Glikosilasi di kepala globular protein hemagglutinin memodulasi virulensi dan sifat antigenik virus influenza H1N1

INTISARI

Dengan penyebaran global pandemi virus influenza H1N1 (pH1N1) 2009, ada peningkatan kekhawatiran tentang evolusi melalui antigenic drift. Salah satu cara strain influenza H1N1 dan H3N2 musiman sebelumnya telah berevolusi dari waktu ke waktu adalah dengan memperoleh glikosilasi tambahan di kepala globular protein hemagglutinin (HA) mereka; glikosilasi ini diyakini melindungi daerah yang relevan secara antigenik dari respons imun antibodi. Kami menambahkan situs glikosilasi HA tambahan ke virus influenza A/Belanda/602/2009 rekombinan (rpH1N1), yang mencerminkan penampilan temporalnya pada virus H1N1 musiman sebelumnya. Glikosilasi tambahan mengakibatkan infeksi yang dilemahkan secara substansial pada tikus dan musang, sedangkan menghapus situs glikosilasi HA dari virus pra-pandemi mengakibatkan peningkatan patogenisitas pada tikus. Kami kemudian lebih langsung menyelidiki interaksi glikosilasi HA dan respons antibodi melalui analisis mutasi. Kami menemukan bahwa respons antibodi poliklonal yang ditimbulkan oleh tipe liar rpH1N1 HA kemungkinan diarahkan terhadap wilayah imunodominan, yang dapat dilindungi oleh glikosilasi pada posisi 144. Namun, glikosilasi rpH1N1 HA pada posisi 144 memunculkan respons poliklonal yang lebih luas yang mampu menetralkan silang semua virus pH1N1 mutan tipe liar dan glikosilasi. Selain itu, tikus yang terinfeksi dengan virus musiman baru-baru ini di mana situs glikosilasi dihilangkan, menimbulkan antibodi yang melindungi terhadap tantangan dengan virus pH1N1 yang jauh secara antigenik. Dengan demikian, akuisisi situs glikosilasi di HA virus influenza manusia H1N1 tidak hanya mempengaruhi patogenisitas dan kemampuan untuk melepaskan diri dari antibodi poliklonal yang ditimbulkan oleh strain virus influenza sebelumnya tetapi juga kemampuan mereka untuk menginduksi antibodi reaktif silang terhadap varian antigenik yang menyimpang.

 

Gambar 1. Akuisisi situs glikosilasi di HA subtipe H1N1 manusia dari waktu ke waktu sebelum munculnya virus H1N1 2009

Penjajaran asam amino dari situs antigenik dalam HA1 strain H1N1 musiman yang beredar pada manusia sejak 1918 hingga sesaat sebelum munculnya virus pandemi H1N1 2009. Empat isolat pandemi H1N1 2009 yang representatif juga dimasukkan sebagai referensi. Alignment menunjukkan strain referensi prototipikal yang dipilih. Bayangan berwarna (ungu, kuning dan hijau) menggambarkan situs antigenik yang diketahui terdaftar di atas. Kotak kuning mewakili glikosilasi yang dilestarikan dan kotak merah mewakili glikosilasi yang muncul dan menghilang seiring waktu. Panah di sebelah kanan menunjukkan tahun glikosilasi muncul di posisi residu yang ditunjukkan.

 

Gambar. 2. Pemodelan glikosilasi H1N1 dari waktu ke waktu (A) Garis waktu yang menggambarkan tahun perolehan glikosilasi di kepala globular protein HA. Angka berwarna merah menunjukkan posisi asam amino dari situs glikosilasi yang dilestarikan di antara isolat H1N1 manusia sejak kemunculannya pada tahun 1918, dan angka berwarna hitam menunjukkan posisi asam amino dari situs glikosilasi yang muncul pada tahun-tahun tertentu yang ditunjukkan di bagian bawah. Panah menunjukkan kegigihan situs glikosilasi melalui waktu, dan lingkaran mewakili hilangnya mereka. Garis terputus menunjukkan periode waktu dari 157 hingga 177 ketika virus H1N1 tidak beredar pada manusia. (B) Representasi monomer HA dengan situs antigenik disorot dalam warna merah dan situs glikosilasi berwarna kuning. Wilayah batang HA dilambangkan dengan perak. Posisi asam amino mengacu pada nomenklatur H1 (situs 71, 142, 144, 172 dan 177 sesuai dengan H3 penomoran 58, 128, 130, 158 dan 163, masing-masing). Angka berwarna merah menunjukkan situs glikosilasi yang dilestarikan. (C) Pemodelan struktural HA trimerik dengan glikosilasi seperti yang muncul dari waktu ke waktu dari tahun 1918 hingga munculnya virus pH1N1 2009. Struktur glikan untuk situs yang ditunjukkan dengan warna kuning telah dimodelkan ke Cal/09 HA (PDB 3LZG) dan juga digambarkan dengan warna kuning. Semua model dibuat dengan MacPyMol.

Gambar 3. Karakterisasi fenotipik virus mutan glikosilasi HA 2009 pH1N1 (A) Morfologi plak virus mutan glikosilasi HA yang diselamatkan/Belanda/602/2009 dalam sel MDCK. (B) Analisis Western blot dari lisat sel utuh yang diperoleh dari sel MDCK yang terinfeksi pada MOI 5 selama 12 jam. Lysates dijalankan di bawah kondisi non-pereduksi dan bercak dideteksi dengan antiserum poliklonal kelinci 3951 yang dibangkitkan terhadap virus PR8 yang kekurangan H1, yang telah dihilangkan dengan pengobatan asam dan DTT. ( C ) Kinetika pertumbuhan virus yang diselamatkan dalam sel epitel trakeobrokial manusia yang berbeda yang terinfeksi pada MOI 0,001. Data ditampilkan sebagai rata-rata titrasi virus yang dilakukan dalam rangkap tiga untuk setiap titik waktu yang ditunjukkan oleh uji plak standar dalam sel MDCK. Bilah kesalahan mewakili +/− SD pada setiap titik waktu.

