Infeksi Klamidia: Berasal dari Luar Masuk ke Dalam Sel

 

ABSTRAK

 

Klamidia adalah bakteri intraseluler obligat yang ditandai dengan siklus perkembangan bifasik yang unik. Interaksi spesifik dengan sel inang sangat penting bagi kelangsungan hidup dan replikasi bakteri ini karena genom klamidia yang terbatas. Pada awal infeksi, interaksi patogen-inang dilakukan agar Klamidia dapat masuk ke dalam sel inang dan mencapai wilayah peri-Golgi yang kaya nutrisi. Setelah lokalisasi intraseluler terbentuk, interaksi dengan organel dan jalur sel inang memungkinkan pengambilalihan nutrisi yang berasal dari inang. Informasi rinci tentang proses ini dapat meningkatkan pemahaman kita mengenai patogenesis intraseluler Klamidia dan berpotensi mengarah pada strategi baru untuk melawan infeksi klamidia. Ulasan ini merangkum bagaimana Klamidia menciptakan ceruk intraseluler di dalam sel inang, memperoleh nutrisi dari inang untuk mendukung pertumbuhan, dan akhirnya keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel baru. Selain itu, dibahas perkembangan alat genetika molekuler yang diperlukan untuk mempelajari biologi infeksi klamidia secara lebih mendalam.

 

PENDAHULUAN

 

Klamidia dikenal karena siklus hidup bifasik unik mereka yang bergantian antara dua bentuk morfologis: badan elementer (EB) yang infeksius secara ekstraseluler dan badan retikulat (RB) yang aktif secara metabolik di dalam sel. Banyak membran memiliki peran kunci dalam siklus perkembangan klamidia (Gambar 1). Untuk memasuki sel inang, EB yang tidak terbungkus harus melewati membran plasma sel inang. Mereka melekat pada membran sel inang melalui ligan bakteri dan reseptor inang, serta menyuntikkan efektor yang telah dikemas sebelumnya ke dalam sitosol inang untuk memungkinkan invasi. Selama proses internalisasi EB, sebuah vakuola, yang disebut inklusi, terbentuk di mana EB berdiam dan segera berubah menjadi RB (Hackstadt, 2012; Hegemann dan Mölleken, 2012; Mehlitz dan Rudel, 2013).

 

Beberapa EB dapat mengikat dan masuk ke sel inang yang sama, menghasilkan beberapa inklusi di dalam sel ini. Pada beberapa spesies, seperti Chlamydia trachomatis, inklusi-inklusi ini akhirnya menyatu melalui fusi homotipik, membentuk satu inklusi besar (Elwell dan Engel, 2012; Hackstadt, 2012; Richards et al., 2013). Proses ini diatur oleh protein membran inklusi (Inc) IncA, yang akan dibahas lebih rinci dalam ulasan ini (lihat "Protein SNARE").

 

RB yang aktif secara metabolik dengan cepat memodifikasi membran inklusi melalui efektor awal untuk mencegah degradasi inklusi dan memungkinkan transportasi inklusi ke pusat pengorganisasian mikrotubulus (MTOC) (Scidmore et al., 1996). Ketika berada di wilayah peri-Golgi yang kaya nutrisi, produk gen klamidia selama siklus tengah lebih lanjut memodifikasi membran inklusi, memungkinkan interaksi selektif dengan kompartemen dan jalur seluler untuk mengambil alih nutrisi penting (Moore dan Ouellette, 2014).

 

Karena genom klamidia sangat terbatas (sekitar 1 Mb, mengkodekan 895 bingkai baca terbuka untuk C. trachomatis) dan kekurangan banyak enzim metabolik, kelangsungan hidup patogen ini bergantung pada interaksi ini (Stephens et al., 1998). Namun, membran inklusi membentuk penghalang antara patogen dan nutrisi inang, yang berarti bahwa mekanisme transportasi nutrisi melintasi membran inklusi juga merupakan proses terkait membran yang penting bagi kelangsungan hidup klamidia.

 

Selain itu, RB berkembang biak di dalam inklusi melalui pembelahan biner, dan inklusi membesar. Lipid yang dibutuhkan untuk memperbesar membran inklusi dan memperbanyak RBs diambil dari inang (Hackstadt et al., 1995, 1996; Scidmore et al., 1996; Wylie et al., 1997; Van Ooij et al., 2000; Carabeo et al., 2003; Su et al., 2004). Protein yang terdapat dalam membran tersebut sebagian besar spesifik untuk Klamidia (Taraska et al., 1996). Akhirnya, pada akhir siklus hidup mereka, RB secara asinkron kembali menjadi EBs, yang kemudian keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel baru.

GAMBAR 1. Siklus Perkembangan Klamidia dalam Perspektif Interaksi Membran

Klamidia memiliki siklus hidup bifasik yang unik, di mana mereka bergantian antara dua bentuk morfologis: badan elementer (EB) dan badan retikulat (RB).

(a) Pada awal infeksi, EB yang infeksius secara ekstraseluler menggunakan ligan bakteri untuk berikatan dengan reseptor pada permukaan sel inang. Ikatan ini memungkinkan internalisasi bakteri ke dalam vesikel di dalam sel inang, yang disebut inklusi. Proses internalisasi dapat bergantung atau tidak bergantung pada aktin, tetapi karena proses yang bergantung pada aktin telah diteliti lebih luas, proses inilah yang digambarkan dalam gambar. Dalam proses ini, EB menyuntikkan efektor T3SS yang telah dikemas sebelumnya ke dalam sitoplasma inang segera setelah kontak dengan inang terjadi. Hal ini menyebabkan reorganisasi aktin dan pengambilan EB oleh sel inang. Setelah berada di dalam inklusi, EB bertransisi menjadi RB. RB adalah partikel yang aktif secara metabolik dan mampu memperbanyak diri melalui pembelahan biner.

(b) RBs ini segera memproduksi efektor awal yang memodifikasi membran inklusi untuk mencegah degradasi lisosom.

(c) Selain itu, inklusi mulai bergerak melintasi mikrotubulus menjauh dari perifer dan menuju pusat pengorganisasian mikrotubulus (MTOC).

(d) Ketika inklusi mencapai wilayah peri-Golgi yang kaya nutrisi, patogen mengambil alih metabolit sel inang untuk mendukung pertumbuhan dirinya sendiri serta pertumbuhan membran inklusi. Pertumbuhan membran ini diperlukan untuk menyediakan ruang bagi RB yang terus berkembang. Nutrisi diperoleh melalui interaksi spesifik antara inklusi dan berbagai organel sel inang seperti tumpukan mini Golgi yang terfragmentasi, retikulum endoplasma (ER), tetesan lipid, peroksisom, lisosom, endosom daur ulang, mitokondria, dan tubuh multivesikular (MVB).

(e) Akhirnya, inklusi yang telah membesar memenuhi sebagian besar sitoplasma sel inang, setelah itu RB bertransisi kembali menjadi EB. EB ini kemudian keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel-sel baru.

 

Perlu dicatat bahwa kelangsungan hidup dan pertumbuhan Chlamydia tidak hanya bergantung pada pembentukan ceruk intraseluler, dari mana ia dapat membajak berbagai nutrisi sel inang, tetapi juga pada penghindaran respons imun. Jika berhasil, fenomena ini tidak hanya menyelamatkan bakteri dari pembersihan tetapi juga menyebabkan infeksi Chlamydia berlangsung secara asimtomatik. Strategi yang digunakan berbeda-beda antara spesies, karena berbagai strain Chlamydia menginfeksi inang yang berbeda dengan jenis respons imun yang spesifik. Beberapa kelompok peneliti telah mendedikasikan penelitian mereka untuk mempelajari mekanisme molekuler yang mendorong strategi penghindaran imun ini.

 

Sebagai contoh:

• C. trachomatis terbukti melumpuhkan sistem imun inang dengan mencegah aktivasi leukosit polimorfik nukleus (Rajeeve et al., 2018).
• C. trachomatis juga terbukti menghindari mekanisme spesifik manusia berupa penandaan ubiquitin pada inklusi untuk dihancurkan (Haldar et al., 2016).
• Selain itu, bakteri ini memengaruhi presentasi antigen inang dengan meningkatkan presentasi antigen sendiri, yang pada akhirnya mengurangi presentasi peptida yang berasal dari Chlamydia (Cram et al., 2016; Pickering et al., 2017).

 

Selain strategi penghindaran imun, Chlamydia telah mengembangkan mekanisme bertahan dari berbagai stresor dengan beralih ke keadaan fisiologis di mana bakteri berhenti membelah tetapi tetap hidup, yang disebut persistence. Kami merujuk pada Panzetta et al. (2018) dan Chen et al. (2019), yang mengulas mekanisme molekuler yang digunakan Chlamydia untuk melawan pertahanan imun bawaan inang serta untuk membentuk persistence (Panzetta et al., 2018; Chen et al., 2019).

 

Saat ini, peristiwa yang terjadi pada membran plasma inang serta membran inklusi yang mendukung internalisasi dan nutrisi Chlamydia akan dibahas secara lebih rinci. Perlu dicatat bahwa karena terdapat perbedaan signifikan antara spesies dan strain dalam cara Chlamydia berinteraksi dengan sel inang, data tidak selalu dapat diekstrapolasikan ke spesies Chlamydia lainnya, sehingga perlu kehati-hatian (Valdivia, 2008). Selain itu, pada akhir ulasan ini, kemajuan terbaru dalam pengembangan alat genetika molekuler yang diperlukan untuk mempelajari proses Chlamydia ini secara lebih mendalam juga akan dibahas. Dengan mengumpulkan semua data terbaru tentang siklus hidup Chlamydia dalam perspektif interaksi membran serta kemajuan baru dalam teknik manipulasi genetika molekuler yang menjanjikan untuk Chlamydia, penulis berharap dapat membantu para ilmuwan dalam mengidentifikasi target kuat baru untuk profilaksis dan terapi Chlamydia.

 

TRANSPORTASI CHLAMYDIA MELALUI SEL INANG

 

1. Penempelan

 

Perbedaan spesies dalam tropisme inang dan jaringan sebagian disebabkan oleh keragaman mekanisme penempelan dan internalisasi. Penempelan Chlamydia pada sel inang dianggap sebagai proses bertahap.

 

Interaksi awal C. trachomatis dan C. pneumoniae dengan sel inang tampaknya merupakan interaksi elektrostatik afinitas rendah yang reversibel (Heckels et al., 1976; Hatch et al., 1981) antara EB dan glikosaminoglikan (GAGs) seperti heparan sulfat pada inang (Zhang dan Stephens, 1992; Su et al., 1996). Contoh ligan EB yang diketahui untuk mengikat GAG heparan sulfat adalah OmcB untuk C. pneumonia (Mölleken dan Hegemann, 2008) dan C. trachomatis (Fadel dan Eley, 2008) serta protein membran luar utama (MOMP) untuk C. trachomatis (Su et al., 1996).

 

Selain itu, dengan memutasikan secara kimia sel ovarium hamster Tiongkok (CHO) dan kemudian memilih klon yang resisten terhadap infeksi Chlamydia, Carabeo dan Hackstadt menemukan langkah pengikatan yang tidak dapat dipulihkan, bergantung pada suhu, dan resisten terhadap heparin yang belum pernah dijelaskan sebelumnya. Langkah ini terjadi setelah pengikatan reversibel EB serovar L2 C. trachomatis pada heparan sulfat di permukaan sel. Langkah pengikatan ini terbukti sangat penting untuk infeksi L2 dan bahkan membedakan biovar LGV (di mana serovar L2 merupakan anggota) dari biovar trachoma (Carabeo dan Hackstadt, 2001).

 

Fudyk et al. (2002) melengkapi hasil ini dan menunjukkan bahwa mutasi spesifik memodifikasi infektivitas C. trachomatis LGV dengan cara yang berbeda dibandingkan dengan biovar trachoma atau C. pneumoniae. Berdasarkan hasil menginfeksi garis sel CHO yang dimutasi dengan serovar C. trachomatis maupun C. pneumoniae, mereka menghipotesiskan bahwa Chlamydia memanfaatkan jalur internalisasi bertahap yang umum dengan kebutuhan spesifik per spesies (Fudyk et al., 2002).

 

Sejumlah adhesin bakteri dan reseptor inang telah diidentifikasi yang terlibat dalam penempelan EB pada sel inang. Ini dirangkum dalam Tabel 1 dan digambarkan dalam Gambar 2. Beberapa mitra pengikat masih belum teridentifikasi, dan kemungkinan besar masih ada interaksi molekuler lain yang belum ditemukan.

 

Selain itu, Protein Disulfida Isomerase (PDI) inang, yang merupakan komponen dari kompleks reseptor estrogen, terbukti memiliki fungsi ganda dalam proses masuknya Chlamydia ke dalam sel. PDI di permukaan sel yang dimediasi oleh reduksi disulfida memungkinkan masuknya Chlamydia, sementara PDI struktural memungkinkan penempelan, yang independen dari aktivitas enzimatik PDI. Dalam kasus terakhir, Chlamydia mengikat protein inang yang berasosiasi dengan PDI alih-alih mengikat PDI yang berasosiasi dengan sel secara langsung (Abromaitis dan Stephens, 2009).

 

Lebih lanjut, Chlamydia memanfaatkan keterlibatan PDI dalam penempelan dan invasi dengan mengendalikan aktivitasnya untuk menghindari reinfeksi. Ketika sel yang terinfeksi mengalami reinfeksi selama fase replikasi RB, pembentukan EB dapat dicegah. C. trachomatis karenanya menginduksi penipisan protein yang diatur glukosa 96 (Gp96) dari sel yang terinfeksi selama fase replikasinya, yang menyebabkan aktivitas PDI di permukaan sel menurun (Karunakaran et al., 2015).

 

Tabel 1.

GAMBAR 2. Representasi skematis dari pasangan pengikat yang terlibat dalam pengikatan badan elementer (EB) ke permukaan sel inang.

Untuk Chlamydia trachomatis, telah diidentifikasi tiga pasangan pengikat lengkap:

1. Lipopolisakarida klamidia (LPS) dengan Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) pada inang.
2. CT017 klamidia dengan integrin beta-1 (ITGB1) pada inang.
3. Protein kejut panas 70 klamidia (Hsp70) dengan 30 sulfogalactolipid (30SGL) pada inang.

Selain itu, beberapa adhesin klamidia atau reseptor inang diketahui berperan dalam pengikatan EB C. trachomatis ke sel inang meskipun pasangan pengikatnya belum diketahui, seperti:

• Reseptor Ephrin A2 (EPHA2) pada inang,
• Reseptor faktor pertumbuhan turunan trombosit (PDGFR),
• Reseptor faktor pertumbuhan fibroblas (FGFR) yang berfungsi melalui perantara faktor pertumbuhan fibroblas 2 (FGF2),
• Semua protein membran polimorfik klamidia (Pmps).

Untuk Chlamydia pneumoniae, pasangan pengikat yang telah diidentifikasi hingga saat ini adalah:

1. Pmp21 klamidia dengan reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) pada inang,
2. Protein membran luar utama klamidia (MOMP) dengan reseptor manosa 6-fosfat (M6PR) pada inang, melalui perantara N-Man-Glyc.

Selain itu, protein disulfida isomerase (PDI) pada inang diperlukan untuk pengikatan EB ke sel. Namun, bakteri tidak langsung mengikat PDI. Sebagai gantinya, Chlamydia melekat pada protein inang yang berasosiasi dengan PDI.

 

Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan Gambar 2, semua protein membran polimorfik (polymorphic membrane proteins, Pmps) terlibat dalam pengikatan Chlamydia trachomatis ke sel inang. Keluarga Pmp adalah keluarga protein terbesar pada spesies Chlamydia dan merupakan ciri unik dari genus ini (Horn et al., 2004; Vandahl et al., 2004). Karena Pmp menyumbang 3,15% dan 5,1% dari total kapasitas pengkodean C. trachomatis dan C. pneumoniae, masing-masing (Grimwood dan Stephens, 1999), yang merupakan proporsi yang cukup besar dari genom yang sangat berkurang, disarankan bahwa Pmp memiliki peran penting dalam biologi klamidia.

 

Prediksi in silico mengidentifikasi Pmp sebagai protein autotransporter (sistem sekresi tipe V) berdasarkan:

1. Urutan sinyal N-terminal yang dapat dipotong untuk translokasi melintasi membran dalam,

2. Domain penumpang sentral yang menyediakan fungsi protein,

3. Domain transporter C-terminal berbentuk β-barrel,

4.Adanya fenilalanin pada akhir domain ini, yang menunjukkan lokalisasi pada membran luar (Struyve et al., 1991; Henderson dan Lam, 2001; Dautin dan Bernstein, 2007).

 

Selain itu, bukti eksperimental telah mendukung prediksi in silico ini untuk beberapa Pmp (Longbottom et al., 1998; Vandahl et al., 2002; Wehrl et al., 2004; Kiselev et al., 2007; Liu et al., 2010). Salah satu fungsi protein autotransporter ini adalah sebagai adhesin, seperti yang ditunjukkan oleh keberadaan motif konservasi GGA(I,L,V) dan FxxN yang juga ditemukan pada adhesin Anaplasma phagocytophilum (Girard dan Mourez, 2006).

 

Mölleken et al. (2010) menunjukkan bahwa sel ragi yang mengekspresikan C. pneumoniae Pmp6, Pmp20, dan Pmp21 (ortolog dari PmpG, PmpB, dan PmpD pada C. trachomatis) pada permukaannya, serta partikel yang dilapisi dengan protein rekombinan dari tiga Pmp ini, dapat melekat pada sel epitel manusia. Preinkubasi sel epitel dengan ketiga protein ini secara signifikan mengurangi pengikatan, yang mengonfirmasi kapasitas adhesif Pmp6, Pmp20, dan Pmp21 dari C. pneumoniae.

 

Pmp tampaknya berfungsi sebagai adhesin spesifik spesies, karena inkubasi sel epitel dan endotel manusia dengan Pmp dari C. trachomatis tidak efektif dalam menghambat infeksi C. pneumoniae, begitu pula sebaliknya. Hal ini menunjukkan bahwa Pmp berperan dalam tropisme inang dan jaringan (Becker dan Hegemann, 2014).

 

Ukuran dan urutan asam amino pada Pmp sangat bervariasi. Jumlah gen Pmp bergantung pada spesies (Vasilevsky et al., 2016), berkisar dari 9 hingga 16 gen penuh untuk strain referensi klamidia seperti C. abortus S26/3 (Thomson et al., 2005), C. avium 10DC88 (Sachse et al., 2014), C. caviae GPIC (Read, 2003), dan lainnya. Keluarga Pmp diyakini berasal dari duplikasi gen, yang memungkinkan keragaman fungsi, sehingga protein ini diasumsikan terkait langsung dengan variasi tingkat keparahan penyakit yang diamati antar strain (Abdelsamed et al., 2013).

 

Sebagai contoh, meskipun Van Lent et al. (2016) mengamati kesamaan struktural antara Pmp C. psittaci, mereka mengidentifikasi PmpA dan PmpH sebagai faktor penting dalam patogenesis, sekaligus menunjukkan potensi imunogenisitas kedua Pmp ini untuk desain vaksin. Gomes et al. (2006) mempelajari polimorfisme dalam sembilan Pmp dari semua serovar C. trachomatis dan menemukan bukti korelasi antara variasi genetik yang teridentifikasi dengan tropisme jaringan.

 

Lebih khusus lagi, analisis polimorfisme menunjukkan hubungan terkuat antara serovar LGV yang menyebabkan penyakit urogenital invasif, yang paling berbeda dari serovar urogenital non-LGV dan okular. Rekonstruksi filogenetik menunjukkan bahwa pada enam dari sembilan gen Pmp, serovar dikelompokkan berdasarkan tropisme jaringan. Studi ini juga menunjukkan bukti signifikan secara statistik untuk rekombinasi antar genom pada gen Pmp, yang mungkin memungkinkan adaptasi evolusioner dalam tropisme jaringan dan patogenesis (Gomes et al., 2006).

 

Internalisasi

 

Banyak kelompok penelitian telah mendedikasikan sumber daya mereka untuk mempelajari proses internalisasi klamidia. Namun, meskipun banyak data yang telah terkumpul selama bertahun-tahun, belum ada jalur konsensus yang dijelaskan, dan banyak hasil yang saling bertentangan telah diterbitkan.

 

Sebagai contoh, kontribusi endositosis yang dimediasi klatrin dalam internalisasi klamidia masih kontroversial. Beberapa penelitian mendukung konsep endositosis yang dimediasi reseptor melalui lubang berlapis klatrin, sementara penelitian lain menunjukkan bahwa masuknya C. trachomatis tidak terpengaruh ketika endositosis yang bergantung pada klatrin dihambat.

 

Penelitian lain menunjukkan bahwa klamidia dapat masuk ke dalam sel melalui fagositosis terarah atau pinositosis umum. Namun, sebagian besar penelitian berfokus pada proses yang digerakkan oleh aktin, di mana badan elementer (elementary bodies, EB) membawa sistem sekresi tipe 3 (type 3 secretion system, T3SS) yang fungsional. Sistem ini memungkinkan transfer efektor yang telah dikemas sebelumnya beserta chaperonnya langsung ke sitoplasma sel inang untuk menginduksi reorganisasi sitoskeleton (Peters et al., 2007; Saka et al., 2011).

 

Gambar 3. Representasi skematik jalur transduksi sinyal yang terlibat dalam internalisasi C. trachomatis EBs melalui fagositosis.

Setelah elementary body (EB) menempel pada sel inang, aktivasi sistem sekresi tipe 3 (T3SS) terjadi. Efektor T3SS pertama yang disekresikan adalah Tarp, CT166, dan CT694. Tarp mereorganisasi aktin secara langsung maupun tidak langsung. Mekanisme pertama mencerminkan fakta bahwa Tarp memiliki domain pengikat aktin dan wilayah kaya prolin, yang memungkinkannya bertindak sebagai nukleator dan meningkatkan pengikatan aktin.

Proses tidak langsung, di sisi lain, merupakan mekanisme yang bergantung pada Rac1. Kinase inang Src, Syk, dan Abl memfosforilasi pengulangan tandem kaya tirosin di ujung N-terminal Tarp, yang mengarah pada rekrutmen beberapa protein.

• Di satu sisi, ABI1 berinteraksi dengan Tarp yang telah difosforilasi dan membentuk kompleks dengan SOS1 dan EPS8.
• Di sisi lain, PI3K mengikat Tarp yang telah difosforilasi, menghasilkan PI(3,4,5)P3

 

Sebelum C. trachomatis menempel pada inangnya, aktivitas T3SS yang sepenuhnya dirakit dalam EB dihambat melalui ikatan disulfida dalam protein Sekresi dan Translokasi Seluler (Sct) F dan SctC, yang keduanya merupakan protein struktural dari T3SS, serta dengan menempatkan plug CopN pada sisi sitoplasma T3SS.

 

Plug CopN tersebut terdiri atas kompleks CopN dengan chaperone T3SS, yaitu Scc1 dan Scc4 pada sisi N-terminalnya, yang memposisikan CopN pada T3SS dari EB (Silva-Herzog et al., 2011), dan chaperone tambahan Scc3 pada sisi C-terminalnya, yang menghambat sekresi CopN (Slepenkin et al., 2005; Ferrell dan Fields, 2016). Segera setelah EB menempel pada membran plasma sel inang, T3SS diaktifkan melalui sekresi CopN dan pelepasan protein translocator CopB dan CopD. CopB dan CopD kemudian membentuk transklokon yang terkait invasi, yang memungkinkan transportasi efektor T3SS yang disekresikan berikutnya (Bulir et al., 2014, 2015; Ferrell dan Fields, 2016). Duplikasi gen telah terdeteksi pada CopB dan CopD, yang disebut sebagai CopB2 dan CopD2.

 

Chellas-Géry et al. (2011) membandingkan CopB dengan CopB2 dan menunjukkan bahwa, meskipun keduanya terlokalisasi pada membran inklusi, CopB2 terdeteksi secara terus-menerus sementara CopB hanya terdeteksi pada waktu-waktu tertentu selama infeksi, yaitu pada tahap awal dan 20 jam setelah infeksi. Oleh karena itu, diduga bahwa CopB memediasi translokasi pada tahap awal dan akhir, sedangkan CopB2 berfungsi di antaranya (Chellas-Géry et al., 2011).

