Protein PA-X Virus Influenza A Berkontribusi pada Pertumbuhan Virus

Protein PA-X Virus Influenza A Berkontribusi pada Pertumbuhan Virus dan Penekanan Respons Antivirus dan Kekebalan Inang

INTISARI

Infeksi virus influenza menyebabkan penghambatan umum sintesis protein inang dalam sel yang terinfeksi. Penutupan inang ini dianggap memungkinkan virus untuk melarikan diri dari respons antivirus inang, yang membatasi replikasi dan penyebaran virus. Meskipun mekanisme penghentian inang tidak jelas, protein virus baru yang diekspresikan oleh pergeseran bingkai ribosom, PA-X, ditemukan memainkan peran utama dalam penghentian inang yang diinduksi virus influenza. Namun, sedikit yang diketahui tentang dampak ekspresi PA-X pada patogenisitas virus influenza A yang beredar saat ini dan respons antivirus inang. 

Dalam penelitian ini, kami menyelamatkan virus influenza A rekombinan, A/California/04/09 (H1N1, Cal), yang mengandung mutasi pada motif frameshift pada gen polimerase PA (Cal PA-XFS). Cal PA-XFS mengekspresikan PA-X secara signifikan lebih sedikit daripada Cal wild type (WT). Cal WT, tetapi bukan Cal PA-XFS, menginduksi degradasi mRNA-aktin inang dan menekan sintesis protein inang, mendukung gagasan bahwa PA-X menginduksi penghentian inang melalui peluruhan mRNA. Selain itu, Cal WT menghambat ekspresi beta interferon (IFN-β) dan bereplikasi lebih cepat daripada Cal PA-XFS dalam sel pernapasan manusia. 

Tikus yang terinfeksi Cal PA-XFS memiliki tingkat pertumbuhan virus yang lebih rendah secara signifikan dan ekspresi IFN-β mRNA yang lebih besar di paru-parunya  daripada tikus yang terinfeksi Cal WT. Catatan penting, lebih banyak antihemaglutinin dan antibodi penetral diproduksi pada tikus yang terinfeksi Cal PA-XFS daripada pada tikus yang terinfeksi Cal WT, meskipun tingkat replikasi virus di paru-paru lebih rendah. Data ini menunjukkan bahwa PA-X dari virus pandemi H1N1 memiliki dampak yang kuat pada pertumbuhan virus dan respon imun bawaan dan didapat dari inang terhadap virus influenza.

 

PENTING

Penghentian protein inang yang diinduksi virus dianggap sebagai faktor utama yang memungkinkan virus menghindari pengenalan kekebalan bawaan dan didapat. Kami memberikan bukti bahwa protein PA-X virus H1N1 influenza A 2009 berperan dalam replikasi virus dan penghambatan respons antivirus inang melalui aktivitas penghentian sintesis protein inangnya baik secara in vitro maupun in vivo. 

Kami juga menunjukkan bahwa, sementara pertumbuhan Cal PA-XFS dilemahkan di paru-paru hewan yang terinfeksi, mutan ini menginduksi respons humoral yang lebih kuat daripada Cal WT. Temuan kami dengan jelas menyoroti pentingnya PA-X dalam menangkal respons imun bawaan dan didapat dari inang terhadap virus influenza, patogen global yang penting. Karya ini menunjukkan bahwa penghambatan ekspresi PA-X dalam strain vaksin virus influenza dapat memberikan cara baru untuk melemahkan pertumbuhan virus dengan aman sambil menginduksi respons imun yang lebih kuat.

 

Gambar 1 Penyelamatan Cal PA-XFS yang memiliki mutasi pada motif frameshift.

(A) Representasi skematis protein Cal PA dan PA-X. Cal PA-X mengkodekan domain endonuklease terminal-N umum (residu asam amino 1 hingga 191) dari PA yang menyatu dengan wilayah terminal-C yang unik (41 asam amino) yang dihasilkan oleh kerangka pembacaan +1 mRNA PA melalui pemindahan bingkai ribosom. Motif frameshift ditampilkan dalam persegi panjang.

(B) Reaktivitas MAbs sebagaimana ditentukan oleh Western blotting. Sel 293T ditransfeksi dengan plasmid yang ditunjukkan selama 24 jam. Lisis sel menjadi sasaran Western blotting menggunakan MAb yang ditunjukkan. pPA, pCAGGSCalPAflag; p134A, pCAGGSCalPA-X134Aflag; p134AΔC, pCAGGSCalPA-X134AΔCflag.

(C) Sel A549 yang terinfeksi dengan Cal WT atau Cal PA-XFS atau sel 293T yang ditransfeksi dengan pCAGGSCalPA-X134Aflag diberi label dengan metionin dan sistein berlabel 35S. Lisis sel berlabel digunakan untuk imunopresipitasi (IP) oleh anti-PA-X atau anti-PA MAb atau untuk Western blotting (WB) menggunakan MAbs yang ditunjukkan. Data yang ditampilkan mewakili dua eksperimen independen.

Gambar 2 Pengaruh ekspresi PA-X pada sintesis protein inang dan tingkat mRNA aktin dalam sel manusia yang terinfeksi virus Cal.

(A)   sel A549 dibiarkan tidak terinfeksi atau terinfeksi Cal WT atau Cal PA-XFS pada MOI 1. Pada titik waktu yang ditunjukkan, sel diberi label dengan metionin dan sistein berlabel 35S selama 30 menit, dan total lisat diselesaikan oleh SDS-PAGE.

