Efikasi Vaksin Baru yang Diinaktivasi untuk Chlamydophila felis pada Kucing yang Terinfeksi Secara Eksperimental

 

ABSTRAK

Vaksin Chlamydophila felis baru yang diinaktivasi dan diberi adjuvan telah dikembangkan, dan efikasinya pada kucing dibandingkan dengan vaksin inaktivasi dan vaksin hidup yang tersedia secara komersial. Dua vaksin komersial memberikan kekebalan yang tidak memadai pada kucing yang diinokulasi, seperti yang dievaluasi melalui produksi antibodi dan uji tantangan, sedangkan kucing yang diberi vaksin baru menghasilkan antibodi dengan titer tinggi dan memperoleh kekebalan yang cukup. Kucing yang diimunisasi dengan vaksin baru menunjukkan tanda klinis yang ringan atau bahkan tidak ada, dan tidak ditemukan chlamydiae dalam sampel jaringan mereka setelah paparan strain virulen C. felis. Namun, mereka mengeluarkan chlamydiae dalam sekresi hidung dan konjungtiva setelah uji tantangan, sama seperti kucing yang diimunisasi dengan vaksin komersial maupun kelompok kontrol tanpa vaksinasi. Vaksin yang baru dikembangkan ini tidak menimbulkan reaksi merugikan pada kucing yang diinokulasi. Temuan ini menunjukkan bahwa vaksin baru yang disiapkan di sini menjanjikan untuk digunakan secara praktis dalam mengendalikan infeksi C. felis pada kucing.

 

PENDAHULUAN

 

Chlamydophila felis (C. felis) adalah mikroorganisme intraseluler obligat yang menyebabkan konjungtivitis akut dan kronis serta pneumonia pada kucing (1). C. felis pertama kali diisolasi dari paru-paru kucing dengan pneumonia alami di Amerika Serikat pada tahun 1942 (2). Sejak saat itu, keberadaan infeksi C. felis pada kucing dengan gejala mata atau saluran pernapasan atas telah dilaporkan di berbagai negara, termasuk Inggris (3), Australia (4), Swiss (5), Jerman (6), Italia (7), Swedia (8), Kanada (9), Selandia Baru (10), dan Jepang (11, 12).

 

Penggunaan vaksin C. felis yang efektif pada kucing sangat diharapkan dan disarankan untuk mencegah infeksi pada populasi kucing. Beberapa vaksin inaktivasi dan vaksin hidup yang dimodifikasi telah dikembangkan dan digunakan untuk melindungi kucing dari infeksi C. felis. Namun, hanya beberapa laporan yang membahas efikasi vaksin C. felis pada kucing (13–15).

 

Dalam studi ini, kami mengembangkan vaksin C. felis baru yang diinaktivasi dan diberi adjuvan, serta membandingkan efikasinya pada kucing dengan vaksin inaktivasi dan vaksin hidup yang dimodifikasi yang tersedia secara komersial.

 

BAHAN DAN METODE

 

Vaksin

Vaksin eksperimental ini diproduksi menggunakan sel L yang berasal dari fibroblas tikus (diberikan oleh Universitas Gifu, Jepang) dan strain Fe/C-P8 dari C. felis yang diisolasi dari kucing dengan gejala bersin dan konjungtivitis di Jepang pada tahun 1999 (16). Secara singkat, kultur sel L dalam bentuk suspensi diinokulasi dengan strain Fe/C-P8 dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 5 hari. Kultur sel L yang terinfeksi dibekukan-cairkan sekali, kemudian disentrifugasi (1000×g, 10 menit, 4°C). Supernatan diambil dan disentrifugasi kembali (9000×g, 1 jam, 4°C). Pelet yang dihasilkan disuspensikan dalam PBS (phosphate-buffered saline) dengan volume 1/100, dicampur dengan formalin hingga konsentrasi akhir 0,1%, dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 hari untuk menginaktivasi chlamydiae hidup. Kemudian, preparat yang diinaktivasi ini dicampur dengan adjuvan minyak dengan rasio 3:7 untuk membuat produk akhir. Adjuvan minyak yang digunakan adalah ISA-70 (Seppic SA, Prancis). Jumlah chlamydiae dalam produk vaksin akhir diperkirakan sebesar 10^8.2 ELD₅₀ (50% dosis letal embrio)/dosis berdasarkan uji inokulasi kantung kuning telur.

