Uji Donor Babi untuk Xenotransplantasi

 

Desain dan Pengujian Donor Babi yang Disesuaikan untuk Transplantasi Silang Spesies (Xenotransplantasi)

 

ABSTRAK

 

Studi terbaru pada model manusia yang telah meninggal dunia (1,2) dan penggunaan xenograft secara belas kasih (3) telah mengeksplorasi potensi organ babi untuk transplantasi pada manusia. Untuk melanjutkan ke studi klinis, diperlukan donor babi yang siap secara klinis yang harus direkayasa dan xenograft-nya berhasil diuji pada primata nonmanusia. Di sini, kami menjelaskan desain, pembuatan, dan fungsi pendukung kehidupan jangka panjang dari cangkok ginjal yang berasal dari donor babi yang direkayasa secara genetik dan ditransplantasikan pada model monyet cynomolgus. Donor babi ini direkayasa untuk membawa 69 pengeditan genom, menghilangkan antigen glikan, mengekspresikan transgen manusia secara berlebih, dan menonaktifkan retrovirus endogen babi. Analisis fungsional in vitro menunjukkan bahwa sel endotel ginjal yang telah diedit dapat memodulasi inflamasi hingga mencapai tingkat yang tidak dapat dibedakan dari sel endotel manusia, menunjukkan bahwa sel yang telah diedit ini memiliki tingkat kompatibilitas imun manusia yang tinggi. Ketika ditransplantasikan pada monyet cynomolgus, ginjal dengan tiga penghapusan antigen glikan saja menunjukkan kelangsungan hidup cangkok yang buruk, sedangkan ginjal dengan penghapusan antigen glikan dan ekspresi transgen manusia menunjukkan waktu kelangsungan hidup yang jauh lebih lama, menunjukkan manfaat ekspresi transgen manusia in vivo. Hasil ini menunjukkan bahwa studi praklinis xenotransplantasi ginjal dapat berhasil dilakukan pada primata nonmanusia dan membawa kita lebih dekat ke uji klinis cangkok ginjal babi yang direkayasa secara genetik.

 

PENDAHULUAN

 

Xenotransplantasi dapat menawarkan solusi transformatif terhadap krisis kekurangan organ di seluruh dunia (1,2,3). Untuk melanjutkan ke studi klinis, diperlukan donor babi yang siap secara klinis yang harus direkayasa dan xenograft-nya berhasil diuji pada model primata nonmanusia (NHP) untuk menilai keamanan dan efektivitasnya.

 

Selama bertahun-tahun, berbagai donor babi yang direkayasa secara genetik telah diciptakan, dan ginjal mereka ditransplantasikan pada monyet Dunia Lama (OWM) (4,5,6). Meskipun donor-donor ini memberikan pemahaman tentang ketidakcocokan molekuler dalam xenotransplantasi, mereka belum siap secara klinis. Pertama, donor sering kali dibuat pada jenis babi komersial yang ukuran jantung dan ginjalnya terlalu besar untuk aplikasi manusia. Walaupun eliminasi ekspresi gen reseptor hormon pertumbuhan dapat mengurangi ukuran organ (2,3), hal ini juga menyebabkan konsekuensi biologis yang tidak diinginkan (7). Kedua, donor dirancang untuk pengujian pada OWM (4,5,6). Donor ini tidak memiliki α-Gal (galaktosa-α-1,3-galaktosa) atau α-Gal dan Sd(a) (Sia-α2.3-[GalNAc-β1.4]Gal-β1.4-GlcNAc) tetapi masih mengekspresikan Neu5Gc (N-glycolylneuraminic acid) untuk mencocokkan ekspresi Neu5Gc pada OWM. Namun, analisis in vitro menunjukkan bahwa donor babi yang kompatibel dengan manusia idealnya harus memiliki ketiga glikan ini dihilangkan untuk mencocokkan ketiadaan ketiga glikan tersebut pada manusia (8,9). Meskipun cangkok ginjal dari donor babi yang tidak memiliki ketiga glikan ini dan membawa berbagai transgen manusia telah diuji pada OWM, kelangsungan hidup cangkoknya pendek (8) atau tidak semua transgen manusia diekspresikan (10). Ketiga, donor membawa sekuens retrovirus endogen babi (PERV) dalam genom mereka, yang menghadirkan risiko zoonosis, karena transmisi PERV ke sel manusia dalam kultur dan integrasinya ke dalam genom manusia telah terbukti (11,12).

 

Di sini, kami menciptakan donor babi yang disesuaikan dengan manusia pada jenis babi miniatur Yucatan dan mentransplantasikan cangkok ginjal babi yang tidak memiliki tiga glikan dengan atau tanpa penghapusan PERV (inaktivasi retrovirus (RI)) (disebut 3KO.RI atau 3KO), atau 3KO dengan tujuh transgen manusia dengan atau tanpa RI (disebut 3KO.7TG.RI atau 3KO.7TG) ke dalam monyet cynomolgus (Macaca fascicularis). Kami menunjukkan bahwa cangkok ginjal babi yang disesuaikan dengan manusia, dikombinasikan dengan rejimen imunosupresif yang relevan secara klinis, mendukung kelangsungan hidup NHP jangka panjang hingga 2 tahun (758 hari).

 

Ketidakcocokan Molekuler Babi

 

Terdapat ketidakcocokan molekuler yang substansial antara babi dan manusia. Ketidakcocokan ini terutama berfokus pada antigen permukaan sel dan regulator kaskade komplemen, jalur koagulasi, serta proses inflamasi (13,14)(Tab Tambahan 1).

 

Sel babi menampilkan tiga antigen glikan utama pada permukaan selnya — α-Gal (15), Neu5Gc (16), dan Sd(a) (17) — yang merupakan produk dari gen sintesis glikan terkait, yaitu glycoprotein α-galactosyltransferase 1 (GGTA1), cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH), dan β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2 (B4GALNT2)/B4GALNT2-like (B4GALNT2L). Pada manusia, GGTA1 (18) dan CMAH (19) berkembang menjadi pseudogen, sehingga epitope α-Gal dan Neu5Gc tidak diekspresikan (Gambar 1a).

 

Setelah lahir, manusia mengembangkan antibodi terhadap α-Gal dan Neu5Gc, yang disebut sebagai antibodi bawaan, akibat paparan terhadap molekul yang menyerupai kedua antigen ini (16,20,21). Meskipun gen B4GALNT2 pada manusia bersifat fungsional (22), tingkat ekspresinya bervariasi, dan mutasi alami telah diidentifikasi yang berkorelasi dengan fenotipe Sd(a-) (23). Tingkat rendah antibodi yang bereaksi dengan Sd(a) telah terdeteksi pada manusia (24). Sama seperti manusia, monyet Dunia Lama (Old World Monkeys, OWM) memiliki antibodi bawaan terhadap α-Gal dan Sd(a), tetapi berbeda dengan manusia, mereka tidak memiliki antibodi bawaan terhadap Neu5Gc karena mereka memiliki gen CMAH yang fungsional (25) (Gambar 1a).

 

Gambar 1. Ketidakcocokan fungsional antara donor babi dan penerima primata.

 

a. Analisis imunohistokimia (IHC) mengonfirmasi bahwa tiga antigen glikan diekspresikan pada ginjal babi tipe liar (WT), tetapi telah dieliminasi dari ginjal 3KO.7TG (ID donor 21077) dan 3KO.7TG.RI (ID donor A9161), dengan pola yang serupa dengan ginjal manusia. Sebagai perbandingan, monyet Dunia Lama (Old World Monkeys, OWM) mengekspresikan antigen Neu5Gc. Analisis IHC untuk 3KO dilakukan pada semua sampel ginjal kontralateral yang disertakan dalam studi ini, dan fenotipe 3KO dikonfirmasi pada semua sampel.

 

b. Sel endotel ginjal babi tipe liar (WT KEC) mengikat antibodi bawaan manusia dan primata non-manusia (NHP), sementara sel endotel ginjal babi 3KO menunjukkan pengikatan antibodi yang berkurang secara signifikan. Setiap sampel diuji dalam tiga replikasi teknis. Garis kesalahan menunjukkan standar deviasi (s.d.).

 

c. Sel endotel yang berasal dari aorta 3KO (3KO AECs) mengikat IgG dan IgM secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan WT AECs ketika diinkubasi dengan 96 sampel serum individu dari monyet cynomolgus. Perlu dicatat bahwa 3KO AECs masih menunjukkan tingkat pengikatan IgG dan IgM yang substansial. Analisis statistik dilakukan menggunakan uji Wilcoxon matched-pairs signed rank.

 

d. WT KECs menunjukkan deposisi C3b yang signifikan dalam serum manusia dibandingkan dengan sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs). Meskipun berkurang secara signifikan, 3KO KECs tetap menunjukkan tingkat deposisi C3b yang substansial (panel kanan). Garis kesalahan menunjukkan standar error mean (s.e.m.).

 

e. WT KECs menunjukkan deposisi C3b, sementara 3KO KECs menunjukkan deposisi yang lebih rendah ketika diinkubasi dalam serum monyet cynomolgus. Garis kesalahan menunjukkan s.e.m.

 

f. Sel endotel ginjal babi (WT atau 3KO) tidak menghasilkan protein C teraktivasi (aPC), sementara HUVECs dengan mudah menghasilkan aPC. Untuk d–f, WT KECs (n = 1), 3KO KECs (n = 3), dan HUVECs (n = 1). OD405, densitas optik pada panjang gelombang 405 nm.

 

g. Ketika diinkubasi dengan darah utuh manusia, WT (n = 1) dan 3KO (n = 1) KECs babi memicu pembekuan, yang diukur sebagai pembentukan kompleks trombin-antitrombin (TAT). Garis kesalahan menunjukkan s.e.m. Untuk d–g, setiap titik mewakili replikasi biologis yang diperiksa dalam setidaknya dua eksperimen independen. Kecuali untuk c, analisis statistik dilakukan menggunakan uji t dua sisi tanpa pasangan. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05.

