Lisosom Bisa Membengkak hingga Rusak! Begini Cara Mendeteksi Gangguan Lisosomal akibat Nanomaterial.

 

Penilaian Pembengkakan, Ukuran, dan Jumlah Lisosom sebagai Parameter Evaluasi Gangguan Lisosomal akibat Paparan Nanomaterial

Abstrak

Lisosom merupakan organel intraseluler yang berperan penting dalam degradasi makromolekul, autofagi, homeostasis seluler, dan regulasi berbagai jalur kematian sel. Paparan nanomaterial dapat memengaruhi struktur dan fungsi lisosom setelah material tersebut mengalami internalisasi dan terakumulasi pada kompartemen endolisosomal. Salah satu manifestasi awal gangguan lisosomal adalah perubahan morfologi, termasuk pembengkakan, perubahan ukuran, dan perubahan jumlah lisosom. Parameter tersebut dapat digunakan sebagai indikator perubahan fungsi lisosomal, tetapi tidak dapat secara tunggal dianggap sebagai bukti langsung terjadinya lysosomal membrane permeabilization (LMP). Artikel ini bertujuan membahas pendekatan metodologis untuk mengevaluasi pembengkakan, ukuran, dan jumlah lisosom, khususnya dengan menggunakan pewarna fluoresen seperti LysoTracker, serta mengintegrasikannya dengan metode pencitraan dan biomarker lisosomal lainnya. Kajian literatur menunjukkan bahwa nanomaterial dapat menyebabkan perubahan pada ukuran dan morfologi lisosom melalui akumulasi intraseluler, perubahan tekanan osmotik, gangguan homeostasis ion, pembentukan reactive oxygen species, serta perubahan fungsi membran lisosomal. LysoTracker dapat digunakan untuk memvisualisasikan kompartemen asam dan mengevaluasi perubahan distribusi, ukuran, serta jumlah struktur yang terdeteksi, tetapi interpretasi hasil perlu mempertimbangkan ketergantungannya terhadap keasaman lisosomal dan parameter pencitraan. Oleh karena itu, evaluasi morfologi sebaiknya dikombinasikan dengan pendekatan lain, seperti acridine orange, neutral red, LAMP1/LAMP2, cathepsin release, atau metode langsung untuk mengevaluasi permeabilitas membran. Pendekatan multimodal tersebut memberikan dasar yang lebih kuat untuk membedakan perubahan morfologi lisosomal dari LMP dan gangguan fungsi lisosomal yang lebih luas.

Kata kunci: lysosome, lysosomal membrane permeabilization, LysoTracker, lysosomal swelling, nanomaterial, nanotoxicology.

1. Pendahuluan

Nanomaterial telah digunakan secara luas dalam bidang kesehatan, pangan, kosmetik, industri, elektronik, dan berbagai aplikasi teknologi. Peningkatan penggunaan nanomaterial menyebabkan semakin pentingnya pemahaman mengenai interaksi antara material berukuran nano dengan sistem biologis. Efek biologis nanomaterial tidak hanya ditentukan oleh komposisi kimia, tetapi juga oleh ukuran, bentuk, luas permukaan, muatan permukaan, kelarutan, aglomerasi, dan karakteristik fisikokimia lainnya (Uzhytchak et al., 2023).

Setelah memasuki sel melalui mekanisme endositosis atau fagositosis, sejumlah nanomaterial dapat mengalami trafficking menuju kompartemen endosomal dan lisosomal. Lisosom kemudian dapat menjadi lokasi akumulasi material sekaligus salah satu target penting dalam mekanisme toksisitas nanomaterial. Gangguan pada lisosom dapat meliputi perubahan keasaman lumen, perubahan ukuran dan morfologi, gangguan aktivitas enzim, perubahan permeabilitas membran, hingga pelepasan komponen lisosomal ke sitosol (Feng et al., 2024).

Lysosomal membrane permeabilization (LMP) merupakan salah satu mekanisme penting yang dapat menghubungkan kerusakan lisosomal dengan respons seluler yang lebih luas. Pada LMP, permeabilitas membran lisosomal meningkat sehingga komponen lumen, termasuk protease lisosomal seperti cathepsin, dapat berpindah ke sitosol. Tingkat LMP dan karakteristik sel dapat menentukan konsekuensi biologis berikutnya, termasuk aktivasi apoptosis, inflamasi, atau bentuk kematian sel lainnya (Repnik et al., 2014; Bunderson-Schelvan et al., 2017).