 

T3SS yang diaktifkan mensekresikan efektor yang terkait invasi, yang memfasilitasi proses internalisasi. Pada C. trachomatis, fosfoprotein pengikat aktin (Tarp), CT166, dan CT694 adalah yang pertama disekresikan (Pais et al., 2013; Chen et al., 2014). Tarp adalah protein efektor multidomain awal yang memediasi nukleasi dan pengikatan aktin. Dua mekanisme telah dijelaskan mengenai cara Tarp menghasilkan efeknya.

 

1.     Kontak langsung dengan aktin:

o    Sebagai nukleator, Tarp mengandung beberapa domain pengikat aktin C-terminal yang mirip dengan protein domain WH2.

o    Tarp juga mengandung wilayah kaya prolin yang dapat meningkatkan oligomerisasi aktin (Jewett et al., 2006).

 

2.     Remodeling aktin melalui mekanisme yang bergantung pada Rac1 (RAS-related C3 botulinum toxin substrate 1):

Pada situs perlekatan, kinases inang Src (Jewett et al., 2008), Syk (Mehlitz et al., 2008), dan Abl (Elwell et al., 2008) memfosforilasi pengulangan tandem kaya tirosin di ujung N-terminal Tarp. Hal ini memicu rekrutmen son of sevenless homologue 1 (SOS1) dan VAV2. Interaksi antara SOS1 dan Tarp yang terfosforilasi dimediasi oleh ABL interactor 1 (ABI1), yang membentuk kompleks multiprotein dengan SOS1 dan substrat kinase reseptor epidermal 8 (EPS8). Aktivasi VAV2, di sisi lain, bergantung pada phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PI(3,4,5)P3) yang dihasilkan oleh fosfoinositida 3-kinase (PI3K), enzim yang juga mengikat Tarp terfosforilasi. SOS1 dan VAV2 mengaktifkan Rac1, yang selanjutnya merekrut regulator aktin, yaitu anggota keluarga protein sindrom Wiskott-Aldrich 2 (WAVE2 atau WASF2), ABI1, actin-related protein 1 (ARP2), dan ARP3. Regulator ini sangat penting untuk reorganisasi aktin (Carabeo et al., 2007; Lane et al., 2008; Jiwani et al., 2012; Mehlitz dan Rudel, 2013). Polimerisasi aktin ini diikuti oleh remodeling membran yang ekstensif.

 

Reorganisasi aktin yang diinduksi Tarp bersifat sementara, dan diduga bahwa efektor lain seperti CT166 (Thalmann et al., 2010) dan CT694 (Hower et al., 2009) dari C. trachomatis mungkin mengatur depolimerisasi aktin. Sementara C. trachomatis hanya merekrut Rac1 dan bukan Cdc42, C. caviae diketahui menggunakan keduanya serta Arf6 untuk mendukung proses masuk (Subtil et al., 2004; Balañá et al., 2005). Namun, hingga saat ini, peran Arf6 selama infeksi C. trachomatis belum diteliti.

 

Clifton et al. (2005) menganalisis genom C. trachomatis serovar L2 dan D, C. muridarum, C. caviae, dan C. pneumoniae dan menemukan bahwa masing-masing mengandung ortolog Tarp. Tidak ada fosfotirosin yang terdeteksi pada situs masuk untuk ortolog dari C. muridarum, C. caviae, dan C. pneumoniae. Namun, semua ortolog ini memiliki setidaknya satu hingga empat domain pengikat aktin C-terminal yang fungsional, dan untuk masing-masing spesies, Tarp rekombinan murni mampu melakukan nukleasi filamen aktin secara in vitro (Jewett et al., 2010). Hal ini menunjukkan bahwa perekrutan aktin bergantung pada keberadaan domain C-terminal Tarp dan tidak secara eksklusif pada fosforilasi tirosin (Clifton et al., 2005).

 

Selain itu, analisis filogenetik Tarp dari strain referensi C. trachomatis serta isolat klinis ocular, genital, dan LGV C. trachomatis menunjukkan pengelompokan isolat LGV dan ocular, yang terpisah dari kelompok yang dibentuk oleh isolat urogenital. LGV dan strain ocular dapat dibedakan berdasarkan jumlah pengulangan kaya tirosin (hingga sembilan pada strain LGV sementara hanya satu pada strain ocular) dan jumlah domain pengikat aktin (dua pada strain LGV sementara hingga empat pada strain ocular) untuk Tarp. Hal ini menunjukkan bahwa, selain Pmps C. trachomatis yang disebutkan sebelumnya, Tarp juga dapat berperan dalam adaptasi C. trachomatis terhadap ceruk tertentu dalam inang (Lutter et al., 2010).

 

Namun demikian, meskipun gen-gen yang mengkode Pmps dan Tarp, di antara lainnya, telah terbukti mengelompokkan serovar C. trachomatis berdasarkan tropisme jaringan, klasifikasi serovar C. trachomatis tidak didasarkan pada Tarp atau Pmps tetapi pada MOMP. MOMP adalah antigen permukaan imunodominan yang berfungsi sebagai porin pada RBs (Bavoil et al., 1984) dan sebagai adhesin potensial pada EBs (Su et al., 1990; Su dan Caldwell, 1991). Namun, kategori filogenetik MOMP tidak sesuai dengan patobiotipe atau tropisme jaringan C. trachomatis (Stothard et al., 1998; Millman et al., 2006). Oleh karena itu, menganalisis variasi genetik lain di antara strain C. trachomatis, selain yang ada pada gen yang mengkode MOMP, dapat memungkinkan identifikasi faktor baru yang memungkinkan tropisme jaringan spesifik atau tingkat keparahan penyakit. Namun, karena perbandingan genom lengkap antara isolat okulotropik dan isolat genitotropik menunjukkan identitas 99,6% (Carlson et al., 2005), jelas bahwa perbedaan genetik inang juga akan memengaruhi hasil penyakit akibat Chlamydia (Abdelsamed et al., 2013).

 

Transportasi Intracellular ke MTOC

 

Setelah masuk ke dalam sel, badan elementer (Elementary Bodies - EB) langsung disekap dalam inklusi. Proses remodeling membran inklusi dengan penyisipan protein bakteri dengan cepat memisahkannya dari jalur endosomal, sehingga menghindari fusi dengan lisosom (Scidmore et al., 1996; Scidmore et al., 2003). Membran yang telah mengalami remodeling ini kemudian mempromosikan migrasi inklusi sepanjang mikrotubulus menuju MTOC (pusat pengaturan mikrotubulus), yang terletak di dekat wilayah peri-Golgi (Scidmore et al., 1996; Grieshaber et al., 2003). Lokalisasi di MTOC memfasilitasi interaksi dengan kompartemen yang kaya nutrisi (Richards et al., 2013). Transportasi ini bergantung pada protein dynein tetapi tidak bergantung pada p50 dynamitin. Namun, pernyataan bahwa transportasi ini independen dari dynactin tidak sepenuhnya benar karena beberapa komponen kompleks dynactin tetap direkrut (Hackstadt, 2012; Kokes dan Valdivia, 2012). Sebagai contoh, Sherry et al. (2018) menunjukkan bahwa dynactin berinteraksi dengan C. trachomatis Inc CT192 selama infeksi dan direkrut ke membran inklusi secara bergantung pada CT192. Biasanya, p50 dynamitin menghubungkan kargo dengan mikrotubulus. Oleh karena itu, disarankan bahwa protein efektor chlamydia dalam membran inklusi meniru aktivitas pengikatan kargo untuk menautkan inklusi dengan dynein dan/atau sentrosom (Grieshaber et al., 2003).

 

Infeksi C. trachomatis terbukti meningkatkan aktivasi kinases keluarga Src (SFK), yang diperlukan untuk transportasi inklusi yang bergantung pada mikrotubulus ke MTOC dan untuk pertumbuhan intraseluler. Migrasi ke MTOC tidak terjadi pada C. caviae dan C. muridarum, yang tidak merekrut SFK. Lebih lanjut, peningkatan perkembangan inklusi dan pertumbuhan bakteri saat SFK dihambat menunjukkan bahwa SFKs membatasi pertumbuhan strain non-manusia ini (Mital et al., 2010; Mital dan Hackstadt, 2011a). Incs C. trachomatis (dibahas lebih lanjut pada bagian jalur vesikular) seperti IncB (juga dikenal sebagai CT232), CT101, CT222, dan CT850 berada di mikrodomain kaya kolesterol pada titik kontak sentrosom-inklus dan berkorelasi dengan SFKs aktif (Mital et al., 2010), sehingga kemungkinan Incs ini berpartisipasi dalam transportasi. Sebagai contoh, C. trachomatis CT850 secara langsung mengikat rantai ringan dynein 1 (DYNLT1) untuk memungkinkan transportasi inklusi ke MTOC (Mital et al., 2015). Dalam kasus C. psittaci, IncB telah terbukti berinteraksi dengan Snapin, yang juga mengikat dynein, sehingga menghubungkan inklusi dengan jaringan mikrotubulus (Böcker et al., 2014). Snapin adalah protein inang sitoplasmik dengan peran multivalen dalam transportasi intraseluler (Lu et al., 2009).

 

Stabilisasi Membran Inklusi

 

Membran inklusi sangat rapuh, sehingga baru-baru ini berhasil dimurnikan (Aeberhard et al., 2015). Untuk mempertahankan integritas dan stabilitas strukturalnya, F-aktin dan filamen intermediate membungkus inklusi dalam bentuk kerangka dinamis (Kumar dan Valdivia, 2008; Bastidas et al., 2013). Karena gangguan pada integritas inklusi menyebabkan kebocoran isi inklusi ke sitoplasma inang dan aktivasi kuat ekspresi IL-8, kerangka sitoskeletal pada inklusi dapat membatasi paparan produk bakteri terhadap jalur pengawasan imun bawaan sitoplasmik (Buchholz dan Stephens, 2008; Kumar dan Valdivia, 2008). Perekrutan dan perakitan F-aktin terjadi melalui RhoA GTPase (Kumar dan Valdivia, 2008), septin (Volceanov et al., 2014), sinyal EGFR (Patel et al., 2014), dan CT813 (Kokes et al., 2015).

 

Kumar dan Valdivia mengusulkan model di mana Incs C. trachomatis merekrut RhoA, yang kemudian memicu perakitan F-aktin. F-aktin selanjutnya merekrut dan menstabilkan protein filamen intermediate melalui molekul penghubung, menghasilkan pembentukan kerangka stabil di sekitar inklusi. Fleksibilitas yang diperlukan pada struktur ini di sekitar inklusi yang membesar disediakan oleh CPAF, protease chlamydia yang secara progresif memotong filamen yang sudah dirakit tanpa kehilangan fungsi strukturalnya (Kumar dan Valdivia, 2008). Selain itu, mikrotubulus mengalami reorganisasi di permukaan inklusi untuk menciptakan superstruktur mikrotubulus. Namun, karena superstruktur ini bertanggung jawab atas reorganisasi tumpukan mini Golgi, perekrutan dan perakitan kerangka sitoskeletal ini akan dibahas lebih rinci pada bagian interaksi chlamydia dengan aparatus Golgi.

 

Pelepasan

 

Pengetahuan tentang mekanisme pelepasan chlamydia dari sel inang masih terbatas. Banks et al. (1970) membuktikan pada tahun 1970 bahwa C. trachomatis biovar LGV menyebabkan lisis dan kematian sel inang saat keluar, sedangkan Todd dan Caldwell (1985) menunjukkan bahwa biovar okular dan genital C. trachomatis keluar tanpa menyebabkan kematian sel inang.

 

Pada tahun 2007, dua kelompok peneliti mempublikasikan penelitian tentang pelepasan EBs C. trachomatis dari sel inang (Beatty, 2007; Hybiske dan Stephens, 2007). Keduanya menunjukkan kesimpulan yang saling bertentangan. Beatty melengkapi penelitian Todd dan Caldwell (1985) dengan menjelaskan mekanisme pelepasan, menunjukkan bahwa keluarnya C. trachomatis serovar E dimediasi oleh perluasan inklusi bakteri intraseluler, yang disertai dengan gangguan integritas membran plasma. Fusi eksositik lisosom dengan membran plasma dipromosikan oleh depolimerisasi aktin yang diinduksi kalsium. Selain itu, proses perbaikan yang dimediasi lisosom mendukung persistensi chlamydia dengan mempertahankan bakteri yang tersisa dalam sel inang yang bertahan (Beatty, 2007).

 

GAMBAR 4. Representasi skematis transportasi intraseluler inklusi klamidia menuju MTOC.

Perombakan membran inklusi memungkinkan migrasi inklusi yang bergantung pada dynein sepanjang mikrotubulus. Protein membran inklusi C. trachomatis CT850 dapat berikatan langsung dengan DYNLT1 untuk mempromosikan posisi inklusi di MTOC.

 

Makalah kedua tentang pelepasan klamidia dari sel inang, yang diterbitkan pada tahun 2007, ditulis oleh Hybiske dan Stephens.

Makalah ini membahas dua metode pelepasan yang saling eksklusif, yaitu lisis dan ekstrusi. Pelepasan secara lisis dijelaskan sebagai cara pelepasan yang merusak, yang terjadi melalui proses dua langkah yang terdefinisi secara temporal: pertama, lisis vakuola inklusi yang bergantung pada sistein protease, diikuti oleh perusakan membran plasma sel inang. Proses kedua tampaknya diatur oleh sinyal kalsium intraseluler. Selain itu, Nguyen et al. (2018) mengidentifikasi interaksi antara Inc MrcA dan saluran kalsium inositol-1,4,5-trifosfat reseptor tipe 3 (ITPR3) dan membuktikan melalui studi mutagenesis dan pengurangan siRNA bahwa jalur sinyal Ca²⁺ terlibat dalam pengaturan pelepasan C. trachomatis.

 

Sebaliknya, ekstrusi menggambarkan pelepasan paket inklusi klamidia secara aktin-dependen melalui penonjolan membran. Baik sel asal maupun inklusi residu tetap utuh, sehingga mendukung persistensi infeksi. Dengan demikian, pelepasan kandungan inflamasi dapat dicegah, dan EB terlindungi dari kekebalan sel inang. EB yang dilepaskan akhirnya berada dalam tubuh inklusi ekstraseluler yang dikelilingi oleh sitoskeleton aktin (Chin et al., 2012), membran plasma inang, dan lapisan sitoplasma tipis di antara membran plasma dan membran inklusi.

 

Ekstrusi terbukti bergantung pada polimerisasi aktin, protein sindrom Wiskott-Aldrich neuron, miosin II, dan RhoA. RhoA secara khusus mengatur tahap akhir ekstrusi, yaitu pemisahan tubuh inklusi (Hybiske dan Stephens, 2007). Selain itu, hasil penelitian menunjukkan bahwa kelangsungan hidup C. trachomatis secara signifikan lebih rendah ketika menginfeksi makrofag atau dendritic cells (DC) dibandingkan dengan sel epitel (Steele et al., 2004). Namun, kelompok Hybiske membuktikan bahwa makrofag sumsum tulang serta DC menelan ekstrusi, dan kelangsungan hidup klamidia selanjutnya didukung oleh penghalang lipid yang mengelilinginya (Sherrid dan Hybiske, 2017; Zuck et al., 2017). Meski begitu, penelanan ekstrusi memicu apoptosis cepat pada DC dan secara signifikan mengubah peningkatan transkripsi sitokin DC yang relevan secara biologis (Sherrid dan Hybiske, 2017).

 

Hybiske dan Stephens juga menyatakan bahwa kedua proses, ekstrusi dan lisis, lazim terjadi pada biovar genital maupun LGV C. trachomatis dan terjadi dengan frekuensi hampir setara (Hybiske dan Stephens, 2007), sehingga membantah laporan Banks et al. (1970) dan Todd dan Caldwell (1985).

 

Pengaturan Mekanisme Pelepasan

 

Penelitian terbaru oleh Lutter et al. (2013) memberikan wawasan pertama tentang pengaturan mekanisme pelepasan pada C. trachomatis. Kelompok ini menemukan rekrutmen MYPT1, subunit fosfatase miosin, ke periferi inklusi melalui interaksi dengan protein membran inklusi CT228, yang tampaknya merupakan pemain sentral dalam regulasi pelepasan. Fosforilasi MLC2 (rantai ringan miosin II) yang dimediasi MYPT1 mendukung ekstrusi, sedangkan pengurangan atau defosforilasi MLC2 mendukung lisis (Lutter et al., 2013).

 

Stabilitas Membran Inklusi

 

Stabilitas membran inklusi bergantung pada keberadaan kerangka aktin yang mengelilinginya. Oleh karena itu, untuk keluar dari sel inang melalui lisis, klamidia harus mampu membongkar kerangka ini. Kelompok Yang et al. (2015) menunjukkan bahwa plasmid kriptik klamidia mengontrol lisis. Mereka juga menunjukkan bahwa protein gen plasmid 4 (Pgp4), pengatur transkripsi dari beberapa gen kromosom, sangat penting untuk depolimerisasi aktin sebelum keluar dari sel, dan pelepasan yang bergantung pada Pgp4 bergantung pada T3SS klamidia (Yang et al., 2015). Selain itu, protease klamidia CPAF yang sebelumnya dibahas, yang memotong filamen intermediate, diyakini juga terlibat dalam pelepasan klamidia, meskipun tidak terlibat dalam depolimerisasi aktin (Snavely et al., 2014).

 

PERAN PROTEIN TERKAIT MEMBRAN INKLUSI DALAM MEMENUHI KEBUTUHAN METABOLISME KLAMIDIA

 

Protein Transport Membran Inklusi

 

Inklusi memberikan perlindungan bagi bakteri dengan melindunginya dari sel inang, tetapi di sisi lain, membran inklusi juga mewakili penghalang metabolit (Heinzen dan Hackstadt, 1997). Membran ini memiliki pH netral dan permeabel terhadap ion (Grieshaber et al., 2002), tetapi tidak permeabel terhadap senyawa yang lebih besar dari 520 Da (Heinzen dan Hackstadt, 1997). Untuk memungkinkan pengambilan metabolit melalui transporter nutrisi klamidia yang tertanam di dinding sel patogen, metabolit yang diperlukan harus tersedia di lumen inklusi.

 

Lipida eukariotik diperoleh melalui jalur vesikuler dan non-vesikuler (seperti yang dibahas secara rinci dalam ulasan ini). Pada proses pertama, juga nutrisi yang larut yang terdapat dalam vesikel yang berasal dari inang dapat diberikan kepada bakteri melalui fusi vesikel dengan membran inklusi. Namun, komposisi dari larutan yang terdapat di lumen banyak vesikel intraseluler masih belum diketahui, dan karena itu kemampuan metabolit tersebut untuk memenuhi kebutuhan chlamydiae masih bisa diperdebatkan (Haferkamp, 2017). Di sisi lain, membran inklusi mungkin juga mengandung protein transportasi, yang memediasi perpindahan larutan spesifik. Hipotesis ini didukung oleh analisis proteomik dari membran inklusi, yang mengungkapkan adanya beberapa protein inang, termasuk protein membran dari retikulum endoplasma (ER), aparatus Golgi, dan membran plasma (Saka et al., 2011; Aeberhard et al., 2015; Herweg et al., 2015, 2016). Berikut ini beberapa contoh transporter membran inklusi yang disertai dengan transporter nutrisi tubuh chlamydial yang bersangkutan.

 

Biotin adalah vitamin yang berfungsi sebagai kofaktor bagi beberapa enzim karboksilase. Meskipun beberapa spesies Chlamydia memiliki repertoar enzimatik untuk sintesis de novo (misalnya, C. pneumoniae), yang lainnya tidak dan karena itu bergantung pada perampasan biotin (misalnya, C. trachomatis) atau bisa melakukan keduanya (misalnya, C. psittaci). Pengambilan biotin oleh bakteri dimediasi oleh transporter BioY, dengan syarat biotin ada di lumen inklusi. Pada kasus sel yang terinfeksi C. trachomatis, SMVT inang, transporter biotin, dipindahkan dari membran plasma ke membran inklusi. Menariknya, ekspresi SMVT pada sel inang meningkat dalam kondisi permintaan yang tinggi, misalnya, akibat pengambilan biotin oleh patogen (Fisher et al., 2012).

 

Karena genom C. trachomatis kekurangan sebagian besar jalur biosintesis untuk asam amino (Stephens et al., 1998; Read et al., 2000), patogen ini merampas sebagian besar asam amino dari inang juga (Bader dan Morgan, 1958; Mehlitz et al., 2017). Meskipun demikian, tampaknya C. trachomatis mensintesis sebagian kecil alanin, asparat, dan glutamat de novo (Mehlitz et al., 2017). Terutama penggunaan molekul yang berasal dari inang dalam menyediakan tryptophan untuk chlamydiae tampaknya sangat penting. Beberapa spesies membutuhkan prekursor turunan inang, yaitu kinurenin, untuk sintesis tryptophan karena mereka hanya memiliki sebagian jalur biosintesis (misalnya, C. caviae, C. felis, dan C. pecorum), sementara yang lain membutuhkan tryptophan yang berasal dari inang itu sendiri karena mereka kekurangan jalur biosintesis yang lengkap (misalnya, C. abortus, C. pneumoniae, dan C. psittaci) (Xie et al., 2002). Ketergantungan Chlamydia terhadap tryptophan ini dimanfaatkan oleh respons imun inang dengan menggunakan kelaparan tryptophan, sebuah proses yang dikendalikan oleh IFNγ, dalam upaya untuk membersihkan chlamydiae. Namun, kelaparan tryptophan dapat membunuh Chlamydia yang auxotrofik terhadap tryptophan (Byrne dan Beatty, 2012) atau mengubah transkripsi gen dan metabolisme mereka, sehingga mengubah mereka menjadi keadaan persisten (Beatty et al., 1993, 1994). Selain itu, serovar genital C. trachomatis mempertahankan jalur relik, menggunakan indol untuk sintesis tryptophan, sebuah sifat yang hilang pada serovar okular. Menariknya, dalam kasus ini, indol bukanlah produk dari sel inang manusia melainkan dari mikrobiota penghasil indol yang dapat hidup berdampingan di saluran genital pada kasus vaginosis bakterial (Ziklo et al., 2016). Oleh karena itu, tropisme spesies juga terkait dengan kemampuan untuk merampas indol dari komunitas mikroba yang ada (Fehlner-Gardiner et al., 2002). Analisis genom menunjukkan bahwa C. trachomatis memiliki setidaknya satu pembawa untuk pengambilan tryptophan (Bonner et al., 2014). Tryptophan pertama kali dipindahkan dari sitosol inang ke lumen inklusi melalui dua komponen sistem pengambilan asam amino manusia: SLC7A5 dan SLC3A2 (Aeberhard et al., 2015). Komponen-komponen ini dapat membentuk heterodimer melalui interaksi kovalen, yang kemudian berfungsi sebagai antiporter asam amino yang lebih memilih asam amino besar (Wagner et al., 2001). Ini termasuk tryptophan tetapi juga fenilalanin, tirosin, dan histidin. Meskipun demikian, transportasi asam amino yang lebih kecil seperti metionin, valin, atau leusin juga dimungkinkan (Kanai et al., 1998; Yanagida et al., 2001).