 

Ketika sel babi terpapar serum primata, antigen glikan dikenali oleh antibodi bawaan primata, yang mengarah pada penolakan yang dimediasi antibodi (antibody-mediated rejection, AMR) (13). Dalam uji pengikatan antibodi, sel endotel ginjal babi tipe liar (WT KECs) mengikat tingkat tinggi IgG dan IgM manusia, dan pengikatan ini berkurang secara signifikan ketika tiga xenoantigen dieliminasi (3KO KECs) (Gambar 1b). Pengikatan IgG dan IgM serum OWM serupa, meskipun pengikatan antibodi residual yang substansial (terutama pengikatan IgM) terdeteksi pada 3KO KECs (Gambar 1b). Hal ini konsisten dengan laporan lain bahwa sel babi 3KO memiliki xenoantigen tambahan yang dikenali oleh serum OWM (8,9). Sel endotel yang berasal dari aorta (AECs) tipe liar dan 3KO menunjukkan perilaku serupa dengan KECs ketika diinkubasi dengan 96 sampel serum individu dari monyet cynomolgus (Gambar 1c).

 

Pengikatan antibodi memicu aktivasi komplemen, menghasilkan C3b yang terikat pada permukaan dan C3a yang larut. Ketika diinkubasi dengan serum manusia, HUVECs tidak menunjukkan deposisi C3b (Gambar 1d), yang menunjukkan tidak adanya pengikatan antibodi dan/atau mitigasi lengkap aktivasi komplemen. Ketika WT KECs babi diinkubasi dengan serum manusia, deposisi C3b yang signifikan diamati. Meskipun 3KO KECs menunjukkan pengurangan signifikan dalam deposisi C3b dibandingkan dengan WT KECs, mereka masih menunjukkan deposisi C3b residual yang substansial (Gambar 1d), menunjukkan bahwa regulator komplemen babi kurang efektif dalam mengurangi aktivasi komplemen manusia. Ketika WT dan 3KO KECs babi diinkubasi dengan serum monyet cynomolgus, hasil yang serupa diperoleh, meskipun tingkat C3b residual yang lebih tinggi pada sel babi 3KO dibandingkan dengan serum manusia (Gambar 1e).

 

Dalam kondisi fisiologis, trombomodulin dan reseptor protein C endotel (EPCR) diekspresikan pada permukaan sel endotel dan menghambat pembekuan dengan memungkinkan regulasi yang dimediasi aPC (26,27). Ketika trombin manusia dan protein C diberikan ke HUVECs, aPC dengan mudah dihasilkan (Gambar 1f). Sebaliknya, produksi aPC tidak diamati ketika reagen ini diberikan ke WT atau 3KO KECs babi (Gambar 1f), menunjukkan bahwa trombin dan protein C manusia tidak kompatibel dengan trombomodulin dan/atau EPCR babi. Pembekuan darah utuh manusia secara eks vivo yang ditingkatkan diamati, diukur sebagai pembentukan kompleks trombin-antitrombin (TAT), yang kemungkinan disebabkan oleh ketidakmampuan sel babi untuk menghasilkan aPC (Gambar 1g).

 

Donor Babi yang Dimanusiakan

 

Ras babi mini Yucatan dipilih karena ukuran organnya sebanding dengan organ manusia (28). Selain itu, babi dengan golongan darah OO dipilih untuk menghilangkan ketidakcocokan golongan darah ABO (29).

 

Babi-babi ini direkayasa untuk membawa 69 modifikasi genomik menggunakan teknik clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) dan protein terkait CRISPR-9 (Cas9) melalui mekanisme penyambungan ujung yang tidak homolog (nonhomologous end joining) serta perbaikan yang diarahkan oleh homologi (homology-directed repair) (30,31), dan pertukaran kaset yang dimediasi oleh rekombinase (recombinase-mediated cassette exchange) (32) (Gambar 2a, Gambar Data Ekstensi 1a, dan Tabel Tambahan 2). Modifikasi ini mengganggu tiga gen sintesis glikan (delapan alel; Gambar Data Ekstensi 1b) (3KO), menyisipkan konstruksi transgenik yang disebut Payload 15S (PL15S) secara hemizigot di lokasi AAVS1 (Gambar Data Ekstensi 1a) (7TG), serta menonaktifkan elemen PERV (59 salinan) (RI) (Gambar Data Ekstensi 1c) yang dibawa dalam sel betina Yucatan Yuc25F.

 

Gambar 2: Donor Porcine Yucatan Direkayasa untuk Membawa 69 Modifikasi Genomik

 

a. Ginjal donor Babi, 3KO.7TG.RI, direkayasa untuk menghilangkan tiga antigen glikan (3KO), mengekspresikan tujuh transgen manusia secara berlebih (PL15S), dan menonaktifkan elemen PERV (RI) melalui tiga tahap pengeditan dan kloning. Ginjal donor, 3KO.7TG, membawa 3KO dan PL15S tanpa RI. KI adalah knock in, sedangkan RMCE adalah pertukaran kaset yang dimediasi oleh rekombinase (recombinase-mediated cassette exchange).

 

b. Pembacaan dari sekuensing genom lengkap berbasis Nanopore pada donor 3KO.7TG.RI, A9161, disejajarkan dengan kromosom kustom yang membawa PL15S yang disisipkan pada situs aman genomik AAVS1 (atas). Pembacaan dari sekuensing RNA langsung berbasis Nanopore (dRNA-seq) pada mRNA ginjal A9161 disejajarkan dengan kromosom kustom (bawah). Ketiga unit transkripsi ditranskripsi.

 

c. Ketujuh protein transgenik manusia terdeteksi di ginjal kontralateral (contra) A9161 yang diambil saat transplantasi (baris 1), dan di ginjal xenograft (xeno) yang diambil saat nekropsi pada hari ke-176 pasca-transplantasi (baris 2). HRP: horseradish peroxidase; TM: trombomodulin; Ms–HRP: antibodi sekunder anti-tikus yang terkonjugasi dengan HRP; Rb–HRP: antibodi sekunder anti-kelinci yang terkonjugasi dengan HRP.

 

d. Tiga jenis sel endotelial diidentifikasi dari populasi sel ginjal yang terdisosiasi menggunakan sekuensing RNA sel tunggal (single-cell RNA-seq), yaitu sel endotelial (ECs) (PECAM1+PLVAP−EHD3−GATA5−), sel endotelial glomerulus (GECs) (PECAM1+EHD3+GATA5+), atau sel endotelial berfenestrasi (FECs) (PECAM1+PLVAP+) (bawah), dan ekspresi transgen dianalisis pada ketiga jenis sel tersebut (atas). Rata-rata log2-normalisasi unique molecular identifier diplot terhadap tiga unit transkripsi PL15S (ssUBC, ssEEF1A1, dan CAG). UMAP: uniform manifold approximation and projection.

 

e. Donor porcine 3KO.7TG (n=3) menunjukkan tingkat filtrasi glomerulus terukur (mGFR) yang normal dibandingkan dengan babi Yucatan tipe liar (WT) seusia (n=4). Unpaired two-tailed Student’s t-test; garis kesalahan adalah s.e.m. Titik-titik menunjukkan replikasi biologis, dan data dihasilkan dari satu eksperimen.

 

PL15S membawa tujuh gen manusia (Tabel Tambahan 3), termasuk CD46 dan CD55 dari jalur komplemen, THBD dan PROCR dari jalur koagulasi, CD47 yang terlibat dalam imunitas bawaan, serta TNFAIP3 dan HMOX1 yang mengurangi cedera iskemia-reperfusi, apoptosis, dan inflamasi. Konstruksi transgenik ini dirancang dalam format polikistronik, di mana dua sekuens DNA komplementer dihubungkan dengan sekuens viral 2A (33), dan tujuh DNA komplementer dipisahkan ke dalam tiga kaset transkripsi (Gambar Data Ekstensi 1a).

 

Sekuensing generasi berikutnya dilakukan pada sel-sel yang diedit dan/atau babi yang dikloning setelah setiap tahap pengeditan dan kloning. Data yang disajikan berasal dari donor porcine A9161 dengan genotipe 3KO.7TG.RI, yang ginjalnya ditransplantasikan ke penerima NHP M6521 dan mencapai waktu kelangsungan cangkok selama 176 hari. Sekuensing genom lengkap berbasis bacaan panjang menunjukkan bahwa satu salinan utuh dari sekuens PL15S disisipkan ke dalam intron 1 gen PPP1R12C pada babi (ortholog dengan gen AAVS1 pada manusia) (Gambar 2b, atas). Sekuensing RNA langsung (dRNA-seq) pada sampel ginjal A9161 menunjukkan bahwa ketiga unit transkripsi dalam PL15S ditranskripsi dengan inisiasi transkripsi, eksisi intron, dan poliadenilasi mRNA yang sesuai (Gambar 2b, bawah). Di antara ketiga unit tersebut, ekspresi unit CAG dan ssUBC lebih tinggi, sedangkan ekspresi unit ssEEF1A1 berada pada tingkat yang lebih rendah. Genotipe 3KO dan RI diverifikasi melalui sekuensing produk PCR yang mencakup situs target CRISPR–Cas9 (Gambar Data Ekstensi 1b,c dan Tabel Tambahan 4).

 

RNA-seq dan imunohistokimia (IHC) dilakukan pada semua transplantasi ginjal 3KO.7TG ± RI yang telah selesai, kecuali untuk donor 21405 yang tidak memiliki sampel biopsi ginjal kontralateral (n = 11). Untuk RNA-seq, sampel kontralateral, biopsi, dan nekropsi dianalisis dan menunjukkan bahwa semua transgen manusia diekspresikan, dengan ekspresi yang lebih tinggi di bawah promoter CAG dan ssUBC, sementara ekspresi di bawah promoter ssEEF1A1 lebih rendah (Extended Data Fig. 2a). Untuk analisis IHC (Supplementary Table 5), dua sampel dari setiap eksperimen transplantasi ginjal, yaitu ginjal kontralateral yang diambil saat transplantasi dan ginjal transplantasi yang diambil saat nekropsi, dianalisis. Sebagai contoh, gambar IHC dari A9161 ditampilkan (Fig. 2c). Semua tujuh protein transgenik terdeteksi di ginjal kontralateral, baik di glomeruli maupun sel tubulus, dan ekspresi tetap dipertahankan di cangkok ginjal pada hari ke-176 setelah transplantasi. Fotomikrograf IHC dari semua studi NHP yang selesai dipindai dan dihitung (Extended Data Fig. 2b–e), menunjukkan bahwa semua protein transgenik terdeteksi. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa ekspresi transgenik bersifat tahan lama.

