Pengembangan Kandidat Vaksin PMK Quadrivalen

Pengembangan Kandidat Vaksin Quadrivalen Penyakit Mulut dan Kuku untuk Penggunaan di Afrika Timur

 

ABSTRAK

 

Penyakit mulut dan kuku (Foot-and-mouth disease, FMD) disingkat PMK adalah penyakit viral yang sangat menular pada hewan ternak dan tersebar luas di Afrika, Timur Tengah, Asia, dan Amerika Selatan, dengan dampak ekonomi yang signifikan terhadap industri pertanian. Vaksinasi dengan vaksin virus yang diinaktivasi digunakan sebagai metode utama pengendalian di wilayah endemik ini. Namun, keberadaan berbagai serotipe, subtipe, dan kemunculan terus-menerus strain baru yang berbeda secara antigenik membatasi efektivitasnya. Afrika Timur telah diidentifikasi sebagai wilayah yang membutuhkan pembaruan vaksin FMD karena vaksin yang tersedia saat ini mengandung strain lama yang tidak memberikan perlindungan memadai terhadap strain kontemporer. Saat ini, empat serotipe FMD beredar di Afrika Timur, sehingga diperlukan pengembangan vaksin quadrivalen yang mengandung strain representatif dari masing-masing serotipe.

 

Pertimbangan penting dalam pemilihan strain vaksin adalah stabilitas partikel virus, mengingat kapsid virus mudah terdisosiasi ketika terpapar suhu tinggi, sementara hanya kapsid utuh yang dapat memicu kekebalan protektif terhadap FMD. Untuk menghasilkan vaksin quadrivalen yang lebih stabil dan diperbarui untuk Afrika Timur, kami telah menyaring panel isolat virus FMD dari wilayah tersebut untuk memilih strain dengan stabilitas termal alami yang lebih tinggi serta mengonfirmasi imunogenisitasnya pada sapi. Dalam penelitian ini, kami mendeskripsikan formulasi dan penilaian serologis kandidat vaksin quadrivalen berbasis strain liar dan rekombinan, yang menunjukkan bahwa kedua vaksin mampu menghasilkan titer antibodi penetral yang tinggi terhadap strain homolog dan heterolog dari Afrika Timur. Vaksin ini memenuhi kriteria yang ditetapkan oleh proyek tantangan vaksin AgResults dan menawarkan perlindungan silang yang baik terhadap panel strain FMD regional.

 

Kata kunci: Penyakit mulut dan kuku, Virus FMD, Vaksin FMD, Vaksin quadrivalen FMD, AgResults

 

1. PENDAHULUAN

 

Penyakit mulut dan kuku (FMD) adalah penyakit menular yang memengaruhi beberapa spesies ternak penting seperti sapi, domba, dan babi. Penyakit ini endemik di banyak wilayah Afrika, Asia, Timur Tengah, dan Amerika Selatan, menyebabkan kerugian ekonomi besar akibat penurunan produktivitas. FMD disebabkan oleh virus FMD (Foot-and-mouth disease virus, FMDV), anggota keluarga Picornaviridae, yang merupakan virus tidak berselubung dengan genom RNA untai tunggal positif dalam kapsid protein berbentuk ikosahedral.

 

Secara global, FMDV menunjukkan keragaman antigenik yang signifikan dan terbagi menjadi tujuh serotipe, yaitu O, A, C, Asia-1, Southern African Territories (SAT) 1, SAT2, dan SAT3. Serotipe ini memiliki pola distribusi yang berbeda namun saling tumpang tindih, dengan banyak serotipe sering kali beredar bersama di wilayah dengan prevalensi tinggi. Setiap serotipe terdiri atas berbagai topotipe dan strain yang terus berkembang dan mengalami divergensi, sehingga menghindari imunitas yang dimediasi antibodi.

 

Vaksinasi adalah satu-satunya strategi efektif untuk memerangi penyebaran FMDV di wilayah endemik dan mengurangi beban penyakit pada ternak serta komunitas yang bergantung pada mereka. Program vaksinasi saat ini menggunakan vaksin virus yang diinaktivasi secara kimiawi, yang harus sesuai dengan strain yang beredar di wilayah sasaran agar memberikan perlindungan yang memadai. Namun, terdapat banyak tantangan dalam keberhasilan kampanye ini. Pertama, kapsid virus dalam vaksin tidak stabil dan mudah terdisosiasi pada pH di bawah 7,0 atau suhu di atas 30 °C, dan ketika terdisosiasi tidak dapat memicu respons imun protektif. Oleh karena itu, menjaga rantai dingin selama transportasi dan penyimpanan vaksin sangat penting untuk pengirimannya yang efektif, yang menjadi tantangan di negara dengan iklim hangat dan infrastruktur yang tidak memadai. Kedua, keragaman antigenik FMDV yang telah disebutkan, mengharuskan vaksin bersifat multivalen dan terus diperbarui untuk mencerminkan strain yang baru muncul, karena kurangnya perlindungan silang antarserotipe dan sering kali antarstrain dalam satu serotipe.