Sebelum atau bersamaan dengan perubahan permeabilitas membran, lisosom dapat mengalami perubahan morfologi. Pembengkakan lisosom, perubahan ukuran, perubahan distribusi, dan perubahan jumlah struktur lisosomal telah dilaporkan setelah paparan berbagai jenis nanopartikel. Namun demikian, perubahan morfologi tidak boleh secara otomatis disamakan dengan LMP. Perubahan tersebut dapat mencerminkan perubahan fungsi lisosomal, akumulasi material, gangguan osmolaritas, perubahan pH, atau respons adaptif sel (Feng et al., 2024).

Salah satu pendekatan yang dapat digunakan untuk mengevaluasi kompartemen lisosomal adalah pewarna fluoresen LysoTracker. Pewarna ini bersifat acidotropic dan terakumulasi pada organel dengan lingkungan asam. Dengan mikroskop fluoresensi atau high-content imaging, distribusi sinyal LysoTracker dapat digunakan untuk mengevaluasi karakteristik morfologi kompartemen lisosomal, termasuk luas area, ukuran, intensitas, dan jumlah struktur yang terdeteksi.

Berdasarkan pertimbangan tersebut, evaluasi pembengkakan, ukuran, dan jumlah lisosom dapat menjadi salah satu komponen penting dalam kerangka pengujian gangguan lisosomal akibat nanomaterial. Namun, diperlukan interpretasi yang hati-hati agar parameter morfologi tidak digunakan secara berlebihan sebagai bukti langsung LMP.

2. Metodologi

2.1. Desain kajian

Artikel ini menggunakan pendekatan narrative literature review dengan fokus pada hubungan antara paparan nanomaterial, perubahan morfologi lisosomal, lysosomal membrane permeabilization, dan metode evaluasi menggunakan pewarna fluoresen, terutama LysoTracker. Literatur yang relevan mencakup artikel penelitian dan artikel tinjauan mengenai nanotoxicology, lysosomal dysfunction, LMP, dan pencitraan lisosomal.

2.2. Konsep pengukuran

Parameter utama yang dapat dievaluasi meliputi:

1. Ukuran lisosom, misalnya diameter ekuivalen, luas area, atau volume apabila data tiga dimensi tersedia.
2. Pembengkakan lisosom, yang dapat dinilai sebagai peningkatan ukuran atau luas lisosom dibandingkan kelompok kontrol.
3. Jumlah lisosom atau lysosome-like structures, berdasarkan jumlah objek fluoresen yang memenuhi kriteria segmentasi.
4. Distribusi lisosom, termasuk perubahan pola distribusi perinuklear atau sitoplasmik.
5. Intensitas fluoresensi, sebagai parameter tambahan untuk menggambarkan perubahan kompartemen asam, dengan catatan bahwa intensitas tidak secara langsung ekuivalen dengan jumlah lisosom atau tingkat LMP.

2.3. Penggunaan LysoTracker

LysoTracker merupakan kelompok pewarna fluoresen yang memiliki sifat acidotropic sehingga terakumulasi pada kompartemen intraseluler yang bersifat asam. Pewarna ini dapat digunakan untuk visualisasi lisosom dan kompartemen asam melalui mikroskop fluoresensi.

Dalam rancangan pengujian, sel dapat dibagi menjadi kelompok kontrol dan kelompok yang mendapatkan paparan nanomaterial pada beberapa konsentrasi dan waktu pajanan. Setelah perlakuan, sel diberi LysoTracker sesuai dengan kondisi eksperimental yang tervalidasi, kemudian dilakukan pencitraan menggunakan parameter akuisisi yang konsisten antara kelompok.

Untuk menghindari bias, konsentrasi pewarna, waktu inkubasi, intensitas laser atau lampu, gain kamera, exposure time, objective, dan pengaturan threshold sebaiknya dipertahankan atau didokumentasikan secara konsisten. Analisis citra dilakukan dengan segmentasi objek secara otomatis atau semiotomatis.

2.4. Analisis morfologi

Pembengkakan lisosom dapat dinilai dengan membandingkan distribusi ukuran objek fluoresen antara kelompok kontrol dan kelompok paparan. Parameter yang dapat digunakan antara lain:

• mean atau median lysosomal area;
• equivalent circular diameter;
• ukuran objek maksimum;
• distribusi ukuran;
• jumlah objek per sel;
• total lysosomal area per cell;
• integrated fluorescence intensity.