 

Jaringan ginjal kontralateral dari dua donor babi, A9161 dan 21077 (donor 3KO.7TG), diisolasi menjadi sel tunggal, dan RNA-seq sel tunggal dilakukan. Tiga jenis KEC diidentifikasi, termasuk sel endotelial (PECAM1+PLVAP−EHD3−GATA5−), sel endotelial berfenestra (PECAM1+PLVAP+), dan sel endotelial glomerular (PECAM1+EHD3+GATA5+) (Fig. 2d). Transkrip dari kaset CAG dan ssUBC terdeteksi dengan jelas pada ketiga jenis sel endotelial, sementara transkrip kaset ssEEF1A1 ditemukan pada sel endotelial dan sel endotelial berfenestra, tetapi tidak pada sel endotelial glomerular. Hal ini mungkin mencerminkan tingkat ekspresi kaset ssEEF1A1 yang lebih rendah sebagaimana ditunjukkan oleh RNA-seq langsung (Fig. 2b). Namun demikian, baik protein manusia TNFAIP3 maupun HMOX1 terdeteksi di ginjal melalui IHC (Fig. 2c), dan TNFAIP3 juga terdeteksi melalui western blot (Extended Data Fig. 5c).

 

Mengingat jumlah pengeditan genom yang relatif besar pada donor babi, kami ingin mengetahui apakah fungsi ginjal terganggu. Tingkat filtrasi glomerulus yang terukur pada donor 3KO.7TG tidak berbeda dari babi Yucatan WT yang cocok berdasarkan usia dan jenis kelamin (Fig. 2e). Selain itu, ketika dilakukan studi tantangan cairan, kedua kelompok memberikan respons yang serupa, memberikan bukti lebih lanjut bahwa ginjal 3KO.7TG berfungsi secara normal (Extended Data Fig. 1d).

 

Pengeditan Genom Memberikan Perlindungan

 

Kami mengisolasi KEC primer dari babi (Extended Data Fig. 3a,b) dan melakukan analisis in vitro. Seperti yang diharapkan, KEC 3KO tidak memiliki α-Gal, Neu5Gc, dan Sd(a) (Extended Data Fig. 3c), dan KEC 3KO.7TG ± RI mengekspresikan transgen manusia, sebagaimana dianalisis melalui flow cytometry (Extended Data Fig. 4a, CD46, CD55, EPCR, dan trombomodulin; Extended Data Fig. 5a, CD47) dan melalui western blot (Extended Data Fig. 5c, TNFAIP3).

 

Ketika diinkubasi dalam serum manusia atau monyet cynomolgus, KEC 3KO.7TG ± RI menunjukkan penurunan yang signifikan pada deposisi C3b dibandingkan dengan sel 3KO, menunjukkan bahwa transgen (atau transgen-transgen) menghambat aktivasi komplemen (Fig. 3a,b). Ketika diinkubasi dengan serum manusia atau monyet cynomolgus selama 45 menit, sel WT terlisis, sedangkan modifikasi 3KO hampir sepenuhnya menghilangkan sitotoksisitas yang bergantung pada komplemen dari serum manusia, tetapi tidak pada serum monyet cynomolgus (Fig. 3c dan Extended Data Fig. 4b,c). Hal ini menunjukkan bahwa serum monyet cynomolgus memiliki aktivitas sitotoksik anti-babi yang lebih kuat dibandingkan dengan serum manusia. Ketika waktu inkubasi diperpanjang menjadi 15 jam, modifikasi 3KO tidak cukup untuk sepenuhnya melindungi sel bahkan dari kematian sel akibat serum manusia, sedangkan KEC 3KO.7TG ± RI terlindungi dari sitotoksisitas serum manusia dan monyet cynomolgus, melampaui perlindungan yang diberikan oleh 3KO (Extended Data Fig. 4b). Kontribusi transgen CD46 dan CD55 diverifikasi dengan antibodi penghambat (Fig. 3d dan Extended Data Fig. 4d,e). Selain itu, ketika CD46, CD55, atau keduanya diekspresikan dalam KEC 3KO, masing-masing terbukti secara fungsional kompeten untuk mengurangi aktivasi komplemen (Fig. 3e). Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa protein manusia transgenik CD46 dan CD55 mengatur aktivitas komplemen ketika diekspresikan pada KEC babi. Dengan memasukkan kedua transgen, kami meniru redundansi bawaan alami, yang dapat membuat sistem lebih tangguh jika salah satu regulator hilang akibat pelepasan (CD46) atau oleh pemotongan enzimatik (CD55) selama peradangan atau cedera jaringan (34,35).

 

Gambar 3: Gen Transgenik Manusia Memberikan Perlindungan

 

a, b. Dalam serum manusia (a) atau monyet cynomolgus (b), deposisi C3b pada sel endotel ginjal babi yang dimodifikasi (3KO.7TG ± RI KECs) semakin berkurang. Garis putus-putus menunjukkan rata-rata deposisi C3b (serum + EDTA).

 

c. Dalam serum manusia atau monyet cynomolgus, 3KO.7TG ± RI KECs terlindungi dari sitotoksisitas yang bergantung pada komplemen. Sel 3KO KECs menunjukkan sisa sitotoksisitas komplemen dalam serum monyet cynomolgus.

 

d. Sel 3KO.7TG ± RI KECs mengurangi deposisi C3b ketika CD46, CD55 manusia, atau keduanya tidak diblokir oleh antibodi. NHS: serum manusia normal.

 

e. Sel 3KO KECs yang membawa gen polisitronik CD46, CD55, atau CD46–CD55–CD47 mengatur deposisi C3b dalam serum manusia atau monyet cynomolgus. Garis putus-putus menunjukkan rata-rata deposisi C3b dari serum yang diolah EDTA.

 

f. Sel 3KO.7TG ± RI KECs dengan mudah menghasilkan aPC. Produksi aPC berkurang ketika EPCR atau trombomodulin (TM) diblokir dengan antibodi, dengan pemblokiran trombomodulin memberikan efek yang lebih besar. Garis putus-putus menunjukkan rata-rata produksi aPC tanpa sel.

 

g. Sel 3KO.7TG ± RI KECs mengatur pembentukan TAT dalam darah utuh. Garis putus-putus menunjukkan baseline TAT dalam darah donor.

 

h. CD47 manusia (hCD47) pada 3KO.7TG ± RI KECs memberi sinyal melalui SIRPα pada sel Jurkat manusia. Sel WT KECs (n = 1), 3KO KECs (n = 1), 3KO.7TG ± RI (n = 2 untuk 3KO.7TG dan n = 1 untuk 3KO.7TG.RI). mAb: antibodi monoklonal; RLU: unit cahaya relatif.

 

i. Sel 3KO.7TG ± RI KECs terlindungi dari aktivasi kaspase 3/7 yang diinduksi TNF manusia.

 

j. Sel korteks ginjal 3KO yang mengekspresikan TNFAIP3, HMOX1, atau gen polisitronik TNFAIP3–HMOX1 terlindungi dari aktivasi kaspase 3/7 yang diinduksi TNF manusia.

 

Pada a–d, f–i: WT (n = 1), 3KO (n = 3), 3KO.7TG (n = 3, lingkaran biru solid), 3KO.7TG.RI (n = 2, lingkaran terbuka), kontrol manusia (HC), dan sel endotel vena umbilikalis manusia (n = 1, segitiga abu-abu). Dalam a–d, f, g: sel endotel mikrovasikular glomerular manusia (n = 1, segitiga terbalik abu-abu). Data berasal dari replikasi biologis yang diulang minimal dua kali untuk a–d, f–i. Untuk e, j, data berasal dari replikasi teknis. Bilah kesalahan menunjukkan s.e.m. Analisis statistik menggunakan uji t Student dua sisi, berpasangan (3KO.7TG ± RI dengan versus tanpa antibodi pemblokir (f)) dan tidak berpasangan (perbandingan lainnya). ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01; NS: tidak signifikan.

 

Berbeda dengan sel babi WT atau 3KO, 3KO.7TG ± RI KECs dengan mudah menghasilkan aPC (Gambar 3f), mengurangi pembentukan TAT (Gambar 3g), dan mengatur koagulasi darah utuh manusia seefisien sel kontrol manusia (Gambar Data Tambahan 4h). Dengan menggunakan antibodi pemblokir (Gambar Data Tambahan 4f), kami menunjukkan bahwa EPCR dan trombomodulin berkontribusi pada produksi aPC (Gambar 3f), dengan trombomodulin memiliki efek lebih signifikan. Selain itu, sel 3KO KECs yang mengekspresikan EPCR, trombomodulin, atau keduanya menunjukkan bahwa keduanya berkontribusi pada produksi aPC, dengan trombomodulin memiliki efek yang lebih besar dalam sistem eksperimental ini (Gambar Data Tambahan 4g).

 

CD47 babi tidak dapat berinteraksi secara efektif dengan reseptor SIRPα manusia. Menggunakan garis sel reporter SIRPα, kami menemukan bahwa 3KO.7TG ± RI KECs yang mengekspresikan transgen CD47 manusia mengaktifkan jalur sinyal SIRPα, dan pra-inkubasi dengan antibodi anti-CD47 manusia memblokir sinyal SIRPα secara bergantung dosis (Gambar 3h).

 

Akhirnya, aktivasi sel imun bawaan dalam xenograft memicu peradangan dan apoptosis sel endotel. Untuk meningkatkan ketahanan jaringan, TNFAIP3 dan HMOX1 manusia diekspresikan dalam ginjal 3KO.7TG ± RI (Gambar 2c). Analisis Western blot mengonfirmasi ekspresi TNFAIP3 dalam sel 3KO.7TG ± RI KECs (Data Tambahan Gambar 5c). Efek ekspresi transgenik TNFAIP3 dan HMOX1 terhadap apoptosis dinilai menggunakan uji caspase 3/7, yang menunjukkan bahwa tingkat protein transgenik dalam sel 3KO.7TG cukup untuk mengurangi aktivasi caspase 3/7 setelah perlakuan dengan TNF manusia, dibandingkan dengan sel KEC 3KO (Gambar 3i). Selain itu, sel-sel yang berasal dari korteks ginjal yang mengekspresikan secara berlebihan TNFAIP3, HMOX1, atau keduanya secara efektif menghambat aktivasi caspase 3/7 yang diinduksi TNF dalam uji in vitro (Gambar 3j). Meskipun memiliki aktivitas anti-apoptotik yang tumpang tindih, TNFAIP3 dan HMOX1 mencapai hasil tersebut melalui fungsi biologisnya yang unik dan mengurangi peradangan dalam keadaan yang berbeda. TNFAIP3 adalah enzim deubiquitinasi yang menghambat apoptosis yang dimediasi TNF (38), sedangkan HMOX1 terlibat dalam langkah awal degradasi heme dan telah terbukti memiliki efek antioksidan dan anti-inflamasi (38,39). Kami memasukkan TNFAIP3 dan HMOX1 dalam donor kami, karena kedua transgen ini telah terbukti memberikan manfaat dalam uji in vitro maupun in vivo (40,41).