 

Glikogen adalah polisakarida glukosa bercabang banyak yang merupakan senyawa penyimpanan energi penting bagi hewan, manusia, dan bakteri. RB C. trachomatis menyimpan glikogen di lumen inklusi (Gordon dan Quan, 1965) dan kemudian, selama transisi RBEB, memanfaatkan pasokan ini untuk membangun stok glikogen intra-bakteri. Dalam skenario tersebut, glikogen luminal terdegradasi menjadi glukosa-1-fosfat dan kemudian diubah menjadi glukosa-6-fosfat. Chlamydia bergantung pada impor gula terfosforilasi karena mereka kekurangan enzim heksokinase, yaitu enzim yang memfosforilasi glukosa (Gehre et al., 2016). Transporter glukosa-6-fosfat yang masuk ke dalam C. trachomatis dan C. pneumoniae masih diusulkan (Schwöppe et al., 2002). Sebagian kecil glikogen yang ada di lumen inklusi diperoleh melalui translokasi massal melalui jalur vesikuler. Namun, mayoritas glikogen di lumen inklusi disintesis de novo dengan menggunakan dua enzim bakteri yang disekresikan: glikogen sintase bakteri GlgA dan enzim percabangan GlgB. Prekursor yang dibutuhkan, UDP-glukosa yang berasal dari inang, memasuki inklusi melalui pembawa solut SLC35D2, yang tertanam di membran inklusi (Gehre et al., 2016). Selain itu, Chlamydia terbukti menginduksi heksokinase II inang, sebuah enzim yang diketahui memainkan peran penting dalam mengatur masuknya glukosa ke dalam sel dengan mengkatalisis langkah pertama dalam metabolisme glukosa (Al-Zeer et al., 2017).

 

Kelompok Wang et al. (2017) menunjukkan bahwa Chlamydia memanfaatkan protein transporter glukosa yang berasal dari inang, yaitu GLUT1 dan GLUT3, untuk memenuhi kebutuhan sumber karbonnya dengan mengubah ekspresi, perputaran, dan lokalisasi mereka. Penurunan ekspresi protein-protein ini, menggunakan siRNA, jelas memengaruhi perkembangan chlamydial. Peningkatan ekspresi GLUT1 dan GLUT3 selama infeksi chlamydial terbukti bergantung pada sintesis protein bakteri dan aktivasi kinase MAPK yang diinduksi oleh Chlamydia. Selain itu, GLUT1, tetapi bukan GLUT3, terbukti berada dalam kedekatan dengan membran inklusi sepanjang siklus hidup chlamydia dan kedekatan ini bergantung pada jalur yang sensitif terhadap brefeldin A. Akhirnya, stabilisasi GLUT1 melalui penghambatan ubiquitinasi yang bergantung pada inang oleh protein efektor deubiquitinase chlamydial CT868 dijelaskan (Wang et al., 2017).

 

Antiporter Npt1 ada di dinding sel chlamydia dan mengkatalisis pengambilan ATP yang berasal dari inang dengan menukar ADP bakteri dan fosfat (Tjaden et al., 1999; Trentmann et al., 2008). Ini menunjukkan bahwa keberadaan ATP di lumen inklusi diperlukan dan bahwa ADP serta fosfat harus dihilangkan. Ini wajib dilakukan karena molekul-molekul tersebut dapat mengalahkan ATP dalam pengikatan Npt1. Pengiriman ATP bisa dilakukan melalui fusi vesikel, namun, seperti yang disebutkan sebelumnya, apakah vesikel menyediakan solut ke inklusi masih belum diketahui. Selain itu, kebutuhan untuk menghilangkan ADP dan fosfat mengarah pada translokasi nukleotida yang dimediasi oleh pembawa. Oleh karena itu, diasumsikan bahwa transporter nukleotida adenin dari inang yang berasal dari retikulum endoplasma (ER) dan/atau Golgi disisipkan ke dalam membran inklusi, meskipun kandidat yang mungkin masih belum diketahui. Namun, secara mencolok, tampaknya membran inklusi juga mengandung Npt1 (Saka et al., 2011).

 

Interaksi antara Inklusi dan Mitokondria

 

Mitokondria ditemukan berasosiasi dekat dengan inklusi C. psittaci dan C. caviae, tetapi asosiasi ini tidak terlihat pada sel yang terinfeksi C. trachomatis dan C. pneumoniae (Matsumoto et al., 1991; Vanrompay et al., 1996). Kompleks translokase membran dalam–kompleks translokase membran luar (TIMTOM), yang terbukti terlibat dalam pengenalan dan transportasi protein mitokondria inang ke dalam mitokondria, sangat penting untuk biogenesis inklusi C. caviae dan C. trachomatis serta produksi keturunan infeksius. Kehilangan kompleks ini mengganggu infeksi klamidia mereka (Kokes dan Valdivia, 2012; Gurumurthy et al., 2014). Signifikansi fungsional dari asosiasi ini mungkin terkait dengan perampasan metabolit energi. Meskipun klamidia memiliki kapasitas untuk menghasilkan ATP, gen-gen yang dibutuhkan hanya ditranskripsi mulai dari 6 jam pasca infeksi. Oleh karena itu, energi yang dibutuhkan untuk diferensiasi awal dari EB (elemen badan) menjadi RB (retikulat badan) mungkin berasal baik dari cadangan ATP klamidia maupun dari inang (Iliffe-Lee dan McClarty, 1999). Hipotesis ini didukung oleh fakta bahwa klamidia mengandung transporter-mimik ATP Npt1 dan Npt2 pada EB, RB, dan membran inklusinya, seperti yang disebutkan sebelumnya (Tjaden et al., 1999; Saka et al., 2011). Namun, pencegahan apoptosis juga disarankan sebagai alasan mengapa inklusi berasosiasi dengan mitokondria. Pelepasan sitokrom c mitokondria ke dalam sitoplasma sangat penting untuk induksi apoptosis (Yang, 1997). Dengan demikian, salah satu efek yang diamati dari efek klamidia adalah pencegahan pelepasan sitokrom c mitokondria ke dalam sitoplasma inang (Fan et al., 1998). Pencegahan apoptosis sel inang sangat menarik bagi patogen intraseluler obligat untuk menyelesaikan siklus hidupnya. Strategi anti-apoptotik klamidia yang baru-baru ini ditemukan lainnya melibatkan ekspresi yang diinduksi dan peningkatan stabilitas protein anti-apoptotik inang seperti Mcl-1 (Rajalingam et al., 2008; Sarkar et al., 2015) dan inhibitor protein apoptosis (IAP) (Prakash et al., 2009), serta peningkatan regulasi beberapa anggota kelompok miRNA yang beragam, yang disebut apoptomir. MiRNA ini menargetkan beberapa protein pro- dan anti-apoptotik dan dengan demikian memengaruhi jalur sinyal apoptosis. Chowdhury et al. (2017) mengamati bahwa C. trachomatis secara signifikan meningkatkan miR-30c-5p, yang menargetkan protein penekan tumor p53. Kehilangan p53 selanjutnya menarik untuk klamidia karena aktivasi p53 menekan jalur pentosa fosfat, yang sangat penting untuk pertumbuhan klamidia (Chowdhury et al., 2017). Selain itu, miR-30c-5p juga menurunkan regulasi pengatur pemisahan mitokondria utama, Drp1, dan oleh karena itu menghambat pemisahan mitokondria, baik karena rangsangan pro-fragmentasi intrinsik maupun ekstrinsik, serta degradasi fragmen yang dihasilkan. Pelestarian arsitektur mitokondria ini menguntungkan bagi klamidia karena mitokondria merupakan sumber ATP yang sangat penting (Chowdhury et al., 2017).

 

Interaksi antara Inklusi dan Lisosom

 

Meskipun klamidia memodifikasi membran inklusi untuk mencegah fusi dengan jalur endolisosom, lisosom tetap berada dalam kedekatan dengan membran inklusi. Oleh karena itu, Ouellette et al. (2011) menghipotesiskan kemungkinan bahwa Chlamydia merampas asam amino dan/atau oligopeptida lisosomal. Hipotesis ini dibuktikan dengan pelabelan klamidia yang tumbuh di dalam sel yang diberi protein berlabel sebagai sumber nutrisi eksogen (Ouellette et al., 2011). Selain itu, perlakuan dengan Bafilomycin A1 (BafA1), inhibitor vacuolar H+/ATPase yang menghambat asidifikasi lisosom, mengganggu pertumbuhan C. trachomatis dan C. pneumoniae, dengan efek yang lebih mendalam pada yang terakhir. Penghambatan pertumbuhan ini lebih lanjut dibuktikan bukan disebabkan oleh perubahan dalam asidifikasi lisosom itu sendiri, karena inhibitor katepsin juga menghambat pertumbuhan. Akhirnya, Ouellette et al. (2011) menunjukkan bahwa EB mengandung transporter asam amino dan oligopeptida, sedangkan setelah diferensiasi awal, RB lebih banyak menggunakan transporter oligopeptidanya untuk memperoleh oligopeptida dari lisosom. Namun, di kemudian hari dalam siklus infeksi, C. trachomatis menggunakan transporter asam amino untuk merampas asam amino bebas sitosolik, sementara C. pneumoniae terus bergantung pada oligopeptida yang berasal dari lisosom (Ouellette et al., 2011).

 

Jalur Vesikuler dan Non-Vesikuler

 

Selain menggunakan transporter nutrisi yang terbenam dalam membrannya, inklusi secara selektif berinteraksi dengan organel di niche peri-Golgi untuk menyekresikan faktor-faktor esensial bagi perkembangan klamidia. Meskipun klamidia mampu menghasilkan lipid bakteri umum, sangat penting bagi perkembangan dan kelangsungan hidup mereka bahwa lipid eukariotik juga ada dalam membran mereka. Sphingolipid (Hackstadt et al., 1996), kolesterol (Carabeo et al., 2003), dan gliserofosfolipid (Wylie et al., 1997) sangat penting untuk beberapa proses termasuk tetapi tidak terbatas pada replikasi klamidia, pertumbuhan, reaktivasi dari ketahanan, dan diferensiasi ulang dari RB ke EB. Karena klamidia kekurangan enzim biosintetik yang diperlukan, interaksi yang canggih dengan berbagai jalur inang dilakukan untuk memperoleh lipid eukariotik tersebut, yang melibatkan jalur vesikuler dan non-vesikuler (Gambar 5). Namun, Gilk et al. (2013) mengamati bahwa prekursor kolesterol mungkin cukup untuk memungkinkan infeksi C. trachomatis karena pertumbuhan C. trachomatis dan pembentukan inklusi tidak terpengaruh pada fibroblas embrionik tikus yang bebas kolesterol (Gilk et al., 2013).

 

Jalur Vesikular

 

Perangkat Golgi

Perangkat Golgi terfragmentasi menjadi tumpukan mini selama tahap pertengahan siklus infeksi C. trachomatis. Fragmen-fragmen ini mengelilingi inklusi untuk meningkatkan efisiensi pengiriman lipid eukariotik. Selain itu, peningkatan buatan terhadap pembentukan tumpukan mini dengan pengurangan Golgin-84 terbukti meningkatkan produksi keturunan infeksius (Heuer et al., 2009). Namun, fragmentasi tidaklah penting untuk pertumbuhan C. trachomatis dan untuk pengambilan lipid (Gurumurthy et al., 2014). Aktivitas deubiquitinase dari efektor chlamydial ChlaDUB1 baru-baru ini terbukti terkait dengan fragmentasi perangkat Golgi inang (Pruneda et al., 2018). Sekitar 12 jam pasca infeksi, sebuah "kerangkeng" dari mikrotubulus yang dimodifikasi pasca-translasi mengelilingi inklusi dan mengontrol penempatan tumpukan mini perangkat Golgi di sekitarnya (Al-Zeer et al., 2014). Modifikasi pasca-translasi ini mempengaruhi struktur mikrotubulus dan laju depolimerisasi, khususnya termasuk tubulin yang asetilasi dan detirosinasi (Peris et al., 2009). Wesolowski et al. (2017) menunjukkan bahwa Inc CT813 mengontrol modifikasi pasca-translasi dan penempatan tumpukan mini di sekitar inklusi melalui perekrutan dan aktivasi Arf GTPase inang, Arf1 dan Arf4. Menariknya, karena Arf GTPase diaktifkan oleh Arf GEF melalui pertukaran nukleotida, tetapi CT813 tidak menunjukkan aktivitas GEF, diyakini bahwa CT813 merekrut atau memanfaatkan GEF seluler atau senyawa tak teridentifikasi lain yang memungkinkan CT813 berfungsi sebagai GEF. Hipotesis terakhir ini adalah yang paling masuk akal karena CT813 bertindak sebagai GEF dengan berinteraksi dengan Arf-GDP serta Arf-GTP dan, lebih lanjut, bersaing dengan GEF seluler dalam vitro (Mueller dan Goody, 2016). Selain itu, Al-Zeer et al. (2014) menyarankan bahwa aktivitas RhoA dan ROCK (Rho-associated protein kinase) penting untuk perekrutan dan/atau perakitan mikrotubulus yang stabil di membran inklusi. Akhirnya, data dari kelompok Dumoux et al. (2015) secara mekanistik melengkapi dan memperluas model ini, karena mereka mengidentifikasi efektor C. trachomatis IPAM sebagai inisiator organisasi mikrotubulus di sekitar inklusi melalui perekrutan CEP170. Seperti yang disebutkan sebelumnya, selain kerangkeng mikrotubulus, inklusi chlamydia juga dikelilingi oleh jaringan aktin, yang memastikan integritas inklusi (Kumar dan Valdivia, 2008). Menariknya, karena CT813 terbukti juga terlibat dalam pembentukan rangka aktin ini (Kokes et al., 2015), CT813 disarankan sebagai pengatur utama sitoskeleton (Wesolowski et al., 2017).

 

Sphingomyelin dan kolesterol diperoleh melalui intersepsi vesikel eksositosis dari tumpukan mini Golgi yang terfragmentasi, yang ditujukan untuk membran plasma (Hackstadt et al., 1996; Carabeo et al., 2003) dan melalui tubuh multivesikular (lihat ‘Translokasi ke dalam inklusi’) (Beatty, 2006, 2008; Kesley Robertson et al., 2009). Dalam strategi akuisisi pertama ini, protein inang seperti Rab GTPase (khususnya, Rab6, Rab11, dan Rab14 dalam kasus C. trachomatis) (Lipinski et al., 2009; Capmany et al., 2011), SNARE protein (Kabeiseman et al., 2013), Arf GTPase (Moorhead et al., 2010; Reiling et al., 2013), faktor pertukaran nukleotida guanin Arf GBF1 (Elwell et al., 2011), dinamin (Gurumurthy et al., 2014), dan FYN kinase (Mital et al., 2010; Mital dan Hackstadt, 2011a,b) terlibat.

 

Rab GTPase. Beberapa Rab GTPase terkait dengan endosom dan Golgi, yang merupakan pengatur utama lalu lintas intraseluler, fusi membran, dan identitas organel (Seabra dan Wasmeier, 2004; Hutagalung dan Novick, 2011), berasosiasi dengan membran inklusi. Protein Rab diamati berasosiasi dengan membran inklusi baik secara tergantung spesies maupun tidak tergantung spesies, tergantung pada protein tersebut. Sebagai contoh, Rab1, 4, dan 11 direkrut ke membran inklusi C. trachomatis, C. muridarum, dan C. pneumoniae. Sebaliknya, Rab6 direkrut ke membran inklusi C. trachomatis tetapi tidak ke membran C. pneumoniae atau C. muridarum, sementara yang sebaliknya berlaku untuk Rab10 (Rzomp et al., 2003; Brumell dan Scidmore, 2007).

 

Rab GTPase berfungsi dalam berbagai jalur, dan perekrutan berbagai Rab disarankan untuk mempromosikan interaksi selektif dan/atau fusi dengan beberapa vesikel inang yang mengandung nutrisi penting (Bastidas et al., 2013). Chlamydia membajak Rab terkait Golgi (seperti Rab6, 11, dan 14) untuk menangkap vesikel eksositosis yang diperkaya dalam lipid inang yang disintesis secara endogen (Rzomp et al., 2003). Rab6 dan 11 memediasi fragmentasi Golgi menjadi tumpukan mini (Heuer et al., 2009; Lipinski et al., 2009) sementara Rab14 memediasi pengiriman sphingomyelin yang berasal dari Golgi ke inklusi (Capmany dan Damiani, 2010; Damiani et al., 2014). Di sisi lain, Rab GTPase juga mungkin terlibat dalam akuisisi nutrisi selain yang berasal dari perangkat Golgi: Rab4 dan 11 memediasi interaksi dengan jalur daur ulang lambat transferrin untuk memperoleh zat besi. Meskipun pemadaman Rab4 tidak menunjukkan efek pada patogen, pengurangan simultan Rab4 dan Rab11 mengganggu pertumbuhan chlamydia (Ouellette dan Carabeo, 2010).

 

Gambar 5. Representasi skematik jalur vesikuler dan non-vesikuler yang digunakan oleh C. trachomatis.

Inklusi berinteraksi secara selektif dengan organel di wilayah peri-Golgi melalui jalur vesikuler dan non-vesikuler untuk mengumpulkan lipid eukariotik yang diperlukan untuk perkembangan dan kelangsungan hidup chlamydia. Lipid-lipid ini meliputi sphingolipid, kolesterol, dan gliserofosfolipid. Perampokan lipid yang berasal dari aparatus Golgi difasilitasi oleh posisi mini-tumpukan di sekitar inklusi. Sphingomielin dan kolesterol diperoleh melalui intersepsi vesikula eksositosis yang terfragmentasi dari mini-tumpukan ini. Penangkapan vesikula dilakukan dengan merampok Rab yang terkait dengan Golgi (seperti Rab6, 11, dan 14), yang mempromosikan interaksi selektif dan/atau fusi antara beberapa vesikula inang. Rab4 dan 11 juga memediasi interaksi dengan jalur daur ulang lambat transferrin untuk memperoleh besi. Perekrutan Rab ini dilakukan oleh protein chlamydia Inc, misalnya, CT229 merekrut Rab4. Rab11 pada gilirannya merekrut Rab11FIP2 dan bersama-sama mereka merekrut Rab14. Selain pengangkutan, Rab juga mempromosikan fusi vesikula dengan merekrut kinase lipid seperti inositol polifosfat 5-fosfatase OCRL1, sebuah enzim yang terlokalisasi di Golgi, dan PI4KIIα. Keduanya menghasilkan lipid spesifik Golgi PI4P dan peningkatan lipid ini dianggap sebagai strategi untuk menyamarkan inklusi sebagai kompartemen khusus dari aparatus Golgi. Selain itu, chlamydia berinteraksi dengan trans-Golgi STX6 dan STX10, VAMP4, dan GS15. Ini juga mengatur perolehan nutrisi dari jalur eksositosis Golgi. Lebih lanjut, GBF1, regulator pengangkutan vesikuler tergantung Arf1 dalam jalur sekresi awal, digunakan. Akhirnya, pertumbuhan C. trachomatis bergantung pada interaksi dengan DYN1, sebuah GTPase besar yang menginduksi pemisahan vesikula dari, antara lain, aparatus Golgi. Apakah atau tidak FYN kinase mengatur pengangkutan vesikuler saat ini masih belum diketahui. Namun, ada hipotesis bahwa FYN memediasi penghubungan inklusi dengan jaringan mikrotubulus, dengan demikian berinteraksi dengan vesikula yang mengandung sphingomielin yang bergerak sepanjang mikrotubulus. LDs, peroksisom, dan MVBs juga merupakan sumber lipid eukariotik yang berguna dan dipindahkan sepenuhnya ke dalam inklusi. LDs adalah organel penyimpanan yang berasal dari RE untuk lipid netral atau asam lemak rantai panjang. Lda3 dipindahkan ke sitosol inang setelah itu menghubungkan LD sitoplasmik dengan membran inklusi. Selanjutnya, disarankan bahwa IncA mungkin menandai situs masuk untuk LDs pada membran inklusi. Mekanisme pengambilan peroksisom dan MVB masih belum jelas, meskipun Rab39 terbukti berpartisipasi dalam pengiriman MVB ke inklusi. Sphingomielin yang berasal dari RE, di sisi lain, diperoleh melalui jalur non-vesikuler. Keberadaan MCS RE-inklusi telah ditunjukkan, di mana CERT, protein RESIDEN RE VAPB, SMS2, dan sensor kalsium RE STIM1 terkumpul. CERT terbukti direkrut ke MCS ini melalui interaksi langsung dengan IncD, yang pada gilirannya menyebabkan pengikatan CERT dengan VAPB. Dipercaya bahwa CERT dan VAPB berpartisipasi dalam pengangkutan non-vesikuler ceramide, prekursor sphingomielin, dari RE ke inklusi, setelah itu ceramide lebih lanjut diubah menjadi sphingomielin oleh SMS2. Peran STIM1 masih belum terjawab. Selain CERT, IncV juga dapat berinteraksi dengan VAPs, mungkin membantu dalam pengikatan RE-inklusi. Jalur non-vesikuler lainnya melibatkan pengambilalihan sistem transport lipid inang yang terlibat dalam pembentukan HDL. HDL terbentuk ketika kolesterol dan fosfolipid dipindahkan ke ApoA-1 ekstraseluler oleh protein pengikat lipid ABCA1, ABCG1, dan CLA1. ABCA1, CLA1, dan ApoA-1 terbukti terlokalisasi pada membran inklusi. Terakhir, PI dan PC diperoleh melalui jalur non-vesikuler lainnya, yang dimediasi oleh ERK.

 

Incs Chlamydia kemungkinan merekrut Rabs yang berasal dari inang melalui interaksi spesifik spesies (Rzomp et al., 2003). Sebagai contoh, Inc Cpn0585 dari C. pneumoniae berinteraksi dengan Rab1, 10, dan 11 (Cortes et al., 2007). Rab11, pada gilirannya, merekrut efektor Rab11, yaitu Rab11 family interacting protein 2 (Rab11FIP2), dan bersama-sama mereka mempromosikan perekrutan Rab14 (Leiva et al., 2013). Karena belum jelas bagi C. trachomatis protein Inc mana yang berinteraksi dengan Rab11 dan karena genom mereka tidak mengkodekan protein yang homolog dengan Cpn0585, kemungkinan pasangan pengikat dapat terdeteksi dengan melakukan studi perbandingan urutan terbatas pada wilayah fungsional dari Cpn0585 (Cortes et al., 2007). Inc C. trachomatis CT229 merekrut, antara lain, Rab4 (Rzomp et al., 2006). Selain itu, pentingnya CT229 dalam membentuk dan mempertahankan niche intraseluler C. trachomatis terbukti dengan fakta bahwa ketidakhadirannya memicu lisis inklusi dini dan kematian sel inang (Weber et al., 2017). Baru-baru ini, kelompok Faris et al. (2019) menunjukkan bahwa CT229 merekrut berbagai GTPase Rab dan efektor kognat mereka ke dalam inklusi dan bahwa CT229 mengalihkan dan memintas vesikel yang dilapisi klatrin dari jalur daur ulang, sehingga mengatur lalu lintas transferrin dan reseptor mannosa-6-fosfat.

 

Incs adalah keluarga protein efektor T3S yang diekspresikan pada beberapa titik waktu selama siklus perkembangan (Nicholson et al., 2003), tetapi terutama pada tahap awal infeksi, ketika mereka penting untuk pelarian inklusi dari jalur endolisosom, dan pada siklus pertengahan, ketika mereka sangat diperlukan dalam akuisisi nutrisi yang berasal dari inang (Moore dan Ouellette, 2014). Inc diidentifikasi dengan satu atau lebih domain hidrofobik bilateral N-terminal, yang terdiri dari dua daerah membran yang sangat berdekatan yang dipisahkan oleh loop rambut pendek (Bannantine et al., 2000). Selain itu, bagian amino terminal dan/atau karboksil terminal mereka diprediksi untuk memperpanjang ke dalam sitoplasma sel inang (Rockey et al., 2002; Hackstadt, 2012). Terakhir, sinyal sekresi tipe 3 N-terminal yang memungkinkan sekresi dan penyisipan protein ke dalam membran inklusi juga merupakan penanda (Bauler dan Hackstadt, 2014; Moore dan Ouellette, 2014). Selama studi bioinformatika oleh Lutter et al. (2012), jumlah Inc yang teridentifikasi adalah: 55 di C. trachomatis, 68 di C. felis, 92 di C. pneumoniae, 79 di C. caviae, dan 54 di C. muridarum. Selain itu, homolog Inc dibandingkan di antara lima spesies ini dan satu set inti 23 Inc diidentifikasi sebagai yang dipertukarkan di antara semuanya, yang mungkin mewakili protein yang terlibat dalam interaksi yang dilestarikan antara chlamydia dan inang. Di sisi lain, diversifikasi Inc di antara spesies ini menunjukkan keterlibatan beberapa Inc dalam jalur patogenik yang unik. Selain itu, ekspansi genom Inc teridentifikasi pada C. pneumoniae, C. caviae, dan C. felis tetapi tidak pada C. trachomatis atau C. muridarum. Terakhir, Lutter et al. (2012) menunjukkan bahwa, selain Pmps dan Tarp yang disebutkan sebelumnya, beberapa Inc dari C. trachomatis juga mengelompokkan biovar yang berbeda, sehingga menunjukkan bahwa protein ini juga dapat berkontribusi pada tropisme jaringan. Kelompok Almeida et al. (2012) juga menunjukkan bahwa variasi halus pada asam amino dari subset Inc C. trachomatis dan ekspresinya mungkin berkontribusi pada karakter invasif strain LGV C. trachomatis. 50 gen pengkode Inc mewakili sekitar 6% dari kapasitas pengkode C. trachomatis (Stephens et al., 1998). Mengingat genom chlamydia yang sangat tereduksi, Inc berfungsi sangat penting (Moore dan Ouellette, 2014).