 

Vaksin komersial yang digunakan untuk perbandingan adalah dua vaksin kombinasi kucing (herpesvirus kucing-1, calicivirus kucing, virus panleukopenia kucing, virus leukemia kucing (FeLV), dan C. felis) yang berlisensi di Amerika Serikat. Satu vaksin berupa vaksin inaktivasi dengan adjuvan, yaitu Fel-O-Vax Lv-K IV (Fort Dodge Laboratories, AS). Vaksin lainnya adalah vaksin hidup yang dimodifikasi, yaitu Eclipse 4+FeLV (Intervet Schering–Plough Animal Health, AS). Sayangnya, informasi tentang jumlah antigen C. felis atau formulasi adjuvan pada vaksin inaktivasi komersial tidak tersedia. Namun, vaksin hidup komersial mengandung 10^3.5 ELD₅₀/dosis C. felis berdasarkan uji inokulasi kantung kuning telur kami.

 

Hewan Eksperimental

Kucing bebas patogen spesifik (SPF) berusia 3–4 bulan, terdiri atas 12 jantan dan 12 betina, digunakan. Percobaan dilakukan sesuai dengan pedoman institusional untuk eksperimen hewan. Status SPF kucing diverifikasi sebagaimana dijelaskan sebelumnya (17).

 

Desain Eksperimental

Kucing dibagi secara acak menjadi empat kelompok: A, B, C, dan D. Kelompok A dan D masing-masing berisi tujuh kucing, sedangkan kelompok B dan C masing-masing terdiri atas lima kucing. Kucing dalam kelompok A, B, dan C diinokulasi secara subkutan sebanyak dua kali (pertama di atas bahu kanan dan tiga minggu kemudian di atas bahu kiri) dengan 1 ml vaksin yang dikembangkan dalam studi ini, Fel-O-Vax Lv-K IV, dan Eclipse 4+FeLV, secara berurutan. Tujuh kucing yang tersisa dalam kelompok D bertindak sebagai kontrol tanpa vaksinasi dan diberikan 1 ml PBS dua kali sebagai pengganti vaksin.

 

Semua kucing dipalpasi setiap hari pada lokasi inokulasi dan area sekitarnya selama 21 hari setelah vaksinasi pertama dan kedua. Pada hari ke-21 setelah vaksinasi kedua, semua kucing, termasuk kontrol tanpa vaksinasi, diberikan tantangan paparan 25 μl tetesan yang mengandung 10^3.0 ELD₅₀ strain B166 C. felis virulen yang dikembangbiakkan di kantung kuning telur (18) melalui rute nasal dan okular.

 

Tanda klinis pada mata diamati setiap hari dan diberi skor selama 21 hari setelah tantangan sebagaimana dijelaskan sebelumnya (17), dan rata-rata skor klinis mata pada setiap kelompok dianalisis menggunakan uji Mann–Whitney. Nilai P<0,05 dianggap signifikan secara statistik. Suhu rektal juga dicatat setiap hari selama 21 hari setelah tantangan.

 

Swab konjungtiva dan hidung dikumpulkan dari semua kucing pada hari setelah tantangan (PCD) 1, 3, 5, 7, 14, dan 21. Sampel darah juga diambil pada PCD 7, 14, dan 21. Semua sampel ini diuji untuk keberadaan chlamydiae menggunakan metode inokulasi kantung kuning telur sebagaimana dijelaskan sebelumnya (17). Serum kucing dikumpulkan secara berkala dan diuji untuk antibodi anti-chlamydial menggunakan tes mikro-imunofluoresensi tidak langsung (MIF) berdasarkan metode yang dilaporkan oleh Pudjiatmoko (19). Semua kucing dikorbankan dan diautopsi pada PCD 21. Jaringan tertentu (paru-paru, tonsil, hati, limpa, dan ginjal) dikumpulkan, dihomogenkan menjadi suspensi 20% dengan media transportasi chlamydia (20), dan disimpan pada suhu -80°C. Homogenat ini diuji keberadaan chlamydiae menggunakan metode inokulasi kantung kuning telur sebagaimana dijelaskan sebelumnya (17).