 

Baru-baru ini, diakui bahwa ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan vaksin FMD yang lebih baik untuk digunakan di Afrika Timur karena vaksin yang tersedia saat ini mengandung strain yang sudah lama digunakan dan tidak lagi sesuai dengan strain yang beredar saat ini ([1], [2], [3], [4], [5]). Untuk memenuhi kebutuhan ini, kami telah menyaring panel strain FMDV kontemporer dari Afrika Timur, yang mencakup serotipe O, A, SAT1, dan SAT2, untuk mengidentifikasi strain dengan stabilitas termal alami yang lebih tinggi, yang dapat dimasukkan dalam kandidat vaksin quadrivalen yang lebih stabil [6]. Strain O/ETH/29/2008, A/ETH/9/2008, SAT1/KEN/80/2010, dan SAT2/ETH/65/2009 dipilih berdasarkan suhu disosiasi kapsidnya yang relatif tinggi dan digunakan untuk memproduksi batch kecil vaksin monovalen untuk penilaian antigenisitas awal. Semua strain ini memicu titer antibodi penetral (>2 log10, dianggap protektif) terhadap strain homolog pada sapi dan menunjukkan perlindungan silang intraserotipe yang baik terhadap strain Afrika Timur lainnya [6].

 

Manipulasi genetik juga dapat digunakan untuk melakukan perubahan spesifik pada virus guna meningkatkan stabilitas kapsid lebih lanjut. Kapsid virus serotipe SAT umumnya kurang stabil dibandingkan serotipe O, sehingga sebagai strategi untuk meningkatkan stabilitas SAT2, kami sebelumnya telah menghasilkan virus chimera SAT2/O yang mengandung protein kapsid luar (VP1-3) dari strain SAT2 dan protein VP4 serta protein nonstruktural dari O1Kaufbeuren (O1K). Virus chimera yang dihasilkan menggunakan SAT2/ZIM/7/83 atau SAT2/ETH/65/2009 menunjukkan antigenisitas seperti virus SAT2, dengan stabilitas termal yang meningkat dibandingkan strain liar [7].

 

Berdasarkan temuan tersebut, kami berhipotesis bahwa strategi rekayasa genetika terbalik serupa dapat digunakan untuk menghasilkan virus rekombinan chimera untuk strain Afrika Timur serotipe O, A, dan SAT1, yang dapat meningkatkan stabilitas termal masing-masing strain. Dua vaksin quadrivalen yang terdiri atas virus liar dan virus rekombinan chimera diinaktivasi diproduksi dan digunakan dalam studi imunogenisitas in vivo untuk menghasilkan serum vaksin. Serum vaksin ini secara efektif menetralkan keempat serotipe, serta menunjukkan netralisasi silang yang baik terhadap virus heterolog dari panel antigen referensi FMDV Afrika Timur yang disusun oleh Laboratorium Referensi Dunia untuk FMD (WRL-FMD) dan digunakan oleh Proyek Tantangan Vaksin AgResults untuk menilai vaksin FMD baru di Afrika Timur [8].

 

2. BAHAN DAN METODE

 

2.1. Virus dan sel

Strain WT FMDV diperoleh dari WRL-FMD dalam bentuk stok gliserol. Virus ini telah mengalami sedikit pasase (<3 pasase) pada sel tiroid sapi primer (BTY). Virus rekombinan dihasilkan dengan menghilangkan cDNA yang mengkode protein VP2, VP3, VP1, dan 2A dari plasmid salinan infeksius O1K dan menggantinya dengan urutan yang sesuai dari O/ETH/29/2008, A/ETH/9/2008, SAT1/KEN/80/2010, atau SAT2/ETH/65/2009 seperti dijelaskan dalam [7]. Sel BHK-21 yang secara stabil mengekspresikan integrin αvβ6 (SP38-Mix) telah dijelaskan sebelumnya [9] dan dikultur dalam media esensial minimal Glasgow (GMEM; Fisher Scientific, Inggris) dengan serum sapi dewasa 10%, penisilin (100 SI unit/ml), dan streptomisin (100 µg/ml). Virus diselamatkan melalui ko-transfeksi SP38-Mix dengan plasmid salinan infeksius terkait dan plasmid yang mengkode polimerase RNA T7 [10], diikuti dengan pasase berturut-turut pada SP38-Mix.