Apabila memungkinkan, analisis sebaiknya dilakukan pada sejumlah sel yang memadai dari beberapa biological replicates. Unit analisis perlu dibedakan antara sel dan lisosom. Penggunaan ribuan lisosom dari satu kultur sebagai independent observations tanpa memperhitungkan biological replicate dapat menyebabkan pseudoreplikasi.

2.5. Konfirmasi gangguan lisosomal

Perubahan morfologi sebaiknya tidak digunakan sebagai satu-satunya indikator LMP. Evaluasi dapat diperkuat dengan metode tambahan, misalnya:

• acridine orange atau neutral red untuk fungsi kompartemen asam;
• LAMP1 atau LAMP2 untuk karakterisasi membran lisosomal;
• cathepsin B, cathepsin D, atau cathepsin L untuk mengevaluasi pelepasan enzim lisosomal;
• galectin-based assays untuk indikasi kerusakan membran endolisosomal;
• transmission electron microscopy (TEM) untuk evaluasi ultrastruktur;
• pengukuran apoptosis atau necrosis sebagai endpoint downstream.

Pendekatan kombinasi diperlukan karena LMP merupakan perubahan permeabilitas membran, sedangkan pembengkakan merupakan perubahan morfologi.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Lisosom sebagai target penting nanomaterial

Literatur menunjukkan bahwa lisosom merupakan salah satu target penting dalam respons sel terhadap nanomaterial. Berbagai nanopartikel dapat masuk melalui endositosis dan kemudian terakumulasi pada kompartemen endolisosomal. Akumulasi tersebut dapat menyebabkan perubahan fungsi dan struktur lisosom (Feng et al., 2024; Uzhytchak et al., 2023).

Gangguan lisosomal dapat terjadi melalui beberapa mekanisme. Interaksi permukaan nanopartikel dengan membran, pembentukan reactive oxygen species, perubahan keseimbangan ion, gangguan aktivitas pompa proton, dan akumulasi material yang sulit didegradasi dapat berkontribusi terhadap perubahan fungsi lisosomal. Dengan demikian, respons lisosomal perlu dipandang sebagai suatu proses biologis yang melibatkan beberapa parameter, bukan sebagai satu endpoint tunggal.

3.2. Pembengkakan lisosom sebagai indikator perubahan morfologi

Pembengkakan lisosom merupakan salah satu perubahan morfologis yang dapat diamati setelah paparan partikel tertentu. Perubahan tersebut dapat mencerminkan gangguan homeostasis osmotik dan ionik, akumulasi material, atau perubahan trafficking serta degradasi intraseluler.

Namun, pembengkakan tidak secara spesifik menunjukkan bahwa membran lisosom telah mengalami permeabilisasi. Dengan kata lain:

lysosomal swelling ≠ lysosomal membrane permeabilization.

Lisosom dapat mengalami pembesaran tanpa terjadi pelepasan signifikan komponen lumen ke sitosol. Sebaliknya, LMP dapat terjadi tanpa selalu menghasilkan perubahan ukuran yang besar dan mudah terdeteksi. Oleh karena itu, pembengkakan sebaiknya diposisikan sebagai morphological endpoint atau supporting indicator of lysosomal dysfunction, bukan sebagai pengukuran langsung LMP.

Konsep tersebut penting dalam penyusunan metode pengujian berbasis standar karena mencegah interpretasi yang terlalu absolut. Literatur mengenai LMP menunjukkan bahwa permeabilisasi membran merupakan proses yang dapat memiliki derajat berbeda dan konsekuensi biologis yang berbeda pula (Repnik et al., 2014).

3.3. Penggunaan LysoTracker untuk evaluasi ukuran dan jumlah lisosom

LysoTracker memiliki keuntungan karena dapat digunakan untuk visualisasi kompartemen asam secara relatif cepat dan kompatibel dengan fluorescence microscopy. Sinyal yang dihasilkan dapat digunakan untuk melakukan segmentasi struktur yang memiliki karakteristik fluoresensi tertentu.

Dalam konteks pengukuran ukuran dan jumlah lisosom, analisis citra dapat menghasilkan beberapa parameter kuantitatif. Misalnya, peningkatan median area objek LysoTracker dibandingkan kontrol dapat menunjukkan adanya perubahan ukuran struktur yang terdeteksi. Demikian pula, perubahan jumlah objek per sel dapat menunjukkan perubahan dalam distribusi atau organisasi kompartemen asam.

