Deteksi Coxiella burnetii dari Spesimen Klinis dengan PCR

 

RINGKASAN

Untuk deteksi PCR Coxiella burnetii dalam berbagai spesimen klinis, kami mengembangkan metode preparasi sampel di mana pengikatan silika DNA digunakan. Metode ini ternyata cepat, mudah dilakukan dengan jumlah sampel yang besar, dan sama sensitifnya untuk semua spesimen yang diuji (hati, limpa, plasenta, katup jantung, susu, darah). Metode preparasi DNA yang dijelaskan di sini juga dapat digunakan sebagai langkah awal dalam pemeriksaan spesimen berbasis PCR. Prosedur ini diuji dengan lebih dari 600 sampel susu, yang diambil dari 21 ekor sapi yang seropositif C. burnetii dan dilaporkan memiliki masalah kesuburan (dan karena itu dicurigai melepaskan agen melalui susu sebentar-sebentar atau terus-menerus). Dari 21 ekor sapi yang diuji, 6 ekor melepaskan C. burnetii melalui susu. Secara keseluruhan, DNA C. burnetii terdeteksi pada 6% sampel. Tidak ada korelasi antara pola shedding dan hasil serologis.

 

PENGANTAR

Coxiella burnetii adalah agen penyebab demam Q, zoonosis yang terjadi di seluruh dunia (12). Hewan yang terinfeksi, terutama ternak, dianggap sebagai sumber penularan terpenting ke manusia (9). Sedangkan hewan pada umumnya tidak menunjukkan tanda-tanda klinis infeksi kecuali aborsi sesekali dan masalah reproduksi lainnya, C. burnetii dapat menyebabkan penyakit serius pada manusia. Agen ini sangat tahan terhadap pengaruh lingkungan, dan bahkan satu partikel infektif dapat memulai infeksi pada model hewan (16).

 

Pentingnya infeksi melalui rute oral (misalnya, dengan minum susu yang tidak dipasteurisasi) masih menjadi bahan diskusi (2, 5, 7, 20, 22). Bahkan jika tingkat rata-rata yang dikeluarkan jauh lebih rendah, hingga 10⁵ coxiellae/ml dapat ditumpahkan dalam susu sapi selama beberapa periode laktasi (3, 20, 23). Oleh karena itu, sistem diagnostik yang spesifik dan sensitif diperlukan untuk mendeteksi bahkan sejumlah kecil coxiellae.

 

Kultur sel masih digunakan sebagai alat sensitif untuk deteksi rutin C. burnetii, yang merupakan bakteri obligat intraseluler, tetapi metode ini relatif memakan waktu. Sebuah capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) juga secara rutin digunakan untuk diagnosis infeksi C. burnetii (24); metode ini lebih cepat daripada tes kultur sel, tetapi batas deteksi tidak sepenuhnya memuaskan, mengingat tingkat pelepasan yang rendah dan dosis infeksi C. burnetii yang minimum.

 

PCR adalah metode deteksi yang sangat sensitif dan spesifik yang telah digunakan sebelumnya untuk melacak C. burnetii dalam sampel klinis (6, 13, 14, 26, 27). PCR yang dilakukan dengan primer berdasarkan elemen transposonlike berulang (Trans-PCR) (26) terbukti sangat spesifik dan sensitif, tetapi ekstraksi DNA dari sampel susu membutuhkan banyak usaha dan ada risiko tinggi kontaminasi karena banyaknya langkah-langkah persiapan.

 

Teknik di mana matriks silika digunakan telah berhasil digunakan untuk memurnikan DNA bakteri dari berbagai sumber untuk PCR (4, 8, 15, 25). Oleh karena itu, kami mengembangkan prosedur di mana matriks silika digunakan untuk ekstraksi DNA dalam penelitian ini, dan prosedur ini digabungkan dengan Trans-PCR untuk mendeteksi C. burnetii. Tujuan kami adalah untuk mengembangkan metode diagnostik yang cepat, murah, aman, dan sangat sensitif untuk mendeteksi C. burnetii dalam berbagai spesimen klinis. Selain itu, penerapan metode baru ini pada sampel susu dimaksudkan untuk menunjukkan kesesuaian sistem baru untuk diagnostik rutin dan untuk mengumpulkan informasi baru tentang pelepasan C. burnetii melalui susu sapi.

 

BAHAN DAN METODE

Organisme dan kondisi pertumbuhan.