(B)   Jejak densitometri dari protein berlabel dalam sel yang dibiarkan tidak terinfeksi atau terinfeksi virus yang ditunjukkan pada panel A.

 

(C dan D) Sel A549 atau Calu-3 dibiarkan tidak terinfeksi atau terinfeksi Cal WT atau Cal PA-XFS pada MOI 3. Pada 4 atau 12 hpi, RNA total diekstraksi dari lisat sel dan menjadi sasaran analisis Northern blot menggunakan probe -aktin manusia antisense berlabel DIG. 18S dan 28S rRNA diwarnai dengan etidium bromida dan ditampilkan sebagai kontrol pemuatan. Data yang ditampilkan mewakili dua (A) atau tiga (C dan D) percobaan independen.

 

 

Gambar 3 Efek ekspresi PA-X pada pertumbuhan virus dan ekspresi IFN-β in vitro.

(A) Kinetika pertumbuhan virus dalam sel Calu-3. Sel-sel terinfeksi dengan Cal WT atau Cal PA-XFS pada MOI 0,025. Pada titik waktu yang ditunjukkan, 10% supernatan dikumpulkan dan dititrasi pada sel MDCK. Garis putus-putus menunjukkan batas deteksi pengujian. Data mewakili rata-rata dengan standar deviasi dari dua percobaan independen dengan pengujian yang dilakukan dalam rangkap tiga (n = 6).

(B) Sel Calu-3 dibiarkan tidak terinfeksi atau terinfeksi Cal WT atau Cal PA-XFS pada MOI 3. Pada titik waktu yang ditunjukkan, RNA total diekstraksi dan menjadi sasaran analisis qRT-PCR. Jumlah salinan dalam setiap sampel dihitung menggunakan kurva standar pengenceran serial 10 kali lipat dari produk gen IFN-β manusia. Perubahan lipatan adalah rasio jumlah salinan setiap sampel di atas sel yang terinfeksi tiruan pada 6 jam. Tingkat mRNA mewakili rata-rata dengan standar deviasi.

(C) Sel A549 dibiarkan tidak terinfeksi atau terinfeksi Cal WT atau Cal PA-XFS pada MOI 10. Tingkat protein IFN-β dalam supernatan kultur pada 12 atau 24 hpi ditentukan dengan menggunakan kit ELISA IFN-β manusia. Data mewakili rata-rata dengan standar deviasi. Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dengan uji t Student (*, P < 0,05).

 

Gambar 4 Kelangsungan hidup dan perubahan berat badan mencit yang terinfeksi virus Cal.

(A dan B) Tikus C57BL/6 diinfeksi tiruan atau terinfeksi Cal WT atau Cal PA-XFS dengan dosis 10¹, 10², 10³, atau 10⁴ PFU intranasal.

Kelangsungan hidup (A) dan berat badan (B) masing-masing tikus dipantau setiap hari hingga 16 dpi (n = 5). Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dengan uji t Student (*, P < 0,05).

 

Gambar 5 Pertumbuhan virus, ekspresi mRNA IFN-β, dan patologi pada paru-paru mencit yang terinfeksi. Tikus C57BL/6 tiruan terinfeksi atau terinfeksi Cal WT atau Cal PA-XFS dengan dosis 102 PFU intranasal. Pada 2, 5, atau 8 dpi, empat tikus dari setiap kelompok dikorbankan secara manusiawi dan seluruh paru-paru yang diekstraksi dihomogenisasi dalam 1 ml PBS.

(A) Virus yang ada dalam homogenat dititrasi pada sel MDCK dengan uji plak.

(B) Total RNA diekstraksi dari 100 l homogenat, dan kadar mRNA IFN-β ditentukan dengan analisis qRT-PCR. Perubahan lipatan adalah rasio jumlah salinan setiap sampel di atas sampel kontrol pada 2 dpi. Data mewakili rata-rata dengan standar deviasi. Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dengan uji t Student (*, P < 0,05).

(C) Gambar representatif hematoxylin-and-eosin dari paru-paru yang tidak terinfeksi atau terinfeksi pada 8 dpi. Perbesaran asli, ×10.

Gambar 6 Titrasi antibodi netralisasi dalam serum mencit yang terinfeksi virus Cal. (A sampai C) Uji netralisasi dilakukan dengan menggunakan sampel serum yang dikumpulkan pada 16 dpi dari tikus yang masih hidup yang terinfeksi virus Cal dengan dosis 10¹, 10², atau 10³ PFU. Setiap sampel serum diencerkan secara serial dan dicampur dengan 150 PFU Cal WT, dan kemudian jumlah plak dihitung. Data disajikan sebagai persentase jumlah plak virus kontrol yang diinkubasi dengan PBS. (D) Pengenceran serum yang dihitung menunjukkan penghambatan plak 50%. Data yang ditampilkan adalah rata-rata dengan standar deviasi hasil dari 4 atau 5 (kontrol, 10¹, atau 10² PFU virus) atau 2 atau 3 (10³ PFU virus) individu tikus. Tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dengan uji t Student (*, P < 0,05).

Sumber:

Tsuyoshi Hayashi, Leslie AMacDonald, Toru Takomoto.  2015. Influenza A Virus Protein PA-X Contributes to Viral Growth and Suppression of the Host Antiviral and Immune Responses. J Virol 2015 Jun; 89(12):6442-52.doi:10.1128/JVI.00319-15. Epub 2015 Apr 8. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25855745/