 

Ginjal babi direkayasa untuk mendukung kehidupan

 

Sekelompok monyet cynomolgus disaring untuk mendeteksi ikatan antibodi preformed yang reaktif terhadap babi. Secara umum, monyet dengan tingkat ikatan antibodi yang lebih rendah terhadap AEC atau KEC 3KO dipilih (Gambar Data Tambahan 6a–d).

 

Karena primata non-manusia (NHP) mahal, sangat diatur, dan terbatas ketersediaannya, tidak memungkinkan untuk melakukan eksperimen dengan kekuatan statistik yang cukup. Oleh karena itu, jumlah transplantasi NHP per kelompok genotipe donor babi ditentukan secara empiris, berdasarkan data historis yang dilaporkan dalam literatur dan apa yang dapat dicapai secara wajar. Penjodohan antara donor babi dan penerima NHP ditentukan berdasarkan ketersediaan. Selain itu, studi ini tidak dilakukan secara buta untuk semua pihak yang terlibat. Para penerima diberikan regimen imunosupresi berupa terapi induksi dengan deplesi limfosit B dan T, terapi pemeliharaan dengan antibodi anti-CD154 dan mycophenolate mofetil, serta terapi singkat pasca-transplantasi menggunakan tacrolimus dan steroid (Gambar Tambahan 1). Ginjal babi yang direkayasa secara genetik ditransplantasikan bersamaan dengan nefrektomi kedua ginjal asli monyet cynomolgus.

 

Mengingat kinerja serupa dari KEC yang diisolasi dari donor 3KO.7TG atau 3KO.7TG.RI dalam uji fungsional (Gambar 3 dan Gambar Data Tambahan 3–5), kami menganalisis transplantasi yang dilakukan dengan ginjal 3KO dengan dan tanpa RI sebagai satu kelompok, serta ginjal 3KO.7TG dan 3KO.7TG.RI sebagai kelompok kedua. Kelangsungan hidup enam penerima transplantasi ginjal 3KO ± RI relatif pendek, dengan akhir studi pada hari ke-4 dan ke-6 (gagal ginjal), hari ke-21 (koagulasi intravaskular diseminata), serta hari ke-26, ke-35, dan ke-50 (edema berat dan proteinuria) (Tabel 1). Sebaliknya, transplantasi 3KO.7TG (n = 8) dan 3KO.7TG.RI (n = 7) menunjukkan kelangsungan hidup cangkok yang secara signifikan lebih lama dibandingkan xenograft 3KO ± RI (n = 6) (median waktu kelangsungan hidup 176 hari versus 24 hari; P = 0,026, uji log-rank) (Tabel 1 dan Gambar 4a). Filtrasi metabolit seperti kreatinin oleh ginjal babi tunggal yang ditransplantasikan cukup untuk mengimbangi ketiadaan dua ginjal asli (Gambar 4b), sebagaimana yang rutin diamati pada alotransplantasi ginjal manusia. Parameter lain, termasuk albumin serum, kalium serum, dan jumlah trombosit darah, umumnya tetap dalam rentang normal, kecuali saat terjadi gagal ginjal (albumin dan kalium serum) (Gambar Tambahan 5).

 

Tabel 1. Ginjal Cangkok Mendukung Kehidupan pada Xenotransplantasi Babi ke Primata Non-Manusia (NHP)

(Dari: Desain dan pengujian donor babi yang disesuaikan untuk transplantasi silang spesies)

Genotipe	ID Hewan	Lama Hidup (hari)a	Alasan Eutanasib	EOS	Pola Cedera Xenograft	De novo DSAc
3KO.RI	M13021	4	Gagal ginjal	–	ATI	Tidak
	M12121	6	Gagal ginjal	T	AMR, TMA	Ya
	CY1061d	21	HE — perdarahan intra-abdomen, DIC dengan anemia refrakter dan insufisiensi ginjal	I, C/A, T, U	ATI, TMA	Tidak
	CY1062d	26	HE — insufisiensi pernapasan dengan hemoptisis, edema perifer, dan insufisiensi ginjal	I, C/A	ATI, TMA	Tidak
	MB1027d	35	HE — edema perifer dan insufisiensi ginjal	–	ATI, TMA	Ya
3KO	M11521e	50	HE — edema perifer	C/A, T, BH	ATI, TCMR-IA	Ya
3KO.7TGf	M2220	8	HE — insufisiensi pernapasan dengan efusi pleura dan insufisiensi ginjal	–	AMR, TMA	Tidak
	M10619	9	Gagal ginjal	C/A, T	AMR, TMA	Tidak
	M11421	25	Gagal ginjal	BH	AMR, ATI, TMA	Tidak
	M8220g,h	103	Gagal ginjal	I, BH	CAMR, TCMR-III, TMA	Ya
	M7721	365	Gagal ginjal	C/A	CAMR, TMA	Ya
	M2519	511	HE — epistaksis dengan anemia refrakter dan insufisiensi ginjal	I, C/A, T	TMA	Ya
	M2420	758	HE — edema perifer dan insufisiensi ginjal	I, C/A	CAMR, TMA	Ya
	M8320	>673, sedang berlangsung	–	–	–	NC
3KO.7TG.RIf	M6421g,i	6	Gagal ginjal	T	ATI, TMA	Tidak
	M12621g,i	9	Gagal ginjal	–	AMR, ATI, TMA	Tidak
	M12021	16	Gagal ginjal	I	TMA	Tidak
	M6521h	176	Gagal ginjal	C/A	CAMR, TMA	Ya
	M6121	283	HE — paraplegia akut	–	Tidak ada bukti penolakan	Tidak
	M5722g,i	>247, sedang berlangsung	–	–	–	NC
	M7621	>429, sedang berlangsung	–	–	–	NC

---

Keterangan:

1.     HE: Hemoragi (Haemorrhage).

2.     EOS: Akhir Studi (End of Study).

3.     ATI: Cedera Tubulus Akut (Acute Tubular Injury).

4.     AMR: Penolakan yang Dimediasi Antibodi (Antibody-Mediated Rejection).

5.     TMA: Mikroangiopati Trombosis (Thrombotic Microangiopathy).

6.     TCMR: Penolakan yang Dimediasi Sel T (T-Cell Mediated Rejection).

7.     NC: Tidak Diklasifikasikan (Not Classified).

Genotipe tambahan:

• 3KO: Tiga gen yang dieliminasi (GGTA1, CMAH, dan B4GALNT2/B4GALNT2L).
• 7TG: Tujuh transgen manusia (CD46, CD55, THBD, PROCR, CD47, TNFAIP3, dan HMOX1).

 

Gambar 4: Ginjal babi yang direkayasa mendukung kehidupan pada monyet cynomolgus.

a. Probabilitas kelangsungan hidup secara signifikan lebih baik (P = 0,026) pada penerima yang ditransplantasi dengan cangkok ginjal 3KO.7TG ± RI (n = 15) dibandingkan dengan 3KO ± RI (n = 6). Analisis statistik dilakukan menggunakan uji log-rank (42).

 

b. Kadar kreatinin serum umumnya tetap dalam rentang normal, kecuali saat terjadi kegagalan cangkok. Kadar kreatinin di atas 6 mg/dl memenuhi kriteria untuk eutanasia. Garis putus-putus menunjukkan rentang normal kadar kreatinin serum (42).

 

c. Pewarnaan Periodic Acid–Schiff (PAS) pada sampel biopsi ginjal dari penerima M2420, yang membawa cangkok ginjal 3KO.7TG pada hari pasca-operasi (POD) 502, menunjukkan tampilan normal (42).

 

d, e. Pembuluh darah (d) dan glomerulus (e) dari biopsi cangkok ginjal M2420 pada POD 502 tampak normal (42).

 

f. Pewarnaan positif C4d di glomerulus, tetapi tidak pada kapiler peritubular, diamati pada biopsi cangkok ginjal M2420 pada POD 502 (42).

 

Penolakan dinilai melalui pemeriksaan histopatologi berdasarkan klasifikasi Banff untuk patologi alograft ginjal (42), dengan modifikasi untuk xenotransplantasi (Tabel 1 dan Tabel Data Tambahan 1). Lima dari enam ginjal 3KO ± RI menunjukkan bukti cedera tubulus akut (ATI), fitur yang tidak termasuk dalam kriteria Banff tetapi mewakili cedera ginjal umum. Selain itu, penolakan yang dimediasi antibodi (AMR)/mikroangiopati trombotik (TMA) (M12121), TMA (CY1061, CY1062, dan MB1027), dan penolakan yang dimediasi sel T (TCMR) (M11521) juga diamati (42). Pada penerima ginjal 3KO.7TG ± RI yang mengalami gagal ginjal, TMA dengan atau tanpa AMR diamati pada saat eutanasia, dan hanya dua yang menunjukkan bukti ATI (42). Berbeda dengan alotransplantasi, penolakan yang dimediasi sel T bukanlah patologi utama pada xenotransplantasi, dengan hanya satu cangkok yang hilang memenuhi kriteria Banff untuk TCMR (42). Masih perlu ditentukan apakah sistem penilaian Banff yang dikembangkan untuk alotransplantasi pada manusia dapat diterapkan secara memadai pada xenotransplantasi, mengingat mekanisme penolakan yang mungkin berbeda (43).

 

Pada alotransplantasi, TMA biasanya mencerminkan proses yang dimediasi antibodi atau terkait obat, sedangkan pada xenotransplantasi, ketidakcocokan yang signifikan pada protein koagulasi atau pengaturan komplemen antarspesies dapat berkontribusi pada TMA, bahkan tanpa keberadaan antibodi spesifik donor baru (de novo donor-specific antibody, dnDSA). Dengan mempertimbangkan hal ini, sampel patologi dinilai menggunakan kriteria yang disesuaikan untuk xenotransplantasi (Tabel Data Tambahan 1 dan Tabel Tambahan 6) (42). Kriteria yang disesuaikan ini mewakili upaya kami untuk memberikan skor dan diagnosis yang informatif serta berguna dalam xenotransplantasi ginjal.