 

2.2. Persiapan antigen vaksin virus yang diinaktivasi

Virus WT dan rekombinan digunakan untuk menginfeksi sel SP38-Mix dalam 10 botol roller per virus pada multiplicity of infection (MOI) sebesar 0,05 hingga efek sitopatik lengkap (CPE) diamati (biasanya setelah 30 jam untuk semua serotipe). Setelah pemanenan dan klarifikasi, virus dalam supernatan diinaktivasi melalui dua kali inkubasi berturut-turut dengan etilenaimin biner (BEI) pada konsentrasi akhir 1 mM, masing-masing pada 37 °C selama 24 jam. Antigen yang diinaktivasi kemudian diendapkan dengan 7,5% (b/v) polietilen glikol (PEG) MW 6000, disuspensikan kembali dalam PBS, dan dipisahkan melalui bantalan sukrosa 30% melalui sentrifugasi pada 104.000xg selama 2,5 jam pada 12 °C. Pelet disuspensikan kembali dalam PBS, dilapisi di atas gradien sukrosa 15–30%, kemudian difraksinasi melalui sentrifugasi pada 104.000xg selama 3 jam pada 12 °C. Antigen yang diinaktivasi dan dimurnikan disuspensikan kembali dalam PBS, dan konsentrasinya ditentukan secara spektrofotometri menggunakan rumus berikut: (OD260 × volume total)/7,6 = mg virus.

 

2.3. Uji Thermofluor PaSTRy

Uji Thermofluor PaSTRy (selanjutnya disebut uji thermofluor) adalah metode untuk menentukan suhu (Tr) di mana kapsid virus terdisosiasi dengan menggunakan pewarna pengikat asam nukleat (SYBR green-II) untuk mendeteksi pelepasan RNA virus saat suhu dinaikkan dari 25 °C hingga 94 °C dengan peningkatan 0,5 °C setiap 10 detik. Uji dilakukan dalam PBS menggunakan 0,4 µg virus yang diinaktivasi dan pewarna SYBR green-II (Thermo Fisher Scientific, Inggris) dengan pengenceran akhir 1:1000 dan Sistem PCR Real-Time MX3005 (Agilent Technologies, Inggris) seperti dijelaskan sebelumnya [11].

 

2.4. SDS-PAGE dan pewarnaan Coomassie Blue

Sampel antigen vaksin yang dimurnikan didenaturasi dengan pemanasan pada 95 °C selama 2 menit dengan keberadaan 2% natrium dodesil sulfat (SDS), dan protein penyusunnya dipisahkan melalui elektroforesis gel poliacrilamida SDS (PAGE) pada gel NovexTM WedgeWellTM 4–20% Tris-glisin (Invitrogen). Protein divisualisasikan dengan mewarnai gel menggunakan Coomassie Brilliant Blue.

 

2.5. Formulasi vaksin dan vaksinasi sapi

Sepuluh anak sapi jantan Holstein Friesian berumur 4–6 bulan secara acak dibagi menjadi dua kelompok, masing-masing terdiri dari 5 ekor, dan diaklimatisasi selama 7 hari sebelum dimulainya penelitian. Selama waktu ini, hewan dilatih untuk berjalan ke perangkat penahan kepala yang dapat mengunci sendiri sehingga dapat ditahan dengan aman untuk prosedur vaksinasi dan pengambilan darah selanjutnya. Kelompok 1 menerima vaksin kuadrivalen WT, sedangkan kelompok 2 menerima vaksin kuadrivalen rekombinan. Setiap dosis vaksin mengandung 12 µg antigen yang diinaktivasi, baik WT maupun rekombinan O/ETH/29/2008, A/ETH/9/2008, SAT1/KEN/80/2010, dan SAT2/ETH/65/2009 dalam 1 mL, serta 1 mL Montanide ISA 201 (SEPPIC), yang diberikan melalui injeksi intramuskular di leher. Vaksin booster yang disiapkan dengan cara yang sama seperti dosis utama diberikan pada hari ke-21 pasca-vaksinasi (p.v.) setelah pengumpulan sampel darah. Eksperimen hewan disetujui oleh Pirbright Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) berdasarkan izin proyek dari Home Office (PP2698569) sesuai dengan legislasi Undang-Undang Prosedur Ilmiah pada Hewan 1986. Ukuran kelompok untuk penelitian ini sesuai dengan panduan Manual Tes Diagnostik dan Vaksin WOAH untuk Hewan Terestrial (Bab 3.1.8) serta studi yang dipublikasikan sebelumnya untuk menentukan induksi titer antibodi yang konsisten dengan perlindungan.

 

2.6. Pengumpulan sampel serum

Sampel darah diambil melalui venipungsi menggunakan vacutainer serum 10 mL dan jarum vacutainer 20G pada hari ke-0, 7, 14, 21, dan 28 p.v. untuk mengukur titer antibodi netralisasi. Sampel darah dibiarkan menggumpal semalam pada suhu 4 °C, kemudian disentrifugasi pada 1.962g selama 10 menit pada 4 °C. Serum dialihtabahkan dan disimpan pada suhu −20 °C.