 

Selain lalu lintas, Rabs juga mempromosikan fusi vesikel dengan merekrut lipid kinase seperti inositol polifosfat 5-fosfatase OCRL1 (juga dikenal sebagai protein sindrom Lowe oculocerebrorenal), enzim yang terlokalisasi di Golgi, dan fosfatidilinositol-4-kinase tipe IIα (PI4KIIα). Keduanya menghasilkan lipid spesifik Golgi, fosfatidilinositol-4-fosfat (PI4P). Peningkatan PI4P dianggap sebagai strategi untuk menyamarkan inklusi sebagai kompartemen spesial di aparat Golgi (Moorhead et al., 2010).

 

Protein SNARE. Jalur vesikuler juga mungkin diatur oleh perekrutan protein SNARE yang larut di inang, yang merupakan komponen kunci dari mesin fusi intraseluler (Südhof dan Rothman, 2009). Chlamydia berinteraksi, antara lain, dengan protein SNARE trans-Golgi yaitu syntaxin 6 (STX6) (Moore et al., 2011) dan STX10 (Lucas et al., 2015), vesicle-associated membrane protein 4 (VAMP4) (Kabeiseman et al., 2013) dan GS15 (juga dikenal sebagai BET1L) (Pokrovskaya et al., 2012). Protein-protein ini mengatur akuisisi nutrisi dari jalur eksositosis Golgi. Kelompok Kabeiseman et al. (2013) mengamati bahwa knockdown VAMP4 mencegah lokalisasi STX6 ke inklusi chlamydia, yang 1 tahun kemudian membuktikan bahwa STX6 dipindahkan ke inklusi chlamydia melalui urutan sinyal YGRL-nya, setelah itu berinteraksi dengan VAMP4 dan tetap berada di membran inklusi (Kabeiseman et al., 2014).

 

Menariknya, chlamydiae juga menggunakan motif SNARE untuk menghambat fusi vesikel melalui mimikri molekuler oleh Incs. Setidaknya ada tiga Inc yang mengandung motif mirip SNARE, memungkinkan mereka bertindak seperti protein SNARE dan membatasi fusi dengan kompartemen yang mengandung VAMP3, VAMP7, atau VAMP8, ketiga SNARE yang terlibat dalam transportasi endosomal (Delevoye et al., 2008; Kokes dan Valdivia, 2012; Ronzone dan Paumet, 2013). Incs ini termasuk IncA (juga dikenal sebagai CT119), InaC (juga dikenal sebagai CT813), dan sebuah Inc yang bekerja pada mikrotubulus (IPAM atau CT223) (Delevoye et al., 2008). IncA diekspos pada sisi sitosolik membran inklusi C. trachomatis (Hackstadt et al., 1999) dan menampilkan dua domain koil-koil, yang menunjukkan homologi tinggi dengan protein SNARE. IncA menghambat fusi membran yang dimediasi oleh SNARE endositik inang untuk SNARE target yang terletak pada membran yang sama dengan IncA (Paumet et al., 2009; Ronzone dan Paumet, 2013). Namun, IncA juga terlibat dalam induksi fusi homotipik inklusi (Hackstadt et al., 1999; Suchland et al., 2000). Pada sel inang yang terinfeksi secara ganda dengan C. trachomatis, inklusi-inklusi tersebut akan bergabung membentuk satu vakuola besar (Blyth dan Taverne, 1972; Ridderhof dan Barnes, 1989). Karena ketidakhadiran IncA berkorelasi dengan pembentukan badan inklusi multilobed yang tidak dapat fusi, fusi vesikel homotipik dari inklusi bergantung pada IncA (Suchland et al., 2000; Pannekoek et al., 2005). Selain itu, strain-strain negatif IncA telah dipelajari oleh kelompok Geisler et al. (2001) yang menunjukkan bahwa isolat klinis non-fusogenik menyebabkan tanda klinis infeksi yang lebih ringan dengan pemulihan Chlamydia yang rendah. Mekanisme bagaimana IncA mengatur keseimbangan yang sangat halus antara menghalangi fusi membran lisosom dan mempromosikan fusi homotipik inklusi tetap tidak jelas. Namun, Ronzone dan Paumet membuktikan bahwa meskipun kedua domain koil-koil dari IncA masing-masing mampu menghambat fusi yang dimediasi oleh SNARE, kerja sama antara kedua domain koil-koil ini sangat penting dalam memediasi multimerisasi IncA dan fusi membran homotipik.

 

Arf GTPases dan GBF1. Pembajakan sphingomielin inang dari Golgi adalah jalur transportasi vesikel yang sensitif terhadap Brefeldin A (BFA) (Hackstadt et al., 1996; Elwell et al., 2011). Elwell et al. (2011) menunjukkan bahwa C. trachomatis secara selektif memilih hanya satu dari tiga target BFA yang diketahui: GBF1, regulator dari jalur transportasi vesikel bergantung pada Arf1 dalam jalur sekretori awal. Jalur akuisisi sphingomielin yang bergantung pada Arf1/GBF1 terbukti sangat penting untuk pertumbuhan membran inklusi, namun tidak diperlukan untuk amplifikasi bakteri (Elwell et al., 2011).

 

Dynamin. Dynamin adalah GTPase besar yang menginduksi pemisahan vesikel dari, antara lain, aparatus Golgi dan yang diperlukan untuk pembentukan vesikel yang dilapisi klatrin dan tidak dilapisi klatrin dari jaringan trans-Golgi. Ternyata dynamin diperlukan untuk pertumbuhan C. trachomatis karena ia sangat penting untuk fusi homotipik dari inklusi C. trachomatis. Selain itu, penekanan aktivitas dynamin mengarah pada gangguan transportasi lipid ke dalam inklusi C. trachomatis dan akuisisi lipid yang dimediasi oleh dynamin terbukti tidak terkait dengan fragmentasi Golgi. Terakhir, aktivitas dynamin terbukti diperlukan untuk re-diferensiasi normal dari RBs ke EBs (Gurumurthy et al., 2014).

 

FYN kinase. Mital dan Hackstadt mengidentifikasi protein inang FYN kinase, bagian dari SFKs, sebagai regulator akuisisi sphingomielin pada C. trachomatis karena pengurangan FYN kinase mengurangi retensi sphingolipid pada inklusi dan EBs. Namun, karena progensi infeksius masih diproduksi meskipun ada pengurangan ini, jalur FYN kinase diasumsikan bersifat redundan dengan jalur transportasi lipid lainnya (Mital dan Hackstadt, 2011b). Selain itu, seperti yang disebutkan sebelumnya, Mital et al. (2010) menunjukkan bahwa untuk C. trachomatis, empat Inc (IncB, Inc101, Inc222, dan Inc850) berkolokasi dengan FYN aktif dan Src kinase aktif lainnya pada mikrodomain kaya kolesterol di titik kontak sentrosom–inklusi, yang membuat kemungkinan bahwa Incs ini berperan dalam transportasi inklusi sepanjang mikrotubulus. Apakah FYN kinase mengatur transportasi vesikel yang dimediasi oleh Golgi apparatus dan/atau MBVs ke inklusi chlamydial dan apakah Fyn berperan dalam akuisisi kolesterol masih belum diketahui. Namun, diperkirakan bahwa FYN memediasi penghubungan inklusi dengan jaringan mikrotubulus, sehingga berinterseksi dengan vesikel yang mengandung sphingomielin yang bergerak sepanjang mikrotubulus (Mital dan Hackstadt, 2011a).

 

CteG. Baru-baru ini, kelompok Pais et al. (2019) mengidentifikasi CT105 sebagai efektor T3S dari C. trachomatis. CT105 terbukti berlokalisasi ke aparatus Golgi dan membran plasma sel inang yang terinfeksi. Selain itu, mereka menunjukkan bahwa CT105 dapat memodulasi transportasi vesikuler eukariotik. Karena CT105 adalah efektor pertama dari Chlamydia yang terbukti berasosiasi dengan kompleks Golgi, mereka memberi nama protein ini CteG (untuk C. trachomatis effector yang berasosiasi dengan Golgi). Namun, belum ada informasi yang diperoleh tentang fungsi dan mekanisme penargetan subseluler dari CteG serta keragaman dan spesifisitasnya dalam C. trachomatis dan di antara spesies Chlamydia lainnya (Pais et al., 2019).

 

Translokasi ke dalam inklusi Droplet Lipid.

 

Droplet lipid (LD) adalah organel penyimpanan yang berasal dari ER untuk lipid netral atau asam lemak rantai panjang (Martin dan Parton, 2006; Cocchiaro et al., 2008). Tiga protein yang berasosiasi dengan LD pada C. trachomatis telah diidentifikasi: Lda1, Lda2, dan Lda3 (Kumar et al., 2006). Peran Lda1 dan Lda2 belum diketahui sampai saat ini. Sebaliknya, ekspresi ektopik Lda3 menunjukkan bahwa protein ini memiliki tropisme baik untuk LD maupun membran inklusi, yang menunjukkan potensinya untuk bertindak sebagai jembatan molekuler antara keduanya (Cocchiaro et al., 2008). Cocchiaro et al. (2008) mengusulkan sebuah model di mana Lda3 yang disekresikan mengikat LD di sekitar inklusi, kemudian LD yang bertanda Lda3 tersebut berlabuh dengan membran inklusi dengan mengikat protein chlamydial hipotetis (IncX). Selanjutnya, membran inklusi akan mengalami invaginasi untuk mengantarkan LD yang utuh ke dalam lumen inklusi, di mana ia berasosiasi erat dengan RBs. Selain itu, karena IncA terfraksinasi dengan LDs, terakumulasi di lumen inklusi, dan sebagian berkolokasi dengan LDs intraluminal, disarankan bahwa IncA mungkin menandai situs masuk untuk LD pada membran inklusi. Selain itu, Lda3 mungkin juga berpartisipasi dalam pembajakan LD inang dengan mempromosikan penghilangan protein pelindung LD, adipocyte differentiation-related protein (ADRP) (Cocchiaro et al., 2008). Selain itu, Saka et al. (2015) mencatat bahwa IncG (CTL00373/CT118), Cap1 (CTL0791/CT529), CTL0882 (CT618) juga berasosiasi dengan LDs ketika diekspresikan ektopik pada sel inang. Mereka berspekulasi bahwa ekspresi Incs ini mungkin mewakili strategi bakteri untuk mempromosikan asosiasi dekat organel-organel ini dengan membran inklusi yang sebelumnya dilaporkan (Saka et al., 2015). Selain itu, protein yang berasosiasi dengan LD mungkin juga memengaruhi chlamydiae. Sebagai contoh, pembawa acyl-CoA manusia, protein yang mengandung domain pengikat acyl-CoA 6 (ACBD6), memengaruhi aktivitas acyltransferase bakteri CT775, sehingga pembentukan fosfatidilkolin pada C. trachomatis (Soupene et al., 2015).

 

Kelebihan kolesterol dipasteurisasi oleh acyl CoA transferase (ACAT) sebelum dikemas dalam LDs. Ekspresi ACAT1 meningkat pada sel HP-1 yang terinfeksi C. pneumoniae, yang menghasilkan tingkat kolesterol esterifikasi yang lebih tinggi (Liu et al., 2010). Selain itu, penurunan aliran keluar kolesterol, yang dibahas lebih lanjut pada bagian "HDL biogenesis," mengarah pada akumulasi kolesterol dalam sel inang (Samanta et al., 2017).

 

Pengamatan bahwa butir lemak (LDs) tidak terakumulasi dalam lumen inklusi mengarah pada saran bahwa mereka digunakan, baik untuk menghasilkan energi dan/atau sebagai sumber asam lemak untuk sintesis lipid (Cocchiaro et al., 2008). Namun, kelompok Sharma et al. (2018) menyatakan bahwa bukan LDs itu sendiri, melainkan ketersediaan asam lemak dalam sel inang yang berkontribusi terhadap pertumbuhan dan perkembangan C. trachomatis. Dipercaya bahwa C. trachomatis CT149 mungkin melepaskan kolesterol dari LDs untuk digunakan oleh bakteri karena LDs menyimpan ester kolesterol. CT149 dilokalisasi di dalam lumen inklusi dengan menggunakan antibodi (Peters et al., 2012; Samanta et al., 2017). Ini adalah esterase karboksilat yang diperkirakan mengandung urutan konsensus pengenalan kolesterol dan dua motif esterase kolesterol GXSXG. Aktivitas esterase kolesterol dari rekombinan CT149 terbukti di dalam vitro. Selain itu, kadar ester kolesterol menurun dan kadar kolesterol bebas meningkat ketika CT149 diekspresikan secara ektopik di sel HeLa (Peters et al., 2012; Samanta et al., 2017).

 

Peroksisom. Mikroskopi fluoresensi tiga dimensi mengungkapkan bahwa peroksisom juga dipindahkan ke dalam inklusi klamidia, di mana mereka terletak berdekatan dengan bakteri. Namun, mekanisme pengambilan peroksisom masih belum jelas. Boncompain et al. (2014) menunjukkan bahwa peroksisom tidak esensial untuk perkembangan bakteri in vivo karena klamidia dapat berkembang biak dan membentuk keturunan infeksius dalam sel inang yang kekurangan biogenesis peroksisom.

 

Badan Multivesikular. Badan multivesikular (MVB) adalah organel endositosis akhir yang heterogen dan penting untuk penyortiran serta pemrosesan protein dan lipid yang akan dihancurkan di lisosom, didaur ulang ke Golgi, atau dieksositosis ke membran plasma (Denzer et al., 2000; Piper dan Luzio, 2001; Woodman dan Futter, 2008). Klamidia menggunakan MVB sebagai sumber tambahan lipid (sphingolipid, fosfolipid, dan kolesterol) dengan memindahkan MVB ke dalam inklusi (Beatty, 2006; Gambarte Tudela et al., 2015). Berbagai penanda MVB, seperti CD63 dan asam lisobisfosfatidat (LBPA), terlokalisasi ke dalam lumen inklusi C. trachomatis (Beatty, 2006). MVB bermigrasi sepanjang mikrotubulus menuju inklusi, dan Rab39, yang menandai subset vesikel endosomal akhir, terutama MVB, berperan dalam pengiriman MVB ke inklusi (Gambarte Tudela et al., 2015). Namun, efektor klamidia yang terlibat dalam transportasi MVB ke dalam lumen inklusi belum diketahui (Gambarte Tudela et al., 2015; Dumoux dan Hayward, 2016).

 

Jalur Non-vesikular

 

Salah satu mekanisme non-vesikular klamidia adalah penggunaan transporter lipid seperti, antara lain, protein transport endoplasmik retikulum ceramide inang (CERT) (Derré et al., 2011; Elwell et al., 2011). Sphingomyelin sintase 2 (SMS2), yang direkrut ke dalam inklusi, kemungkinan mengubah ceramide yang diangkut menjadi sphingomyelin (Elwell et al., 2011). Mekanisme non-vesikular klamidia lainnya termasuk penggunaan anggota mesin biogenesis lipoprotein densitas tinggi (HDL) dan aktivasi fosfolipase A2 dan ERK untuk mengirimkan masing-masing fosfatidilkolin inang (Cox et al., 2012) dan gliserofosfolipid (Su et al., 2004). Semua mekanisme non-vesikular yang disebutkan di atas akan dibahas lebih rinci di bagian berikutnya.

 

CERT/VAPB/IncD dan SMS2

 

Myelin inang penting untuk produksi keturunan dan biogenesis inklusi (Van Ooij et al., 2000; Kesley Robertson et al., 2009). Sebelumnya, penggunaan jalur vesikuler untuk mengangkut vesikel yang mengandung sphingomyelin dari aparatus Golgi ke inklusi telah dijelaskan. Namun, inhibisi transportasi vesikuler yang dimediasi BFA tidak menunjukkan pengaruh pada produksi keturunan infeksius (Hackstadt et al., 1996; Hatch dan Mcclarty, 1998). Pengamatan ini menunjukkan adanya jalur non-vesikular yang memenuhi kebutuhan patogen akan myelin inang.

 

Inklusi Chlamydia trachomatis terbukti dilapisi dengan beberapa patch retikulum endoplasma (ER) pada jarak 10–20 nm dari membran inklusi (Giles dan Wyrick, 2008; Derré et al., 2011; Dumoux et al., 2012). Karena zona kedekatan (10–50 nm) antara dua organel biasanya didefinisikan sebagai Titik Kontak Membran (MCS) (Levine dan Loewen, 2006), titik kontak antara ER dan membran inklusi C. trachomatis dinamakan MCS ER-Inklusi (Derré et al., 2011). Beberapa protein yang secara khusus terperangkap di MCS ER-inklusi C. trachomatis telah diidentifikasi.

 

Protein transfer ceramide CERT adalah komponen fungsional dari MCS ER-Golgi yang terlibat dalam transfer non-vesikuler ceramide dari ER ke Golgi (Hanada et al., 2009). CERT terbukti direkrut ke MCS ER-inklusi untuk infeksi C. trachomatis melalui pengikatan langsung IncD ke domain Pleckstrin homologi (PH) pada CERT (Derré et al., 2011; Agaisse dan Derré, 2014). Substitusi asam amino pada IncD dari strain okular dan LGV C. trachomatis diyakini terlibat dalam memungkinkan tropisme jaringan (Borges et al., 2012; Sugiki et al., 2012). Selain itu, Derré et al. (2011) menunjukkan bahwa pengikatan IncD pada CERT memediasi rekrutmen protein penghuni ER VAPB yang bergantung pada motif FFAT CERT. Namun, masih belum jelas apakah interaksi IncD-CERT-VAPB cukup untuk mentranslokasikan ER ke permukaan inklusi (Derré et al., 2011). Selain CERT, sensor kalsium ER STIM1 sangat terperangkap di MCS ER-inklusi dan kedua protein tersebut kolokal pada semua tahap siklus perkembangan (Agaisse dan Derré, 2015). Namun, meskipun deplesi CERT atau VAPB memengaruhi pertumbuhan C. trachomatis (Derré et al., 2011; Elwell et al., 2011), deplesi STIM1 tidak, meninggalkan peran fungsionalnya yang belum jelas (Agaisse dan Derré, 2015). Selain itu, Stanhope et al. (2017) baru-baru ini menunjukkan bahwa IncV juga mampu berinteraksi dengan VAP, mungkin membantu dalam penjepitan ER-inklusi.

 

Dalam terang jalur non-vesikular yang diusulkan untuk menyediakan inklusi dengan mielin hos, perekrutan CERT di MCSs ER-Inklusi merupakan strategi yang masuk akal untuk mengalirkan ceramide dari ER ke inklusi. Namun, dalam skenario ini, ceramide yang direbut tetap perlu diubah menjadi sphingomyelin. Memang, sintase sphingomyelin 2 (SMS2) juga direkrut ke membran inklusi (Derré et al., 2011; Elwell et al., 2011). Lebih lanjut, Elwell et al. (2011) mengemukakan bahwa sphingomyelin yang diperoleh melalui transportasi non-vesikular sangat penting untuk amplifikasi C. trachomatis, sedangkan sphingomyelin yang diperoleh melalui transportasi vesikular sangat penting untuk ekspansi dan stabilitas membran inklusi (Elwell et al., 2011).

 

Keterlibatan CERT dalam pengambilan sphingomyelin juga telah dipelajari untuk patogen zoonotik C. psittaci, meskipun jauh lebih terbatas dibandingkan dengan C. trachomatis. C. psittaci juga merekrut CERT ke inklusinya, namun juga dapat mengeksploitasi jalur sphingomyelin yang independen dari CERT. Meskipun demikian, penghambatan kimiawi dan penghapusan CERT menggunakan CRISPR/Cas9 mempengaruhi beberapa tahap infeksi, termasuk pertumbuhan inklusi dan pembentukan progeni infeksius, yang membuktikan bahwa CERT sangat penting bagi C. psittaci (Koch-Edelmann et al., 2017).

 

Biogenesis HDL Mesin biogenesis lipoprotein densitas tinggi (HDL) terlibat dalam pengeluaran kolesterol dan fosfolipid. Dalam proses ini, protein pengikat lipid ATP-binding cassette transporters A1 dan G1 (ABCA1, ABCG1), serta CLA1 mengangkut kolesterol dan fosfolipid menuju ApoA-1 ekstraseluler untuk membentuk HDL (Samanta et al., 2017). Menariknya, selama infeksi klamidia, ABCA1, CLA1, dan ApoA-1 berlokalisasi pada membran inklusi dan baik CLA1 maupun ApoA-1 ditemukan dalam fokus terpisah di dalam lumen inklusi (Cox et al., 2012). Selain itu, ApoA-1 yang terakumulasi di dalam inklusi berko-lokal dengan kolam fosfatidilkolin. Cox et al. (2012) menunjukkan bahwa penurunan ekspresi ABCA1 dengan siRNA pada sel HeLa mencegah pertumbuhan C. trachomatis dan bahwa penghambat farmasetik dari aktivitas transporter ABCA1 dan CLA1 juga menghambat perekrutan fosfolipid ke inklusi, mencegah pertumbuhan klamidia. Hasil ini menunjukkan bahwa C. trachomatis mengeksploitasi sistem transportasi lipid sel inang yang terlibat dalam pembentukan HDL untuk memperoleh lipid yang diperlukan untuk pertumbuhan, meskipun mekanismenya belum jelas (Cox et al., 2012). Di sisi lain, C. pneumoniae menurunkan ABCA1 pada tingkat translasi dan pasca-translasi (melalui mikroRNA miR-33), sehingga menargetkan pengeluaran kolesterol dan fosfolipid sebagai mekanisme untuk lebih meningkatkan kadar intraseluler (Korhonen et al., 2013; Sun et al., 2014; Zhao et al., 2014).

 

Fosfolipase A2 dan ERK Fosfatidilinositol (PI) dan fosfatidilkolin (PC), dua gliserofosfolipid eukariotik yang ada dalam EBs yang dimurnikan, juga diperoleh dari sel inang melalui jalur transportasi non-vesikular, yang dimediasi oleh ERK dan fosfolipase A2 sitosolik (cPLA2). Dipercaya bahwa klamidia secara aktif memanipulasi jalur pensinyalan ERK-cPLA2 inang karena aktivasi ERK serta cPLA2 bergantung pada amplifikasi klamidia dan terbatas pada sel yang terinfeksi klamidia (Su et al., 2004). Klamidia memodifikasi gliserofosfolipid yang terperangkap dengan menggantikan asam lemak rantai tidak bercabang dengan asam lemak rantai bercabang yang berasal dari klamidia, yang bertentangan dengan kolesterol dan sphingomyelin yang tidak dimodifikasi (Wylie et al., 1997).