 

Deplesi limfosit dalam darah dibuktikan dengan pengukuran jumlah sel B dan T yang bersirkulasi (Gambar Data Tambahan 7). Meskipun deplesi sel B signifikan, dnDSA yang reaktif terhadap sel endotel 3KO terdeteksi pada beberapa hewan seiring waktu (8 dari 18 transplantasi; Tabel 1 dan Gambar Data Tambahan 8), dan fitur patologis dari cedera cangkok yang dimediasi antibodi diamati (42). Pada penerima M2420, yang memiliki waktu kelangsungan hidup xenograft terlama (758 hari), biopsi protokol menunjukkan histologi ginjal yang sebagian besar normal pada hari ke-502 setelah transplantasi, dengan fibrosis bercak (Gambar 4c–e dan Gambar Data Tambahan 9a). Namun, pewarnaan C4d diamati di glomerulus, menunjukkan aktivasi C4 (Gambar 4f dan Gambar Data Tambahan 9b). Aktivasi C4 adalah proses hilir dari intervensi CD46 dan CD55, sehingga pewarnaan positif C4d dapat diharapkan pada sampel ginjal 3KO.7TG ± RI dalam keberadaan dnDSA. Fotomikrograf histopatologi representatif dari sampel nekropsi dengan waktu kelangsungan hidup 9 hari (M10619), 176 hari (M6521), dan 758 hari (M2420) disediakan dalam Gambar Data Tambahan 9c–e. Di antara penerima dengan kelangsungan hidup jangka panjang, kista ginjal sederhana yang tampak jinak diamati. Etiologinya tidak diketahui dan saat ini sedang diselidiki.

 

Pada NHP dengan dnDSA, mungkin saja regimen imunosupresif saat ini awalnya efektif, tetapi akhirnya gagal mencegah perkembangan respons humoral spesifik porcine. TMA dan AMR pada penerima dengan kelangsungan hidup jangka panjang sering kali dikaitkan dengan infeksi atau prosedur biopsi, yang mungkin telah memicu respons imun. Meskipun pengamatan ini dapat memberikan informasi untuk merancang regimen imunosupresif pada studi klinis (misalnya, mempertimbangkan penghapusan dengan antibodi anti-CD19 dan desensitisasi atau terapi penyelamatan dengan plasmapheresis atau terapi sel plasma terarah), pendekatan yang dapat diterapkan dalam model NHP terbatas. Perlu dicatat, agen yang menargetkan jalur CD40–CD40L telah menjadi standar perawatan dalam studi xenotransplantasi NHP. Meskipun agen ini belum mendapat persetujuan FDA, beberapa di antaranya sedang dalam pengembangan klinis dan akan menjadi dasar dalam regimen imunosupresif, bersama dengan obat-obatan yang disetujui FDA yang saat ini digunakan dalam transplantasi ginjal klinis.

 

DISKUSI

 

Dalam studi ini, kami menggambarkan donor porcine yang membawa 69 suntingan genom, dengan ekspresi dan fungsi semua 7 transgen manusia. Meskipun donor porcine yang membawa knockout CMAH dianggap tidak akan bertahan hidup pada OWM karena komplikasi dari knockout CMAH (8,9), ginjal yang diperoleh dari donor porcine 3KO.7TG ± RI mendukung kehidupan jangka panjang pada monyet cynomolgus, hingga 758 hari.

 

Waktu kelangsungan hidup graft yang bervariasi mungkin merupakan hal yang melekat pada xenotransplantasi ginjal dan/atau unik untuk model OWM. Meskipun 3KO secara substansial mengurangi tingkat pengikatan antibodi anti-porcine yang sudah terbentuk, xenoantigen minor tetap ada dan berkontribusi pada pengikatan antibodi sisa (Gambar 1b). Selain itu, aktivitas sitotoksisitas bergantung pada komplemen lebih tinggi pada serum monyet cynomolgus daripada pada serum manusia (Gambar 3c dan Gambar Data Tambahan 4b,c). Selain itu, data menunjukkan bahwa inaktivasi CMAH dapat menghasilkan antigen baru yang bersifat xenogenik bagi OWM, yang dapat menjadi target pengikatan antibodi yang sudah terbentuk, yang menyebabkan aktivasi komplemen pada serum OWM8,9. Perlu dicatat bahwa dalam pengaturan klinis, komplikasi terkait knockout CMAH yang unik pada OWM tidak akan relevan, karena akan ada kecocokan dengan genotipe pseudogen CMAH dari penerima manusia.

 

Salah satu keuntungan dari xenotransplantasi, dibandingkan dengan allotransplantasi, adalah kesempatan untuk merekayasa secara genetik organ donor. Oleh karena itu, untuk meningkatkan kelangsungan hidup graft, beban imunosupresi yang berat pada penerima dapat dipindahkan ke graft yang lebih optimal yang didonorkan dari donor porcine yang direkayasa secara genetik. Mengingat ketidakcocokan molekuler yang substansial antara kedua spesies, penambahan transgen manusia tambahan dapat dipertimbangkan, seperti TFPI, CD39 (juga dikenal sebagai ENTPD1), HLA-E dan PDL1 (juga dikenal sebagai CD274)14,44. Untuk meniru pola dan tingkat ekspresi gen-endogen porcine, in situ knock-in, di mana urutan pengkode manusia menggantikan gen ortolog porcine, dapat dipertimbangkan. Hal ini terutama relevan untuk THBD dan PROCR, yang biasanya diekspresikan pada sel endotel. Kami menyadari bahwa selain antigen glikan, berbagai protein porcine juga dapat bersifat xenogenik17 dan mungkin tidak mungkin untuk mengidentifikasi dan mengeliminasi semuanya. Pada akhirnya, model porcine yang direkayasa secara genetik, dengan fitur toleransi imun45, mungkin merupakan tujuan akhir. Studi pembuktian prinsip yang berhasil dicapai dalam penelitian ini membawa kita lebih dekat ke pengujian klinis graft ginjal porcine untuk transplantasi pada manusia.

 

METODE

 

Perakitan Konstruksi Transgenik

 

Konstruksi landing pad membawa promotor EEF1A1 manusia yang mengarah pada ekspresi gen penanda mTagBFP2, dibatasi oleh sepasang situs loxP/lox2272. Lengan homologi kiri sepanjang 1.469 bp (koordinat kromosom 6, dari 59.347.343–59.345.875, susScr11) dan lengan homologi kanan sepanjang 1.260 bp (koordinat kromosom 6, dari 59.345.874 hingga 59.344.615, susScr11) diperkuat dari DNA genomik yang diisolasi dari ras Yucatan dan ditempatkan 5′ atau 3′ ke situs loxP/lox2272. Konstruksi transgenik PL15S dirakit melalui rekombinasi homolog ragi (46). Singkatnya, urutan DNA pengkode manusia (Tabel Suplemen 3), promotor, terminator, dan urutan poliadinilasi diatur ke dalam salah satu dari tiga unit transkripsi polisitronik, yang kemudian diatur menjadi molekul DNA linier dalam konfigurasi konvergen atau divergen (Gambar Data Tambahan 1).

 

Desain RNA Panduan CRISPR–Cas9

 

Pustaka R DECIPHER47 digunakan untuk merancang RNA panduan yang menargetkan urutan pengkode inti katalitik dari enzim pol pada elemen PERV (Tabel Suplemen 2). Untuk menonaktifkan empat gen yang terlibat dalam sintesis tiga antigen glikan utama, α-Gal, Neu5Gc, dan Sd(a), kami menggunakan satu RNA panduan tunggal (sgRNA) per gen, yang menargetkan gen GGTA1, CMAH atau B4GALNT2/B4GALNT2L. Untuk memasukkan DNA landing pad ke dalam lokus genomik AAVS1, kami menggunakan satu RNA panduan yang menargetkan lokus AAVS1. Urutan panduan disediakan dalam Tabel Suplemen 2. Semua sgRNA disintesis dan disediakan oleh Synthego.

 

Mutasi CRISPR–Cas9 melalui penyambungan ujung nonhomolog dan perbaikan yang diarahkan homologi

 

Sebuah sgRNA diinkubasi dengan enzim Cas9 (A36496, Thermo Fisher) untuk membentuk kompleks ribonukleoprotein (RNP) segera sebelum digunakan, sesuai dengan petunjuk dari pabrikannya. Untuk menghasilkan knockout pada tiga gen xenoantigen dan penyisipan landing pad dalam reaksi multipelks, plasmid donor landing pad AAVS1 ditambahkan ke kompleks RNP sebelum elektroporasi. Untuk menonaktifkan elemen PERV, tiga sgRNA dikomplekskan dengan protein Cas9 untuk membentuk RNP. Elektroporasi dilakukan menggunakan Neon Transfection System 100 µl Kit (MPK10096, Thermo Fisher).

 

Pembuatan donor babi yang membawa 3KO, penyisipan PL15S ke dalam situs AAVS1 (7TG) dan RI

 

Sebanyak 1 × 10⁶ sel yang diperoleh dari tusukan telinga (EPDCs) dielektroporasi (MPK10096, Thermo Fisher) dengan empat RNP yang menargetkan gen GGTA1, CMAH, dan B4GALNT2/B4GALNT2L, serta lokus AAVS1, bersama dengan plasmid donor landing pad AAVS1. Lima hari kemudian, sel-sel disortir menjadi sel tunggal yang digate berdasarkan tidak adanya glikan α-Gal (isolectin B4, konjugat FITC, ALX-650-001F-MC05, Enzo Life Sciences) dan adanya gen penanda mTagBFP2 dan ditempatkan ke dalam sumur individu pada pelat 96-well. Populasi klonal sel kemudian dilakukan genotyping untuk mengidentifikasi sel yang membawa editan yang benar dari 3KO dan penyisipan landing pad yang berhasil ke dalam situs AAVS1 (Tabel Suplemen 4). Sel-sel yang telah diedit tersebut kemudian digunakan sebagai donor nuklir dalam eksperimen transfer nuklir sel somatik (SCNT) untuk menghasilkan babi yang membawa editan ini.