 

2.7. Titrasi antibodi netralisasi

Sampel serum yang dikumpulkan pada hari ke-0, 7, 14, 21, dan 28 p.v. diuji untuk keberadaan antibodi netralisasi anti-FMDV melalui uji netralisasi virus (VNT) sesuai protokol yang direkomendasikan oleh Organisasi Dunia untuk Kesehatan Hewan (WOAH) [12]. Sel BHK-21 digunakan untuk VNT, dan serum diinaktivasi pada 56 °C selama 30 menit sebelum digunakan. Untuk setiap uji, 100 TCID50 virus digunakan dalam volume 50 µL. Titer antibodi netralisasi dihitung dengan metode Spearman-Karber dan dinyatakan sebagai pengenceran terakhir serum yang menetralkan 50% virus. Nilai r1 dihitung menggunakan rumus berikut:

r1 rata-rata = rata-rata titer antibodi netralisasi virus heterolog/rata-rata titer antibodi netralisasi virus homolog.

 

3. HASIL PENELITIAN

 

3.1. Konstruksi Klon Infeksi Rekombinan dari Kandidat Strain Vaksin
Sebelumnya telah dihasilkan virus rekombinan SAT2/O1K chimeric untuk strain SAT2/ETH/65/2009 [7], dan virus rekombinan chimeric O1K (selanjutnya disebut virus rekombinan) untuk masing-masing strain kandidat vaksin lainnya (O/ETH/29/2008, A/ETH/9/2008, dan SAT1/KEN/80/2010) juga berhasil dibuat (Gambar 1A). Baik virus WT maupun rekombinan hanya dipaparkan secara minimal untuk menghasilkan stok yang digunakan dalam persiapan antigen vaksin. Untuk memfasilitasi hal ini dan menghilangkan kebutuhan adaptasi virus pada kultur sel, sel SP38-Mix [9] yang mengekspresikan reseptor FMDV integrin αvβ6 digunakan untuk menyelamatkan virus rekombinan serta untuk memperbanyak virus WT dan rekombinan. Hingga saat ini, virus telah diselamatkan dari plasmid salinan infeksi melalui transkripsi RNA in vitro dan pasase selanjutnya. Untuk menyederhanakan prosedur ini, sel-sel dikotransfeksi dengan plasmid salinan infeksi yang sesuai serta plasmid yang mengkode T7 RNA polimerase.

 

Gambar 1. Konstruksi strain vaksin rekombinan. (A) Diagram skematik yang menunjukkan genom virus rekombinan yang dihasilkan dengan menghapus cDNA yang mengkode protein VP2, VP3, VP1, dan 2A dari plasmid klon infeksi O1Kaufbeuren (O1K) dan menggantinya dengan urutan yang sesuai dari O/ETH/29/2008, A/ETH/9/2008, SAT1/KEN/80/2010, atau SAT2/ETH/65/2009 sebagaimana ditunjukkan. (B) Stok virus yang ditumbuhkan untuk persiapan antigen vaksin diukur titernya menggunakan uji plak. Hasil yang disajikan merupakan rata-rata dari 3 eksperimen independen dengan batang error menunjukkan standar deviasi. (C) Aliquot antigen vaksin yang dimurnikan dan diinaktivasi dianalisis menggunakan SDS-PAGE dan pewarnaan Coomassie Blue. (Untuk interpretasi referensi warna dalam legenda gambar ini, pembaca diarahkan ke versi web artikel ini.)

 

Selanjutnya, infeksi simultan dengan virus WT dan rekombinan dilakukan, dan hasil virus diukur menggunakan uji plak. Virus rekombinan serotipe O dan A tumbuh dengan titer yang serupa dengan rekan WT-nya, sedangkan virus rekombinan SAT1 dan SAT2 umumnya menghasilkan titer akhir 0,5–1 log lebih rendah dibandingkan strain WT yang setara (Gambar 1B). Virus diinaktivasi secara kimia dengan perlakuan BEI dan dimurnikan menggunakan ultrakentrifugasi gradien kepadatan sukrosa. Kemurnian persiapan antigen akhir kemudian dinilai menggunakan SDS-PAGE dan pewarnaan Coomassie Blue (Gambar 1C). Hasil antigen utuh (146S) yang dihasilkan oleh virus WT dan rekombinan ditentukan dengan spektrofotometri pada OD260 (Tabel 1). Dibandingkan dengan hasil antigen 146S yang dihasilkan oleh strain WT O dan A, tingkat yang lebih tinggi diamati pada rekan rekombinan mereka. Sebaliknya, tingkat antigen 146S yang lebih rendah diperoleh dari strain rekombinan SAT1 dan SAT2 dibandingkan virus WT, yang konsisten dengan hasil virus yang lebih rendah yang diperoleh.

 

Tabel 1. Perbandingan hasil antigen utuh (146S) tipe liar (WT) dan rekombinan yang ditentukan dengan spektrofotometri pada OD260. Rasio WT terhadap antigen utuh rekombinan ditampilkan. Percobaan ini dilakukan dua kali dengan hasil yang serupa.

