Deteksi Chlamydophila psittaci dengan Menggunakan SYBR Green Real Time PCR

 

ABSTRAK

 

Chlamydophila psittaci adalah agen penyebab psittacosis pada manusia dan chlamydiosis pada burung. Patogen zoonosis ini sering ditularkan dari burung yang terinfeksi kepada manusia. Oleh karena itu, deteksi C. psittaci yang tepat dan cepat pada burung sangat penting untuk mengendalikan penyakit ini. Kami mengembangkan metode untuk mendeteksi C. psittaci dengan menggunakan SYBR Green Real-Time PCR yang ditargetkan pada gen protein kaya sistein (envB) dari C. psittaci. Prosedur satu langkah ini sangat sensitif dan cepat untuk mendeteksi serta mengkuantifikasi C. psittaci dari sampel feses. Uji ini juga mampu mendeteksi spesies Chlamydophila zoonosis lainnya seperti C. abortus dan C. felis. Uji ini sangat cocok digunakan sebagai metode deteksi rutin dalam kedokteran hewan.

 

PENDAHULUAN

Bakteri dari keluarga Chlamydiaceae adalah patogen bakteri intraseluler obligat yang menyebabkan berbagai penyakit pada berbagai jenis hewan, termasuk manusia. Di antara mereka, Chlamydophila psittaci, agen penyebab psittacosis pada manusia dan chlamydiosis pada burung, merupakan patogen zoonosis yang paling penting. Patogen ini sering ditularkan melalui aerosol dari burung yang terinfeksi. C. psittaci telah diisolasi dari lebih dari 460 spesies burung dari 30 ordo [15]. Burung parkit, parrot, dan merpati liar dikenal sebagai inang alami yang paling representatif. Baru-baru ini, kami melaporkan bahwa 6,0% burung peliharaan (11 ordo burung) di Jepang positif terhadap C. psittaci [3]. Burung liar, terutama merpati, dapat menjadi sumber psittacosis pada manusia [18, 27]. Chlamydiosis pada burung dapat terjadi sebagai infeksi tanpa gejala, sehingga burung dapat menjadi pembawa penyakit ke manusia.

 

Gejala klinis psittacosis pada manusia adalah gejala mirip flu. Tanpa pengobatan yang tepat, infeksi ini kadang-kadang dapat menyebabkan penyakit pernapasan yang parah dan penyakit sistemik yang fatal [28]. Oleh karena itu, deteksi C. psittaci yang tepat dan cepat pada manusia dan burung sangat penting untuk mengendalikan psittacosis dan chlamydiosis pada burung. Psittacosis adalah penyakit menular yang wajib dilaporkan di Australia, Amerika Serikat, beberapa negara Eropa [13], dan Jepang. Di Jepang, sejak 1999, semua dokter diwajibkan melaporkan kasus psittacosis karena penyakit ini diklasifikasikan sebagai kategori IV berdasarkan Undang-Undang Pengendalian Penyakit Menular Jepang. Oleh karena itu, psittacosis harus dibedakan dari pneumonia chlamydial yang disebabkan oleh C. pneumoniae (terdaftar sebagai penyakit menular kategori V yang wajib dilaporkan di Jepang).

 

Infeksi C. psittaci dapat didiagnosis melalui isolasi patogen, deteksi serologis, atau deteksi DNA [25]. Karena sifat patogen yang menular, isolasi langsung patogen atau uji serologi dengan menggunakan tubuh elementer (elementary body - EB) yang dimurnikan atau sel yang terinfeksi C. psittaci sebagai antigen adalah berbahaya dan memerlukan keahlian laboratorium khusus serta fasilitas yang memadai. Oleh karena itu, diagnosis mikrobiologi untuk psittacosis dan chlamydiosis pada burung hanya dapat dilakukan di laboratorium yang dilengkapi dengan baik. Berbagai metode amplifikasi DNA telah dikembangkan untuk mendeteksi C. psittaci, seperti PCR konvensional dan real-time PCR [25]. Uji real-time PCR berguna sebagai tes diagnostik untuk C. psittaci dan secara bersamaan memungkinkan identifikasi dan/atau kuantifikasi spesies Chlamydia dan Chlamydophila. Selain itu, berbeda dengan PCR konvensional, uji ini dapat mendeteksi patogen hanya dalam satu langkah, sehingga prosedur pasca-PCR seperti elektroforesis tidak diperlukan. Hal ini memungkinkan diagnosis dilakukan dengan cepat dan mengurangi risiko kontaminasi silang.