Meskipun demikian, interpretasi harus dilakukan secara hati-hati. LysoTracker merespons lingkungan asam dan bukan penanda eksklusif untuk semua struktur lisosomal. Perubahan pH lumen dapat memengaruhi akumulasi dan intensitas pewarna. Oleh karena itu, peningkatan atau penurunan intensitas LysoTracker tidak boleh secara langsung diterjemahkan sebagai peningkatan atau penurunan jumlah lisosom.

Hal tersebut menjadi semakin penting ketika nanomaterial menyebabkan perubahan pH lisosomal. Review terbaru menunjukkan bahwa gangguan keasaman lisosomal merupakan salah satu bentuk penting nanomaterial-induced lysosomal dysfunction (Feng et al., 2024). Dengan demikian, pengukuran berbasis LysoTracker perlu dikombinasikan dengan parameter morfologi dan, apabila tujuan utamanya adalah LMP, dengan endpoint yang lebih spesifik terhadap permeabilitas membran.

3.4. Ukuran dan jumlah lisosom sebagai parameter kuantitatif

Pengukuran ukuran dan jumlah lisosom memiliki nilai penting untuk mengubah pengamatan mikroskopis yang bersifat subjektif menjadi data kuantitatif. Untuk tujuan standardisasi, parameter yang digunakan perlu didefinisikan dengan jelas.

Sebagai contoh, istilah lysosomal size dapat didefinisikan sebagai luas area dua dimensi atau diameter ekuivalen dari objek yang tersegmentasi. Sementara itu, lysosome number perlu didefinisikan sebagai jumlah objek yang memenuhi kriteria segmentasi tertentu per sel atau per unit area.

Perubahan jumlah objek dapat memiliki beberapa interpretasi. Penurunan jumlah objek tidak selalu menunjukkan hilangnya lisosom. Beberapa lisosom dapat mengalami fusi sehingga menghasilkan objek yang lebih besar tetapi lebih sedikit. Sebaliknya, fragmentasi dapat meningkatkan jumlah objek yang terdeteksi tanpa menunjukkan peningkatan total massa lisosomal.

Karena itu, jumlah objek sebaiknya dianalisis bersama dengan ukuran, total lysosomal area, dan parameter distribusi ukuran. Pendekatan tersebut dapat membantu membedakan perubahan berupa fragmentasi, fusi, atau pembengkakan.

3.5. Hubungan antara perubahan morfologi dan LMP

LMP merupakan proses yang lebih spesifik daripada perubahan morfologi. Ketika membran lisosomal menjadi permeabel, komponen lumen dapat berpindah ke sitosol. Cathepsin dan hidrolase lisosomal lainnya dapat berkontribusi terhadap perubahan jalur kematian sel dan respons inflamasi (Bunderson-Schelvan et al., 2017).

Penelitian mengenai nanotoxicology menunjukkan bahwa tingkat kerusakan lisosomal dapat menentukan konsekuensi seluler. LMP yang relatif terbatas dapat berhubungan dengan pelepasan cathepsin dan aktivasi jalur apoptosis, sedangkan kerusakan yang lebih berat dapat menyebabkan gangguan homeostasis sel yang lebih luas dan berkontribusi terhadap kematian sel nekrotik (Repnik et al., 2014).

Oleh sebab itu, pengujian LMP yang komprehensif sebaiknya memiliki setidaknya tiga tingkat informasi:

(1) perubahan morfologi → (2) perubahan fungsi/permeabilitas → (3) konsekuensi seluler.

Dalam kerangka tersebut, pengukuran pembengkakan, ukuran, dan jumlah lisosom berada terutama pada tingkat pertama. Pengukuran permeabilitas membran dan pelepasan komponen lisosomal berada pada tingkat kedua, sedangkan apoptosis, necrosis, atau respons inflamasi berada pada tingkat ketiga.

3.6. Pentingnya pendekatan multimodal

Tidak terdapat satu metode tunggal yang secara ideal menggambarkan seluruh aspek fungsi lisosomal. Review mengenai nanomaterial-induced lysosomal dysfunction menunjukkan bahwa gangguan lisosomal dapat melibatkan perubahan keasaman, permeabilitas membran, rupture, serta perubahan protein dan kanal yang berkaitan dengan fungsi lisosomal (Feng et al., 2024).

Oleh karena itu, kombinasi beberapa pendekatan lebih sesuai daripada mengandalkan satu indikator. Misalnya, LysoTracker dapat digunakan untuk karakterisasi kompartemen asam dan morfologi, LAMP1/LAMP2 untuk karakterisasi membran, cathepsin release untuk mendukung evaluasi permeabilitas, dan TEM untuk memperoleh informasi ultrastruktural.