Antigen (FMDV yang diinaktivasi)	Hasil 146S (µg/mL)	Rasio WT vs Rekombinan 146S
WT O	200	1,00:1,25
Rekombinan O	250
WT A	125	1,00:1,48
Rekombinan A	185
WT SAT1	300	1,00:0,33
Rekombinan SAT1	100
WT SAT2	250	1,00:0,70
Rekombinan SAT2	175

 

3.2. Stabilitas Termal Antigen Vaksin WT vs Rekombinan
Stabilitas termal antigen vaksin WT dan rekombinan yang dimurnikan dibandingkan dengan melakukan uji termofluor untuk menentukan suhu (Tr) di mana kapsid terdisosiasi dan genom RNA dilepaskan (Gambar 2). Tr dari rekombinan SAT2/ETH/65/2009 adalah 3 °C lebih tinggi daripada Tr dari WT SAT2/ETH/65/2009, menunjukkan efek positif dari urutan O1K pada stabilitas termal kapsid SAT2. Hal ini sesuai dengan pengamatan sebelumnya bahwa rekombinan SAT2/ETH/65/2009 memiliki stabilitas termal yang lebih tinggi dibandingkan WT SAT2/ETH/65/2009 [7]. Namun, untuk semua serotipe lainnya, virus rekombinan memiliki Tr lebih rendah dibandingkan rekan WT-nya (Gambar 2A-C), menunjukkan bahwa pendekatan ini tidak selalu menghasilkan peningkatan stabilitas termal, dan mungkin hanya berhasil untuk virus serotipe SAT2.

 

Gambar 2. Stabilitas termal antigen vaksin WT dan rekombinan. (A) Uji termofluor dilakukan pada antigen vaksin yang diinaktivasi dan dimurnikan untuk menentukan suhu di mana kapsid terdisosiasi. (B) Data pada (A) disajikan sebagai plot turunan pertama negatif. (C) Tabel menunjukkan suhu disosiasi (Tr) untuk masing-masing antigen vaksin sebagaimana ditentukan melalui uji termofluor.

 

3.3. Imunogenisitas Vaksin WT dan Rekombinan pada Sapi
Untuk menilai kelayakan antigen vaksin WT dan rekombinan untuk digunakan dalam vaksin quadrivalen, jumlah yang setara dari empat antigen WT atau empat antigen rekombinan dicampur dan diformulasikan dengan adjuvan. Kelompok lima anak sapi divaksinasi dengan vaksin quadrivalen WT atau vaksin quadrivalen rekombinan, dan serum dikumpulkan setiap 7 hari selama 28 hari (Gambar 3). Vaksinasi penguat, terdiri dari dosis yang sama dari persiapan vaksin yang sama, diberikan pada hari ke-21 setelah pengumpulan serum. Sampel serum digunakan untuk menilai titer antibodi penetralisasi menggunakan VNT homolog. Pada hari ke-21, semua 5 hewan dalam kedua kelompok memiliki titer penetralisasi virus >1,5 Log10 untuk keempat serotipe (Gambar 4 dan Gambar S1). Vaksinasi kedua pada hari ke-21 lebih meningkatkan tingkat antibodi sehingga pada hari ke-28, semua sampel memiliki titer penetralisasi virus >2 Log10. Tidak ada perbedaan yang diamati antara titer antibodi yang diinduksi oleh vaksin WT dan rekombinan.

 

Gambar 3. Desain imunogenisitas. Lima hewan divaksinasi dengan vaksin WT, dan lima hewan lainnya divaksinasi dengan vaksin rekombinan. Penguat dengan vaksin yang sama diberikan pada hari ke-21. Sampel darah dikumpulkan setiap 7 hari untuk menilai titer antibodi penetralisasi menggunakan VNT homolog dan heterolog.

 

Gambar 4. Penilaian Titer Antibodi Penetral melalui VNT Homolog

Sampel serum dari kelima hewan dalam kedua kelompok yang diambil pada hari ke-0, 7, 14, 21, dan 28 dianalisis untuk titer antibodi penetral homolog menggunakan VNT. Data yang disajikan merupakan rata-rata dari lima hewan di setiap kelompok, dengan garis kesalahan menunjukkan standar deviasi.

 

3.4. Penilaian Kandidat Vaksin untuk Penggunaan di Afrika Timur
Untuk menilai kemampuan kandidat vaksin dalam memberikan perlindungan silang terhadap strain lain yang beredar di Afrika Timur (EA), serum yang diambil pada hari ke-21 (sebelum vaksinasi tambahan) dan hari ke-28 (setelah vaksinasi tambahan) dikirim ke WRL-FMD untuk diuji terhadap panel antigen referensi FMDV Afrika Timur menggunakan VNT heterolog. Panel ini mencakup 16 isolat FMDV (masing-masing 4 isolat dari serotipe O, A, SAT1, dan SAT2) yang dipilih untuk mencakup keragaman garis keturunan virus yang saat ini beredar di wilayah Afrika Timur.