 

ALAT GENETIKA MOLEKULER UNTUK MENGKAJI BIOLOGI INFEKSI

 

Fungsi banyak protein klamidia, yang sangat penting bagi klamidia dalam perjalanan mereka dari luar ke dalam sel inang, masih perlu ditemukan. Mempelajari peran protein klamidia dalam patogenesis dan virulensi telah lama menjadi tantangan karena kesulitan yang terkait dengan manipulasi gen klamidia (Keb et al., 2018). Transformasi klamidia obligat intraseluler dengan DNA eksogen merupakan proses yang rumit karena membran sel inang dan bakteri menjadi penghalang bagi reagen. Oleh karena itu, genetika Chlamydia kemungkinan tidak akan pernah mencapai tingkat kelayakan manipulasi bakteri bebas (Rahnama dan Fields, 2018). Selain itu, EBs ekstraseluler tidak dapat ditransformasi, menambah tingkat komplikasi lebih lanjut (Beare et al., 2011; Rahnama dan Fields, 2018). Selain itu, karena pengurangan signifikan dalam genom klamidia seiring waktu, gangguan fungsi dengan menggunakan gen homolog dari organisme lain sering kali tidak mungkin dilakukan (Brothwell et al., 2016). Meskipun demikian, perkembangan terbaru dalam alat molekuler untuk manipulasi genetik klamidia mengatasi hambatan yang sebelumnya menghalangi penelitian tentang siklus perkembangan klamidia. Berikut ini dibahas kemajuan utama dalam teknik rekayasa genetik untuk mempelajari biologi infeksi Chlamydia.

 

Transformasi Melalui Elektroporasi Selain genom mereka yang sangat tereduksi namun terjaga sekitar 1 Mb, sebagian besar isolat C. trachomatis membawa plasmid kriptik sepanjang 7,5 kb, yang mengkodekan delapan gen (Stephens et al., 1998; Seth-Smith et al., 2009). Namun, meskipun plasmid ini dapat digunakan sebagai vektor, manipulasi genetik klamidia telah lama menjadi tantangan (Clarke, 2010). Transformasi buatan pertama klamidia dengan plasmid rekombinan terjadi pada tahun 1994 ketika elektroporasi terbukti mampu memperkenalkan DNA ke dalam EBs C. trachomatis. Sumber DNA untuk eksperimen ini adalah plasmid yang disebut pPBW100, yang merupakan chimera antara plasmid kriptik C. trachomatis dan plasmid Escherichia coli pBGS9. Untuk memilih langsung C. trachomatis yang membawa pPBW100, fusi gen in-frame antara promotor klamidia P7248 dan kaset resistansi kloramfenikol yang tidak memiliki promotor dimasukkan ke dalam plasmid. Setelah perlakuan dengan kloramfenikol pada sel yang dibudidayakan, yang terinfeksi dengan EBs yang dielektroporasi, pPBW100 terdeteksi di dalam inklusi. Selain itu, ekspresi kaset resistansi diatur secara perkembangan dan terjadi pada tahap awal perkembangan RB. Namun, ekspresi kaset ini sebagian besar bersifat sementara (Tam et al., 1994). Beberapa tahun kemudian, Binet dan Maurelli (2009) mencoba untuk mentransformasi EBs C. psittaci dalam upaya untuk membuat varian melalui rekombinasi homolog. Operon rRNA tunggal menjadi target dengan alel 16S rRNA sintetik, yang membawa subtitusi nukleotida yang, antara lain, memberikan resistansi terhadap kasugamycin (Ksm) dan spektonomisin (Spc). Mereka berhasil mencapai tujuan mereka karena resistansi ganda dan penggantian gen 16S rRNA diamati (Binet dan Maurelli, 2009). Bukti-konsep yang dicapai oleh semua penelitian yang telah disebutkan menunjukkan potensi untuk mentransformasi klamidia secara buatan dan ternyata menjadi batu penjuru bagi teknik yang dikembangkan kemudian.

 

Penemuan Transfer Gen Lateral dan Penggunaannya dalam Alat Genetik Molekuler

 

Penemuan transfer gen lateral (LGT) melalui transformasi alami, yang terjadi pada klamidia, membuka perspektif baru untuk pengembangan alat genetik molekuler (DeMars et al., 2007; Gomes et al., 2007; DeMars dan Weinfurter, 2008; Jeffrey et al., 2010). LGT intraseluler intra- dan antarbakteri terbukti mungkin terjadi, asalkan bakteri yang terlibat hidup dalam inklusi yang sama (Jeffrey et al., 2013). Teknik baru diperkenalkan, menggunakan LGT untuk mentransfer mutasi dari satu strain ke strain lainnya, sehingga memungkinkan studi asosiasi genotipe-fenotipe. Nguyen dan Valdivia, misalnya, memutasi Chlamydia secara kimiawi dan kemudian memetakan lesi genetik yang mendasarinya dengan menggunakan sequencing genom lengkap (WGS) serta LGT dalam sel yang terinfeksi. Lebih spesifik, agen alkilasi etil metil sulfonat (EMS) digunakan untuk memutasi C. trachomatis RB yang resisten terhadap Rifampisin (RifR), setelah itu keturunan yang dihasilkan dibudidayakan dalam kultur sel hingga terbentuk plak yang terlihat. Lesi genetik umum pada mutan yang memiliki morfotipe plak yang sama terdeteksi melalui WGS. Selanjutnya, hubungan genotipe-fenotipe dipelajari dengan mengoinfeksi kultur sel dengan mutan RifR dan strain tipe liar SpcR dan kemudian memilih strain RifR SpcR yang direkombinasi hasil dari LGT di hadapan rifampisin dan spektinomisin. Akhirnya, keturunan rekombinan yang menunjukkan morfotipe yang diinginkan dianalisis menggunakan sequencing DNA terarah untuk mendeteksi mutasi individu yang terpisah yang ada pada strain mutan parental (Nguyen dan Valdivia, 2012). Teknik serupa digunakan oleh Brothwell et al. (2016), yang menyaring perpustakaan 4.184 isolat C. trachomatis yang dimutasi dengan EMS untuk mutan yang sensitif terhadap suhu (TS). Mutan ini hanya menunjukkan perkembangan normal pada suhu fisiologis (37°C). Hubungan langsung genotipe-fenotipe tidak mungkin dilakukan karena hampir semua mutan TS mengandung banyak mutasi. Oleh karena itu, mutan TS dioinfeksi dan keturunan rekombinan, yang tumbuh pada suhu non-permisif 40°C, dipilih. Sequencing terarah berikutnya mengungkapkan bahwa keturunan tersebut mengandung semua mutasi yang ada pada salah satu induk TS, kecuali satu alel (GltXQ487∗) (Brothwell et al., 2016).

 

Transformasi Stabil Menggunakan Plasmid Kimerik, Berdasarkan Plasmid Kriptik Klamidia Wang et al. (2011) mengembangkan teknik transformasi stabil berbasis plasmid pertama untuk C. trachomatis, berdasarkan seleksi penisilin. Yang penting, teknik ini mengandalkan perlakuan kalsium klorida (CaCl2) pada EBs, menjadikannya kompeten (Wang et al., 2011). Kelompok ini merancang vektor pengangkut yang mengandung gen resistensi penisilin, berdasarkan plasmid klamidia dan plasmid E. coli pBR325 yang dapat mereplikasi di kedua spesies. Selanjutnya, mereka menunjukkan efektivitas dan reproduksibilitas teknik ini dengan mengengineering strain C. trachomatis yang resisten terhadap penisilin, yang mengekspresikan GFP (Wang et al., 2011). Hasil dari Wang et al. (2011) menjadi titik balik dalam bidang genetika klamidia, yang menginspirasi para peneliti untuk mulai menganalisis pentingnya gen plasmid klamidia dalam biologi infeksi serta menggunakan plasmid ini dalam desain platform vektor ekspresi inovatif (Agaisse dan Derré, 2013; Ding et al., 2013; Gong et al., 2013; Johnson dan Fisher, 2013; Song et al., 2013; Wickstrum et al., 2013). Akhirnya, penelitian oleh tim Gérard et al. (2013) dan lebih baru lagi Shima et al. (2018) membuktikan efektivitas alat genetik berbasis plasmid pada C. pneumoniae (Gérard et al., 2013).

 

TargeTronTM yang Dimodifikasi oleh Chlamydia Bukti bahwa C. trachomatis dapat ditransformasi membuka peluang untuk mencoba memodifikasi teknik rekayasa genetik yang sudah ada untuk digunakan pada Chlamydia. Oleh karena itu, Johnson dan Fisher memodifikasi teknologi TargeTronTM untuk digunakan pada C. trachomatis. Teknologi ini didasarkan pada penggunaan intron grup II untuk gangguan sisipan gen yang ditargetkan. Tidak ada intron ini yang telah dijelaskan untuk Chlamydia, tetapi intron ini terdapat pada sekitar 25% genom bakteri. Diketahui bahwa intron ini dapat bergerak antar-gen melalui mekanisme retrotransposisi, yang diatur oleh protein yang dikodekan intron (IEP) yang memiliki aktivitas RNA maturase, endonuklease, dan reverse transcriptase (Lambowitz dan Zimmerly, 2004; Johnson dan Fisher, 2013). Menurut Johnson dan Fisher, intron (yang disebut sebagai EBS2, EBS1, dan δ) mengenali urutan dari gen target (yang disebut sebagai IBS2, IBS1, dan δ'), setelah itu disisipkan antara situs IBS1 dan δ’ dari gen target. Meskipun sisipan intron dalam DNA adalah proses yang stabil, transkrip RNA tetap tipe liar dan tidak ada fungsi gen yang hilang akibat pemotongan intron dari RNA setelah transkripsi (Johnson dan Fisher, 2013). Perutka et al. (2004) membuktikan bahwa dengan merekayasa urutan intron EBS1, EBS2, dan δ, intron Ll.LtrB dari Lactococcus lactis dapat ditargetkan ke gen baru yang menarik. Selain itu, mereka menunjukkan bahwa dengan menghilangkan gen IEP Ll.LtrB dari intron dan mengekspresikannya secara trans, pemulihan fungsi gen melalui splicing RNA pasca-transkripsi dapat dihindari. Menariknya, dengan menghilangkan IEP dari intron, ruang dibuat untuk gen lain seperti kaset seleksi. Perutka et al. (2004) memberikan plasmid kepada Chlamydia yang mengandung intron dan gen IEP dan ekspresi IEP selanjutnya memungkinkan sisipan intron ke dalam gen target. Selanjutnya, penghilangan plasmid donor setelah sisipan intron menyebabkan pengurangan IEP dan dengan demikian mencegah pemotongan intron. Akibatnya, sisipan intron yang sudah terbentuk menghasilkan inaktivasi gen (Perutka et al., 2004; Johnson dan Fisher, 2013). Prinsip terakhir ini kemudian dipasarkan oleh Sigma, yang menyebutnya teknologi TargeTronTM. Platform vektor TargeTronTM kemudian dimodifikasi oleh Johnson dan Fisher, yang menempatkan promotor klamidia di hulu intron dan menyisipkan gen resistensi ampisilin ke dalam intron untuk memungkinkan seleksi ampisilin. Sebagai bukti prinsip dalam C. trachomatis, Johnson dan Fisher menggunakan teknologi TargeTronTM yang dimodifikasi untuk menginaktifkan gen kromosom yang mengkode IncA, protein yang dibahas sebelumnya yang mengatur fusi vesikel homotipik. Sel-sel yang terinfeksi berganda dengan mutan IncA(-) yang dihasilkan menunjukkan adanya inklusi non-fusogenik, seperti yang juga diamati pada mutan yang terjadi secara alami. Bukti lebih lanjut dari penurunan ekspresi IncA diberikan dengan menggunakan Western blotting (Johnson dan Fisher, 2013). Selain itu, studi menggunakan mutan sisipan dalam model infeksi tikus yang sudah mapan membuktikan stabilitas sisipan intron dalam pengaturan in vivo (Lowden et al., 2015). Selain itu, sisipan sukses dari penanda tambahan aadA, gen resistensi spektinomycin, dalam Chlamydia menghasilkan produksi mutan ganda yang ditargetkan dan kemampuan untuk menggunakan komplemen gen (Lowden et al., 2015). Namun, meskipun hasil yang menjanjikan, mutagenesis sisipan spesifik gen di ujung 3' operon sulit dilakukan karena efek polar pada operon. Selain itu, sistem ini didasarkan pada algoritma yang bersifat proprietari, membatasi integrasi ke situs yang dievaluasi efisien.

 

Mutagenesis Pertukaran Alelik yang Dilaporkan dengan Fluoresensi (FRAEM)

 

Rekombinasi homolog bergantung pada vektor rekombinan yang membawa modifikasi yang diinginkan. Pengenalan plasmid ini ke dalam sel menghasilkan pertukaran nukleotida dengan genom. Akhirnya, penghilangan vektor, yang sekarang mengandung gen asli yang utuh, sangat penting untuk memperoleh perubahan pada fenotipe sel (Binet dan Maurelli, 2009). Binet dan Maurelli adalah yang pertama mencapai penghilangan vektor rekombinan pada Chlamydia. Mereka membangun plasmid yang dapat mereplikasi secara kondisional dengan menempatkan pgp6, yang terletak pada plasmid kriptik Chlamydia asli dan mengontrol pemeliharaan serta pewarisan plasmid (Gong et al., 2013; Song et al., 2013), di bawah kontrol sirkuit genetik yang dapat diinduksi oleh tetracycline anhidrat (aTet). Kemudian, mereka membuktikan efektivitas plasmid yang dapat mereplikasi secara kondisional ini dengan menargetkan dan berhasil menukar C. trachomatis trpA dengan kaset 2,2 Kb, yang mengkode baik β-laktamase maupun protein fluorescent hijau (GFP). Hal ini dicapai dengan menyertakan kaset dengan 3 Kb DNA yang homolog dengan urutan hulu dan hilir dari trpA. Setelah pertukaran alelik, ketiadaan aTet menyebabkan penghilangan vektor. Selain itu, pengenalan dan penghilangan vektor selanjutnya dapat diamati secara real-time berkat keberadaan gen mCherry pada tulang punggung vektor. Pengenalan yang berhasil menyebabkan hadirnya transforman dengan dua fluoresensi, setelah itu penghilangan vektor tanpa aTet menghasilkan sel yang hanya positif untuk GFP. Versatilitas target FRAEM dipelajari dengan mengulang teknik ini untuk gen-gen chlamydia ctl0063, ctl0064, dan ctl0065. Selanjutnya, WGS pada mutan yang dihasilkan membuktikan efektivitas dan spesifisitas FRAEM pada Chlamydia (Mueller et al., 2016).

 

Mutagenesis Pertukaran Alelik Kaset Floxed

 

FRAEM memungkinkan penghapusan gen kromosom dengan menyisipkan kaset seleksi yang mengkode resistansi antibiotik dan GFP. Namun, seperti yang telah disebutkan, penyisipan kaset dalam operon polikisstronik, yang umum ditemukan dalam genom chlamydia, dapat menyebabkan efek polar. Memang, penghapusan Chlamydia trachomatis tmeA yang dimediasi oleh FRAEM, sebuah gen yang ditranskripsi sebagai operon dengan tmeB, berdampak negatif pada ekspresi gen yang terakhir (Mueller dan Fields, 2015; McKuen et al., 2017; Mueller et al., 2016). Oleh karena itu, Keb et al. (2018) mengadaptasi teknologi FRAEM untuk menciptakan penghapusan gen tanpa penanda dengan menggunakan kaset gfp-bla, yang dikelilingi oleh situs loxP; yang disebut kaset sisipan floxed, dalam kombinasi dengan produksi sementara Cre melalui ekspresi gen tersebut dari template plasmid bunuh diri pSUmC. Menggunakan teknologi FRAEM yang telah diadaptasi, mereka berhasil menghasilkan mutan C. trachomatis kaset floxed tmeA. Selanjutnya, produksi Cre menyebabkan pemotongan kaset, setelah itu Cre dideplesi melalui pemusnahan plasmid bunuh diri yang mengkodekannya. Hal ini dicapai dengan pembudidayaan di bawah kondisi non-selektif. Sebagai hasilnya, mutan tmeA yang dihasilkan tetap mengekspresikan TmeB. Selain berguna dalam studi penghapusan pada operon polikisstronik, penghapusan gen tanpa penanda ini membatasi efek buatan dari penanda seleksi terhadap kebugaran chlamydia dan memiliki kemampuan untuk memotong wilayah besar dari DNA kromosom. Hal ini sangat berguna untuk mengkarakterisasi fungsi dan kontribusi terhadap virulensi dan tropisme jaringan dari wilayah kromosom seperti zona plastisitas yang sangat polimorfik yang mengandung gen biosintesis triptofan yang telah dibahas sebelumnya, atau keluarga Pmp yang diperluas, yang juga disebutkan dalam ulasan ini (Fehlner-Gardiner et al., 2002; Gomes et al., 2006; Keb et al., 2018; Valdivia dan Bastidas, 2018). Selain itu, teknik ini memungkinkan penghapusan RNA non-koding dan RNA kecil. Penelitian tentang elemen pengatur gen ini pada Chlamydia masih terbatas hingga saat ini (Valdivia dan Bastidas, 2018).

 

CRISPRi

 

Menurut Ouellette: “Salah satu alat utama yang masih kurang dalam kotak alat genetik chlamydia adalah kemampuan untuk membuat knock-out kondisional dari gen target melalui represi yang dapat diinduksi atau cara lainnya” (Ouellette, 2018). Karena diasumsikan bahwa sebagian besar gen chlamydia sangat penting bagi biologi infeksi bakteri tersebut karena genom chlamydia yang sangat tereduksi, knock-out kondisional sangat penting dalam mempelajari fungsi gen-gen ini. Oleh karena itu, baru-baru ini, Ouellette menggambarkan teknik inovatif CRISPR interference (CRISPRi) yang menggunakan varian Cas9 yang tidak katalitik (dCas9) dari Staphylococcus aureus untuk meresapkan ekspresi gen secara induktif dan reversibel pada C. trachomatis (Ouellette, 2018). CRISPRi didasarkan pada kemampuan dCas9 untuk mengenali RNA panduan kognitifnya dan mengikat urutan target tanpa memotongnya. Jika pengikatan terjadi di dekat ujung 5′ atau di wilayah promoter dari gen yang diminati, transkripsi akan terhambat secara sterik. Selain itu, dengan mentransformasi sel-sel dengan vektor di mana ekspresi RNA panduan bersifat konstitutif sementara ekspresi dCas9 dikendalikan oleh promoter yang dapat diinduksi, knock-out induktif dari gen target spesifik dapat dicapai (Qi et al., 2013; Ouellette, 2018). Ouellette berhasil menunjukkan penggunaan sistem plasmid tunggal untuk CRISPRi pada Chlamydia, dengan menargetkan ekspresi IncA (Ouellette, 2018).

 

KESIMPULAN

 

Meskipun pengetahuan yang substansial telah terkumpul mengenai interaksi molekuler antara inang dan patogen yang digunakan oleh Chlamydia untuk bertahan hidup dan berkembang biak, jelas bahwa masih banyak jalur yang belum sepenuhnya terkarakterisasi hingga saat ini. Misalnya, masih banyak pasangan pengikatan yang terlibat dalam perlekatan patogen pada sel inang yang belum teridentifikasi. Selain itu, penelitian sebagian besar berfokus pada internalisasi EB yang bergantung pada aktin, sehingga data mengenai internalisasi yang tidak bergantung pada aktin masih sangat terbatas. Lebih lanjut, meskipun banyak jalur yang telah dijelaskan untuk merampas metabolit sel inang, studi yang lebih mendalam mengenai proses-proses ini diperlukan untuk mengisi celah ilmiah yang tersisa dan menemukan jalur-jalur baru yang esensial dan/atau redundan. Pemahaman mengenai mekanisme pelepasan chlamydia dari sel inang yang terinfeksi juga masih terbatas. Karena kelangsungan hidup dan proliferasi chlamydia bergantung pada semua interaksi selektif ini, pengetahuan yang lebih mendalam tentang hal ini akan menjadi alat yang kuat dalam merancang atau mengoptimalkan antimikroba dan vaksin. Untungnya, kemajuan terkini dalam pengembangan alat genetik molekuler memungkinkan komunitas ilmiah untuk mulai menganalisis biologi infeksi chlamydia secara lebih mendalam. Dengan mempelajari patogenesis dan siklus hidup chlamydia, strategi profilaksis dan terapeutik untuk melawan patogen ini akan menjadi lebih efisien.

 

REFERENSI

 

Abdelsamed, H., Peters, J., and Byrne, G. I. (2013). Genetic variation in Chlamydia trachomatis and their hosts: impact on disease severity and tissue tropism. Future Microbiol. 8, 1129–1146. doi: 10.2217/fmb.13.80

Abromaitis, S., and Stephens, R. S. (2009). Attachment and entry of Chlamydia have distinct requirements for host protein disulfide isomerase. PLoS Pathog. 5:e1000357. doi: 10.1371/journal.ppat.1000357

Aeberhard, L., Banhart, S., Fischer, M., Jehmlich, N., Rose, L., Koch, S., et al. (2015). The proteome of the isolated Chlamydia trachomatis containing vacuole reveals a complex trafficking platform enriched for retromer components. PLoS Pathog. 11:e1004883. doi: 10.1371/journal.ppat.1004883

Agaisse, H., and Derré, I. (2013). A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One 8:e57090. doi: 10.1371/journal.pone.0057090

Agaisse, H., and Derré, I. (2014). Expression of the effector protein IncD in Chlamydia trachomatis mediates recruitment of the lipid transfer protein CERT and the endoplasmic reticulum-resident protein VAPB to the inclusion membrane. Infect. Immun. 82, 2037–2047. doi: 10.1128/IAI.01530-14

Agaisse, H., and Derre, I. (2015). STIM1 is a novel component of ER-Chlamydia trachomatis inclusion membrane contact sites. PLoS One 10:e0125671. doi: 10.1371/journal.pone.0125671

Ajonuma, L. C., Fok, K. L., Ho, L. S., Chan, P. K. S., Chow, P. H., Tsang, L. L., et al. (2010). CFTR is required for cellular entry and internalization of Chlamydia trachomatis. Cell Biol. Int. 34, 593–600. doi: 10.1042/CBI20090227

Almeida, F., Borges, V., Ferreira, R., Borrego, M. J., Gomes, J. P., and Mota, L. J. (2012). Polymorphisms in inc proteins and differential expression of inc genes among Chlamydia trachomatis strains correlate with invasiveness and tropism of lymphogranuloma venereum isolates. J. Bacteriol. 194, 6574–6585. doi: 10.1128/JB.01428-12

Al-Zeer, M. A., Al-Younes, H. M., Kerr, M., Abu-Lubad, M., Gonzalez, E., Brinkmann, V., et al. (2014). Chlamydia trachomatis remodels stable microtubules to coordinate Golgi stack recruitment to the Chlamydial inclusion surface. Mol. Microbiol. 94, 1285–1297. doi: 10.1111/mmi.12829

Al-Zeer, M. A., Xavier, A., Abu Lubad, M., Sigulla, J., Kessler, M., Hurwitz, R., et al. (2017). Chlamydia trachomatis prevents apoptosis via activation of PDPK1-MYC and enhanced mitochondrial binding of Hexokinase II. EBioMedicine 23, 100–110. doi: 10.1016/j.ebiom.2017.08.005

Azuma, Y., Hirakawa, H., Yamashita, A., Cai, Y., Rahman, M. A., Suzuki, H., et al. (2006). Genome sequence of the cat pathogen, Chlamydophila felis. DNA Res. 13, 15–23. doi: 10.1093/dnares/dsi027

Bachmann, N. L., Fraser, T. A., Bertelli, C., Jelocnik, M., Gillett, A., Funnell, O., et al. (2014). Comparative genomics of koala, cattle and sheep strains of Chlamydia pecorum. BMC Genomics 15:667. doi: 10.1186/1471-2164-15-667

Bader, J. P., and Morgan, H. R. (1958). Latent viral infection of cells in tissue culture. VI. Role of amino acids, glutamine, and glucose in psittacosis virus propagation in L cells. J. Exp. Med. 108, 617–630. doi: 10.1084/jem.108.5.617

Balañá, M. E., Niedergang, F., Subtil, A., Alcover, A., Chavrier, P., and Dautry-Varsat, A. (2005). ARF6 GTPase controls bacterial invasion by actin remodelling. J. Cell Sci. 118, 2201–2210. doi: 10.1242/jcs.02351

Banks, J., Eddie, B., Schachter, J., and Meyer, K. F. (1970). Plaque formation by Chlamydia in L cells. Infect. Immun. 1, 259–262.