 

EPDC yang membawa 3KO dan landing pad yang disisipkan pada situs AAVS1 diisolasi dan dielektroporasi dengan konstruksi transgenik PL15S, bersama dengan mRNA Cre recombinase (130-101-113, Miltenyi Biotec), untuk memungkinkan pertukaran kaset yang dimediasi oleh rekombinase. Selanjutnya, sel-sel disortir menjadi sel tunggal yang digate berdasarkan ekspresi permukaan sel dari gen-gen yang dibawa pada payload (CD46, CD55, PROCR, THBD, atau CD47), dan ditempatkan ke dalam sumur tunggal pada pelat 96-well. Populasi klonal sel kemudian dilakukan genotyping untuk mengidentifikasi sel yang berhasil menggantikan landing pad dengan urutan PL15S (Tabel Suplemen 4). Sel-sel yang telah diedit ini digunakan dalam eksperimen SCNT dan dikloning ke dalam babi.

 

Untuk menentukan jumlah salinan elemen PERV yang dibawa dalam genom Yucatan, PCR digital tetesan dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (48). Dengan menggunakan assay yang dirancang terhadap gen pol, garis betina Yucatan 25 (Yuc25F) ditemukan membawa 59 salinan urutan tersebut. Untuk menonaktifkan elemen PERV, EPDC yang membawa 3KO dan PL15S yang disisipkan pada situs AAVS1 dihasilkan dan dielektroporasi dengan tiga RNP yang menargetkan inti katalitik aktivitas reverse transcriptase dari gen pol (Tabel Suplemen 2), dan sel tunggal disortir ke dalam sumur individu pada pelat 96-well. Populasi klonal sel kemudian dilakukan genotyping dengan urutan amplikon (Tabel Suplemen 4) dan sel-sel yang membawa mutasi indel pada semua salinan elemen PERV diidentifikasi. Sel-sel yang telah diedit tersebut digunakan dalam eksperimen SCNT dan dikloning ke dalam babi.

 

Produksi donor babi melalui transfer inti sel somatik

 

Sel yang telah diedit genetiknya dikloning ke dalam babi melalui SCNT49 dan kloning dilakukan oleh eGenesis Wisconsin dan Precigen Exemplar. Kloning hewan dilakukan berdasarkan protokol yang disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (protokol eGenesis Wisconsin HF2020-01, disetujui pada 24 November 2020; protokol Precigen Exemplar MRP2018-003, disetujui pada 21 Juni 2018). Semua donor porcine Yucatan yang dihasilkan (Sus scrofa domesticus) adalah betina Yucatan. Semua produksi donor mengikuti pedoman perawatan dan penggunaan hewan laboratorium (National Research Council of National Academies), khususnya prinsip 3R.

 

Pewarnaan IHC dan analisis ekspresi transgen

 

Ekspresi protein manusia (EPCR, thrombomodulin, TNFAIP3, HMOX1, CD46, CD55, dan CD47) dinilai dari potongan jaringan yang diperbaiki dengan formalin dan disematkan dalam parafin dari sampel ginjal porcine Yucatan WT dan transgenik yang berusia 8 minggu berdasarkan protokol standar (amplifikasi sinyal tyramide) menggunakan Cy5+-tyramide sebagai reagen deteksi. Setelah semua target terdeteksi, potongan jaringan diberi pewarnaan kontra dengan Hoechst 33258 dan dipasang dengan ProLong Glass antifade mountant. Potongan jaringan yang telah diwarnai kemudian diambil gambarnya menggunakan pemindai fluoresensi otomatis Zeiss Axio Scan.Z1 dengan parameter pemindaian yang sama untuk setiap jaringan. Gambar-gambar dihasilkan menggunakan perangkat lunak analisis gambar Zeiss Zen Blue 3.4. Daftar reagen dapat dilihat pada Tabel Suplemen 5.

 

Intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) dari protein transgen pada seluruh jaringan ginjal, glomerulus, tubulus, dan pembuluh darah dari kontrol positif dan negatif diukur menggunakan perangkat lunak analisis gambar Zeiss ZEN Blue 3.4. Kontrol positif terdiri dari sampel yang diwarnai dengan antibodi primer yang spesifik terhadap protein transgen manusia, goat anti-mouse–horseradish peroxidase (HRP) atau goat anti-rabbit–HRP konjugat, dan Cy5+-tyramide. Kontrol negatif terdiri dari sampel yang diinkubasi dengan mouse–HRP atau rabbit–HRP konjugat dan Cy5+-tyramide saja.

 

Pengukuran jaringan seluruh tubuh dan biopsi jaringan dilakukan dengan menggambar sekitar kontur seluruh jaringan. Nilai MFI sesuai dengan intensitas piksel di dalam kontur yang dihitung oleh perangkat lunak. Untuk pengukuran MFI glomerulus dan pembuluh darah pada jaringan seluruh tubuh, 20 glomerulus dan 8 pembuluh darah dipilih secara acak dengan distribusi yang merata dalam jaringan, dan kontur digambar untuk mendefinisikan struktur tersebut. Untuk biopsi jaringan kecil, 5–10 glomerulus dan 3–5 pembuluh darah dipilih. Nilai rata-rata MFI untuk glomerulus dan pembuluh darah (per jaringan seluruh tubuh atau biopsi jaringan) dihitung. Pengukuran MFI tubulus dilakukan menggunakan 20 persegi panjang (diukur oleh perangkat lunak sebagai 500 × 500 piksel) dan 5–10 persegi panjang (diukur oleh perangkat lunak sebagai 300 × 300 piksel) pada jaringan seluruh tubuh dan biopsi jaringan, masing-masing. Nilai rata-rata MFI untuk 20 persegi panjang (per jaringan) atau 5–10 persegi panjang (per biopsi jaringan) dihitung. Nilai MFI yang dilaporkan dalam grafik batang sesuai dengan MFI rata-rata yang dinormalisasi (yaitu, sinyal spesifik) dari 11 sampel. MFI rata-rata yang dinormalisasi didefinisikan sebagai nilai MFI rata-rata dari kontrol positif dikurangi nilai MFI rata-rata dari kontrol negatif (yaitu, sinyal tidak spesifik).

 

Pewarnaan IHC untuk 3KO pada ginjal

 

Potongan jaringan ginjal yang diperbaiki dengan formalin dan disematkan dalam parafin dari sampel ginjal Yucatan porcine, manusia, cynomolgus, rhesus, dan babun diproses seperti yang dijelaskan di atas menggunakan buffer sitrat Thermo Fisher 1X untuk pemulihan epitop yang dipicu oleh panas dalam modul pretreatment (PT). Setelah pemulihan epitop yang dipicu oleh panas, potongan jaringan diblokir dalam TBS ditambah dengan serum kambing 5% selama 30 menit, diikuti dengan inkubasi selama 2 jam dengan campuran reagen pengikat dalam TBS dengan serum kambing 5%. Campuran reagen pengikat terdiri dari pengenceran 1:100 isolectin B4-FITC (untuk mendeteksi antigen α-Gal), pengenceran 1:100 antibodi anti-Neu5GC ayam (untuk mendeteksi antigen Neu5GC), dan pengenceran 1:250 DBA-biotin (untuk mendeteksi antigen Sd(a)). Potongan jaringan dicuci dengan TBS-T tiga kali selama 3 menit setiap kali dan diinkubasi dengan campuran pengenceran 1:1.000 goat anti-chicken Alexa Fluor 647 dan pengenceran 1:1.000 streptavidin-Alexa Fluor 568 dalam TBS yang disuplai dengan serum kambing 5%. Pewarnaan inti, pemasangan jaringan dengan ProLong Glass antifade mountant, pencitraan, dan analisis gambar dilakukan seperti yang dijelaskan di atas.

 

Analisis Laju Filtrasi Glomerulus yang Diukur

 

Sapi Yucatan WT dan 3KO.7TG yang berusia empat bulan menerima dosis intravena tunggal Omnipaque 300 Iohexol sebanyak 64,7 mg kg−1 (00407141359, GE Healthcare). Sampel darah dikumpulkan pada 5, 15, dan 30 menit serta 1, 2, 3, 6, 8, 10, dan 24 jam setelah pemberian dosis, dan plasma dipisahkan menggunakan K2EDTA. Konsentrasi Iohexol diukur menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi dengan spektroskopi ultraviolet (HPLC-UV). Berbagai parameter farmakokinetik termasuk klirens (ml menit kg−1) dihitung menggunakan model dua kompartemen (Phoenix WinNonlin, perangkat lunak versi 8.1). Luas permukaan tubuh (BSA) dihitung dengan rumus BSA (m2) = 9 × BW2/3/100, dan laju filtrasi glomerulus yang diukur (ml menit m−2) dihitung sebagai klirens Iohexol yang dinormalisasi terhadap BSA50. Data diplot dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Analisis Antibodi Anti-Porcine IgG dan IgM pada Primata

 

Sel endotel dari hewan porcine 3KO yang tidak mengandung transgen manusia digunakan untuk mengukur antibodi anti-IgG dan IgM terhadap porcine dalam serum yang diinaktivasi panas yang diperoleh dari penerima cynomolgus sebelum dan setelah transplantasi, bersama dengan kumpulan serum dari 96 hewan cynomolgus, dan serum manusia dari setidaknya 100 donor sehat (SeraCare Life Sciences). Setiap sampel sel endotel (1 × 10⁵ sel per uji) diinkubasi dengan serum yang diencerkan 1:4 dalam 1× PBS dengan 1% BSA pada suhu 4°C selama 30 menit. Sel-sel dicuci dan diinkubasi pada suhu 4°C selama 30 menit dengan antibodi sekunder F(ab′)2 anti-human IgG yang terkonjugasi dengan Alexa Fluor 488 (109-546-098, Jackson ImmunoResearch) atau F(ab′)2 anti-human IgM yang terkonjugasi dengan Alexa Fluor 647 (109-606-129, Jackson ImmunoResearch) yang diencerkan 1:100. Sampel difiksasi dengan paraformaldehida 4,2%, diambil dalam waktu 3 hari menggunakan FACSymphony A3 (BD Bioscience), dan dianalisis menggunakan perangkat lunak Flow Jo v10.6.1 (Flow Jo LLC). Tingkat MFI IgG dan IgM dievaluasi dalam duplikat. Data MFI diplot dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Uji Deposi C3b

 