 

Berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh Proyek Tantangan Vaksin FMD AgResults, serum dari 3 dari 5 hewan yang divaksinasi yang diambil 21 hari setelah satu kali vaksinasi harus memiliki titer penetral virus sebesar ≥ 1,5 log10 untuk 3 dari 4 isolat per serotipe agar dianggap protektif.

 

Vaksin WT jelas memenuhi kriteria ini, dengan serum dari setidaknya 3 dari 5 hewan memiliki VNT ≥ 1,5 log10 untuk semua empat strain O, SAT1, dan SAT2, serta 3 dari 4 virus serotipe A (Gambar 5). Setidaknya 3 dari 5 sampel serum dari hewan yang diberi vaksin rekombinan memiliki VNT ≥ 1,5 log10 untuk semua empat strain O, SAT1, dan SAT2, tetapi hanya 2 dari 4 strain A (Gambar 5).

 

Selain itu, sampel serum yang diambil pada hari ke-28 (7 hari setelah vaksinasi tambahan) memiliki VNT ≥ 1,5 log10 pada 5 dari 5 hewan untuk 16/16 isolat dalam kasus vaksin WT, dan setidaknya 4 dari 5 hewan untuk 16/16 isolat dalam kasus vaksin rekombinan, dengan hanya satu sampel serum yang berada di bawah batas netralisasi untuk A/ETH/2/2018.

 

Gambar 5. Penilaian Titer Antibodi Penetral melalui VNT Heterolog

Sampel serum dari hari ke-21 (sebelum vaksinasi tambahan) dan hari ke-28 (setelah vaksinasi tambahan) dikirim ke WRL-FMD untuk penilaian titer antibodi penetral terhadap Panel Antigen Referensi FMDV Afrika Timur. Hasil dari masing-masing hewan disajikan. Dosis virus yang digunakan adalah sebagai berikut: O/KEN/4/2018–1,95; O/ETH/9/2019–1,61; O/ETH/4/2015–2,14; O/ETH/30/2016–1,95; A/UGA/28/2019–1,80; A/ETH/2/2018–1,73; A/ETH/19/2019–1,73; A/SUD/9/2018–1,80; SAT1/TAN/22/2014–1,54; SAT1/TAN/22/2013–1,69; SAT1/KEN/10/2013–1,54; SAT1/TAN/27/2012–1,58; SAT2/ETH/11/2018–1,99; SAT2/EGY/1/2018–1,88; SAT2/ETH/16/2015–1,73; SAT2/KEN/19/2017–1,65.

 

4. DISKUSI

 

PMK (Penyakit Mulut dan Kuku) adalah salah satu penyakit viral yang paling menular pada hewan ternak, dan keberadaannya memberikan beban ekonomi yang besar pada industri pertanian di negara-negara endemik. Negara-negara tersebut secara tidak proporsional berasal dari kelompok pendapatan rendah dan menengah. PMK memperburuk kemiskinan dan membatasi pembangunan dengan menghalangi perdagangan dengan negara-negara bebas PMK yang memiliki pasar menguntungkan untuk hewan dan produk hewan. Satu-satunya opsi pengendalian penyakit di wilayah ini adalah vaksinasi, sehingga ketersediaan vaksin yang berkualitas tinggi, efektif, dan terjangkau sangat penting untuk mengatasi masalah yang berkaitan dengan PMK. Afrika Timur telah diidentifikasi sebagai wilayah yang akan sangat diuntungkan dari peningkatan vaksin, karena strain yang saat ini beredar tidak tercakup dengan baik oleh vaksin yang ada.

 

Proyek AgResults FMD Vaccine Challenge adalah inisiatif multi-donor untuk memenuhi kebutuhan ini dengan mempromosikan pengembangan dan produksi vaksin PMK kuadrivalen baru yang disesuaikan dengan garis keturunan virus tertentu yang beredar di negara-negara pool 4 Afrika Timur (Burundi, Ethiopia, Kenya, Rwanda, Tanzania, dan Uganda) (8). Vaksin yang sesuai harus mengandung virus serotipe O, A, SAT1, dan SAT2 yang memberikan perlindungan silang yang baik terhadap berbagai strain endemik. Kriteria AgResults menyatakan bahwa kandidat vaksin harus menginduksi titer antibodi netralisasi ≥ 1,5 log10 pada 3 dari 5 hewan untuk 3 dari 4 isolat setiap serotipe dalam panel antigen referensi PMK Afrika Timur.