C. burnetii Nine Mile fase I ditanam dalam kultur sel monyet hijau kerbau seperti yang dijelaskan sebelumnya (1) dan digunakan untuk mengkontaminasi spesimen. Sel monyet hijau kerbau diperbanyak dalam medium esensial minimal Eagle dan diinokulasi dengan C. burnetii. Supernatan kultur sel dipanen setiap minggu dan disonikasi untuk melepaskan agen infeksi dari sel. Puing-puing sel dihilangkan dengan sentrifugasi, dan pelet bakteri disuspensikan kembali dalam 0,15 M NaCl yang mengandung 0,04% NaN₃. Coxiellae yang panas tidak aktif (80 ° C, 15 menit), dan jumlah coxiellae di setiap suspensi ditentukan dengan mengukur densitas optik pada 420 nm. Konsentrasi sel riketsia dihitung dengan menggunakan kurva standar yang telah ditentukan sebelumnya. Suspensi rickettsial disimpan pada suhu 4°C sampai digunakan.

 

Sampel.

Sampel darah, susu, plasenta sapi, katup jantung babi, hati sapi, dan limpa domba diuji. Hati, limpa, dan katup jantung disediakan oleh rumah potong hewan setempat. Plasenta, darah, dan susu disumbangkan oleh klinik kebidanan dan kandungan setempat untuk hewan. Pengambilan sampel ELISA- dan PCR-negatif disimpan pada suhu -20 °C dan digunakan untuk kontaminasi buatan atau sebagai kontrol negatif.

 

Sampel susu yang digunakan dalam survei dikumpulkan setiap hari dari 21 sapi di empat peternakan sapi perah dan disimpan pada -20 ° C. Penurunan kesuburan telah dilaporkan untuk ternak. Sapi yang dipilih ditemukan serologis positif pada pemeriksaan sebelumnya, seperti yang ditentukan oleh ELISA atau CFT. Tidak ada indikasi mastitis pada sapi yang diperiksa, dan sampel susu menunjukkan konsistensi fisiologis.

 

Ekstraksi DNA.

Bagian (25 mg) dari jaringan hewan yang disebutkan di atas secara mekanis dihomogenisasi dalam 180 μl saline buffer fosfat. Untuk sampel susu dan darah, volume sampel 200 μl digunakan. Sel dilisiskan dengan proteinase K (konsentrasi akhir, 200 g/ml) pada 56°C semalaman. DNA disiapkan dengan kit pemurnian Prep-A-Gene (Bio-Rad, Munich, Jerman) dengan menggunakan 10 μl matriks silika. DNA dielusi dari matriks silika dengan menambahkan 100 μl buffer elusi Prep-A-Gene. Untuk meningkatkan hasil, DNA dielusi pada 56 ° C selama 5 menit dan disentrifugasi lagi. Satu mikroliter supernatan yang mengandung DNA digunakan untuk amplifikasi.

 

Sampel yang digunakan untuk uji sensitivitas terkontaminasi dengan 10⁴ sampai 100 coxiellae/sampel. Sampel yang digunakan sebagai kontrol positif terkontaminasi 10⁴ partikel/sampel. Kontrol diperlakukan seperti sampel. Setiap sampel susu diuji dalam rangkap tiga.

 

Oligonukleotida.

Primer Trans1 (5′-TAT GTA TCC ACC GTA GCC AGT C-3′), Trans2 (5′-CCC AAC AAC ACC TCC TTA TTC-3′) (26), Trans3 (5′-GTA ACG ATG CGC AGG CGA T-3′), dan Trans4 (5′-CCA CCG CTT CGC TCG CTA-3′) dibeli dari MWG Biotech (Ebersberg, Jerman).

 

Pemeriksaan PCR.

Trans-PCR dilakukan dengan menggunakan protokol yang dijelaskan sebelumnya (26) kecuali bahwa program siklus termal telah dimodifikasi. Primer Trans1 dan Trans2 mengapit urutan target 687-bp di wilayah berulang transposonlike genom C. burnetii.

Satu mikroliter dari setiap sampel digunakan untuk amplifikasi PCR. Total volume reaksi adalah 20 μl, dan setiap campuran reaksi mengandung setiap primer pada konsentrasi 1 M, setiap deoksinukleosida trifosfat (Roth, Karlsruhe, Jerman) pada konsentrasi 200 M, buffer reaksi (20 mM Tris-HCl [pH 9.0 ], 8 mM amonium sulfat, 1,5 mM MgCl2), dan 0,2 U Tfl DNA polimerase (Biozym, Hameln, Jerman). DNA dari 10⁴ coxiellae dan air suling ganda sebagai pengganti DNA digunakan masing-masing untuk menyiapkan kontrol positif dan negatif.