 

HASIL PENELITIAN

 

Reaksi pada Kucing yang Divaksinasi

Tidak ada kucing yang menunjukkan respons tidak terduga atau reaksi buruk secara umum, dan tidak ditemukan reaksi lokal yang merugikan di lokasi injeksi setelah vaksinasi pertama maupun kedua menggunakan vaksin eksperimental atau komersial.

 

Respon Antibodi

Respon antibodi pada kucing disajikan dalam Tabel 1. Meskipun inokulasi tunggal dengan vaksin eksperimental hanya memicu produksi antibodi anti-klamidia dengan titer rendah pada 5 dari 7 kucing, semua kucing tersebut menghasilkan antibodi dengan titer 64–128 setelah inokulasi kedua. Di sisi lain, tidak ada antibodi anti-klamidia yang terdeteksi pada kucing setelah inokulasi pertama dengan Fel-O-Vax Lv-K IV, dan hanya ditemukan antibodi dengan titer rendah pada 4 dari 5 kucing setelah inokulasi penguat kedua. Selain itu, Eclipse 4+FeLV tidak memicu produksi antibodi anti-klamidia yang dapat terdeteksi, bahkan setelah vaksinasi kedua. Paparan tantangan terhadap C. felis virulen memicu produksi antibodi atau meningkatkan titer antibodi pada kucing yang diinokulasi dengan vaksin komersial dan pada kelompok kontrol yang tidak divaksinasi, sedangkan titer antibodi pada kucing yang diimunisasi dengan vaksin eksperimental tidak berubah setelah tantangan.

Respon Klinis Setelah Tantangan

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, kucing kontrol yang tidak divaksinasi menunjukkan respon demam yang parah dan mengembangkan konjungtivitis yang disertai hiperemia konjungtiva, sekret okular serosa dan mukopurulen, serta pembengkakan kelopak mata pada hari pasca tantangan (PCD) 5–7, yang berlangsung lebih dari 10 hari. Serupa, kucing pada kelompok B dan C menunjukkan tanda-tanda okular yang parah setelah tantangan, meskipun respon demam mereka lebih ringan dibandingkan kelompok kontrol yang tidak divaksinasi.

Gambar 1. Skor Mata Klinis Rata-rata dan Suhu Rektal Kucing Setelah Tantangan Paparan terhadap C. felis

 

Kolom atas dan bawah menunjukkan skor mata klinis dan suhu rektal, masing-masing. Sumbu samping menunjukkan PCD, dan sumbu kiri menunjukkan skor mata klinis (poin) atau suhu rektal (°C). Kelompok A, B, dan C diinokulasi dengan vaksin inaktif baru yang dikembangkan dalam penelitian ini, Fel-O-Vax Lv-K IV, dan Eclipse 4+FeLV, masing-masing. Kelompok D adalah kontrol yang tidak divaksinasi.

 

Respon klinis kucing dalam kelompok A lebih ringan dibandingkan dengan kelompok B, C, dan D. Enam dari tujuh kucing dalam kelompok A hanya menunjukkan konjungtivitis ringan pada PCD 6–11, yang berlangsung selama beberapa hari, sementara kucing lainnya tidak menunjukkan tanda klinis yang dapat diamati setelah tantangan. Perbedaan signifikan pada skor mata klinis rata-rata ditemukan antara kelompok A dan B, A dan C, serta kelompok A dan kelompok kontrol yang tidak divaksinasi D (P<0,01). Meskipun perbedaan skor mata klinis rata-rata antara kelompok B dan D secara statistik signifikan (P<0,01), tidak ditemukan perbedaan signifikan antara kelompok C dan D (P>0,05).