 

Beberapa penelitian telah menggunakan real-time PCR untuk mendeteksi C. psittaci. Gen target dalam penelitian ini adalah gen protein membran luar utama (major outer membrane protein - MOMP) (ompA) [10, 14, 22], gen 23S rRNA [1, 5, 7], dan gen protein membran inklusi A (inclusion membrane protein A - incA) [19]. Namun, sebagian besar laporan ini bertujuan untuk mengembangkan tes diagnostik spesifik untuk C. psittaci.

 

Dalam penelitian ini, kami memilih gen protein kaya sistein molekuler (envB) dari C. psittaci sebagai gen target. Kami merancang primer yang dapat mendeteksi Chlamydophila yang berasal dari hewan, termasuk C. psittaci, C. abortus, dan C. felis, tetapi tidak mendeteksi spesies Chlamydia atau Chlamydophila lainnya. Kami juga mengevaluasi potensi sistem real-time PCR kami untuk digunakan sebagai sistem diagnostik klinis untuk infeksi C. psittaci dan Chlamydophila terkait lainnya.

 

Spesies dan strain chlamydial yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel 1. Semua strain dikultur dalam sel HeLa atau sel L dalam bentuk suspensi. Sel HeLa diperlakukan terlebih dahulu dengan 30 µg/ml DEAE-dextran dalam medium esensial minimal α (Wako Pure Chemical Ltd., Osaka, Jepang) pada suhu kamar selama 30 menit sebelum inokulasi. Setelah inokulasi setiap Chlamydia pada tingkat infeksi hingga 10, sel yang terinfeksi diinkubasi dalam kehadiran 5% CO₂ pada suhu 37°C selama 60 menit. Inokulum diganti dengan medium esensial minimal α yang dilengkapi dengan 5% serum sapi janin (Invitrogen, Carlsbad, CA, AS) dan 1 µg/ml sikloheksimid dalam kehadiran 5% CO₂ pada suhu 37°C hingga terbentuknya badan inklusi yang matang.

 

Tabel 1. Spesies dan Strain Chlamydia yang Digunakan dalam Penelitian Ini

Spesies	Strain	Inang	Referensi
C. psittaci	6BC	Parkit	[11]
	Cal-10	Manusia	[23]
	Daruma	Parkit	[8]
	GCP-1	Burung Nuri	[23]
	Mat116	Psittacine	Penelitian ini
	Nose	Burung Kenari	Penelitian ini
C. abortus	B577	Domba	[23]
C. felis	Fe/C-56	Kucing	[21]
C. caviae	GPIC	Marmut	[20]
C. pecorum	Maeda	Sapi	[8]
C. pneumoniae	TW183	Manusia	[12]
C. muridarum	Nigg	Tikus	[8]
C. suis	S45	Babi	[16]
C. trachomatis	L2/434/Bu	Manusia	[8]
	D/UW-3/CX	Manusia	[2]
	E/UW-5/CX	Manusia	[4]

 

Badan elementer (elementary body - EB) dari C. psittaci dimurnikan dari sel L yang terinfeksi dalam bentuk suspensi melalui sentrifugasi gradien sukrosa seperti yang dijelaskan sebelumnya [9, 21]. EB yang dimurnikan diencerkan pada konsentrasi protein 2,0 mg/ml dalam 0,01 M Tris-HCl (pH 7,2) dan disimpan pada suhu –80°C hingga digunakan.