Sel endotel (50.000 sel per sumur) diinokulasi dalam pelat 96 sumur dengan buffer pengencer serum (SDB) (1× buffer annexin V (51-66121E, BD Pharmingen), 1 mM MgCl2 (68475, Sigma) dan 1% BSA (A9576, Sigma)). Serum manusia normal yang terkumpul (NHS, Complement Technology) atau serum monyet cynomolgus (NHP01SRM, BioIVT) yang diencerkan dalam SDB ditambahkan ke sumur yang sesuai dengan konsentrasi akhir 25% dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Untuk kontrol negatif, sel-sel diperlakukan dengan serum 25% yang mengandung 10 mM EDTA (15575038, Thermo Fisher) untuk menginaktivasi komplemen. Setelah inkubasi, sel-sel dicuci dan diwarnai dengan antibodi anti-C3b yang terkonjugasi dengan phycoerythrin pada pengenceran 1:100 (846104, BioLegend) dan pewarna viabilitas Ghost Dye Red 780 pada pengenceran 1:500 (13-0865, Tonbo Biosciences) selama 30 menit pada suhu 4°C dalam kegelapan. Sel-sel dicuci dua kali, segera diambil menggunakan cytometer BD FACSymphony A3 dan dianalisis di Flow Jo. Deposi C3b diplot sebagai MFI dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Uji Sitotoksisitas Bergantung pada Komplemen

 

Satu hari sebelum uji, sel endotel (3.000 sel per sumur) diinokulasi dalam pelat 96 sumur (3595, Corning) dengan medium dasar sel endotel. Pada hari berikutnya, sel-sel yang melekat dicuci sekali dengan SDB, diperlakukan dengan serum yang diencerkan 25% (seperti yang dijelaskan sebelumnya) yang mengandung pewarna viabilitas Cytotox Red 250 nM (4632, Essen Biosciences), kemudian langsung dimasukkan ke dalam sistem analisis sel hidup Incucyte SX5 (model S3, Sartorius) dan diinkubasi pada suhu 37°C dalam inkubator CO₂ selama durasi yang tercantum pada legenda gambar. Jumlah sel yang positif Cytotox Red dihitung dengan perangkat lunak Incucyte, dan jumlah total sel ditentukan secara manual dari gambar kontras fase. Sitotoksisitas bergantung pada komplemen dihitung dengan menormalkan jumlah sel positif Cytotox Red terhadap jumlah total sel. Data diplot sebagai persentase sel positif Cytotox Red, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Uji aPC

 

Pada hari sebelum uji, sel endotel (20.000 sel per sumur) diinokulasi dalam pelat 48 sumur (FB012930, Thermo Fisher) dengan medium dasar sel endotel. Pada hari berikutnya, sel-sel yang melekat dicuci sekali dengan buffer uji (10 mM Tris HCl (15567-027, Thermo Fisher), 150 mM NaCl (S5886, Sigma), 5 mM CaCl2 (C1016, Sigma), 0,1% BSA (A9576, Sigma), pH 7,5), dan kemudian, jika diperlukan, diinkubasi dengan 40 μg ml−1 RCR-252 (konsentrasi akhir 2×; MA5-33375, Thermo Fisher) dan/atau 4 μg ml−1 PBS-01 (konsentrasi akhir 2×; ab6980, Abcam) selama 1 jam pada suhu ruangan dalam buffer uji. Setelah inkubasi dan tanpa mengeluarkan antibodi penghambat, sel-sel diperlakukan dengan 0,1 U ml−1 trombin (605190, Sigma) dan 150 nM protein C (539215, Sigma), keduanya diencerkan dalam buffer uji, selama 60 menit pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, 2 U ml−1 hirudin (H0393, Sigma) yang diencerkan dalam buffer uji ditambahkan untuk menghentikan aktivitas trombin dan pelat diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C. Larutan dari setiap sumur dipindahkan ke pelat 96 sumur, bersama dengan pengenceran serial dari kompleks aPC manusia yang dimurnikan (HCAPC-0080, Prolytix) yang diencerkan dalam buffer uji untuk membuat kurva standar. Substrat kromogenik Spectrozyme PCa (336, Biomedica Diagnostics), yang diencerkan hingga 1 mM dalam buffer imidazol (0,1985 g ml−1 imidazol (I5513, Sigma), 0,03535 g ml−1 Tris (BP152, Thermo Fisher), 0,12675 g ml−1 NaCl dan 250 mM HCl, pH 8,5), ditambahkan dan absorbansi dibaca pada 405 nm setiap 30 detik selama 15 menit dengan pembaca pelat mikro (FilterMax F5, Molecular Devices). Kecepatan awal reaksi dihitung (kemiringan bagian linier awal dari kurva), dan konsentrasi aPC ditentukan menggunakan kurva standar aPC. Data konsentrasi diplot, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Uji Kompleks TAT Seluruh Darah

 

Pada hari sebelum uji, sel endotel (75.000 sel per sumur) diinokulasi dalam pelat 24 sumur (353226, Corning) dengan medium dasar sel endotel. Darah utuh segar dikumpulkan di dalam rumah oleh seorang phlebotomist (Quadrant Health) dalam tabung pengumpulan serum Vacutainer (367820, BD Biosciences) yang mengandung 0,5 U ml−1 heparin (H3393, Sigma), 225 μl ditambahkan ke sel-sel yang melekat setelah dicuci dengan 1× PBS dan diinkubasi pada suhu 37°C menggunakan pengocok pelat Orbitron (201100, Boekel Scientific) selama 40 menit. Setelah inkubasi, darah yang tidak menggumpal dipindahkan ke tabung Eppendorf dan disentrifugasi pada 1.500g selama 10 menit. Untuk konsentrasi TAT dasar, darah utuh disentrifugasi pada saat yang sama darah ditambahkan ke sel. Plasma dikumpulkan dan dibekukan dengan es kering hingga digunakan. Sampel plasma digunakan dalam uji ELISA kompleks TAT (ab108907, Abcam) sesuai dengan petunjuk produsen dengan konsentrasi TAT dihitung berdasarkan kurva standar kompleks TAT manusia yang dimurnikan, dibaca menggunakan Envision 2105 Multimode Plate Reader (2105-0010, Perkin Elmer). Data konsentrasi diplot, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Uji Reporter SIRPα

 

Kit Uji Bioassay Sinyal SIRPα PathHunter Jurkat (93-1135Y19, Eurofins DiscoverX) digunakan untuk menilai fungsi CD47 manusia. Sel KEC babi (30.000 sel per sumur) diinkubasi dengan atau tanpa peningkatan konsentrasi antibodi penghambat anti-CD47 manusia (klon B6H12.2) yang diikuti dengan penambahan sel reporter SIRPα Jurkat (10.000 sel per sumur). Sel-sel diinkubasi pada suhu 37°C dalam inkubator CO₂ yang terhumidi (5% CO2) selama 24 jam, dan petunjuk kit diikuti untuk deteksi sinyal. Luminensia pelat dibaca menggunakan pembaca pelat mikro (FilterMax F5, Molecular Devices) sesuai dengan petunjuk produsen. Unit luminensia relatif diplot, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Uji Caspase 3/7

 

Sel endotel (70% konfluensi dalam cawan kultur jaringan berlapis gelatin 10 cm) diperlakukan dengan 50 ng/ml TNF rekombinan manusia (210-TA-100/CF, R&D Systems) dalam media sel endotel lengkap semalam. Sel-sel dipanen dari pelat dan 10.000 sel ditambahkan ke dalam pelat putih 96 sumur dengan dasar datar (07200589, Thermo Fisher), dan aktivitas caspase 3/7 ditentukan menggunakan Sistem Uji Caspase-Glo 3/7 (G8093, Promega). Secara singkat, volume yang sama dari reagen Caspase-Glo 3/7 segar ditambahkan ke dalam sumur, pelat diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang dalam gelap dan kemudian dibaca menggunakan Pembaca Pelat Multimode Envision 2105 (2105-0010, Perkin Elmer). Data diplot, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.

 

Penerima NHP

 

Monyet cynomolgus jantan dan betina (Macaca fascicularis; Bioculture US LLC dan Alpha Genesis) dengan berat 4–12 kg (perkiraan usia 3–8 tahun) digunakan. Monyet disaring untuk keberadaan anti-IgG dan IgM porcine (yang dijelaskan di atas), dan hewan dengan kadar rendah anti-IgG dan anti-IgM porcine dipilih sebagai penerima. Babi Yucatan dengan berat 5–27 kg digunakan sebagai donor ginjal. Semua perawatan hewan, prosedur bedah, dan perawatan pascaoperasi dilakukan sesuai dengan Pedoman NIH untuk perawatan dan penggunaan primata serta Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional di Duke University (protokol A032-20-02, disetujui 27 Februari 2020), University of Wisconsin di Madison (protokol G006507, disetujui 30 September 2021), dan Massachusetts General Hospital (protokol 2017N000216, disetujui 20 November 2020). Semua studi mengikuti prinsip 3R.

 

Transplantasi Ginjal

 

Untuk mempersiapkan monyet cynomolgus untuk prosedur, saluran vena sentral dimasukkan melalui vena jugularis internal 2–7 hari sebelum transplantasi ginjal. Melalui insisi garis tengah, xenograft ginjal ditransplantasikan secara intraperitoneal dengan menganastomosis vena ginjal dan arteri ke vena cava dan aorta abdominalis, masing-masing. Anastomosis ureterovesikal dilakukan dengan teknik Lich–Gregoir tanpa memasang stent ureter. Nefrektomi native bilateral dilakukan secara bersamaan pada mayoritas penerima kecuali pada M8220 dan M6521, di mana satu ginjal native dibiarkan utuh pada saat transplantasi dan kemudian diangkat sekitar hari pascaoperasi (POD) ke-20. Pascaoperasi, ginjal yang ditransplantasikan dimonitor melalui output urin, ultrasound, kimia klinis dan hematologi, serta biopsi protokol. Saluran vena sentral diangkat dalam 2–4 minggu setelah hewan penerima memiliki fungsi ginjal yang stabil, untuk menghindari risiko infeksi. Kelangsungan hidup jangka panjang mengacu pada fungsi pendukung kehidupan lebih dari 3 bulan pada penerima NHP.