 

Isolasi Klamidia

Hasil isolasi klamidia dari sampel klinis disajikan dalam Tabel 2 dan Tabel 3. Klamidia secara konsisten ditemukan dari usapan konjungtiva dan hidung semua kucing, tanpa memandang status vaksinasi, antara hari pasca tantangan (PCD) ke-3 atau ke-5 hingga akhir percobaan (PCD 21). Tidak ada klamidia yang ditemukan dalam darah pada kelompok kucing yang divaksinasi (kelompok A, B, dan C), sedangkan empat kucing dari kelompok yang tidak divaksinasi (kelompok D) positif untuk isolasi klamidia dari darah pada PCD 21 (Tabel 2).

 

Pada pemeriksaan autopsi, tidak ada klamidia yang diisolasi dari jaringan apa pun yang diuji pada kelompok A, sedangkan hati dari enam kucing, limpa dari lima kucing, serta paru-paru, tonsil, dan ginjal dari empat kucing dalam kelompok kontrol D positif untuk klamidia. Pada kelompok B, klamidia terdeteksi pada paru-paru dan tonsil dari dua kucing, serta pada hati dan limpa dari satu kucing. Klamidia juga ditemukan pada tonsil dan limpa dari dua kucing, serta pada paru-paru dan hati dari satu kucing dalam kelompok C (Tabel 3).

DISKUSI

Vaksin C felis yang diinaktivasi baru telah dikembangkan, dan efektivitasnya pada kucing dibandingkan dengan vaksin yang tersedia secara komersial. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa vaksin baru yang diinaktivasi lebih efektif dibandingkan dengan vaksin komersial yang diuji. Vaksin eksperimental kami menghasilkan respons antibodi dengan titer yang lebih tinggi terhadap C felis pada kucing yang divaksinasi, dan manifestasi klinis mereka setelah paparan tantangan dengan C felis virulen relatif ringan dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak divaksinasi dan kucing yang divaksinasi dengan vaksin komersial.

 

Meskipun kucing dalam kelompok A hanya menunjukkan konjungtivitis ringan atau tidak menunjukkan gejala klinis, mereka secara konsisten melepaskan klamidia dalam usapan konjungtiva dan hidung mereka setelah tantangan, seperti yang juga terjadi pada kelompok B, C, dan D. Hal ini dapat menunjukkan bahwa vaksin yang diinaktivasi yang dikembangkan dalam penelitian ini memiliki potensi untuk menginduksi imunitas, mengurangi tingkat keparahan penyakit klinis, dan mencegah infeksi sistemik, tetapi tidak mampu menginduksi imunitas lokal untuk melindungi dari infeksi di membran mukosa mata dan hidung. Fakta bahwa tidak ada klamidia yang ditemukan dari organ kucing pada kelompok A, berbeda dengan kelompok B, C, dan D, dapat mendukung hipotesis ini.

 

Vaksin komersial yang diinaktivasi dan vaksin hidup yang dimodifikasi yang dievaluasi dalam penelitian ini kurang efektif dan hampir tidak menghasilkan antibodi terhadap C felis pada kucing yang divaksinasi. Selain itu, kucing yang diimunisasi dengan vaksin hidup yang dimodifikasi secara komersial menunjukkan tanda-tanda mata yang parah, seperti halnya kontrol yang tidak divaksinasi, setelah tantangan. Meskipun alasan rendahnya potensi vaksin komersial tidak diketahui, satu kemungkinan penjelasan untuk perbedaan efektivitas antara vaksin komersial yang diinaktivasi dan vaksin yang dihasilkan dalam penelitian ini mungkin terkait dengan jumlah antigen C felis dan formulasi adjuvan yang digunakan dalam masing-masing vaksin. Shewen et al melaporkan bahwa vaksin yang diinaktivasi yang terdiri dari 10^7.5 ELD₅₀/dosis klamidia dan adjuvan L75 atau FD19 memberikan kekebalan parsial pada kucing yang diinokulasi (14). Sayangnya, tidak ada informasi yang tersedia tentang jumlah antigen klamidia atau formulasi adjuvan dalam vaksin komersial yang diuji. Formulasi kami terdiri dari 10^8.2 ELD₅₀/dosis klamidia dan adjuvan efektif ISA-70; hal ini mungkin menjelaskan mengapa vaksin yang diinaktivasi yang diuji di sini menghasilkan kekebalan yang baik pada kucing. Penelitian lebih lanjut tentang jumlah antigen klamidia dan formulasi adjuvan diharapkan memberikan informasi yang berguna untuk lebih meningkatkan vaksin C felis.

