementer mungkin ada di suatu tempat yang sama sekali berbeda dalam genom. Ini berarti ada potensi RNA pemandu untuk mengikat di sana alih-alih atau sebaik pada urutan target.

3.  Enzim Cas9 kemudian akan memotong di situs yang salah dan akhirnya memperkenalkan mutasi di lokasi yang salah. Sementara mutasi ini mungkin tidak penting sama sekali bagi individu, itu bisa mempengaruhi gen penting atau bagian penting lain dari genom.

4.  Para ilmuwan ingin menemukan cara untuk memastikan bahwa CRISPR-Cas9 mengikat dan memotong secara akurat. Dua cara ini dapat dicapai adalah melalui:

· desain RNA panduan yang lebih baik dan lebih spesifik menggunakan pengetahuan kami tentang urutan DNA genom dan perilaku 'di luar target' dari berbagai versi kompleks Cas9-gRNA.

·   penggunaan enzim Cas9 yang hanya akan memotong satu untai DNA target daripada untai ganda. Ini berarti bahwa dua enzim Cas9 dan dua RNA pemandu harus berada di tempat yang sama agar pemotongan dapat dilakukan. Ini mengurangi kemungkinan pemotongan dilakukan di tempat yang salah.

Sumber:

https://www.yourgenome.org/facts/what-is-crispr-cas9#:~:text=CRISPR%2DCas9%20is%20a%20unique,buzz%20in%20the%20science%20world. Diakses 26 September 2021.

Penggunaan Ig Y Ayam untuk Kesehatan

Ada sejumlah keuntungan menggunakan sapi dan ayam untuk produksi antibodi. Produksi  Ig G kolostrum sapi atau produksi IgY ayam hanya membutuhkan pengumpulan susu atau telur, dan merupakan sumber antibodi yang relatif murah dibandingkan dengan pengumpulan darah pada mamalia lain.

Kolostrum dari hewan yang diimunisasi bisa memiliki peningkatan titer antibodi lebih dari 100 kali lipat dibandingkan dengan kolostrum dari hewan yang tidak diimunisasi (Janson et al., 1994). Kolostrum mengandung antara 30 dan 200 mg imunoglobulin per mililiter, sebagian besar (75%) di antaranya adalah IgG1 (Berghman et al., 2005).

Sapi menghasilkan sekitar 1-1,5 kg imunoglobulin dalam beberapa hari pertama setelah melahirkan; karena itu menarik untuk produksi antibodi skala besar. Protokol imunisasi bervariasi dan umumnya, imunisasi berulang diberikan selama akhir kehamilan atau selama periode kering kandang. Banyak dari studi ini telah menggunakan imunisasi intramuskular atau subkutan, meskipun beberapa juga telah memasukkan imunisasi oral atau intramammary tetapi dengan keberhasilan yang kurang.

Sekresi susu kemudian dikumpulkan pada saat pemerahan pertama atau dikumpulkan dari empat hingga enam pemerahan pertama atau dari enam hingga 10 hari pertama setelah melahirkan (Hurley dan Theil, 2011).

Produksi Ig Y ayam lebih mudah dan murah

Imunisasi ayam hanya membutuhkan sejumlah kecil antigen untuk mendapatkan titer IgY yang tinggi dan tahan lama dalam kuning telur (Tini et al., 2002). Rute injeksi yang paling umum adalah intramuskular karena menghasilkan tingkat antibodi IgY spesifik yang lebih tinggi daripada imunisasi subkutan (Chang et al., 1999). Konsentrasi IgY dalam kuning telur bisa mencapai 25 mg / mL. Karena induk ayam dapat bertelur hingga 250 telur dalam setahun, hasil IgY yang hiperimunisasi bisa besar. Karena 160 mg IgY dapat diperoleh dari satu telur, satu induk ayam yang diimunisasi dapat menghasilkan 40 g IgY dalam satu tahun, yang mana 1–10% dapat diharapkan spesifik antigen (Hatta et al., 1997).

Berbeda dengan serum mamalia, kuning telur hanya mengandung satu kelas antibodi (IgY), yang dapat dengan mudah diisolasi dari kuning telur dengan teknik presipitasi, dan IgY tidak mengaktifkan komplemen mamalia atau berinteraksi dengan reseptor Fc mamalia yang dapat memediasi respons inflamasi. (Kovacs-Nolan and Mine, 2012).

Ketahanan bovine IgG1 dan IgY terhadap pH rendah dan proteolisis luminal menjadikannya secara fungsional mirip dengan IgA manusia dan cocok untuk pemberian oral (Kovacs-Nolan and Mine, 2012). Ruminansia memberikan kekebalan ibu (maternal antibody) hanya setelah kelahiran (postnatal) melalui antibodi kolostral (Quigley, 2002), sehingga antibodi kolostrum dan kuning telur secara rutin digunakan untuk profilaksis dan terapi penyakit menular pada hewan ternak (Berghman et al., 2005).

Sediaan imunoglobulin sapi terhadap rotavirus dan E. coli ETEC telah tersedia secara komersial untuk digunakan pada hewan ternak selama beberapa dekade karena biayanya murah dan mudah pemberiannya.