Bannantine, J. P., Griffiths, R. S., Viratyosin, W., Brown, W. J., and Rockey, D. D. (2000). A secondary structure motif predictive of protein localization to the Chlamydial inclusion membrane. Cell. Microbiol. 2, 35–47. doi: 10.1046/j.1462-5822.2000.00029.x

Bastidas, R. J., Elwell, C. A., Engel, J. N., and Valdivia, R. H. (2013). Chlamydial intracellular survival strategies. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 3:a010256. doi: 10.1101/cshperspect.a010256

Bauler, L. D., and Hackstadt, T. (2014). Expression and targeting of secreted proteins from Chlamydia trachomatis. J. Bacteriol. 196, 1325–1334. doi: 10.1128/JB.01290-13

Bavoil, P., Ohlin, A., and Schachter, J. (1984). Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis. Infect. Immun. 44, 479–485.

Beare, P., Sandoz, K., Omsland, A., Rockey, D., and Heinzen, R. (2011). Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front. Microbiol. 2:97. doi: 10.3389/fmicb.2011.00097

Beatty, W. L. (2006). Trafficking from CD63-positive late endocytic multivesicular bodies is essential for intracellular development of Chlamydia trachomatis. J. Cell Sci. 119, 350–359. doi: 10.1242/jcs.02733

Beatty, W. L. (2007). Lysosome repair enables host cell survival and bacterial persistence following Chlamydia trachomatis infection. Cell. Microbiol. 9, 2141–2152. doi: 10.1111/j.1462-5822.2007.00945.x

Beatty, W. L. (2008). Late endocytic multivesicular bodies intersect the Chlamydial inclusion in the absence of CD63. Infect. Immun. 76, 2872–2881. doi: 10.1128/IAI.00129-08

Beatty, W. L., Belanger, T. A., Desai, A. A., Morrison, R. P., and Byrne, G. I. (1994). Tryptophan depletion as a mechanism of gamma interferon-mediated Chlamydial persistence. Infect. Immun. 62, 3705–3711.

Beatty, W. L., Byrne, G. I., and Morrison, R. P. (1993). Morphologic and antigenic characterization of interferon gamma-mediated persistent Chlamydia trachomatis infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 90, 3998–4002. doi: 10.1073/pnas.90.9.3998

Becker, E., and Hegemann, J. H. (2014). All subtypes of the Pmp adhesin family are implicated in Chlamydial virulence and show species-specific function. Microbiologyopen 3, 544–556. doi: 10.1002/mbo3.186

Binet, R., and Maurelli, A. T. (2009). Transformation and isolation of allelic exchange mutants of Chlamydia psittaci using recombinant DNA introduced by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 292–297. doi: 10.1073/pnas.0806768106

Blyth, W. A., and Taverne, J. (1972). Some consequences of the multiple infection of cell cultures by TRIC organisms. J. Hyg. 70, 33–37. doi: 10.1017/s0022172400022063

Böcker, S., Heurich, A., Franke, C., Monajembashi, S., Sachse, K., Saluz, H. P., et al. (2014). Chlamydia psittaci inclusion membrane protein IncB associates with host protein Snapin. Int. J. Med. Microbiol. 304, 542–553. doi: 10.1016/j.ijmm.2014.03.005

Boleti, H., Benmerah, A., Ojcius, D. M., Cerf-Bensussan, N., and Dautry-Varsat, A. (1999). Chlamydia infection of epithelial cells expressing dynamin and Eps15 mutants: clathrin-independent entry into cells and dynamin-dependent productive growth. J. Cell Sci. 112(Pt 10), 1487–1496.

Boncompain, G., Muller, C., Meas-Yedid, V., Schmitt-Kopplin, P., Lazarow, P. B., and Subtil, A. (2014). The intracellular bacteria Chlamydia hijack peroxisomes and utilize their enzymatic capacity to produce bacteria-specific phospholipids. PLoS One 9:e86196. doi: 10.1371/journal.pone.0086196

Bonner, C. A., Byrne, G. I., and Jensen, R. A. (2014). Chlamydia exploit the mammalian tryptophan-depletion defense strategy as a counter-defensive cue to trigger a survival state of persistence. Front. Cell. Infect. Microbiol. 4:17. doi: 10.3389/fcimb.2014.00017

Borges, V., Nunes, A., Ferreira, R., Borrego, M. J., and Gomes, J. P. (2012). Directional evolution of Chlamydia trachomatis towards niche-specific adaptation. J. Bacteriol. 194, 6143–6153. doi: 10.1128/JB.01291-12

Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Toh, E., Rockey, D. D., Putman, T. E., Barta, M. L., et al. (2016). Interrogating genes that mediate Chlamydia trachomatis survival in cell culture using conditional mutants and recombination. J. Bacteriol. 198, 2131–2139. doi: 10.1128/JB.00161-16

Brumell, J. H., and Scidmore, M. A. (2007). Manipulation of rab GTPase function by intracellular bacterial pathogens. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 71, 636–652. doi: 10.1128/MMBR.00023-07

Buchholz, K. R., and Stephens, R. S. (2008). The cytosolic pattern recognition receptor NOD1 induces inflammatory interleukin-8 during Chlamydia trachomatis infection. Infect. Immun. 76, 3150–3155. doi: 10.1128/IAI.00104-08

Bulir, D. C., Waltho, D. A., Stone, C. B., Liang, S., Chiang, C. K. W., Mwawasi, K. A., et al. (2015). Chlamydia outer protein (Cop) B from Chlamydia pneumoniae possesses characteristic features of a type III secretion (T3S) translocator protein. BMC Microbiol. 15:163. doi: 10.1186/s12866-015-0498-1

Bulir, D. C., Waltho, D. A., Stone, C. B., Mwawasi, K. A., Nelson, J. C., and Mahony, J. B. (2014). Chlamydia pneumoniae CopD translocator protein plays a critical role in type III Secretion (T3S) and infection. PLoS One 9:e0099315. doi: 10.1371/journal.pone.0099315

Byrne, G. I., and Beatty, W. L. (2012). “Chlamydial persistence redux,” in Intracellular Pathogens 1: Chlamydiales, Vol. 1, eds M. Tan, and P. M. Bavoil, (Hearndon, VA: ASM Press), 265–284. doi: 10.1128/9781555817329.ch12

Byrne, G. I., and Moulder, J. W. (1978). Parasite-specified phagocytosis of Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis by L and HeLa cells. Infect. Immun. 19, 598–606.

Capmany, A., and Damiani, M. T. (2010). Chlamydia trachomatis intercepts Golgi-derived sphingolipids through a rab14-mediated transport required for bacterial development and replication. PLoS One 5:e0014084. doi: 10.1371/journal.pone.0014084

Capmany, A., Leiva, N., and Damiani, M. T. (2011). Golgi-associated Rab14, a new regulator for Chlamydia trachomatis infection outcome. Commun. Integr. Biol. 4, 590–593. doi: 10.4161/cib.4.5.16594

Carabeo, R. A., Dooley, C. A., Grieshaber, S. S., and Hackstadt, T. (2007). Rac interacts with Abi-1 and WAVE2 to promote an Arp2/3-dependent actin recruitment during Chlamydial invasion. Cell. Microbiol. 9, 2278–2288. doi: 10.1111/j.1462-5822.2007.00958.x

Carabeo, R. A., Grieshaber, S. S., Hasenkrug, A., Dooley, C. A., and Hackstadt, T. (2004). Requirement for the Rac GTPage in Chlamydia trachomiatis invasion of non-phagoycytic cells. Traffic 5, 418–425. doi: 10.1111/j.1600-0854.2004.00184.x

Carabeo, R. A., and Hackstadt, T. (2001). Isolation and characterization of a mutant Chinese hamster ovary cell line that is resistant to Chlamydia trachomatis infection at a novel step in the attachment process. Infect. Immun. 69, 5899–5904. doi: 10.1128/iai.69.9.5899-5904.2001

Carabeo, R. A., Mead, D. J., and Hackstadt, T. (2003). Golgi-dependent transport of cholesterol to the Chlamydia trachomatis inclusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 6771–6776. doi: 10.1073/pnas.1131289100

Carlson, J. H., Porcella, S. F., McClarty, G., and Caldwell, H. D. (2005). Comparative genomic analysis of Chlamydia trachomatis oculotropic and genitotropic strains. Infect. Immun. 73, 6407–6418. doi: 10.1128/IAI.73.10.6407-6418.2005

Chellas-Géry, B., Wolf, K., Tisoncik, J., Hackstadt, T., and Fields, K. A. (2011). Biochemical and localization analyses of putative type III secretion translocator proteins CopB and CopB2 of Chlamydia trachomatis reveal significant distinctions. Infect. Immun. 79, 3036–3045. doi: 10.1128/IAI.00159-11

Chen, H., Wen, Y., and Li, Z. (2019). Clear victory for Chlamydia: the subversion of host innate immunity. Front. Microbiol. 10:1412. doi: 10.3389/fmicb.2019.01412

Chen, Y.-S., Bastidas, R. J., Saka, H. A., Carpenter, V. K., Richards, K. L., Plano, G. V., et al. (2014). The Chlamydia trachomatis type III secretion chaperone Slc1 engages multiple early effectors, including TepP, a tyrosine-phosphorylated protein required for the recruitment of CrkI-II to nascent inclusions and innate immune signaling. PLoS Pathog. 10:e1003954. doi: 10.1371/journal.ppat.1003954

Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., and Hybiske, K. (2012). Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One 7:e46949. doi: 10.1371/journal.pone.0046949

Chowdhury, S. R., Reimer, A., Sharan, M., Kozjak-Pavlovic, V., Eulalio, A., Prusty, B. K., et al. (2017). Chlamydia preserves the mitochondrial network necessary for replication via microRNA-dependent inhibition of fission. J. Cell Biol. 216, 1071–1089. doi: 10.1083/jcb.201608063

Clarke, I. N. (2010). “Chlamydial transformation: facing up to the challenge,” in Proceedings of the Twelfth International Symposium on Human Chlamydial Infections, eds J. Schachter, G. I. Byrne, H. D. Caldwell, M. Chernesky, I. N. Clarke, D. Mabey, et al. Salzburg, 295–304.

Clifton, D. R., Dooley, C. A., Grieshaber, S. S., Carabeo, R. A., Fields, K. A., and Hackstadt, T. (2005). Tyrosine phosphorylation of the Chlamydial effector protein tarp is species specific and not required for recruitment of actin. Infect. Immun. 73, 3860–3868. doi: 10.1128/IAI.73.7.3860-3868.2005

Clifton, D. R., Fields, K. A., Grieshaber, S. S., Dooley, C. A., Fischer, E. R., Mead, D. J., et al. (2004). A Chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10166–10171. doi: 10.1073/pnas.0402829101

Cocchiaro, J., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., and Valdivia, R. H. (2008). Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9379–9384. doi: 10.1073/pnas.0712241105

Cortes, C., Rzomp, K. A., Tvinnereim, A., Scidmore, M. A., and Wizel, B. (2007). Chlamydia pneumoniae inclusion membrane protein Cpn0585 interacts with multiple rab GTPases. Infect. Immun. 75, 5586–5596. doi: 10.1128/IAI.01020-07

Cox, J. V., Naher, N., Abdelrahman, Y. M., and Belland, R. J. (2012). Host HDL biogenesis machinery is recruited to the inclusion of C. trachomatis-infected cells and regulates Chlamydial growth. Cell. Microbiol. 14, 1497–1512. doi: 10.1111/j.1462-5822.2012.01823.x

Cram, E. D., Simmons, R. S., Palmer, A. L., Hildebrand, W. H., Rockey, D. D., and Dolan, B. P. (2016). Enhanced direct major histocompatibility complex class I self-antigen presentation induced by Chlamydia infection. Infect. Immun. 84, 480–490. doi: 10.1128/IAI.01254-15

Damiani, M. T., Gambarte Tudela, J., and Capmany, A. (2014). Targeting eukaryotic Rab proteins: a smart strategy for Chlamydial survival and replication. Cell. Microbiol. 16, 1329–1338. doi: 10.1111/cmi.12325

Dautin, N., and Bernstein, H. D. (2007). Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Annu. Rev. Microbiol. 61, 89–112. doi: 10.1146/annurev.micro.61.080706.093233

Delevoye, C., Nilges, M., Dehoux, P., Paumet, F., Perrinet, S., Dautry-Varsat, A., et al. (2008). SNARE protein mimicry by an intracellular bacterium. PLoS Pathog. 4:e1000022. doi: 10.1371/journal.ppat.1000022

DeMars, R., and Weinfurter, J. (2008). Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro: mechanism and significance. J. Bacteriol. 190, 1605–1614. doi: 10.1128/JB.01592-07

DeMars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., and Potucek, Y. (2007). Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J. Bacteriol. 189, 991–1003. doi: 10.1128/JB.00845-06

Denzer, K., Kleijmeer, M. J., Heijnen, H. F., Stoorvogel, W., and Geuze, H. J. (2000). Exosome: from internal vesicle of the multivesicular body to intercellular signaling device. J. Cell Sci. 113(Pt 19), 3365–3374.

Derré, I., Swiss, R., and Agaisse, H. (2011). The lipid transfer protein CERT interacts with the Chlamydia inclusion protein IncD and participates to ER-Chlamydia inclusion membrane contact sites. PLoS Pathog. 7:e1002092. doi: 10.1371/journal.ppat.1002092

Ding, H., Gong, S., Tian, Y., Yang, Z., Brunham, R., and Zhong, G. (2013). Transformation of sexually transmitted infection-causing serovars of Chlamydia trachomatis using blasticidin for selection. PLoS One 8:e0080534. doi: 10.1371/journal.pone.0080534

Dumoux, M., Clare, D. K., Saibil, H. R., and Hayward, R. D. (2012). Chlamydiae assemble a pathogen synapse to hijack the host endoplasmic reticulum. Traffic Cph. Den. 13, 1612–1627. doi: 10.1111/tra.12002

Dumoux, M., and Hayward, R. D. (2016). Membrane contact sites between pathogen-containing compartments and host organelles. Biochim. Biophys. Acta 1861(8 Pt B), 895–899. doi: 10.1016/j.bbalip.2016.01.018

Dumoux, M., Menny, A., Delacour, D., and Hayward, R. D. (2015). A Chlamydia effector recruits CEP170 to reprogram host microtubule organization. J. Cell Sci. 128, 3420–3434. doi: 10.1242/jcs.169318

Elwell, C. A., Ceesay, A., Jung, H. K., Kalman, D., and Engel, J. N. (2008). RNA interference screen identifies Abl kinase and PDGFR signaling in Chlamydia trachomatis entry. PLoS Pathog. 4:e1000021. doi: 10.1371/journal.ppat.1000021

Elwell, C. A., and Engel, J. N. (2012). Lipid acquisition by intracellular Chlamydiae. Cell. Microbiol. 14, 1010–1018. doi: 10.1111/j.1462-5822.2012.01794.x

Elwell, C. A., Jiang, S., Kim, J. H., Lee, A., Wittmann, T., Hanada, K., et al. (2011). Chlamydia trachomatis co-opts GBF1 and CERT to acquire host sphingomyelin for distinct roles during intracellular development. PLoS Pathog. 7:e1002198. doi: 10.1371/journal.ppat.1002198

Fadel, S., and Eley, A. (2008). Differential glycosaminoglycan binding of Chlamydia trachomatis OmcB protein from serovars E and LGV. J. Med. Microbiol. 57, 1058–1061. doi: 10.1099/jmm.0.2008/001305-0

Fan, T., Lu, H., Hu, H., Shi, L., McClarty, G. A., Nance, D. M., et al. (1998). Inhibition of apoptosis in Chlamydia-infected cells: blockade of mitochondrial cytochrome c release and caspase activation. J. Exp. Med. 187, 487–496. doi: 10.1084/jem.187.4.487

Faris, R., Merling, M., Andersen, S. E., Dooley, C. A., Hackstadt, T., and Weber, M. M. (2019). Chlamydia trachomatis CT229 subverts rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote Chlamydial infection. Cell Rep. 26, 3380–3390.e5. doi: 10.1016/j.celrep.2019.02.079

Fehlner-Gardiner, C., Roshick, C., Carlson, J. H., Hughes, S., Belland, R. J., Caldwell, H. D., et al. (2002). Molecular basis defining human Chlamydia trachomatis tissue tropism. A possible role for tryptophan synthase. J. Biol. Chem. 277, 26893–26903. doi: 10.1074/jbc.M203937200

Ferrell, J. C., and Fields, K. A. (2016). A working model for the type III secretion mechanism in Chlamydia. Microbes Infect. 18, 84–92. doi: 10.1016/j.micinf.2015.10.006

Fisher, D. J., Fernández, R. E., Adams, N. E., and Maurelli, A. T. (2012). Uptake of biotin by Chlamydia Spp. through the use of a bacterial transporter (BioY) and a host-cell transporter (SMVT). PLoS One 7:e46052. doi: 10.1371/journal.pone.0046052

Frost, A., Unger, V. M., and De Camilli, P. (2009). The BAR domain superfamily: membrane-molding macromolecules. Cell 137, 191–196. doi: 10.1016/j.cell.2009.04.010

Fudyk, T., Olinger, L., and Stephens, R. S. (2002). Selection of mutant cell lines resistant to infection by Chlamydia spp [corrected]. Infect. Immun. 70, 6444–6447. doi: 10.1128/iai.70.11.6444-6447.2002

Gabel, B. R., Elwell, C., van Ijzendoorn, S. C. D., and Engel, J. N. (2004). Lipid raft-mediated entry is not required for Chlamydia trachomatis infection of cultured epithelial cells. Infect. Immun. 72, 7367–7373. doi: 10.1128/IAI.72.12.7367-7373.2004

Gambarte Tudela, J., Capmany, A., Romao, M., Quintero, C., Miserey-Lenkei, S., Raposo, G., et al. (2015). The late endocytic Rab39a GTPase regulates multivesicular bodies-Chlamydial inclusion interaction and bacterial growth. J. Cell Sci. 11, 3068–3081. doi: 10.1242/jcs.170092

Gehre, L., Gorgette, O., Perrinet, S., Prevost, M.-C., Ducatez, M., Giebel, A. M., et al. (2016). Sequestration of host metabolism by an intracellular pathogen. eLife 5:e12552. doi: 10.7554/eLife.12552

Geisler, W. M., Suchland, R. J., Rockey, D. D., and Stamm, W. E. (2001). Epidemiology and clinical manifestations of unique Chlamydia trachomatis isolates that occupy nonfusogenic inclusions. J. Infect. Dis. 184, 879–884. doi: 10.1086/323340

Gerard, H. C., Fomicheva, E., Whittum-Hudson, J. A., and Hudson, A. P. (2008). Apolipoprotein E4 enhances attachment of Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae elementary bodies to host cells. Microb. Pathog. 44, 279–285. doi: 10.1016/j.micpath.2007.10.002

Gérard, H. C., Mishra, M. K., Mao, G., Wang, S., Hali, M., Whittum-Hudson, J. A., et al. (2013). Dendrimer-enabled DNA delivery and transformation of Chlamydia pneumoniae. Nanomedicine 9, 996–1008. doi: 10.1016/j.nano.2013.04.004

Giles, D. K., and Wyrick, P. B. (2008). Trafficking of Chlamydial antigens to the endoplasmic reticulum of infected epithelial cells. Microbes Infect. 10, 1494–1503. doi: 10.1016/j.micinf.2008.09.001

Gilk, S. D., Cockrell, D. C., Luterbach, C., Hansen, B., Knodler, L. A., Ibarra, J. A., et al. (2013). Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9:e1003107. doi: 10.1371/journal.ppat.1003107

Girard, V., and Mourez, M. (2006). Adhesion mediated by autotransporters of Gram-negative bacteria: structural and functional features. Res. Microbiol. 157, 407–416. doi: 10.1016/j.resmic.2006.02.001

Gomes, J. P., Bruno, W. J., Borrego, M. J., and Dean, D. (2004). Recombination in the genome of Chlamydia trachomatis involving the polymorphic membrane protein C gene relative to ompA and evidence for horizontal gene transfer. J. Bacteriol. 186, 4295–4306. doi: 10.1128/JB.186.13.4295-4306.2004

Gomes, J. P., Bruno, W. J., Nunes, A., Santos, N., Florindo, C., Borrego, M. J., et al. (2007). Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17, 50–60. doi: 10.1101/gr.5674706

Gomes, J. P., Nunes, A., Bruno, W. J., Borrego, M. J., Florindo, C., and Dean, D. (2006). Polymorphisms in the nine polymorphic membrane proteins of Chlamydia trachomatis across all serovars: evidence for serovar da recombination and correlation with tissue tropism. J. Bacteriol. 188, 275–286. doi: 10.1128/JB.188.1.275-286.2006

Gong, S., Yang, Z., Lei, L., Shen, L., and Zhong, G. (2013). Characterization of Chlamydia trachomatis plasmid-encoded open reading frames. J. Bacteriol. 195, 3819–3826. doi: 10.1128/JB.00511-13

Gordon, F. B., and Quan, A. L. (1965). OCCURENCE OF GLYCOGEN IN INCLUSIONS OF THE PSITTACOSIS-LYMPHOGRANULOMA VENEREUM-TRACHOMA AGENTS. J. Infect. Dis. 115, 186–196. doi: 10.1093/infdis/115.2.186

Grieshaber, S., Swanson, J. A., and Hackstadt, T. (2002). Determination of the physical environment within the Chlamydia trachomatis inclusion using ion-selective ratiometric probes. Cell Microbiol. 4, 273–283. doi: 10.1046/j.1462-5822.2002.00191.x

Grieshaber, S. S., Grieshaber, N. A., and Hackstadt, T. (2003). Chlamydia trachomatis uses host cell dynein to traffic to the microtubule-organizing center in a p50 dynamitin-independent process. J. Cell Sci. 116, 3793–3802. doi: 10.1242/jcs.00695

Grimwood, J., and Stephens, R. S. (1999). Computational analysis of the polymorphic membrane protein superfamily of Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae. Microb. Comp. Genomics 4, 187–201. doi: 10.1089/omi.1.1999.4.187

Gurumurthy, R. K., Chumduri, C., Karlas, A., Kimmig, S., Gonzalez, E., Machuy, N., et al. (2014). Dynamin-mediated lipid acquisition is essential for Chlamydia trachomatis development. Mol. Microbiol. 94, 186–201. doi: 10.1111/mmi.12751

Hackstadt, T. (2012). Intracellular Pathogens 1: Chlamydiales, Vol. 1, eds M. Tan, and P. M. Bavoil, (Washington, DC: ASM Press), 26–148.

Hackstadt, T., Rockey, D. D., Heinzen, R. A., and Scidmore, M. A. (1996). Chlamydia trachomatis interrupts an exocytic pathway to acquire endogenously synthesized sphingomyelin in transit from the Golgi apparatus to the plasma membrane. EMBO J. 15, 964–977. doi: 10.1002/j.1460-2075.1996.tb00433.x

Hackstadt, T., Scidmore, M. A., and Rockey, D. D. (1995). Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the Chlamydial inclusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4877–4881. doi: 10.1073/pnas.92.11.4877

Hackstadt, T., Scidmore-Carlson, M. A., Shaw, E. I., and Fischer, E. R. (1999). The Chlamydia trachomatis IncA protein is required for homotypic vesicle fusion. Cell. Microbiol. 1, 119–130. doi: 10.1046/j.1462-5822.1999.00012.x

Haferkamp, I. (2017). Crossing the border - Solute entry into the Chlamydial inclusion. Int. J. Med. Microbiol. 308, 41–48. doi: 10.1016/j.ijmm.2017.08.006

Haldar, A. K., Piro, A. S., Finethy, R., Espenschied, S. T., Brown, H. E., Giebel, A. M., et al. (2016). Chlamydia trachomatis is resistant to inclusion ubiquitination and associated host defense in gamma interferon-primed human epithelial cells. mBio 7, e1417–16. doi: 10.1128/mBio.01417-16

Hanada, K., Kumagai, K., Tomishige, N., and Yamaji, T. (2009). CERT-mediated trafficking of ceramide. Biochim. Biophys. Acta 1791, 684–691. doi: 10.1016/j.bbalip.2009.01.006

Hatch, G. M., and Mcclarty, G. (1998). Phospholipid composition of purified Chlamydia trachomatis mimics that of the eucaryotic host cell. Infect. Immun. 66, 3727–3735.