 

Vaksin hidup yang dimodifikasi secara komersial memberikan perlindungan yang tidak memadai, meskipun mengandung 10^3.5 ELD₅₀/dosis C felis. Alasan mengapa vaksin hidup yang dimodifikasi secara komersial menghasilkan sedikit atau tidak ada kekebalan masih belum jelas.

 

Adjuvan ISA-70 yang digunakan dalam penelitian ini dianggap lebih efektif dibandingkan dengan adjuvan lain pada marmut, tikus, ayam, dan tikus (21–23), serta digunakan dalam vaksin inaktivasi trivalen kucing yang tersedia secara komersial (24). Sarkoma terkait vaksin pada kucing telah diakui sebagai konsekuensi potensial dari vaksinasi selama lebih dari satu dekade (25, 26). Diperkirakan lebih dari 0,01% kucing yang divaksinasi mengembangkan tumor di lokasi inokulasi vaksin yang mengandung adjuvan di Amerika Serikat (27, 28). Meskipun palpasi di lokasi inokulasi vaksin tidak menunjukkan pembengkakan atau efek samping lainnya dalam penelitian ini, diperlukan studi jangka panjang untuk menilai keamanan vaksin ini. Selain itu, perlu dicatat bahwa vaksin dengan adjuvan berbasis minyak menghadirkan risiko potensial bagi operator; jika tangan atau jari tertusuk jarum secara tidak sengaja, adjuvan minyak dapat menyebabkan pembengkakan dan nyeri akibat peradangan.

 

Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa vaksin eksperimental, yang terdiri dari sejumlah besar antigen C felis yang diinaktivasi dan adjuvan ISA-70, efektif dalam mengurangi tingkat keparahan penyakit ketika kucing yang divaksinasi terinfeksi secara eksperimental.

 

REFERENSI

 

1. Sykes J.E. Feline chlamydiosis, Clin Tech Small Anim Pract 20, 2005, 129–134.

2. Baker J.A. A virus obtained from a pneumonia of cats and its possible relation to the cause of atypical pneumonia in man, Science 96, 1942, 475–476.

3. Wills J.M., Howard P.E., Gruffydd-Jones T.J., Wathes C.M. Prevalence of Chlamydia psittaci in different cat populations in Britain, J Small Anim Pract 29, 1988, 327–339.

4. Studdert M.J., Studdert V.P., Wirth H.J. Isolation of Chlamydia psittaci from cats with conjunctivitis, Aust Vet J 57, 1981, 515–517.

5. Lazarowicz M., Steck F., Kihm U., Moehl H. Respiratory infections of the cat. A serology survey in different populations, Zentralbl Veterinarmed B 29, 1982, 769–775.

6. Danwitz B.R.V., Rehman S.U. Studies of the prevalence of chlamydial infection in cats, Tieraerztl Umsch 46, 1991, 313–317.

7. Rampazzo A., Appino S., Pregel P., Tarducci A., Zini E., Biolatti B. Prevalence of Chlamydophila felis and feline herpesvirus 1 in cats with conjunctivitis in northern Italy, J Vet Intern Med 17, 2003, 799–807.

8. Holst B.S., Englund L., Palacios S., Renstrom L., Berndtsson L.T. Prevalence of antibodies against feline coronavirus and Chlamydophila felis in Swedish cats, J Feline Med Surg 8, 2006, 207–211.

9. Lang G.H. Prevalence of antibodies to Coxiella and Chlamydia spp in cats in Ontario, Can Vet J 33, 1992, 134.

10. Gruffydd-Jones T.J., Jones B.R., Hodge H., Rice M., Gething M.A. Chlamydia infection in cats in New Zealand, N Z Vet J 43, 1995, 201–203.

11. Cai Y., Fukushi H., Matsudate H., et al. Seroepidemiological investigation of feline chlamydiosis in cats and humans in Japan, Microbiol Immunol 44, 2000, 155–160.