 

Analisis Histopatologis

 

Biopsi ginjal protokol diperoleh setiap 2–4 bulan pada penerima dengan fungsi stabil serta ketika penolakan dicurigai karena peningkatan kreatinin. Jaringan diproses untuk mikroskopi cahaya. Setelah euthanasia monyet, autopsi lengkap dilakukan untuk pemeriksaan histopatologis xenograft ginjal, kelenjar getah bening, jantung, paru-paru, hati, pankreas, timus, dan kulit. Sampel yang diwarnai dengan hematoksilin dan eosin serta dengan pewarnaan asam periodik-Schiff pada xenograft dinilai berdasarkan kriteria Banff terkini, termasuk deposisi C4d. (42)

 

REFERENSI

1.Montgomery, R. A. et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889–1898 (2022).

2.Porrett, P. M. et al. First clinical‐grade porcine kidney xenotransplant using a human decedent model. Am. J. Transplant. 22, 1037–1053 (2022).

3.Griffith, B. P. et al. Genetically modified porcine-to-human cardiac xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 387, 35–44 (2022).

4. Adams, A. B. et al. Anti-C5 antibody tesidolumab reduces early antibody-mediated rejection and prolongs survival in renal xenotransplantation. Ann. Surg. 274, 473–480 (2021).

5.Iwase, H. et al. Immunological and physiological observations in baboons with life-supporting genetically engineered pig kidney grafts. Xenotransplantation 24, e12293 (2017).

6.Kim, S. C. et al. Long‐term survival of pig‐to‐rhesus macaque renal xenografts is dependent on CD4 T cell depletion. Am. J. Transplant. 19, 2174–2185 (2019).

7.Hinrichs, A. et al. Growth hormone receptor-deficient pigs resemble the pathophysiology of human Laron syndrome and reveal altered activation of signaling cascades in the liver. Mol. Metab. 11, 113–128 (2018).

8.     Yamamoto, T. et al. Old World monkeys are less than ideal transplantation models for testing pig organs lacking three carbohydrate antigens (triple-knockout). Sci. Rep. 10, 9771 (2020).

9.     Estrada, J. L. et al. Evaluation of human and non-human primate antibody binding to pig cells lacking GGTA1/CMAH/β4GalNT2 genes. Xenotransplantation 22, 194–202 (2015).

10.Ma, D. et al. Successful long-term TMA- and rejection-free survival of a kidney xenograft with triple xenoantigen knockout plus insertion of multiple human transgenes. Transplantation https://doi.org/10.1097/01.tp.0000698660.82982.ca (2020).

11.Niu, D. et al. Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9. Science 357, 1303–1307 (2017).

12.Patience, C., Takeuchi, Y. & Weiss, R. A. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat. Med. 3, 282–286 (1997).

13.Robson, S. C., Am Esch, J. S. & Bach, F. H. Factors in xenograft rejection. Ann. N. Y. Acad. Sci. 875, 261–276 (1999).

14. Wolf, E., Kemter, E., Klymiuk, N. & Reichart, B. Genetically modified pigs as donors of cells, tissues, and organs for xenotransplantation. Anim. Front. 9, 13–20 (2019).

15. Galili, U., Shohet, S. B., Kobrin, E., Stults, C. L. & Macher, B. A. Man, apes, and Old World monkeys differ from other mammals in the expression of α-galactosyl epitopes on nucleated cells. J. Biol. Chem. 263, 17755–17762 (1988).

16.Bouhours, D., Pourcel, C. & Bouhours, J.-F. Simultaneous expression by porcine aorta endothelial cells of glycosphingolipids bearing the major epitope for human xenoreactive antibodies (Galα1–3Gal), blood group H determinant and N-glycolylneuraminic acid. Glycoconj. J. 13, 947–953 (1996).

17.Byrne, G. W., Stalboerger, P. G., Du, Z., Davis, T. R. & McGregor, C. G. A. Identification of new carbohydrate and membrane protein antigens in cardiac xenotransplantation. Transplantation 91, 287–292 (2011).

18.Shaper, N. L., Lin, S. P., Joziasse, D. H., Kim, D. Y. & Yang-Feng, T. L. Assignment of two human alpha-1,3-galactosyltransferase gene sequences (GGTA1 and GGTA1P) to chromosomes 9q33-q34 and 12q14-q15. Genomics 12, 613–615 (1992).

19.Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T. & Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J. Biol. Chem. 273, 15866–15871 (1998).

20.Galili, U., Rachmilewitz, E. A., Peleg, A. & Flechner, I. A unique natural human IgG antibody with anti-alpha-galactosyl specificity. J. Exp. Med. 160, 1519–1531 (1984).

21.Kappler, K. & Hennet, T. Emergence and significance of carbohydrate-specific antibodies. Genes Immun. 21, 224–239 (2020).

22.Montiel, M.-D., Krzewinski-Recchi, M.-A., Delannoy, P. & Harduin-Lepers, A. Molecular cloning, gene organization and expression of the human UDP-GalNAc:Neu5Acalpha2-3Galbeta-R beta1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase responsible for the biosynthesis of the blood group Sda/Cad antigen: evidence for an unusual extended cytoplasmic domain. Biochem. J. 373, 369–379 (2003).

23.Stenfelt, L. et al. Missense mutations in the C-terminal portion of the B4GALNT2-encoded glycosyltransferase underlying the Sd(a−) phenotype. Biochem. Biophys. Rep. 19, 100659 (2019).

24.Renton, P. H., Howell, P., Ikin, E. W., Giles, C. M. & Goldsmith, Dr. K. L. G. Anti-Sda, a new blood group antibody. Vox. Sang. 13, 493–501 (1967).

25.Morozumi, K. et al. Significance of histochemical expression of hanganutziu–deicher antigens in pig, baboon and human tissues. Transplant. Proc. 31, 942–944 (1999).

26.Mohan Rao, L. V., Esmon, C. T. & Pendurthi, U. R. Endothelial cell protein C receptor: a multiliganded and multifunctional receptor. Blood 124, 1553–1562 (2014).

27.Esmon, C. Do-all receptor takes on coagulation, inflammation. Nat. Med. 11, 475–477 (2005).

28.Panepinto, L. M., Phillips, R. W., Wheeler, L. R. & Will, D. H. The Yucatan minature pig as a laboratory animal. Lab. Anim. Sci. 28, 308–313 (1978).

29.Choi, M.-K. et al. Determination of complete sequence information of the human ABO blood group orthologous gene in pigs and breed difference in blood type frequencies. Gene 640, 1–5 (2018).

30. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823 (2013).

31.Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823–826 (2013).

32.Schlake, T. & Bode, J. Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry 33, 12746–12751 (1994).

33.Kim, J. H. et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS ONE 6, e18556 (2011).

34.Ni Choileain, S. et al. TCR-stimulated changes in cell surface CD46 expression generate type 1 regulatory T cells. Sci. Signal. 10, eaah6163 (2017).

35.Angeletti, A. et al. Loss of decay-accelerating factor triggers podocyte injury and glomerulosclerosis. J. Exp. Med. 217, e20191699 (2020).

36.Esmon, C. T. The protein C pathway. Chest 124, 26S–32S (2003).

37.Ide, K. et al. Role for CD47-SIRPα signaling in xenograft rejection by macrophages. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 5062–5066 (2007).

38.Lee, E. G. et al. Failure to regulate TNF-induced NF-κB and cell death responses in A20-deficient mice. Science 289, 2350–2354 (2000).

39.Kapturczak, M. H. et al. Heme oxygenase-1 modulates early inflammatory responses. Am. J. Pathol. 165, 1045–1053 (2004).

40.Oropeza, M. et al. Transgenic expression of the human A20 gene in cloned pigs provides protection against apoptotic and inflammatory stimuli. Xenotransplantation 16, 522–534 (2009).

41.Petersen, B. et al. Transgenic expression of human heme oxygenase-1 in pigs confers resistance against xenograft rejection during ex vivo perfusion of porcine kidneys. Xenotransplantation 18, 355–368 (2011).

42.Roufosse, C. et al. A 2018 reference guide to the Banff Classification of Renal Allograft Pathology. Transplantation 102, 1795–1814 (2018).

43.Rosales, I. A. & Colvin, R. B. The pathology of solid organ xenotransplantation. Curr. Opin. Organ Transplant. 24, 535 (2019).

44.Cooper, D. K. C., Ezzelarab, M., Iwase, H. & Hara, H. Perspectives on the optimal genetically engineered pig in 2018 for initial clinical trials of kidney or heart xenotransplantation. Transplantation 102, 1974–1982 (2018).

45.Sachs, D. H. Transplantation tolerance through mixed chimerism: from allo to xeno. Xenotransplantation 25, e12420 (2018).

46.Joska, T. M., Mashruwala, A., Boyd, J. M. & Belden, W. J. A universal cloning method based on yeast homologous recombination that is simple, efficient, and versatile. J. Microbiol. Methods 100, 46–51 (2014).

47.Wright, E. S. Using DECIPHER v2.0 to analyze big biological sequence data in R. R J. 8, 352 (2016).

48.Yang, L. et al. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science 350, 1101–1104 (2015).

49.Campbell, K. H. S., McWhir, J., Ritchie, W. A. & Wilmut, I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380, 64–66 (1996).

50. Dhondt, L. et al. Development and validation of an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of iohexol, p-aminohippuric acid and creatinine in porcine and broiler chicken plasma. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 1117, 77–85 (2019).

 

SUMBER:

Ranjith P. Anand, Jacob V. Layer, David Heja, Takayuki Hirose, Grace Lassiter, Daniel J. Firl, Violette B. Paragas, Adam Akkkad, Sagar Chhangawala, Robert B. Colvin, Russell J. Ernst, Nicholas Esch, Kristen Getchell, Alexandra K. Griffin, Xiaoyum Guo, Kathherine C. Hall, Paula Hamilton, Lokesh A. Kalekar, Yinan Kan, Ahmad Karadagi, Feng Li, Susan C. Low, Rudy Matheson, Clamudia Nehring, Winning Qin. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature volume 622, pages393–401 (2023)

 

Ringkasan Pelaporan

Informasi lebih lanjut mengenai desain penelitian tersedia dalam Nature Portfolio Reporting Summary yang terhubung dengan artikel ini.

 

Ketersediaan Data

Semua data sekuensing mentah dan yang telah diproses yang dihasilkan dalam penelitian ini telah diserahkan ke NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) dan Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) di bawah BioProject PRJNA870308. Data tambahan yang mendukung temuan penelitian ini, termasuk data imunohistokimia (IHC) dari setiap transplantasi NHP, tersedia dari penulis korespondensi berdasarkan permintaan yang wajar. Data sumber disediakan bersama dengan makalah ini.