 

Bakteri yang umumnya terdeteksi dalam sampel feses burung digunakan untuk menguji spesifisitas PCR waktu nyata (real-time PCR). Spesies bakteri yang diuji meliputi Proteus sp., Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Salmonella enterica biovar Pullorum, dan Yersinia enterocolitica dari stok kultur laboratorium kami.

 

Dua set primer oligonukleotida dirancang berdasarkan urutan gen envB dari Chlamydia psittaci strain 6BC dengan nomor akses M61116 (Pusat Informasi Bioteknologi Nasional: NCBI). Seluruh wilayah gen envB diamplifikasi menggunakan sepasang primer (Clone-F: 5’-GTTCATTTGCC AGCGGGAAGATAGAGG-3’; dan Clone-R: 5’-AGAACCACGGTTGGTTACACAAATACGG-3’) untuk membuat DNA plasmid yang digunakan dalam pembuatan kurva standar. Penyelarasan gen envB dari C. psittaci 6BC, C. abortus B577 (nomor akses AF111200), C. felis Fe/C-56 (nomor akses AP006861), C. caviae GPIC (nomor akses U41579), C. pecorum W73 (nomor akses U76761), C. pneumoniae TW-183 (nomor akses AE009440), C. muridarum Nigg (nomor akses AE002160), dan C. trachomatis L2/434/Bu (nomor akses AM884176) menunjukkan bahwa wilayah yang mencakup posisi nukleotida 997 hingga 2.670 dari gen envB adalah yang paling terkonservasi di antara mereka (Gambar 1). Oleh karena itu, untuk analisis PCR waktu nyata, satu set primer lain (Env-F: 5’-AACCTCGGATAGCAAATTAATCTGG-3’; dan EnvR: 5’-ATTTGGTATAAGAGCGAAGTTCTGG-3’) dirancang untuk mengamplifikasi wilayah gen envB (152 bp) yang menunjukkan kesamaan tinggi di antara C. psittaci dan Chlamydophila terkait seperti C. abortus dan C. felis tetapi tidak pada spesies Chlamydia dan Chlamydophila lainnya (Gambar 1).

 

Untuk menghasilkan kurva standar bagi pengujian PCR waktu nyata, produk PCR sepanjang 1.358 bp yang mencakup sebagian gen envB dikloning ke dalam vektor pGEM T easy (Promega Corporation, Madison, WI, AS), menghasilkan plasmid pEnvB. Plasmid pEnvB dimurnikan menggunakan kit komersial (Illustra plasmidPrep Mini Spin Kit, GE Healthcare UK Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, Inggris) sesuai dengan petunjuk produsen. Konsentrasi larutan pEnvB dihitung berdasarkan absorbansi pada 260 nm yang diukur dengan spektrofotometer (GeneQuant II, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, AS). Pengenceran seri 10 kali lipat dari pEnvB digunakan dalam reaksi amplifikasi. Untuk menentukan batas deteksi analisis PCR waktu nyata dan memverifikasi akurasi ekstraksi DNA pada sampel lapangan, feses burung yang mengandung titer C. psittaci EB tertentu digunakan sebagai templat. Emulsi feses burung [20% (b/v) dalam PBS] dicampur dengan jumlah PBS yang setara, yang mengandung pengenceran seri 10 kali lipat dari EB, menghasilkan emulsi feses burung 10% yang mengandung titer EB tertentu [10 hingga 10⁶ unit pembentuk inklusi (IFU)].

 

DNA diekstraksi dari sel yang terinfeksi Chlamydia, feses burung yang mengandung EB Chlamydia, dan kultur bakteri menggunakan kit ekstraksi DNA (SepaGene; Sankojunyaku Co., Ltd., Tokyo, Jepang) sesuai dengan petunjuk produsen. DNA dilarutkan dalam 20 µl buffer TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, dan 1 mM EDTA) dan disimpan pada suhu –30°C hingga digunakan.