 

Salah satu pertimbangan utama dalam pengembangan vaksin PMK adalah stabilitas antigen. Di negara-negara dengan rantai dingin yang tidak andal, paparan suhu tinggi dapat menyebabkan disosiasi kapsid secara cepat dan hilangnya efektivitas vaksin karena ketidakmampuan kapsid yang terdisosiasi untuk menginduksi respons antibodi netralisasi. Sebagai langkah awal dalam memilih strain vaksin kandidat, kami sebelumnya telah menyaring panel isolat PMK dari Afrika Timur untuk mengidentifikasi strain yang secara alami memiliki stabilitas termal lebih tinggi (6). Satu strain dari masing-masing serotipe O, A, SAT1, dan SAT2 dipilih dan dievaluasi lebih lanjut untuk kemampuannya menginduksi respons antibodi netralisasi protektif pada sapi yang divaksinasi. Semua empat strain terbukti sangat efektif ketika diberikan sebagai vaksin monovalen. Kami kini telah mengombinasikan strain-strain ini menjadi kandidat vaksin kuadrivalen dan menunjukkan bahwa serum hewan yang divaksinasi mengandung titer antibodi netralisasi yang dianggap protektif dan memenuhi kriteria AgResults untuk perlindungan silang terhadap strain Afrika Timur heterolog.

 

Vaksin rekombinan diproduksi sebagai alternatif dari versi WT (liar) karena dua alasan. Pertama, kami ingin menunjukkan bahwa strategi ini dapat digunakan untuk memproduksi vaksin untuk strain apa pun hanya berdasarkan urutan wilayah P1 tanpa perlu mengisolasi virus. Kedua, setelah sebelumnya menunjukkan bahwa kapsid SAT2 memiliki stabilitas termal lebih tinggi saat dimasukkan ke dalam latar belakang O1K [7], kami tertarik untuk melihat apakah ini dapat lebih meningkatkan stabilitas kapsid serotipe lainnya.

 

Keempat virus rekombinan berhasil direkonstruksi dan diperbanyak hingga mencapai titer tinggi, membuktikan kelayakan strategi ini untuk menghasilkan kandidat vaksin tanpa memerlukan isolasi virus. Selain itu, kami menemukan bahwa suhu disosiasi kapsid SAT2/ETH/65/2009 meningkat sebesar 3 °C saat dimasukkan ke dalam latar belakang O1K. Namun, antigen rekombinan O, A, atau SAT1 tidak menunjukkan peningkatan stabilitas termal dibandingkan rekan WT-nya. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa peningkatan stabilitas chimera SAT2/O1K adalah fungsi dari protein O1K VP4, dan kami berspekulasi bahwa alasan kami tidak melihat peningkatan stabilitas serotipe lainnya dalam latar belakang O1K mungkin disebabkan oleh perbedaan dalam cara O1K VP4 berinteraksi dengan protein kapsid lainnya.

 

Tidak ada perbedaan yang diamati antara respons antibodi netralisasi yang diinduksi oleh vaksin WT dibandingkan dengan vaksin rekombinan terhadap strain virus homolog, dengan keduanya menghasilkan titer tinggi pada hari ke-7 pasca-vaksinasi yang dipertahankan hingga hari ke-21 dan meningkat lebih lanjut setelah vaksinasi boost (Gambar 4, S1). VNT homolog ini dilakukan menggunakan strain WT masing-masing sebagai virus tantangan, menunjukkan bahwa serum hewan yang divaksinasi terhadap antigen rekombinan secara efektif menetralkan virus WT. Hal ini mendukung temuan sebelumnya bahwa kapsid eksternal virus chimera semacam itu sebanding dengan WT [7, 13]. Kedua jenis vaksin juga menginduksi tingkat netralisasi silang yang serupa terhadap strain heterolog dari panel antigen referensi PMK Afrika Timur (Gambar 5).

 

Serum dari setidaknya 3 dari 5 hewan yang diberikan vaksin WT atau rekombinan mengandung titer antibodi netralisasi ≥ 1,5 log10 untuk keempat strain O, keempat strain SAT1, dan keempat strain SAT2. Serum hewan yang divaksinasi menunjukkan perlindungan silang yang lebih lemah terhadap beberapa virus serotipe A, terutama A/ETH/2/2018. Serum dari setidaknya 3 dari 5 hewan yang diberikan vaksin WT mengandung titer antibodi netralisasi ≥ 1,5 log10 untuk 3 dari 4 strain A, sementara serum dari vaksin rekombinan hanya mencapai titer > 1,5 log10 untuk 2 dari 4 strain A. Oleh karena itu, vaksin WT tetapi tidak vaksin rekombinan memenuhi kriteria AgResults, meskipun perbedaannya hanya pada VNT dari 1 sampel serum dari kelompok rekombinan yang tidak mencapai batas untuk salah satu strain A. Setelah vaksinasi boost, baik serum vaksin WT maupun rekombinan memiliki VNT ≥ 1,5 log10 untuk semua sampel kecuali satu hewan yang diberikan vaksin rekombinan yang memiliki VNT sedikit di bawah 1,5 log10 terhadap A/ETH/2/2018.