Gambar 4. 2009 virus pH1N1 dengan glikosilasi tambahan di HA dilemahkan pada tikus dan musang (A – E) Infeksi tikus C57B/6 betina berusia 9 minggu dengan virus mutan glikosilasi Neth/09. Kelompok 5 tikus per virus rekombinan yang terinfeksi i.n. dengan dosis yang ditunjukkan. Bobot badan mewakili rata-rata setiap grup dan bilah kesalahan menunjukkan +/− SD pada setiap titik waktu. (F) Titer virus pada paru-paru mencit yang diinfeksi 1x10³ pfu masing-masing virus mutan diperoleh pada hari ke-2 (lingkaran), 5 (persegi), dan 7 (segitiga) p.i. seperti yang ditunjukkan. Bilah hitam mewakili titer virus rata-rata untuk 2 (panah) atau 3 tikus per kelompok pada setiap titik waktu dibandingkan dengan virus rNeth/09 WT. N.D. = Tidak terdeteksi. (G) Perubahan berat badan pada musang yang terinfeksi (n=3 per kelompok) dengan virus yang ditunjukkan. Bobot ditampilkan sebagai rata-rata dan bilah kesalahan mewakili +/− SD. pada setiap titik waktu. Perbedaan yang signifikan secara statistik (*) dari keseluruhan berat badan musang selama periode infeksi diperkirakan dengan uji pasangan cocok Wilcoxon. (H) Titer virus dalam pencuci hidung diperoleh setiap hari dari musang yang ditunjukkan pada (G). (I) Viral load dalam jaringan dari musang (n=3) pada hari ke 3 p.i. dengan virus yang ditunjukkan. Nilai direpresentasikan seperti pada (F).

Gambar 5. Aktivitas HI serum manusia setelah vaksinasi terhadap pandemi 2009 H1N1. Sampel serum sebelum dan sesudah vaksinasi diperoleh dari 52 subjek yang terdaftar dalam uji klinis untuk menguji keamanan dan imunogenisitas vaksin influenza H1N1 2009 yang inaktif, diuji HI-nya aktivitas melawan WT Neth/09 dan virus mutan glikosilasi. Untuk setiap subjek, perbedaan aktivitas HI antara pasca dan pra-vaksinasi (titer HI pasca-vaksinasi – titer HI pra-vaksinasi dalam jumlah sumur) ditentukan untuk menormalkan aktivitas HI yang sudah ada sebelumnya. Untuk setiap virus distribusi peningkatan aktivitas HI pasca vaksinasi diplot. Median distribusi ditandai dengan garis merah dan perbedaan yang signifikan secara statistik ditentukan dengan uji jumlah peringkat Wilcoxon.

Gambar 6. Penghapusan situs glikosilasi di HA Tx/91 meningkatkan virulensi pada tikus dan perlindungan silang terhadap strain pH1N1 2009 Karakterisasi fenotipik virus influenza A rekombinan yang membawa baik tipe liar atau glikosilasi penghapusan mutan A/Texas/36/ 1991 HAs (N71K + S73N, T144D, N177K) dan 7 gen sisanya dari PR8 (virus adalah 7:1 rPR8 yang mengekspresikan Tx/91 HA). (A ) Analisis Western blot dari lisat yang diperoleh dari sel MDCK yang terinfeksi pada MOI 5 selama 12 jam dengan virus mutan penghapusan glikosilasi masing-masing. Lisat dijalankan dalam kondisi reduksi dan bercak dideteksi dengan antibodi poliklonal 3951. (B) Tikus C57B/6 betina berumur 8 minggu yang terinfeksi dengan 1x10⁴ pfu dari setiap virus yang ditunjukkan. Rata-rata berat badan mencit n=5 per kelompok. Bilah kesalahan menunjukkan +/− SD untuk setiap titik waktu. (C) Tikus yang terinfeksi pada panel B diizinkan untuk melakukan serokonversi selama 27 hari dan pada saat itu mereka ditantang dengan 100 LD₅₀ Neth/09. Persen kelangsungan hidup ditampilkan. (D) Tikus yang terinfeksi 1x10⁴ pfu dari setiap mutan penghapusan glikosilasi, di mana situs glikosilasi yang sama dihilangkan dengan set alternatif substitusi asam amino dengan yang digunakan dalam B dan C. Pada 29 hari p.i. tikus ditantang dengan 100 LD₅₀ dari Neth/09. Persentase kelangsungan hidup setelah tantangan ditampilkan. Student’s t-test digunakan untuk menentukan signifikansi penurunan berat badan dan uji log-rank digunakan untuk menilai signifikansi (* P<0,05) dari hasil kelangsungan hidup.

 

Sumber:

Rafael A. Medina, Silke Stertz, Balaji Manicassamy, Petra Zimmermann4, Xiangjie Sun, Randy A. Albrecht, Hanni Uusi-Kerttula, Osvaldo Zagordi, Robert B. Belshe, Sharon E. Frey, Terrence M. Tumpey and Adolfo García-Sastre. 2013. Glycosylations in the Globular Head of the Hemagglutinin Protein Modulate the Virulence and Antigenic Properties of the H1N1 Influenza Viruses.  Science Translational Medicine 29 May 2013: Vol. 5, Issue 187, pp. 187ra70.  DOI: 10.1126/scitranslmed.3005996