 

PCR waktu nyata dilakukan menggunakan Sistem Thermal Cycler Dice Real Time TP800 (Takara Bio Inc., Otsu, Jepang). Reaksi dilakukan dalam 12,5 µl SYBR Premix EX Taq II (Perfect Real Time: Takara Bio Inc.), 10 µM masing-masing primer, dan 2 µl ekstrak DNA dengan volume akhir 25 µl. Kondisi siklus adalah sebagai berikut: siklus awal pada suhu 95°C selama 10 detik, 40 siklus pada suhu 95°C selama 5 detik, dan 60°C selama 30 detik dengan data diperoleh selama annealing dan ekstensi. Setelah reaksi PCR selesai, kurva pelelehan dibuat dengan memanaskan pada suhu 95°C selama 15 detik, 60°C selama 30 detik, kemudian suhu dinaikkan dari 60°C ke 95°C. Identitas produk PCR dikonfirmasi melalui analisis urutan DNA.

 

PCR bersarang konvensional diperiksa menggunakan sampel yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya [3]. Sensitivitas dan linearitas pengujian PCR waktu nyata dinilai menggunakan DNA pEnvB yang diencerkan secara seri 10 kali lipat, mengandung wilayah gen envB yang mencakup daerah primer sebagai templat dalam tiga kali ulangan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a, sensitivitas deteksi bersifat linear dari 1 × 10 hingga 1 × 10⁸ salinan pEnvB per reaksi melalui PCR waktu nyata. Kontrol negatif tidak menunjukkan amplifikasi apa pun. Kurva standar mencakup rentang linear sebesar 8 orde magnitudo [koefisien regresi (R²) adalah 0,99], memberikan pengukuran yang akurat terhadap jumlah target awal (Gambar 2b). Produk amplifikasi diverifikasi melalui analisis kurva pelelehan setelah prosedur PCR (Gambar 2c), menunjukkan bahwa hanya satu puncak pelelehan (pada 81,75°C) yang diamati. Hasil ini menunjukkan bahwa minimal 10 salinan pEnvB dapat dideteksi secara konsisten dalam pengujian PCR waktu nyata.

 

Gambar 1. Penyelarasan urutan nukleotida dari strain-varian representatif C. psittaci 6BC, C. abortus B577, C. felis Fe/C-56, C. caviae GPIC, C. pneumoniae TW-183, C. pecorum W73, C. trachomatis L2/434/Bu, dan C. muridarum Nigg. Bagian-bagian urutan yang digarisbawahi dan dicetak tebal adalah lokasi pengikatan primer.

 

Karena C. psittaci EB (elemen badan) dikeluarkan dalam feses burung yang terinfeksi, sampel feses burung secara rutin digunakan sebagai sumber DNA untuk diagnosis laboratorium infeksi C. psittaci [24]. Kami menyiapkan feses burung yang mengandung jumlah EB yang diketahui untuk mensimulasikan sampel klinis, dengan menambahkan suspensi EB dalam PBS sebagai kontrol. DNA diekstraksi dari feses dan PBS yang mengandung C. psittaci EB. PCR waktu nyata menunjukkan bahwa nilai ambang siklus (Ct) dari sampel ini berkorelasi dengan jumlah EB baik dalam feses maupun PBS (data tidak ditampilkan).

 

Sensitivitas PCR waktu nyata dibandingkan dengan PCR bersarang (nested PCR) yang secara rutin digunakan di laboratorium kami untuk diagnosis klinis [3]. Sampel DNA templat yang diekstraksi dari feses dan PBS yang mengandung titer EB yang diketahui, seperti dijelaskan di atas, dianalisis menggunakan PCR bersarang. Batas deteksi uji PCR bersarang adalah 10⁴ IFU per reaksi (data tidak ditampilkan). Dalam eksperimen menggunakan sampel yang sama, batas deteksi PCR waktu nyata SYBR Green hanya 10 IFU (data tidak ditampilkan).