 

Uji PCR dilakukan dengan model 9600 thermal cycler (ABI/Perkin-Elmer, Weiterstadt, Jerman) di bawah kondisi berikut: lima siklus terdiri dari denaturasi pada 94°C selama 30 detik, anil pada 77 hingga 69°C (suhu penurunan 2°C antara langkah berurutan) selama 15 detik, dan ekstensi pada 77°C selama 1 menit dan kemudian 38 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94°C selama 30 detik, annealing pada 67°C selama 30 detik, dan ekstensi pada 77° C selama 1 menit. Sepuluh mikroliter produk PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa dan divisualisasikan dengan pewarnaan etidium bromida dan transiluminasi UV.

 

Pengurutan/ Sequencing.

Reaksi sekuensing nonradioaktif dilakukan dengan kit pengurutan siklus terminator dye-deoxy siap reaksi PRISM (Perkin-Elmer/ABI) seperti yang direkomendasikan oleh pabrikan.

 

Analisis urutan/ Sequencing.

Analisis urutan DNA dilakukan dengan paket perangkat lunak DNASTAR (DNASTAR Inc., London, Inggris Raya).

 

HASIL

Sensitivitas PCR.

Sensitivitas analitik dari Trans-PCR ditemukan 100 (kadang-kadang bahkan 10−1) partikel C. burnetii per campuran reaksi. Tes sensitivitas yang dilakukan dengan spesimen klinis yang terkontaminasi artifisial mengungkapkan batas deteksi 4.000 partikel/g jaringan (Gbr.1) dan 500 partikel/ml ketika darah atau susu digunakan(Gbr.2 ). Nilai-nilai ini sesuai dengan 1 partikel per campuran PCR.

                                                    Gambar 1

Sensitivitas Trans-PCR spesifik C. burnetii dengan sampel hati setelah preparasi DNA dengan matriks silika. Jalur 1, kontrol negatif dengan hati; jalur 2, 4 × 10⁵ C. partikel burnetii/g hati; jalur 3, 4 × 10⁴ partikel C. burnetii/g hati; jalur 4, 4 × 10³ partikel C. burnetii/g hati; jalur 5, 4 × 10¹ partikel C. burnetii/g hati; jalur 6, 4 × 100 partikel C. burnetii/g hati; jalur 7, kontrol negatif tanpa hati; jalur 8, tangga DNA 100-bp; jalur 9, kontrol positif tanpa hati.

 

                               Gambar 2

Sensitivitas Trans-PCR spesifik C. burnetii dengan sampel susu setelah preparasi DNA dengan matriks silika. Jalur 1, kontrol negatif dengan susu; jalur 2, 5 × 10⁴ partikel C. burnetii/g susu; jalur 3, 5 × 103 partikel C. burnetii/ml susu; jalur 4, 5 × 10² partikel C. burnetii/ml susu; jalur 5, 5 × 10¹ partikel C. burnetii/ml susu; jalur 6, 5 × 100 partikel C. burnetii/ml susu; jalur 7, kontrol negatif tanpa susu; jalur 8, tangga DNA 100-bp; jalur 9, kontrol positif tanpa susu.

 

Pengurutan/ Sequencing

Untuk memverifikasi identitas amplikon PCR, dilakukan sekuensing lengkap menggunakan primer PCR Trans1 dan Trans2, serta dua primer internal (Trans3 dan Trans4). Dalam semua kasus, urutan amplikon identik dengan urutan dalam database EMBL/GenBank (aksesi no. M80806).

 

Deteksi DNA C. burnetii

Dalam sampel susu klinis.

Selama survei 1 bulan dilakukan dengan sapi seropositif, hanya 6 ekor dari 21 ekor sapi diperiksa coxiellae diekskresikan dalam susu; 2 ekor dari 21 sapi melepaskan coxiellae melalui susu satu kali, 1 ekor melepaskan coxiellae dalam 2 hari, 1 ekor melepaskan coxiellae dalam 3 hari, dan 1 ekor melepaskan coxiellae dalam 6 hari. Biasanya, shedding tidak koheren. Hanya satu ekor yang menunjukkan pelepasan agen yang hampir terus menerus melalui susu selama 23 hari. Tidak ada korelasi antara hasil serologis dan pola pelepasan coxiellae dalam susu, kami juga tidak mengamati hubungan antara tanggal melahirkan terakhir dan pelepasan C. burnetii.