 

Sebagai kesimpulan, kami telah menunjukkan bahwa vaksin kuadrivalen yang terdiri dari strain PMK Afrika Timur yang secara alami stabil untuk serotipe O, A, SAT1, dan SAT2 sangat efektif dalam menginduksi respons antibodi netralisasi pada sapi dan memberikan perlindungan silang yang baik terhadap strain heterolog yang beredar di wilayah tersebut. Kami mengusulkan ini sebagai kandidat vaksin yang sangat baik untuk dikembangkan secara komersial. Lebih lanjut, strain virus yang dipilih di sini yang telah terbukti efektif sebagai vaksin virus inaktivasi kimiawi tradisional juga dapat menjadi kandidat yang baik untuk dimasukkan ke dalam vaksin PMK generasi berikutnya seperti vaksin partikel mirip virus (VLP).

 

REFERENSI

[1] Y. A/Raouf, I. Ibrahim. Diversity of SAT2 foot-and-mouth disease virus in Sudan: implication for diagnosis and control. Vet Res Commun, 46 (3) (2022), pp. 789-798.

[2] S.N. Balinda, A.K. Sangula, R. Heller, V.B. Muwanika, G.J. Belsham, C. Masembe, et al. Diversity and transboundary mobility of serotype O foot-and-mouth disease virus in East Africa: implications for vaccination policies. Infect Genet Evol, 10 (7) (2010), pp. 1058-1065.

[3] K. Lloyd-Jones, M. Mahapatra, S. Upadhyaya, D.J. Paton, A. Babu, G. Hutchings, et al. Genetic and antigenic characterization of serotype O FMD viruses from East Africa for the selection of suitable vaccine strain. Vaccine, 35 (49) (2017), pp. 6842-6849.

[4] F.D. Bari, S. Parida, T. Tekleghiorghis, A. Dekker, A. Sangula, R. Reeve, et al. Genetic and antigenic characterisation of serotype A FMD viruses from East Africa to select new vaccine strains. Vaccine, 32 (44) (2014), pp. 5794-5800.

[5] Y. Tesfaye, F. Khan, M. Yami, J. Wadsworth, N.J. Knowles, D.P. King, et al. A vaccine-matching assessment of different genetic variants of serotype O foot-and-mouth disease virus isolated in Ethiopia between 2011 and 2014. Arch Virol, 165 (8) (2020), pp. 1749-1757.

[6] B. Jackson, Y. Harvey, E. Perez-Martin, G. Wilsden, N. Juleff, B. Charleston, et al. The selection of naturally stable candidate foot-and-mouth disease virus vaccine strains for East Africa. Vaccine, 39 (35) (2021), pp. 5015-5024.

[7] A. Kotecha, E. Perez-Martin, Y. Harvey, F. Zhang, S.L. Ilca, E.E. Fry, et al. Chimeric O1K foot-and-mouth disease virus with SAT2 outer capsid as an FMD vaccine candidate. Sci Rep, 8 (1) (2018).

[8] J.M. Hammond, B. Maulidi, N. Henning. Targeted FMD vaccines for Eastern Africa: The AgResults foot and mouth disease vaccine challenge project. Viruses, 13 (2021).

[9] Y. Harvey, B. Jackson, B.V. Carr, K. Childs, K. Moffat, G. Freimanis, et al. An improved αvβ6-receptor-expressing suspension cell line for foot-and-mouth disease vaccine production. Viruses, 14 (3) (2022), p. 621.

[10] J.J. Dunn, F.W. Studier, M. Gottesman. Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and the locations of T7 genetic elements. J Mol Biol, 166 (1983), pp. 477-535.

[11] A. Kotecha, F. Zhang, N. Juleff, T. Jackson, E. Perez, D. Stuart, et al. Application of the thermofluor PaSTRy technique for improving foot-and-mouth disease virus vaccine formulation. J Gen Virol, 97 (7) (2016), pp. 1557-1565.

[12] OIE. Foot-and-Mouth Disease, Manual of Diagnostic. - Google Scholar n.d. https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C5&q=OIE.+Foot-and-Mouth+Disease%2C+Manual+of+Diagnostic+Tests+and+Vaccines+for+Terrestrial+Animals%3A+Mammals%2C+Birds%2C+and+Bees.+Paris%3B+2012.&btnG= [accessed May 10, 2023].

[13] A. Kotecha, J. Seago, K. Scott, A. Burman, S. Loureiro, J. Ren, et al. Structure-based energetics of protein interfaces guides foot-and-mouth disease virus vaccine design. Nat Struct Mol Biol, 22 (10) (2015), pp. 788-794.

 

SUMBER:

Kay Childs, Yongjie Harvey, Ryan Waters, Timothy Woma, Ginette Wilsden, Hualu Sun, Peng Sun, Julian Seago. 2023. Development of a quadrivalent foot-and-mouth disease vaccine candidate for use in East Africa. Vaccine. Vol. 41, Issue 44, 20 October 2023, Pages 6572-6578.