 

Spesifisitas uji PCR waktu nyata dievaluasi dengan 7 strain C. psittaci, 10 strain spesies Chlamydophila dan Chlamydia, serta kultur bakteri. Hasilnya, strain C. psittaci termasuk 6BC, Borg, Cal-10, Daruma, GCP1, Mat116, Nose, dan spesies Chlamydophila terkait erat lainnya seperti C. felis dan C. abortus teramplifikasi oleh PCR waktu nyata. Semua reaksi ini menunjukkan satu puncak pelelehan pada suhu 81,75 ± 0,5°C (data tidak ditampilkan). Tidak ada sinyal yang terdeteksi dari C. pneumoniae dan C. trachomatis (Tabel 1), serta tidak ada dari kultur bakteri yang diuji.

 

Dalam penelitian ini, kami mengembangkan uji PCR waktu nyata berdasarkan pewarna SYBR Green untuk mendeteksi C. psittaci dan spesies Chlamydophila terkait. Uji ini adalah alternatif yang efektif untuk PCR bersarang konvensional.

 

Meskipun terdapat banyak uji untuk mendeteksi C. psittaci [25], analisis yang sederhana dan efisien masih diperlukan oleh dokter hewan dan klinisi. Baru-baru ini, uji PCR waktu nyata semakin banyak digunakan sebagai tes diagnostik utama. Analisis PCR konvensional termasuk PCR bersarang [3] dan PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) [17, 26] hanya mengkonfirmasi keberadaan patogen dan memerlukan waktu lama karena membutuhkan elektroforesis gel untuk memverifikasi produk PCR setelah reaksi [25]. Sebaliknya, teknik PCR waktu nyata saat ini dapat mendeteksi dan mengukur patogen lebih cepat daripada PCR konvensional. Metode PCR waktu nyata yang dijelaskan di sini hanya memerlukan separuh waktu dari PCR bersarang konvensional.

 

Uji kami menggunakan primer yang menargetkan wilayah konservatif gen envB pada spesies Chlamydophila. Wilayah envB ini cocok untuk diagnosis diferensial, yaitu metode ini dapat membedakan C. psittaci dari C. pneumoniae atau C. trachomatis. Pasangan primer ini juga dapat mengamplifikasi spesies terkait seperti C. abortus dan C. felis. Pantchev et al. melaporkan bahwa C. psittaci dan C. abortus berpotensi menyebabkan infeksi ganda pada babi dan sapi [22], dan kami menduga bahwa infeksi ganda ini juga dapat terjadi pada spesies burung. Oleh karena itu, PCR waktu nyata yang dikembangkan dalam penelitian ini, yang dapat mendeteksi C. psittaci dan C. abortus secara bersamaan, mungkin menjadi alat yang berguna dalam kedokteran hewan.

 

Sampel feses burung secara rutin digunakan sebagai sumber DNA untuk diagnosis laboratorium infeksi C. psittaci [24]. Feses mengandung berbagai jenis inhibitor PCR [26]. Pengotor ini dapat memengaruhi amplifikasi. Namun, dikonfirmasi bahwa pengotor feses tidak memengaruhi hasil dalam metode deteksi ini. Salah satu masalah umum uji PCR adalah bahwa zat penghambat dapat memberikan hasil negatif palsu. Sistem kontrol internal mungkin diperlukan untuk meningkatkan akurasi PCR waktu nyata kami [14].