Hatch, T. P., Vance, D. W. Jr., and Al-Hossainy, E. (1981). Attachment of Chlamydia psittaci to formaldehyde-fixed and unfixed L cells. J. Gen. Microbiol. 125, 273–283. doi: 10.1099/00221287-125-2-273

Heckels, J. E., Blackett, B., Everson, J. S., and Ward, M. E. (1976). The influence of surface charge on the attachment of Neisseria gonorrhoeae to human cells. J. Gen. Microbiol. 96, 359–364. doi: 10.1099/00221287-96-2-359

Hegemann, J. H., and Mölleken, K. (2012). “Chlamydial adhesion and adhesins,” in Intracellular Pathogens 1: Chlamydiales, Vol. 1, eds M. Tan, and P. M. Bavoil, (Washington, DC: ASM Press), 97–125. doi: 10.1128/9781555817329.ch5

Heinzen, R. A., and Hackstadt, T. (1997). The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infect. Immun. 65, 1088–1094.

Henderson, I. R., and Lam, A. C. (2001). Polymorphic proteins of Chlamydia spp.–autotransporters beyond the Proteobacteria. Trends Microbiol. 9, 573–578. doi: 10.1016/s0966-842x(01)02234-x

Herweg, J.-A., Hansmeier, N., Otto, A., Geffken, A. C., Subbarayal, P., Prusty, B. K., et al. (2015). Purification and proteomics of pathogen-modified vacuoles and membranes. Front. Cell. Infect. Microbiol. 5:48. doi: 10.3389/fcimb.2015.00048

Herweg, J.-A., Pons, V., Becher, D., Hecker, M., Krohne, G., Barbier, J., et al. (2016). Proteomic analysis of the Simkania-containing vacuole: the central role of retrograde transport. Mol. Microbiol. 99, 151–171. doi: 10.1111/mmi.13222

Heuer, D., Rejman Lipinski, A., Machuy, N., Karlas, A., Wehrens, A., Siedler, F., et al. (2009). Chlamydia causes fragmentation of the Golgi compartment to ensure reproduction. Nature 457, 731–735. doi: 10.1038/nature07578

Hodinka, R. L., Davis, C. H., Choong, J., and Wyrick, P. B. (1988). Ultrastructural study of endocytosis of Chlamydia trachomatis by McCoy cells. Infect. Immun. 56, 1456–1463.

Horn, M., Collingro, A., Schmitz-Esser, S., Beier, C. L., Purkhold, U., Fartmann, B., et al. (2004). Illuminating the evolutionary history of Chlamydiae. Science 304, 728–730. doi: 10.1126/science.1096330

Hower, S., Wolf, K., and Fields, K. A. (2009). Evidence that CT694 is a novel Chlamydia trachomatis T3S substrate capable of functioning during invasion or early cycle development. Mol. Microbiol. 72, 1423–1437. doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06732.x

Hutagalung, A. H., and Novick, P. J. (2011). Role of Rab GTPases in membrane traffic and cell physiology. Physiol. Rev. 91, 119–149. doi: 10.1152/physrev.00059.2009

Hybiske, K., and Stephens, R. S. (2007). Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11430–11435. doi: 10.1073/pnas.0703218104

Iliffe-Lee, E. R., and McClarty, G. (1999). Glucose metabolism in Chlamydia trachomatis: the energy parasite hypothesis revisited. Mol. Microbiol. 33, 177–187. doi: 10.1046/j.1365-2958.1999.01464.x

Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., and Rockey, D. D. (2013). Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiol. 13:142. doi: 10.1186/1471-2180-13-142

Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Quinn, K. L., Davidson, J. R., Stamm, W. E., and Rockey, D. D. (2010). Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect. Immun. 78, 2544–2553. doi: 10.1128/IAI.01324-09

Jewett, T. J., Dooley, C. A., Mead, D. J., and Hackstadt, T. (2008). Chlamydia trachomatis tarp is phosphorylated by src family tyrosine kinases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 371, 339–344. doi: 10.1016/j.bbrc.2008.04.089

Jewett, T. J., Fischer, E. R., Mead, D. J., and Hackstadt, T. (2006). Chlamydial TARP is a bacterial nucleator of actin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15599–15604. doi: 10.1073/pnas.0603044103

Jewett, T. J., Miller, N. J., Dooley, C. A., and Hackstadt, T. (2010). The conserved Tarp actin binding domain is important for Chlamydial invasion. PLoS Pathog. 6:e1000997. doi: 10.1371/journal.ppat.1000997

Jiwani, S., Ohr, R. J., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Alvarado, S., Romero, A., et al. (2012). Chlamydia trachomatis Tarp cooperates with the Arp2/3 complex to increase the rate of actin polymerization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 420, 816–821. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.03.080

Johnson, C. M., and Fisher, D. J. (2013). Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One 8:e83989. doi: 10.1371/journal.pone.0083989

Kabeiseman, E. J., Cichos, K., Hackstadt, T., Lucas, A., and Moore, E. R. (2013). Vesicle-associated membrane protein 4 and syntaxin 6 interactions at the Chlamydial inclusion. Infect. Immun. 81, 3326–3337. doi: 10.1128/IAI.00584-13

Kabeiseman, E. J., Cichos, K. H., and Moore, E. R. (2014). The eukaryotic signal sequence, YGRL, targets the Chlamydial inclusion. Front. Cell. Infect. Microbiol. 4:129. doi: 10.3389/fcimb.2014.00129

Kalman, S., Mitchell, W., Marathe, R., Lammel, C., Fan, J., Hyman, R. W., et al. (1999). Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis. Nat. Genet. 21, 385–389.

Kanai, Y., Segawa, H., Miyamoto, K. I., Uchino, H., Takeda, E., and Endou, H. (1998). Expression cloning and characterization of a transporter for large neutral amino acids activated by the heavy chain of 4F2 antigen (CD98). J. Biol. Chem. 273, 23629–23632. doi: 10.1074/jbc.273.37.23629

Karunakaran, K., Subbarayal, P., Vollmuth, N., and Rudel, T. (2015). Chlamydia-infected cells shed Gp96 to prevent Chlamydial re-infection. Mol. Microbiol. 98, 694–711. doi: 10.1111/mmi.13151

Keb, G., Hayman, R., and Fields, K. A. (2018). Floxed-cassette allelic exchange mutagenesis enables markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis and can reverse cassette-induced polar effects. J. Bacteriol. 200, e479–18. doi: 10.1128/JB.00479-18

Kesley Robertson, D., Gu, L., Rowe, R. K., and Beatty, W. L. (2009). Inclusion biogenesis and reactivation of persistent Chlamydia trachomatis requires host cell sphingolipid biosynthesis. PLoS Pathog. 5:e1000664. doi: 10.1371/journal.ppat.1000664

Kim, J. H., Jiang, S., Elwell, C. A., and Engel, J. N. (2011). Chlamydia trachomatis co-opts the FGF2 signaling pathway to enhance infection. PLoS Pathog. 7:e1002285. doi: 10.1371/journal.ppat.1002285

Kiselev, A. O., Stamm, W. E., Yates, J. R., and Lampe, M. F. (2007). Expression, processing, and localization of PmpD of Chlamydia trachomatis Serovar L2 during the Chlamydial developmental cycle. PLoS One 2:e568. doi: 10.1371/journal.pone.0000568

Koch-Edelmann, S., Banhart, S., Saied, E. M., Rose, L., Aeberhard, L., Laue, M., et al. (2017). The cellular ceramide transport protein CERT promotes Chlamydia psittaci infection and controls bacterial sphingolipid uptake. Cell. Microbiol. 19:e12752. doi: 10.1111/cmi.12752

Kokes, M., Dunn, J. D., Granek, J. A., Nguyen, B. D., Barker, J. R., Valdivia, R. H., et al. (2015). Integrating chemical mutagenesis and whole-genome sequencing as a platform for forward and reverse genetic analysis of Chlamydia. Cell Host Microbe 17, 716–725. doi: 10.1016/j.chom.2015.03.014

Kokes, M., and Valdivia, R. H. (2012). “Cell Biology of the Chlamydial Inclusion,” in Intracellular Pathogens 1: Chlamydiales, Vol. 1, eds M. Tan, and P. M. Bavoil, (Washington, DC: ASM Press), 170–191. doi: 10.1128/9781555817329.ch8

Korhonen, J. T., Olkkonen, V. M., Lahesmaa, R., and Puolakkainen, M. (2013). ABC-cassette transporter 1 (ABCA1) expression in epithelial cells in Chlamydia pneumoniae infection. Microb. Pathog. 61–62, 57–61. doi: 10.1016/j.micpath.2013.05.006

Kumar, Y., Cocchiaro, J., and Valdivia, R. H. (2006). The obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis targets host lipid droplets. Curr. Biol. 16, 1646–1651. doi: 10.1016/j.cub.2006.06.060

Kumar, Y., and Valdivia, R. H. (2008). Actin and intermediate filaments stabilize the Chlamydia trachomatis vacuole by forming dynamic structural scaffolds. Cell Host Microbe 4, 159–169. doi: 10.1016/j.chom.2008.05.018

Lambowitz, A. M., and Zimmerly, S. (2004). Mobile group II introns. Annu. Rev. Genet. 38, 1–35. doi: 10.1146/annurev.genet.38.072902.091600

Lane, B. J., Mutchler, C., Al Khodor, S., Grieshaber, S. S., and Carabeo, R. A. (2008). Chlamydial entry involves TARP binding of guanine nucleotide exchange factors. PLoS Pathog. 4:e1000014. doi: 10.1371/journal.ppat.1000014

Leiva, N., Capmany, A., and Damiani, M. T. (2013). Rab11-family of interacting protein 2 associates with Chlamydial inclusions through its Rab-binding domain and promotes bacterial multiplication. Cell. Microbiol. 15, 114–129. doi: 10.1111/cmi.12035

Levine, T., and Loewen, C. (2006). Inter-organelle membrane contact sites: through a glass, darkly. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 371–378. doi: 10.1016/j.ceb.2006.06.011

Lipinski, A. R., Heymann, J., Meissner, C., Karlas, A., Brinkmann, V., Meyer, T. F., et al. (2009). Rab6 and Rab11 regulate Chlamydia trachomatis development and golgin-84-dependent Golgi fragmentation. PLoS Pathog. 5:e1000615. doi: 10.1371/journal.ppat.1000615

Liu, X., Afrane, M., Clemmer, D. E., Zhong, G., and Nelson, D. E. (2010). Identification of Chlamydia trachomatis outer membrane complex proteins by differential proteomics. J. Bacteriol. 192, 2852–2860. doi: 10.1128/JB.01628-09

Longbottom, D., Findlay, J., Vretou, E., and Dunbar, S. M. (1998). Immunoelectron microscopic localisation of the OMP90 family on the outer membrane surface of Chlamydia psittaci. FEMS Microbiol. Lett. 164, 111–117. doi: 10.1016/s0378-1097(98)00187-6

Lowden, N. M., Yeruva, L., Johnson, C. M., Bowlin, A. K., and Fisher, D. J. (2015). Use of aminoglycoside 3’ adenyltransferase as a selection marker for Chlamydia trachomatis intron-mutagenesis and in vivo intron stability. BMC Res. Notes 8:570. doi: 10.1186/s13104-015-1542-9

Lu, L., Cai, Q., Tian, J. H., and Sheng, Z. H. (2009). Snapin associates with late endocytic compartments and interacts with late endosomal SNAREs. Biosci. Rep. 29, 261–269. doi: 10.1042/BSR20090043

Lucas, A. L., Ouellette, S. P., Kabeiseman, E. J., Cichos, K. H., and Rucks, E. A. (2015). The trans-Golgi SNARE syntaxin 10 is required for optimal development of Chlamydia trachomatis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 5:68. doi: 10.3389/fcimb.2015.00068

Lutter, E. I., Barger, A. C., Nair, V., and Hackstadt, T. (2013). Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein CT228 recruits elements of the myosin phosphatase pathway to regulate release mechanisms. Cell Rep. 3, 1921–1931. doi: 10.1016/j.celrep.2013.04.027

Lutter, E. I., Bonner, C., Holland, M. J., Suchland, R. J., Stamm, W. E., Jewett, T. J., et al. (2010). Phylogenetic analysis of Chlamydia trachomatis Tarp and correlation with clinical phenotype. Infect. Immun. 78, 3678–3688. doi: 10.1128/IAI.00515-10

Lutter, E. I., Martens, C., and Hackstadt, T. (2012). Evolution and conservation of predicted inclusion membrane proteins in Chlamydiae. Comp. Funct. Genomics 2012:362104. doi: 10.1155/2012/362104

Majeed, M., and Kihlström, E. (1991). Mobilization of F-actin and clathrin during redistribution of Chlamydia trachomatis to an intracellular site in eucaryotic cells. Infect. Immun. 59, 4465–4472.

Mamelak, D., Mylvaganam, M., Whetstone, H., Hartmann, E., Lennarz, W., Wyrick, P. B., et al. (2001). Hsp70s contain a specific sulfogalactolipid binding site. Differential aglycone influence on sulfogalactosyl ceramide binding by recombinant prokaryotic and eukaryotic hsp70 family members. Biochemistry 40, 3572–3582. doi: 10.1021/bi001643u

Martin, S., and Parton, R. G. (2006). Lipid droplets: a unified view of a dynamic organelle. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 373–378. doi: 10.1038/nrm1912

Matsumoto, A., Bessho, H., Uehira, K., and Suda, T. (1991). Morphological studies of the association of mitochondria with Chlamydial inclusions and the fusion of Chlamydial inclusions. J. Electron Microsc. 40, 356–363.

McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., and Fields, K. A. (2017). Fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis reveals a role for Chlamydia trachomatis TmeA in invasion that is independent of host AHNAK. Infect. Immun. 85, e640–17. doi: 10.1128/IAI.00640-17

Mehlitz, A., Banhart, S., Hess, S., Selbach, M., and Meyer, T. F. (2008). Complex kinase requirements for Chlamydia trachomatis Tarp phosphorylation. FEMS Microbiol. Lett. 289, 233–240. doi: 10.1111/j.1574-6968.2008.01390.x

Mehlitz, A., Eylert, E., Huber, C., Lindner, B., Vollmuth, N., Karunakaran, K., et al. (2017). Metabolic adaptation of Chlamydia trachomatis to mammalian host cells. Mol. Microbiol. 103, 1004–1019. doi: 10.1111/mmi.13603

Mehlitz, A., and Rudel, T. (2013). Modulation of host signaling and cellular responses by Chlamydia. Cell Commun. Signal. 11:90. doi: 10.1186/1478-811X-11-90

Millman, K., Black, C. M., Stamm, W. E., Jones, R. B., Hook, E. W., Martin, D. H., et al. (2006). Population-based genetic epidemiologic analysis of Chlamydia trachomatis serotypes and lack of association between ompA polymorphisms and clinical phenotypes. Microbes Infect. 8, 604–611. doi: 10.1016/j.micinf.2005.08.012

Mirrashidi, K. M., Elwell, C. A., Verschueren, E., Johnson, J. R., Frando, A., Von Dollen, J., et al. (2015). Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts Chlamydia infection. Cell Host Microbe 18, 109–121. doi: 10.1016/j.chom.2015.06.004

Mital, J., and Hackstadt, T. (2011a). Diverse requirements for SRC-family tyrosine kinases distinguish Chlamydial species. mBio 2, e31–11. doi: 10.1128/mBio.00031-11

Mital, J., and Hackstadt, T. (2011b). Role for the SRC family kinase Fyn in sphingolipid acquisition by Chlamydiae ? Infect. Immun. 79, 4559–4568. doi: 10.1128/IAI.05692-11

Mital, J., Lutter, E. I., Barger, A. C., Dooley, C. A., and Hackstadt, T. (2015). Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein CT850 interacts with the dynein light chain DYNLT1 (Tctex1). Biochem. Biophys. Res. Commun. 462, 165–170. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.04.116

Mital, J., Miller, N. J., Fischer, E. R., and Hackstadt, T. (2010). Specific Chlamydial inclusion membrane proteins associate with active Src family kinases in microdomains that interact with the host microtubule network. Cell. Microbiol. 12, 1235–1249. doi: 10.1111/j.1462-5822.2010.01465.x

Mölleken, K., Becker, E., and Hegemann, J. H. (2013). The Chlamydia pneumoniae invasin protein Pmp21 recruits the EGF receptor for host cell entry. PLoS Pathog. 9:e1003325. doi: 10.1371/journal.ppat.1003325

Mölleken, K., and Hegemann, J. H. (2008). The Chlamydia outer membrane protein OmcB is required for adhesion and exhibits biovar-specific differences in glycosaminoglycan binding. Mol. Microbiol. 67, 403–419. doi: 10.1111/j.1365-2958.2007.06050.x

Mölleken, K., Schmidt, E., and Hegemann, J. H. (2010). Members of the Pmp protein family of Chlamydia pneumoniae mediate adhesion to human cells via short repetitive peptide motifs. Mol. Microbiol. 78, 1004–1017. doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07386.x

Moore, E. R., Mead, D. J., Dooley, C. A., Sager, J., and Hackstadt, T. (2011). The trans-Golgi SNARE syntaxin 6 is recruited to the Chlamydial inclusion membrane. Microbiol. Read. Engl. 157, 830–838. doi: 10.1099/mic.0.045856-0

Moore, E. R., and Ouellette, S. P. (2014). Reconceptualizing the Chlamydial inclusion as a pathogen-specified parasitic organelle: an expanded role for Inc proteins. Front. Cell. Infect. Microbiol. 4:157. doi: 10.3389/fcimb.2014.00157

Moorhead, A. M., Jung, J.-Y., Smirnov, A., Kaufer, S., and Scidmore, M. A. (2010). Multiple host proteins that function in phosphatidylinositol-4-phosphate metabolism are recruited to the Chlamydial inclusion. Infect. Immun. 78, 1990–2007. doi: 10.1128/IAI.0134009

Mueller, K. E., and Fields, K. A. (2015). Application of β-Lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One 10:e0135295. doi: 10.1371/journal.pone.0135295

Mueller, K. E., Wolf, K., and Fields, K. A. (2016). Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio 7, e1817–15. doi: 10.1128/mBio.01817-15

Mueller, M. P., and Goody, R. S. (2016). Review: Ras GTPases and myosin: qualitative conservation and quantitative diversification in signal and energy transduction. Biopolymers 105, 422–430. doi: 10.1002/bip.22840

Nguyen, B. D., and Valdivia, R. H. (2012). Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1263–1268. doi: 10.1073/pnas.1117884109

Nguyen, P. H., Lutter, E. I., and Hackstadt, T. (2018). Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein MrcA interacts with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 3 (ITPR3) to regulate extrusion formation. PLoS Pathog. 14:e1006911. doi: 10.1371/journal.ppat.1006911

Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., and Stephens, R. S. (2003). Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. J. Bacteriol. 185, 3179–3189. doi: 10.1128/JB.185.10.3179

Norkin, L. C., Wolfrom, S. A., and Stuart, E. S. (2001). Association of caveolin with Chlamydia trachomatis inclusions at early and late stages of infection. Exp. Cell Res. 266, 229–238. doi: 10.1006/excr.2001.5202

Ouellette, S. P. (2018). Feasibility of a conditional knockout system for Chlamydia based on CRISPR interference. Front. Cell. Infect. Microbiol. 8:59. doi: 10.3389/fcimb.2018.00059

Ouellette, S. P., and Carabeo, R. A. (2010). A functional slow recycling pathway of transferrin is required for growth of Chlamydia. Front. Microbiol. 1:112. doi: 10.3389/fmicb.2010.00112

Ouellette, S. P., Dorsey, F. C., Moshiach, S., Cleveland, J. L., and Carabeo, R. A. (2011). Chlamydia species-dependent differences in the growth requirement for lysosomes. PLoS One 6:e0016783. doi: 10.1371/journal.pone.0016783

Pais, S. V., Key, C. E., Borges, V., Pereira, I. S., Gomes, J. P., Fisher, D. J., et al. (2019). CteG is a Chlamydia trachomatis effector protein that associates with the Golgi complex of infected host cells. Sci. Rep. 9:6133. doi: 10.1038/s41598-019-42647-3

Pais, S. V., Milho, C., Almeida, F., and Mota, L. J. (2013). Identification of novel type III secretion chaperone-substrate complexes of Chlamydia trachomatis. PLoS One 8:e56292. doi: 10.1371/journal.pone.0056292

Pannekoek, Y., Spaargaren, J., Langerak, A. A. J., Merks, J., Morré, S. A., and van der Ende, A. (2005). Interrelationship between polymorphisms of incA, fusogenic properties of Chlamydia trachomatis strains, and clinical manifestations in patients in The Netherlands. J. Clin. Microbiol. 43, 2441–2443. doi: 10.1128/JCM.43.5.2441-2443.2005

Panzetta, M. E., Valdivia, R. H., and Saka, H. A. (2018). Chlamydia persistence: a survival strategy to evade antimicrobial effects in-vitro and in-vivo. Front. Microbiol. 9:3101. doi: 10.3389/fmicb.2018.03101

Patel, A. L., Chen, X., Wood, S. T., Stuart, E. S., Arcaro, K. F., Molina, D. P., et al. (2014). Activation of epidermal growth factor receptor is required for Chlamydia trachomatis development. BMC Microbiol. 14:277. doi: 10.1186/s12866-014-0277-4

Paumet, F., Wesolowski, J., Garcia-Diaz, A., Delevoye, C., Aulner, N., Shuman, H. A., et al. (2009). Intracellular bacteria encode inhibitory SNARE-like proteins. PLoS One 4:e7375. doi: 10.1371/journal.pone.0007375

Peris, L., Wagenbach, M., Lafanechère, L., Brocard, J., Moore, A. T., Kozielski, F., et al. (2009). Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. J. Cell Biol. 185, 1159–1166. doi: 10.1083/jcb.200902142

Perutka, J., Wang, W., Goerlitz, D., and Lambowitz, A. M. (2004). Use of computer-designed group II introns to disrupt Escherichia coli DExH/D-box protein and DNA helicase genes. J. Mol. Biol. 336, 421–439. doi: 10.1016/j.jmb.2003.12.009

Peters, J., Onguri, V., Nishimoto, S. K., Marion, T. N., and Byrne, G. I. (2012). The Chlamydia trachomatis CT149 protein exhibits esterase activity in vitro and catalyzes cholesteryl ester hydrolysis when expressed in HeLa cells. Microbes Infect. Inst. Pasteur 14, 1196–1204. doi: 10.1016/j.micinf.2012.07.020

Peters, J., Wilson, D. P., Myers, G., Timms, P., and Bavoil, P. M. (2007). Type III secretion a la Chlamydia. Trends Microbiol. 15, 241–251. doi: 10.1016/j.tim.2007.04.005

Pickering, H., Teng, A., Faal, N., Joof, H., Makalo, P., Cassama, E., et al. (2017). Genome-wide profiling of humoral immunity and pathogen genes under selection identifies immune evasion tactics of Chlamydia trachomatis during ocular infection. Sci. Rep. 7:9634. doi: 10.1038/s41598-017-09193-2

Piper, R. C., and Luzio, J. P. (2001). Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. Traffic Cph. Den. 2, 612–621. doi: 10.1034/j.1600-0854.2001.20904.x

Pokrovskaya, I. D., Szwedo, J. W., Goodwin, A., Lupashina, T. V., Nagarajan, U. M., and Lupashin, V. V. (2012). Chlamydia trachomatis hijacks intra-Golgi COG complex-dependent vesicle trafficking pathway. Cell. Microbiol. 14, 656–668. doi: 10.1111/j.1462-5822.2012.01747.x

Prakash, H., Becker, D., Böhme, L., Albert, L., Witzenrath, M., Rosseau, S., et al. (2009). cIAP-1 controls innate immunity to C. pneumoniae pulmonary infection. PLoS One 4:e6519. doi: 10.1371/journal.pone.0006519

Pruneda, J. N., Bastidas, R. J., Bertsoulaki, E., Swatek, K. N., Santhanam, B., Clague, M. J., et al. (2018). A Chlamydia effector combining deubiquitination and acetylation activities induces Golgi fragmentation. Nat. Microbiol. 3, 1377–1384. doi: 10.1038/s41564-018-0271-y

Puolakkainen, M., Kuo, C.-C., and Campbell, L. A. (2005). Chlamydia pneumoniae uses the mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor 2 receptor for infection of endothelial cells. Infect. Immun. 73, 4620–4625. doi: 10.1128/IAI.73.8.4620-4625.2005

Qi, L. S., Larson, M. H., Gilbert, L. A., Doudna, J. A., Weissman, J. S., Arkin, A. P., et al. (2013). Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173–1183. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.022

Rahnama, M., and Fields, K. A. (2018). Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of Chlamydial infection biology. Microbes Infect. 20, 445–450. doi: 10.1016/j.micinf.2018.01.002

Rajalingam, K., Sharma, M., Lohmann, C., Oswald, M., Thieck, O., Froelich, C. J., et al. (2008). Mcl-1 Is a key regulator of apoptosis resistance in Chlamydia trachomatis-infected cells. PLoS One 3:e0003102. doi: 10.1371/journal.pone.0003102

Rajeeve, K., Das, S., Prusty, B. K., and Rudel, T. (2018). Chlamydia trachomatis paralyses neutrophils to evade the host innate immune response. Nat. Microbiol. 3, 824–835. doi: 10.1038/s41564-018-0182-y

Read, T. D. (2003). Genome sequence of Chlamydophila caviae (Chlamydia psittaci GPIC): examining the role of niche-specific genes in the evolution of the Chlamydiaceae. Nucleic Acids Res. 31, 2134–2147. doi: 10.1093/nar/gkg321

Read, T. D., Brunham, R. C., Shen, C., Gill, S. R., Heidelberg, J. F., White, O., et al. (2000). Genome sequences of Chlamydia trachomatis MoPn and Chlamydia pneumoniae AR39. Nucleic Acids Res. 28, 1397–1406. doi: 10.1093/nar/28.6.1397

Reiling, J. H., Olive, A. J., Sanyal, S., Carette, J. E., Brummelkamp, T. R., Ploegh, H. L., et al. (2013). A Luman/CREB3–ADP-ribosylation factor 4 (ARF4) signaling pathway mediates the response to Golgi stress and susceptibility to pathogens. Nat. Cell Biol. 15, 1473–1485. doi: 10.1038/ncb2865

Reynolds, D. J., and Pearce, J. H. (1990). Characterization of the cytochalasin D-resistant (pinocytic) mechanisms of endocytosis utilized by Chlamydiae. Infect. Immun. 58, 3208–3216.