 

DISKUSI

Kesesuaian metode deteksi untuk diagnostik rutin tergantung pada beberapa faktor, seperti spesifisitas, sensitivitas, biaya, jumlah waktu, dan penerapan pada sejumlah besar spesimen yang relevan secara klinis. Prosedur persiapan sampel yang dijelaskan di sini telah terbukti bekerja sama baiknya dengan semua bahan yang dianggap penting untuk diagnosis infeksi C. burnetii. Plasenta dan jaringan janin, seperti jaringan hati atau limpa, harus diperiksa setelah aborsi yang diduga disebabkan oleh coxiellosis. Pemeriksaan darah diperlukan untuk membuktikan coxiellaemia. Dalam kasus demam Q kronis pada manusia, katup hati dan jantung dapat menjadi tempat kolonisasi (18).

 

Karena jaringan manusia tidak tersedia, padanan hewan digunakan dalam percobaan kami. Karena masalah kesehatan masyarakat, susu sering diperiksa, terutama bila susu yang tidak dipasteurisasi digunakan secara komersial. Dengan teknik mapan yang dijelaskan di sini sejumlah besar sampel dapat diperiksa secara bersamaan; hingga 64 sampel sekaligus diproses dengan mudah dalam penelitian ini. Hasil tersedia dalam 1 hari, termasuk waktu yang dibutuhkan untuk preparasi sampel (0,5-1,5 jam), PCR, dan dokumentasi. Tergantung pada jumlah sampel, waktu kerja adalah sekitar 2 sampai 4 jam. Oleh karena itu, metode yang digunakan dalam penelitian ini lebih cepat daripada prosedur yang dijelaskan sebelumnya untuk mendeteksi C. burnetii. Selain itu, metode kami tidak mahal dibandingkan dengan metode lain yang digunakan untuk menyiapkan sampel untuk PCR. Dengan demikian, teknik yang dijelaskan di sini mudah diterapkan untuk diagnostik rutin sehari-hari dan studi epidemiologi C. burnetii yang lebih besar.

 

Namun, sensitivitas metode kami terbukti lebih rendah daripada sensitivitas yang diperoleh dengan metode preparasi sampel yang awalnya dijelaskan untuk deteksi C. burnetii dengan PCR (26). Kapasitas pengikatan dan volume reaksi memungkinkan preparasi DNA dari sampel masing-masing hanya sebesar 200 μl dan 25 mg. Di sisi lain, tidak ada ukuran sampel minimum, sehingga sampel biopsi pun cocok untuk pengujian.

 

Selama pemurnian DNA PCR inhibitor dimurnikan. Oleh karena itu, volume elusi yang direkomendasikan (10 μl)) harus ditingkatkan (menjadi 100 μl)) untuk mengencerkan inhibitor. Batas deteksi ditentukan menjadi 4.000 coxiellae/g jaringan. Setidaknya ketika plasenta diperiksa, batas ini sudah cukup, karena telah dilaporkan bahwa sejumlah besar C. burnetii bersarang di dalam rahim dan cairan ketuban sapi yang terinfeksi (23). Sedikit yang diketahui tentang tingkat rata-rata agen di jaringan lain.

 

Dalam penelitian sebelumnya (19) konsentrasi coxiellae dalam susu ditentukan sebagai unit menular dengan menggunakan kelinci percobaan sebagai model hewan. Schaal (19) menemukan bahwa susu dari sapi yang terinfeksi mengandung 10² hingga 10⁴ unit infeksius/ml. Dengan asumsi bahwa infeksi marmot biasanya membutuhkan lebih dari satu sel coxiella, batas deteksi PCR, 500 coxiellae/ml susu, mencakup jumlah yang diharapkan dari agen yang ditumpahkan melalui susu. Selanjutnya, PCR tidak hanya mendeteksi agen infeksius tetapi juga agen yang tidak dapat hidup. Bagaimanapun, metode yang dijelaskan di atas lebih sensitif daripada capture ELISA (batas deteksi, 2.000 coxiellae per pengujian) dan jauh lebih cepat dan nyaman daripada kultur sel, di mana setidaknya 6 hari pemeriksaan diperlukan untuk hasil diagnostik (18). Karena metode yang dijelaskan di sini tidak spesifik untuk DNA C. burnetii, metode ini mungkin berguna untuk mendiagnosis infeksi dengan bakteri lain juga. Ini berbeda dengan metode preparasi di mana pemisahan imunomagnetik digunakan (13), yang secara selektif memurnikan DNA spesifik.