 

PCR bersarang konvensional mampu mendeteksi 10⁴ IFU, sedangkan batas deteksi lebih rendah dari PCR waktu nyata SYBR Green hanya 10 IFU. Oleh karena itu, uji PCR SYBR Green 1.000 kali lebih sensitif dibandingkan PCR bersarang konvensional. Amplikon pendek pada uji PCR waktu nyata yang digunakan dalam penelitian ini kemungkinan menghasilkan amplifikasi yang lebih efisien dan sensitivitas yang lebih tinggi. Uji PCR waktu nyata SYBR Green kami juga mencapai sensitivitas yang sama dengan uji PCR TaqMan lain berdasarkan nilai Ct dibandingkan dengan IFU [19, 22]. Ehricht et al. menunjukkan bahwa sensitivitas deteksi sebenarnya bergantung pada integritas DNA target [6, 25]. PCR waktu nyata yang dikembangkan dalam penelitian ini dapat diaplikasikan bahkan pada sampel DNA yang diekstraksi dari feses burung.

 

Gambar 2. Kurva amplifikasi, kurva standar, dan kurva pelelehan dari uji real-time PCR.

(a) Kurva amplifikasi dihasilkan dari data fluoresensi yang dikumpulkan pada setiap siklus selama fase ekstensi PCR. Nilai tersebut merupakan ulangan tiga kali dari berbagai pengenceran pEnvB yang digunakan sebagai standar. Jumlah salinan pEnvB per sampel adalah 1 × 10¹, 1 × 10², 1 × 10³, 1 × 10⁴, 1 × 10⁵, 1 × 10⁶, 1 × 10⁷, 1 × 10⁸, dan kontrol negatif (NC).

(b) Kurva standar berdasarkan pengenceran seri DNA plasmid (jumlah salinan adalah 1 × 10¹ hingga 1 × 10⁸). Nilai linearitas R² dari regresi linier adalah 0,99.

(c) Analisis kurva pelelehan dari eksperimen yang sama seperti pada (a).

 

Metode kami menggunakan primer yang menargetkan wilayah konservatif dari gen envB pada spesies Chlamydophila. Wilayah envB ini cocok untuk diagnosis diferensial, yaitu metode ini dapat membedakan antara C. psittaci, C. pneumoniae, atau C. trachomatis. Pasangan primer ini juga dapat mengamplifikasi spesies terkait erat seperti C. abortus dan C. felis. Pantchev et al. melaporkan bahwa C. psittaci dan C. abortus memiliki kemungkinan menyebabkan infeksi ganda pada babi dan sapi [22], dan kami berspekulasi bahwa hal serupa juga dapat terjadi pada spesies burung. Oleh karena itu, metode real-time PCR yang dikembangkan dalam penelitian ini, yang dapat mendeteksi C. psittaci dan C. abortus secara bersamaan, mungkin menjadi alat yang berguna dalam kedokteran hewan.

 

Sampel feses burung secara rutin digunakan sebagai sumber DNA untuk diagnosis laboratorium infeksi C. psittaci [24]. Sampel feses mengandung berbagai jenis inhibitor PCR [26]. Pengotor ini mungkin memengaruhi proses amplifikasi. Namun, dikonfirmasi bahwa pengotor dari feses tidak memengaruhi hasil dalam metode deteksi ini. Salah satu masalah umum dalam uji PCR adalah bahwa zat penghambat dapat memberikan hasil negatif palsu. Sistem kontrol internal mungkin diperlukan untuk meningkatkan akurasi metode real-time PCR kami [14].

 

Metode nested PCR konvensional dapat mendeteksi 10⁴ IFU, sedangkan batas deteksi terendah dari real-time PCR berbasis SYBR Green hanya 10 IFU. Oleh karena itu, uji SYBR Green PCR ini 1.000 kali lebih sensitif dibandingkan dengan nested PCR konvensional. Amplicon pendek dalam metode real-time PCR yang digunakan dalam penelitian ini kemungkinan menghasilkan amplifikasi yang lebih efisien dan sensitivitas yang lebih tinggi. Uji SYBR Green real-time PCR kami juga mencapai sensitivitas yang sama dengan uji PCR TaqMan lainnya berdasarkan nilai Ct [19, 22]. Ehricht et al. menunjukkan bahwa sensitivitas deteksi aktual bergantung pada integritas DNA target [6, 25]. Metode real-time PCR yang dikembangkan dalam penelitian ini dapat diaplikasikan bahkan pada sampel DNA yang diekstraksi dari feses burung.