Pendekatan tersebut juga membantu mengurangi risiko false interpretation. Misalnya, perubahan intensitas LysoTracker dapat berasal dari perubahan keasaman, sedangkan perubahan ukuran dapat berasal dari swelling atau fusi. Tanpa endpoint tambahan, kedua perubahan tersebut sulit dikaitkan secara spesifik dengan LMP.

3.7. Implikasi untuk standardisasi pengujian nanomaterial

Untuk keperluan standardisasi, terminologi dan klaim perlu dibuat proporsional dengan kemampuan metode. Apabila metode hanya mengukur ukuran, jumlah, dan morfologi struktur LysoTracker-positive, maka klaim yang tepat adalah assessment of lysosomal morphological changes atau assessment of lysosomal size, number and swelling.

Sebaliknya, istilah assessment of lysosomal membrane permeabilization sebaiknya digunakan apabila metode menyediakan bukti yang relevan terhadap perubahan permeabilitas membran. Penggunaan terminologi yang tepat penting agar metode tidak memberikan kesan bahwa perubahan morfologi merupakan bukti langsung terjadinya LMP.

Selain itu, faktor yang dapat memengaruhi hasil seperti jenis sel, kondisi kultur, konsentrasi nanomaterial, waktu paparan, ukuran dan aglomerasi partikel, metode pencitraan, parameter segmentasi, serta karakteristik pewarna perlu dilaporkan secara memadai. Hal ini sejalan dengan prinsip bahwa efek biologis nanopartikel tidak dapat digeneralisasi hanya berdasarkan ukuran atau komposisinya, karena sifat fisikokimia material dapat menentukan interaksi seluler dan respons toksikologisnya (Uzhytchak et al., 2023).

4. Kesimpulan

Pembengkakan, ukuran, jumlah, dan perubahan morfologi lisosom merupakan parameter yang relevan untuk mengevaluasi lysosomal morphological changes akibat paparan nanomaterial. LysoTracker dapat digunakan sebagai pendekatan pencitraan untuk memvisualisasikan kompartemen asam dan mendukung analisis kuantitatif terhadap ukuran serta jumlah struktur lisosomal.

Namun, perubahan morfologi, termasuk lysosomal swelling, tidak dapat dianggap sebagai bukti langsung lysosomal membrane permeabilization. LMP merupakan perubahan permeabilitas membran yang memerlukan endpoint tambahan untuk mendukung interpretasinya. Oleh karena itu, evaluasi yang lebih komprehensif sebaiknya mengintegrasikan analisis morfologi dengan parameter fungsi lisosomal, biomarker membran seperti LAMP1/LAMP2, indikator pelepasan cathepsin, dan/atau metode pencitraan ultrastruktural.

Untuk tujuan standardisasi, metode sebaiknya menggunakan terminologi yang sesuai dengan apa yang benar-benar diukur. Dengan demikian, pengukuran berbasis LysoTracker untuk ukuran, jumlah, dan pembengkakan lebih tepat diposisikan sebagai assessment of lysosomal morphological changes, sedangkan klaim mengenai LMP perlu didukung oleh pengukuran permeabilitas membran yang relevan. Pendekatan multimodal tersebut dapat meningkatkan ketepatan interpretasi dan reproducibility dalam evaluasi toksisitas nanomaterial.

Daftar Pustaka

Bunderson-Schelvan, M., Holian, A., & Hamilton, R. F., Jr. (2017). Engineered nanomaterial-induced lysosomal membrane permeabilization and anti-cathepsin agents. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B, 20(4), 230–248. https://doi.org/10.1080/10937404.2017.1305924

Feng, Y., Fu, H., Zhang, X., Liu, S., & Wei, X. (2024). Lysosome toxicities induced by nanoparticle exposure and related mechanisms. Ecotoxicology and Environmental Safety, 286, 117215. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2024.117215

Repnik, U., Hafner Česen, M., & Turk, B. (2014). Lysosomal membrane permeabilization in cell death: Concepts and challenges. Mitochondrion, 19, 49–57. https://doi.org/10.1016/j.mito.2014.06.006

Uzhytchak, M., Smolková, B., Lunova, M., Frtús, A., Jirsa, M., Dejneka, A., & Lunov, O. (2023). Lysosomal nanotoxicity: Impact of nanomedicines on lysosomal function. Advanced Drug Delivery Reviews, 197, 114828. https://doi.org/10.1016/j.addr.2023.114828

#Nanotoxicology 

#Lysosome 

#LysoTracker 

#LMP 

#Nanomaterial