Richards, T. S., Knowlton, A. E., and Grieshaber, S. S. (2013). Chlamydia trachomatis homotypic inclusion fusion is promoted by host microtubule trafficking. BMC Microbiol. 13:185. doi: 10.1186/1471-2180-13-185

Ridderhof, J. C., and Barnes, R. C. (1989). Fusion of inclusions following superinfection of HeLa cells by two serovars of Chlamydia trachomatis. Infect. Immun. 57, 3189–3193.

Rockey, D. D., Scidmore, M. A., Bannantine, J. P., and Brown, W. J. (2002). Proteins in the Chlamydial inclusion membrane. Microbes Infect. 4, 333–340. doi: 10.1016/s1286-4579(02)01546-0

Ronzone, E., and Paumet, F. (2013). Two coiled-coil domains of Chlamydia trachomatis IncA affect membrane fusion events during infection. PLoS One 8:e69769. doi: 10.1371/journal.pone.0069769

Rzomp, K. A., Moorhead, A. R., and Scidmore, M. A. (2006). The GTPase Rab4 interacts with Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein CT229. Infect. Immun. 74, 5362–5373. doi: 10.1128/IAI.00539-06

Rzomp, K. A., Scholtes, L. D., Briggs, B. J., Whittaker, G. R., and Scidmore, M. A. (2003). Rab GTPases are recruited to Chlamydial inclusions in both a species-dependent and species-independent manner. Infect. Immun. 71, 5855–5870. doi: 10.1128/IAI.71.10.5855-5870.2003

Sachse, K., Laroucau, K., Riege, K., Wehner, S., Dilcher, M., Creasy, H. H., et al. (2014). Evidence for the existence of two new members of the family Chlamydiaceae and proposal of Chlamydia avium sp. nov. and Chlamydia gallinacea sp. nov. Syst. Appl. Microbiol. 37, 79–88. doi: 10.1016/j.syapm.2013.12.004

Saka, H. A., Thompson, J. W., Chen, Y.-S., Dubois, L. G., Haas, J. T., Moseley, A., et al. (2015). Chlamydia trachomatis infection leads to defined alterations to the lipid droplet proteome in epithelial cells. PLoS One 10:e0124630. doi: 10.1371/journal.pone.0124630

Saka, H. A., Thompson, J. W., Chen, Y.-S., Kumar, Y., Dubois, L. G., Moseley, M. A., et al. (2011). Quantitative proteomics reveals metabolic and pathogenic properties of Chlamydia trachomatis developmental forms. Mol. Microbiol. 82, 1185–1203. doi: 10.1111/j.1365-2958.2011.07877.x

Samanta, D., Mulye, M., Clemente, T. M., Justis, A. V., and Gilk, S. D. (2017). Manipulation of host cholesterol by obligate intracellular bacteria. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7:165. doi: 10.3389/fcimb.2017.00165

Sarkar, A., Möller, S., Bhattacharyya, A., Behnen, M., Rupp, J., van Zandbergen, G., et al. (2015). Mechanisms of apoptosis inhibition in Chlamydia pneumoniae-infected neutrophils. Int. J. Med. Microbiol. 305, 493–500. doi: 10.1016/j.ijmm.2015.04.006

Schwöppe, C., Winkler, H. H., and Neuhaus, H. E. (2002). Properties of the glucose-6-phosphate transporter from Chlamydia pneumoniae (HPTcp) and the glucose-6-phosphate sensor from Escherichia coli (UhpC). J. Bacteriol. 184, 2108–2115. doi: 10.1128/JB.184.8.2108-2115.2002

Scidmore, M. A., Fischer, E. R., and Hackstadt, T. (2003). Restricted fusion of Chlamydia trachomatis vesicles with endocytic compartments during the initial stages of infection. Infect. Immun. 71, 973–984. doi: 10.1128/IAI.71.2.973-984.2003

Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Fischer, E. R., Heinzen, R. A., and Hackstadt, T. (1996). Vesicular interactions of the Chlamydia trachomatis inclusion are determined by Chlamydial early protein synthesis rather than route of entry. Infect. Immun. 64, 5366–5372.

Seabra, M. C., and Wasmeier, C. (2004). Controlling the location and activation of Rab GTPases. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 451–457. doi: 10.1016/j.ceb.2004.06.014

Seth-Smith, H. M. B., Harris, S. R., Persson, K., Marsh, P., Barron, A., Bignell, A., et al. (2009). Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics 10:239. doi: 10.1186/1471-2164-10-239

Sharma, M., Recuero-Checa, M. A., Fan, F. Y., and Dean, D. (2018). Chlamydia trachomatis regulates growth and development in response to host cell fatty acid availability in the absence of lipid droplets. Cell. Microbiol. 20:e12801. doi: 10.1111/cmi.12801

Sherrid, A. M., and Hybiske, K. (2017). Chlamydia trachomatis cellular exit alters interactions with host dendritic cells. Infect. Immun. 85, e46–17. doi: 10.1128/IAI.00046-17

Sherry, J., Elwell, C., Bastidas, R., Valdivia, R., and Engel, J. (2018). “Role of C. trachomatis inclusion membrane protein CT192,” in Proceedings of 14th International Society for Human Chlamydia Infections Meeting, Zeist, Netherlands: Woudschoten.

Shima, K., Wanker, M., Skilton, R. J., Cutcliffe, L. T., Schnee, C., Kohl, T. A., et al. (2018). The Genetic Transformation of Chlamydia pneumoniae. mSphere 3. doi: 10.1128/mSphere.00412-18

Silva-Herzog, E., Joseph, S. S., Avery, A. K., Coba, J. A., Wolf, K., Fields, K. A., et al. (2011). Scc1 (CP0432) and Scc4 (CP0033) function as a type III secretion chaperone for CopN of Chlamydia pneumoniae. J. Bacteriol. 193, 3490–3496. doi: 10.1128/JB.00203-11

Slepenkin, A., de la Maza, L. M., and Peterson, E. M. (2005). Interaction between components of the type III secretion system of Chlamydiaceae. J. Bacteriol. 187, 473–479. doi: 10.1128/JB.187.2.473-479.2005

Snavely, E. A., Kokes, M., Dunn, J. D., Saka, H. A., Nguyen, B. D., Bastidas, R. J., et al. (2014). Reassessing the role of the secreted protease CPAF in Chlamydia trachomatis infection through genetic approaches. Pathog. Dis. 71, 336–351. doi: 10.1111/2049-632X.12179

Song, L., Carlson, J. H., Whitmire, W. M., Kari, L., Virtaneva, K., Sturdevant, D. E., et al. (2013). Chlamydia trachomatis plasmid-encoded Pgp4 is a transcriptional regulator of virulence-associated genes. Infect. Immun. 81, 636–644. doi: 10.1128/IAI.01305-12

Soupene, E., Wang, D., and Kuypers, F. A. (2015). Remodeling of host phosphatidylcholine by Chlamydia acyltransferase is regulated by acyl-CoA binding protein ACBD6 associated with lipid droplets. Microbiologyopen 4, 235–251. doi: 10.1002/mbo3.234

Stallmann, S., and Hegemann, J. H. (2016). The Chlamydia trachomatis Ctad1 invasin exploits the human integrin beta1 receptor for host cell entry. Cell. Microbiol. 18, 761–775. doi: 10.1111/cmi.12549

Stanhope, R., Flora, E., Bayne, C., and Derre, I. (2017). IncV, a FFAT motif-containing Chlamydia protein, tethers the endoplasmic reticulum to the pathogen-containing vacuole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, 12039–12044. doi: 10.1073/pnas.1709060114

Steele, L. N., Balsara, Z. R., and Starnbach, M. N. (2004). Hematopoietic cells are required to initiate a Chlamydia trachomatis-Specific CD8+ T cell response. J. Immunol. 173, 6327–6337. doi: 10.4049/jimmunol.173.10.6327

Stephens, R. S., Kalman, S., Lammel, C., Fan, J., Marathe, R., Aravind, L., et al. (1998). Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis. Science 282, 754–759. doi: 10.1126/science.282.5389.754

Stothard, D. R., Boguslawski, G., and Jones, R. B. (1998). Phylogenetic analysis of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein and examination of potential pathogenic determinants. Infect. Immun. 66, 3618–3625.

Struyve, M., Moons, M., and Tommassen, J. (1991). Carboxy-terminal phenylalanine is essential for the correct assembly of a bacterial outer membrane protein. J. Mol. Biol. 218, 141–148. doi: 10.1016/0022-2836(91)90880-F

Stuart, E. S., Webley, W. C., and Norkin, L. C. (2003). Lipid rafts, caveolae, caveolin-1, and entry by Chlamydiae into host cells. Exp. Cell Res. 287, 67–78. doi: 10.1016/s0014-4827(03)00059-4

Su, H., and Caldwell, H. D. (1991). In vitro neutralization of Chlamydia trachomatis by monovalent Fab antibody specific to the major outer membrane protein. Infect. Immun. 59, 2843–2845.

Su, H., McClarty, G., Dong, F., Hatch, G. M., Pan, Z. K., and Zhong, G. (2004). Activation of Raf/MEK/ERK/cPLA2 signaling pathway is essential for Chlamydial acquisition of host glycerophospholipids. J. Biol. Chem. 279, 9409–9416. doi: 10.1074/jbc.M312008200

Su, H., Watkins, N. G., Zhang, Y. X., and Caldwell, H. D. (1990). Chlamydia trachomatis-host cell interactions: role of the Chlamydial major outer membrane protein as an adhesin. Infect. Immun. 58, 1017–1025.

Su, H. U. A., Raymond, L., Rockey, D. D., Fischert, E., Hackstadt, T. E. D., and Caldwell, H. D. (1996). A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11143–11148. doi: 10.1073/pnas.93.20.11143

Subbarayal, P., Karunakaran, K., Winkler, A.-C., Rother, M., Gonzalez, E., Meyer, T. F., et al. (2015). EphrinA2 receptor (EphA2) is an invasion and intracellular signaling receptor for Chlamydia trachomatis. PLoS Pathog. 11:e1004846. doi: 10.1371/journal.ppat.1004846

Subtil, A., Wyplosz, B., Balañá, M. E., and Dautry-Varsat, A. (2004). Analysis of Chlamydia caviae entry sites and involvement of Cdc42 and Rac activity. J. Cell Sci. 117, 3923–3933. doi: 10.1242/jcs.01247

Suchland, R. J., Rockey, D. D., Bannantine, J. P., and Stamm, W. E. (2000). Isolates of Chlamydia trachomatis that occupy nonfusogenic inclusions lack IncA, a protein localized to the inclusion membrane. Infect. Immun. 68, 360–367. doi: 10.1128/iai.68.1.360-367.2000

Südhof, T., and Rothman, J. (2009). Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science 323, 474–477. doi: 10.1016/j.surg.2006.10.010.Use

Sugiki, T., Takeuchi, K., Yamaji, T., Takano, T., Tokunaga, Y., Kumagai, K., et al. (2012). Structural basis for the Golgi association by the pleckstrin homology domain of the ceramide trafficking protein (CERT). J. Biol. Chem. 287, 33706–33718. doi: 10.1074/jbc.M112.367730

Sun, S., Cheng, B., Wu, X., Wu, Q., Qi, B., Wu, J., et al. (2014). Chlamydia pneumoniae disrupts lipid metabolism in human umbilical vein endothelial cells. Mol. Med. Rep. 10, 1150–1156. doi: 10.3892/mmr.2014.2295

Tam, J. E., Davis, C. H., and Wyrick, P. B. (1994). Expression of recombinant DNA introduced into Chlamydia trachomatis by electroporation. Can. J. Microbiol. 40, 583–591. doi: 10.1139/m94-093

Taraska, T., Ward, D. M., Ajioka, R. S., Wyrick, P. B., Davis-Kaplan, S. R., Davis, C. H., et al. (1996). The late Chlamydial inclusion membrane is not derived from the endocytic pathway and is relatively deficient in host proteins. Infect. Immun. 64, 3713–3727.

Thalmann, J., Janik, K., May, M., Sommer, K., Ebeling, J., Hofmann, F., et al. (2010). Actin re-organization induced by Chlamydia trachomatis serovar D - evidence for a critical role of the effector protein CT166 targeting rac. PLoS One 5:e9887. doi: 10.1371/journal.pone.0009887

Thomson, N. R., Yeats, C., Bell, K., Holden, M. T. G., Bentley, S. D., Livingstone, M., et al. (2005). The Chlamydophila abortus genome sequence reveals an array of variable proteins that contribute to interspecies variation. Genome Res. 15, 629–640. doi: 10.1101/gr.3684805

Tjaden, J., Winkler, H. H., Schwöppe, C., Van Der Laan, M., and Neuhaus, H. E. (1999). Two Nucleotide transport proteins in Chlamydia trachomatis, one for net nucleoside triphosphate uptake and the other for transport of energy. J. Bacteriol. 181, 1196–1202.

Todd, W. J., and Caldwell, H. D. (1985). The interaction of Chlamydia trachomatis with host cells: ultrastructural studies of the mechanism of release of a biovar II strain from HeLa 229 cells. J. Infect. Dis. 151, 1037–1044. doi: 10.1093/infdis/151.6.1037

Trentmann, O., Jung, B., Neuhaus, H. E., and Haferkamp, I. (2008). Nonmitochondrial ATP/ADP transporters accept phosphate as third substrate. J. Biol. Chem. 283, 36486–36493. doi: 10.1074/jbc.M806903200

Valdivia, R., and Bastidas, R. (2018). The expanding molecular genetics tool kit in Chlamydia. J. Bacteriol. 200, e590–18. doi: 10.1128/JB.00590-18

Valdivia, R. H. (2008). Chlamydia effector proteins and new insights into Chlamydial cellular microbiology. Curr. Opin. Microbiol. 11, 53–59. doi: 10.1016/j.mib.2008.01.003

Van Lent, S., De Vos, W. H., Huot Creasy, H., Marques, P. X., Ravel, J., Vanrompay, D., et al. (2016). Analysis of polymorphic membrane protein expression in cultured cells identifies PmpA and PmpH of Chlamydia psittaci as candidate factors in pathogenesis and immunity to infection. PLoS One 11:e0162392. doi: 10.1371/journal.pone.0162392

Van Ooij, C., Kalman, L., van IJzendoorn, S., Nishijima, M., Hantada, K., Mostov, K., et al. (2000). Host-cell derived sphingolipids are required for the intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Cell Microbiol. 2, 627–638.

van Weering, J. R. T., Verkade, P., and Cullen, P. J. (2012). SNX-BAR-mediated endosome tubulation is co-ordinated with endosome maturation. Traffic 13, 94–107. doi: 10.1111/j.1600-0854.2011.01297.x

Vandahl, B. B., Pedersen, A. S., Gevaert, K., Holm, A., Vandekerckhove, J., Christiansen, G., et al. (2002). The expression, processing and localization of polymorphic membrane proteins in Chlamydia pneumoniae strain CWL029. BMC Microbiol. 2:36. doi: 10.1186/1471-2180-2-36

Vandahl, B. B. S., Birkelund, S., and Christiansen, G. (2004). Genome and proteome analysis of Chlamydia. Proteomics 4, 2831–2842. doi: 10.1002/pmic.200400940

Vanrompay, D., Charlier, G., Ducatelle, R., and Haesebrouck, F. (1996). Ultrastructural changes in avian Chlamydia psittaci serovar A-, B-, and D-infected Buffalo Green Monkey cells. Infect. Immun. 64, 1265–1271.

Vasilevsky, S., Stojanov, M., Greub, G., Baud, D., Vasilevsky, S., Stojanov, M., et al. (2016). Chlamydial polymorphic membrane proteins: regulation, function and potential vaccine candidates. Virulence 7, 11–22. doi: 10.1080/21505594.2015.1111509

Voigt, A., Schöfl, G., Heidrich, A., Sachse, K., and Saluz, H. P. (2011). Full-length de novo sequence of the Chlamydophila psittaci type strain, 6BC. J. Bacteriol. 193, 2662–2663. doi: 10.1128/JB.00236-11

Volceanov, L., Herbst, K., Biniossek, M., Schilling, O., Haller, D., Nolke, T., et al. (2014). Septins arrange F-actin-containing fibers on the Chlamydia trachomatis inclusion and are required for normal release of the inclusion by extrusion. mBio 5, e01802–14. doi: 10.1128/mBio.01802-14

Wagner, C. A., Lang, F., and Bröer, S. (2001). Function and structure of heterodimeric amino acid transporters. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, C1077–C1093. doi: 10.1152/ajpcell.2001.281.4.C1077

Wang, X., Hybiske, K., and Stephens, R. S. (2017). Orchestration of the mammalian host cell glucose transporter proteins-1 and 3 by Chlamydia contributes to intracellular growth and infectivity. Pathog. Dis. 75:ftx108. doi: 10.1093/femspd/ftx108

Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., and Clarke, I. N. (2011). Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7:e1002258. doi: 10.1371/journal.ppat.1002258

Ward, M. E., and Murray, A. (1984). Control mechanisms governing the infectivity of Chlamydia trachomatis for HeLa cells: mechanisms of endocytosis. J. Gen. Microbiol. 130, 1765–1780. doi: 10.1099/00221287-130-7-1765

Weber, M. M., Lam, J. L., Dooley, C. A., Noriea, N. F., Hansen, B. T., Hoyt, F. H., et al. (2017). Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Rep. 19, 1406–1417. doi: 10.1016/j.celrep.2017.04.058

Webley, W. C., Norkin, L. C., and Stuart, E. S. (2004). Caveolin-2 associates with intracellular Chlamydial inclusions independently of caveolin-1. BMC Infect. Dis. 4:23. doi: 10.1186/1471-2334-4-23

Wehrl, W., Brinkmann, V., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., and Szczepek, A. J. (2004). From the inside out–processing of the Chlamydial autotransporter PmpD and its role in bacterial adhesion and activation of human host cells. Mol. Microbiol. 51, 319–334. doi: 10.1046/j.1365-2958.2003.03838.x

Wesolowski, J., Weber, M. M., Nawrotek, A., Dooley, C. A., Calderon, M., St Croix, C. M., et al. (2017). Chlamydia hijacks ARF GTPases to coordinate microtubule posttranslational modifications and Golgi complex positioning. mBio 8, e2280–16. doi: 10.1128/mBio.02280-16

Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., and Hefty, P. S. (2013). Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One 8:e76743. doi: 10.1371/journal.pone.0076743

Woodman, P. G., and Futter, C. E. (2008). Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 408–414. doi: 10.1016/j.ceb.2008.04.001

Wylie, J. L., Hatch, G. M., and Mcclarty, G. (1997). Host cell phospholipids are trafficked to and then modified by Chlamydia trachomatis. J. Bacteriol. 179, 7233–7242. doi: 10.1128/jb.179.23.7233-7242.1997

Wyrick, P. B., Choong, J., Davis, C. H., Knight, S. T., Royal, M. O., Maslow, A. S., et al. (1989). Entry of genital Chlamydia trachomatis into polarized human epithelial cells. Infect. Immun. 57, 2378–2389.

Xie, G., Bonner, C. A., and Jensen, R. A. (2002). Dynamic diversity of the tryptophan pathway in Chlamydiae: reductive evolution and a novel operon for tryptophan recapture. Genome Biol. 3, .1–.0051.

Yanagida, O., Kanai, Y., Chairoungdua, A., Kim, D. K., Segawa, H., Nii, T., et al. (2001). Human L-type amino acid transporter 1 (LAT1): characterization of function and expression in tumor cell lines. Biochim. Biophys. Acta 1514, 291–302. doi: 10.1016/S0005-2736(01)00384-4

Yang, C., Starr, T., Song, L., Carlson, J. H., Sturdevant, G. L., Beare, P. A., et al. (2015). Chlamydial lytic exit from host cells is plasmid regulated. mBio 6, e1648–15. doi: 10.1128/mBio.01648-15

Yang, J. (1997). Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 275, 1129–1132. doi: 10.1126/science.275.5303.1129

Zhang, J., and Stephens, R. S. (1992). Mechanism of C. trachomatis attachment to eukaryotic host cells. Cell 69, 861–869. doi: 10.1016/0092-8674(92)90296-o

Zhao, G.-J., Mo, Z.-C., Tang, S.-L., Ouyang, X.-P., He, P.-P., Lv, Y.-C., et al. (2014). Chlamydia pneumoniae negatively regulates ABCA1 expression via TLR2-Nuclear factor-kappa B and miR-33 pathways in THP-1 macrophage-derived foam cells. Atherosclerosis 235, 519–525. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2014.05.943

Ziklo, N., Huston, W. M., Hocking, J. S., and Timms, P. (2016). Chlamydia trachomatis genital tract infections: when host immune response and the microbiome collide. Trends Microbiol. 24, 750–765. doi: 10.1016/j.tim.2016.05.007

Zuck, M., Ellis, T., Venida, A., and Hybiske, K. (2017). Extrusions are phagocytosed and promote Chlamydia survival within macrophages. Cell. Microbiol. 19:e12683. doi: 10.1111/cmi.12683

 

SUMBER:

Arlieke Gitsels, Niek Sanders, Daisy Vanrompay. 2019. Chlamydial Infection from Outside to Insite. Front. Microbiol., Sec. Infectious Agents and Disease. Vol 10. 09 October 2019. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02329.