 

Sebagai kesimpulan, metode real-time PCR berbasis pewarna SYBR Green yang kami kembangkan menunjukkan sensitivitas tinggi, kecepatan, dan kemampuan kuantifikasi untuk mendeteksi C. psittaci dari sampel feses. Diagnosis dan pengobatan dini sangat penting dalam mengatasi psitakosis. Format ini sebaiknya ditekankan penggunaannya sebagai metode rutin dalam penelitian.

 

REFERENSI

1. Branley, J. M., Roy, B., Dwyer, D. E. and Sorrell, T. C. 2008. Real-time PCR detection and quantitation of Chlamydophila psittaci in human and avian specimens from a veterinary clinic cluster. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27: 269–273.

2. Caldwell, H. D. and Judd, R. C. 1982. Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteins. Infect. Immun. 38: 960–968.

3. Chahota, R., Ogawa, H., Mitsuhashi, Y., Ohya, K., Yamaguchi, T. and Fukushi, H. 2006. Genetic diversity and epizootiology of Chlamydophila psittaci prevalent among the captive and feral avian species based on VD2 region of ompA gene. Microbiol. Immunol. 50: 663–678.

4. Davis, C. H. and Wyrick, P. B. 1997. Differences in the association of Chlamydia trachomatis serovar E and serovar L2 with epithelial cells in vitro may reflect biological differences in vivo. Infect. Immun. 65: 2914–2924.

5. DeGraves, F. J., Gao, D., Hehnen, H. R., Schlapp, T. and Kaltenboeck, B. 2003. Quantitative detection of Chlamydia psittaci and C. pecorum by high-sensitivity real-time PCR reveals high prevalence of vaginal infection in cattle. J. Clin. Microbiol. 41: 1726–1729.

6. Ehricht, R., Slickers, P., Goellner, S., Hotzel, H. and Sachse, K. 2006. Optimized DNA microarray assay allows detection and genotyping of single PCR-amplifiable target copies. Mol. Cell Probes 20: 60–63.

7. Everett, K. D., Hornung, L. J. and Andersen, A. A. 1999. Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests. J. Clin. Microbiol. 37: 575– 580.

8. Fukushi, H. and Hirai, K. 1989. Genetic diversity of avian and mammalian Chlamydia psittaci strains and relation to host origin. J. Bacteriol. 171: 2850–2855.

9. Fukushi, H. and Hirai, K. 1988. Immunochemical diversity of the major outer membrane protein of avian and mammalian Chlamydia psittaci. J. Clin. Microbiol. 26: 675–680.

10. Geens, T., Dewitte, A., Boon, N. and Vanrompay, D. 2005. Development of a Chlamydophila psittaci species-specific and genotype-specific real-time PCR. Vet. Res. 36: 787–797.

11. Golub, O. J. and Wagner, J. C. 1948. Studies on the interference phenomenon with certain members of the psittacosis-lymphogranuloma group of viruses. J. Immunol. 59: 59–70.

12. Grayston, J. T., Kuo, C. C., Campbell, L. A. and Wang, S. P. 1989. Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 88–90.

13. Harkinezhad, T., Geens, T. and Vanrompay, D. 2009. Chlamydophila psittaci infections in birds: a review with emphasis on zoonotic consequences. Vet. Microbiol. 135: 68–77.

14. Heddema, E. R., Beld, M. G., de Wever, B., Langerak, A. A., Pannekoek, Y. and Duim, B. 2006. Development of an internally controlled real-time PCR assay for detection of Chlamydophila psittaci in the LightCycler 2.0 system. Clin. Microbiol. Infect. 12: 571–575.

15. Kaleta, E. F. and Taday, E. M. 2003. Avian host range of Chlamydophila spp. based on isolation, antigen detection and serology. Avian Pathol. 32: 435–461.