Sejumlah besar studi klinis terkontrol menggunakan kolostrum sapi atau antibodi kuning telur hiperimun telah menunjukkan efek profilaksis dan terapi terhadap patogen oral dan gastrointestinal pada manusia, termasuk E. coli enterotoksikogenik, Helicobacter pylori, karies gigi yang menyebabkan Streptococcus mutans, dan infeksi rotaviral ( Hurley dan Theil, 2011; Kovacs-Nolan dan Mine, 2012; Weiner et al., 1999).

Kemampuan antibodi sapi dan kuning telur untuk memberikan perlindungan terhadap penyakit tertentu terus menjadi bidang yang diminati (Ng et al., 2010). Sebagai contoh, IgG sapi dengan reaktivitas gp140 bisa mampu menetralkan human immunodeficiency virus (HIV) telah dikembangkan sebagai mikrobisida topikal yang berpotensi manjur dan terjangkau (Kramski et al., 2012).

Cara Produksi IgY pada ayam

Ayam dapat digunakan untuk produksi antibodi selama periode bertelurnya. Untuk alasan praktis dan ekonomis, ayam yang dipelihara dalam kondisi lapangan biasanya diimunisasi secara intramuskuler pada otot dada atau subkutan (Schade et al., 1996; Carlander et al., 2002). Injeksi antigen secara intramuskular sering menghasilkan tingkat antibodi yang lebih tinggi pada hari ke 28 setelah imunisasi (Wooley & Landon, 1995). Ayam yang diimunisasi secara intramuskuler terus memproduksi antibodi spesifik selama lebih dari 200 hari atau dapat digunakan untuk seluruh periode bertelur tergantung pada titer antibodi hasil induksi yang diperoleh (Horton et al., 1984; Schade et al., 1996).

Jumlah total imunisasi yang diperlukan akan tergantung pada jenis dan dosis antigen, serta pada bahan pembantu tertentu yang digunakan. Apakah titer antibodi mulai berkurang, imunisasi booster dapat diterapkan selama periode bertelur. Vaksinasi primer dan booster harus diberikan secara khusus sebelum periode bertelur, dengan interval 6 minggu untuk adjuvan tipe emulsi dan 4 minggu untuk adjuvan lipopeptida (Schade et al., 1996).

Menurut Schade et al. (1996), penggunaan ayam dalam kandang konvensional digunakan untuk tujuan ilmiah, tetapi ketika antibodi digunakan untuk tujuan terapeutik dan untuk manusia maka wajib menggunakan ayam specific pathogens free (SPF).  Untuk meningkatkan produksi antibodi kuning telur digunakan galur ayam yang berproduksi tinggi melalui seleksi genetik dalam galur yang sama (Carlander, 2002).

IgY ayam menunjukkan aviditas tinggi (109L / mol) bahkan setelah imunisasi pertama. Untuk mencapai nilai aviditas yang sama (1010L / mol), seekor domba, misalnya, harus menerima empat booster (Wooley and Landon, 1995). Larsson et al. (1998), mempelajari respons imun pada ayam menggunakan sejumlah kecil antigen mamalia, dan mengamati respons imun yang baik yang diperoleh dengan penggunaan 0,1-1,0 μg serum albumin sapi. Disarankan bahwa berbagai konsentrasi antigen harus dikombinasikan dengan ajuvan. Namun, biasanya digunakan 25-100 μg antigen per imunisasi, meskipun dimungkinkan untuk mendapatkan respon imun yang baik dengan hanya 1 μg per imunisasi (Carlander, 2002).

Keunggulan penggunaan Ig Y

Antibodi IgY memiliki banyak keunggulan dibandingkan antibodi IgG seperti aviditas kuat, produktivitas tinggi, pengujian murah, dan bisa diterapkan pada banyak immunoassay untuk meningkatkan kinerja dan akurasi pengujian. Ciri-ciri menguntungkan lainnya dari IgY : (a) bisa mengikat antibodi pada berbagai jenis hewan inang; (b) tidak adanya aktivasi serangkaian komplemen mamalia dan interaksi dengan faktor-faktor reumatoid, atau reseptor bakteri dan manusia.  Hal ini akan membantu mengurangi biaya uji klinis dan penelitian imunologi.

Penggunaan IgY merupakan metode alternatif penggunaan IgG mamalia.  Hal ini sesuai dengan upaya internasional yang bertujuan untuk: (a) mengurangi atau bahkan mengganti hewan dalam eksperimen ilmiah; (b) lebih banyak lagi karakteristik yang diinginkan dan (c) aplikasi lain untuk imunodiagnostik.

Daftar Pustaka :

1. Harold Marcotte, Lennart Hammarström. 2015. Passive Immunization: Toward Magic Bullets, in Mucosal Immunology (Fourth Edition), Academic Press, Volume 2,  Pages 1403-1434.

 

2. Lívia Silveira Munhoz; Gilberto D'Ávila Vargas; Geferson Fischer; Marcelo de Lima; Paulo Augusto Esteves^II; Silvia de Oliveira Hübner.  2015. Avian IgY : Characteristic and implementation of immonodiagnostic.  Cienc. Rural vol. 44 no.1 Santa Maria.