12. Mochizuki M., Kawakami K., Hashimoto M., Ishida T. Recent epidemiological status of feline upper respiratory infections in Japan, J Vet Med Sci 62, 2000, 801–803.

13. Mitzel J.R., Strating A. Vaccination against feline pneumonitis, Am J Vet Res 38, 1977, 1361–1363.

14. Shewen P.E., Povey R.C., Wilson M.R. A comparison of the efficacy of a live and four inactivated vaccine preparations for the protection of cats against experimental challenge with Chlamydia psittaci, Can J Comp Med 44, 1980, 244–251.

15. Wills J.M., Gruffydd-Jones T.J., Richmond S.J., Gaskell R.M., Bourne F.J. Effect of vaccination on feline Chlamydia psittaci infection, Infect Immun 55, 1987, 2653–2657.

16. Iwamoto K., Masubuchi K., Nosaka H., et al. Isolation of Chlamydia psittaci from domestic cats with oculonasal discharge in Japan, J Vet Med Sci 63, 2001, 937–938.

17. Masubuchi K., Nosaka H., Iwamoto K., Kokubu T., Yamanaka M., Shimizu Y. Experimental infection of cats with Chlamydophila felis, J Vet Med Sci 64, 2002, 1165–1168.

18. Wills J., Gruffydd-Jones T.J., Richmond S., Paul I.D. Isolation of Chlamydia psittaci from cases of conjunctivitis in a colony of cats, Vet Rec 114, 1984, 344–346.

19. Pudjiatmoko, Fukushi H., Ochiai Y., Yamaguchi T., Hirai K. Seroepidemiology of feline chlamydiosis by microimmunofluorescence assay with multiple strains as antigens, Microbiol Immunol 40, 1996, 755–759.

20. Spencer W.N., Johnson F.W. Simple transport medium for the isolation of Chlamydia psittaci from clinical material, Vet Rec 113, 1983, 535–536.

21. Yamanaka M., Hiramatsu K., Hirahara T., et al. Pathological studies on local tissue reactions in guinea pigs and rats caused by four different adjuvants, J Vet Med Sci 54, 1992, 685–692.

22. Yamanaka M., Okabe T., Nakai M., Goto N. Local pathological reactions and immune response of chickens to ISA-70 and other adjuvants containing Newcastle disease virus antigen, Avian Dis 37, 1993, 459–466.

23. Deville S., Pooter A., Aucouturier J., et al. Influence of adjuvant formulation on the induced protection of mice immunized with total soluble antigen of Trichinella spiralis, Vet Parasitol 132, 2005, 75–80.

24. Takahashi T., Yamanaka M., Kimura Y., et al. Development of an inactivated tri-valent vaccine against panleukopenia, rhinotracheitis and caliciviral disease in cats, J Jpn Vet Med Assoc 45, 1992, 262–268.

25. Hendrick M.J., Shofer F.S., Goldschmidt M.H., et al. Comparison of fibrosarcomas that developed at vaccination sites and at nonvaccination sites in cats: 239 cases (1991–1992), J Am Vet Med Assoc 205, 1994, 1425–1429.

26. Hendrick M.J. Historical review and current knowledge of risk factors involved in feline vaccine-associated sarcomas, J Am Vet Med Assoc 213, 1998, 1422–1423.

27. Kass P.H., Barnes W.G. Jr., Spangler W.L., Chomel B.B., Culbertson M.R. Epidemiologic evidence for a causal relation between vaccination and fibrosarcoma tumorigenesis in cats, J Am Vet Med Assoc 203, 1993, 396–405.

28. Coyne M.J., Reeves N.C., Rosen D.K. Estimated prevalence of injection-site sarcomas in cats during 1992, J Am Vet Med Assoc 210, 1997, 249–251.

 

SUMBER:

Katsuo Masubuchi, Akira Wakatsuki, and Mitsugu Shimizu. Efficacy of a new inactivated Chlamydophila felis vaccine in experimentally-infected cats. Journal of Feline Medicine and Surgery (2010) 12, 609-613