16. Kaltenboeck, B., Kousoulas, K. G. and Storz, J. 1993. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the four chlamydial species. J. Bacteriol. 175: 487–502.

17. Laroucau, K., Vorimore, F., Aaziz, R., Berndt, A., Schubert, E. and Sachse, K. 2009. Isolation of a new chlamydial agent from infected domestic poultry coincided with cases of atypical pneumonia among slaughterhouse workers in France. Infect. Genet. Evol. 9: 1240–1247.

18. Magnino, S., Haag-Wackernagel, D., Geigenfeind, I., Helmecke, S., Dovc, A., Prukner-Radovcic, E., Residbegovic, E., Ilieski, V., Laroucau, K., Donati, M., Martinov, S. and Kaleta, E. F. 2009. Chlamydial infections in feral pigeons in Europe: review of data and focus on public health implications. Vet. Microbiol. 135: 54–67.

19. Menard, A., Clerc, M., Subtil, A., Megraud, F., Bebear, C. and de Barbeyrac, B. 2006. Development of a real-time PCR for the detection of Chlamydia psittaci. J. Med. Microbiol. 55: 471–473.

20. Murray, E. S. 1964. Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. I. Isolation and identification as a Member of the psittacosislymphogranuloma-trachoma group. J. Infect. Dis. 114: 1–12.

21. Ohya, K., Takahara, Y., Kuroda, E., Koyasu, S., Hagiwara, S., Sakamoto, M., Hisaka, M., Morizane, K., Ishiguro, S., Yamaguchi, T. and Fukushi, H. 2008. Chlamydophila felis CF0218 is a novel TMH family protein with potential as a diagnostic antigen for diagnosis of C. felis infection. Clin. Vaccine Immunol. 15: 1606–1615.

22. Pantchev, A., Sting, R., Bauerfeind, R., Tyczka, J. and Sachse, K. 2009. New real-time PCR tests for species-specific detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus from tissue samples. Vet. J. 181: 145–150.

23. Pudjiatmoko, Fukushi, H., Ochiai, Y., Yamaguchi, T. and Hirai, K. 1996. Seroepidemiology of feline chlamydiosis by microimmunofluorescence assay with multiple strains as antigens. Microbiol. Immunol. 40: 755–759.

24. Rodolakis, A. and Yousef Mohamad, K. 2010. Zoonotic potential of Chlamydophila. Vet. Microbiol. 140: 382–391.

25. Sachse, K., Vretou, E., Livingstone, M., Borel, N., Pospischil, A. and Longbottom, D. 2009. Recent developments in the laboratory diagnosis of chlamydial infections. Vet. Microbiol. 135: 2–21.

26. Sareyyupoglu, B., Cantekin, Z. and Bas, B. 2007. Chlamydophila psittaci DNA detection in the faeces of cage birds. Zoonoses Public Health 54: 237–242.

27. Telfer, B. L., Moberley, S. A., Hort, K. P., Branley, J. M., Dwyer, D. E., Muscatello, D. J., Correll, P. K., England, J. and McAnulty, J. M. 2005. Probable psittacosis outbreak linked to wild birds. Emerg. Infect. Dis. 11: 391–397.

28. Vanrompay, D., Harkinezhad, T., van de Walle, M., Beeckman, D., van Droogenbroeck, C., Verminnen, K., Leten, R., Martel, A. and Cauwerts, K. 2007. Chlamydophila psittaci transmission from pet birds to humans. Emerg. Infect. Dis. 13: 1108–1110.

 

SUMBER:

Hideko OKUDA, Kenji OHYA, Yukihiro SHIOTA, Hiroshi KATO and Hideto FUKUSHI. Detection of Chlamydophila psittaci by Using SYBR Green Real-Time PCR. J. Vet. Med. Sci. 73(2): 249–254, 2011  https://www.jstage.jst.go.jp/article/jvms/73/2/73_10-0222/_pdf/-char/en