 

Hasil yang diperoleh untuk sampel susu dari 21 ekor sapi membuktikan bahwa sistem dapat mendeteksi coxiellae pada spesimen yang terinfeksi secara alami. Ini penting karena C. burnetii adalah agen intraseluler obligat (16). Temuan yang diperoleh dengan sampel yang terkontaminasi artifisial yang hanya mengandung partikel C. burnetii ekstraseluler tidak dapat begitu saja ditransfer ke sampel klinis. Selain itu, survei ini mengkonfirmasi kesesuaian tes untuk diagnostik rutin.

 

Persentase sapi seropositif C. burnetii yang dilaporkan sebelumnya yang melepaskan agen melalui susu mereka berkisar antara 8,3 hingga 90% (2, 5). Nilai-nilai ini didasarkan pada deteksi coxiellae dengan uji aglutinasi kapiler (11, 22) atau hewan percobaan (19, 20, 22). Selanjutnya, dalam penelitian ini sapi seropositif dipilih dengan ELISA, sedangkan pada survei sebelumnya CF digunakan untuk uji serologis.  Perbedaan besar dalam hasil penelitian sebelumnya mungkin karena perbedaan ini. Dalam penelitian ini C. burnetii terdeteksi dalam sampel susu dari 6 dari 21 sapi yang diuji. Penumpahan coxiellae dalam susu adalah intermiten untuk semua sapi positif, yang konsisten dengan penelitian sebelumnya (3, 5, 20). Penting bahwa pelepasan agen tidak terjadi dalam pola yang terlihat. Pengamatan ini menunjukkan bahwa penetapan tanggal untuk pemeriksaan susu dapat menghasilkan negatif palsu. Oleh karena itu, di masa depan, survei serologis dari ternak yang membutuhkan susu bebas coxiella mungkin tidak diperlukan.

 

Pemeriksaan tanggal melahirkan menunjukkan tidak ada hubungan antara melahirkan dan pelepasan C. burnetii. Hubungan seperti itu dimungkinkan karena terjadinya C. burnetii dalam susu dilaporkan membutuhkan kelenjar susu yang berkembang penuh (21) dan titer darah antibodi terhadap coxiella meningkat setelah lahir (10). Coxiellae mungkin terkonsentrasi di kelenjar susu selama istirahat dalam menyusui dan kemudian dapat ditumpahkan pada awal periode laktasi baru. Namun, ukuran survei ini tidak memungkinkan pernyataan statistik apa pun; data kami hanya memberikan petunjuk tentang kondisi pelepasan C. burnetii melalui susu sapi. Studi lebih lanjut yang mencakup jumlah hewan yang signifikan secara statistik dan mempertimbangkan faktor-faktor seperti ukuran kawanan, kelahiran, penyakit, dan pengobatan akan diperlukan untuk mendapatkan informasi lengkap tentang perjalanan pelepasan.

 

DAFTAR PUSTAKA

1. Arens M. Kontinuierliche Vermehrung von Coxiella burnetii durch persistierende Infektion in Buffalo-Green-Monkey (BGM)-Zellkulturen. Zentbl Vetmed Reihe B. 1983;30:109–116. [PubMed] [Google Scholar]

2. Benson W W, Brock D W, Mather J. Serologic analysis of a penitentiary group using raw milk from a Q fever infected herd. Public Health Rep. 1963;78:707–710. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

3. Biberstein E L, Behymer D E, Bushnell R, Crenshaw G, Riemann H P, Franti C E. A survey of Q fever (Coxiella burnetii) in California dairy cows. Am J Vet Res. 1974;35:1577–1582. [PubMed] [Google Scholar]

4. Dupon M, Cazenave J, Pellegrin J L, Ragnaud J M, Cheyrou A, Fischer I, Leng B, Lacut J Y. Detection of Toxoplasma gondii by PCR and tissue culture in cerebrospinal fluid and blood of human immunodeficiency virus-seropositive patients. J Clin Microbiol. 1995;33:2421–2426. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

5. Durand M P. L’excrétion lactée et placentaire de Coxiella burnetii, agent de la Fièvre Q, chez la vache. Importance et prévention. Bull Acad Natl Med (Paris) 1993;6:935–946. [PubMed] [Google Scholar]

6. Frazier M E, Mallavia L P, Samuel J E, Baca O G. DNA probes for the identification of Coxiella burnetii strains. Ann NY Acad Sci. 1990;590:445–457. [PubMed] [Google Scholar]

7. Gouverneur K, Schmeer N, Krauss H. Zur Epidemiologie des Q-Fiebers in Hessen: Untersuchungen mit dem Enzymimmuntest (ELISA) und der Komplementbindungsreaktion (KBR) Berl Muench Tieraerztl Wochenschr. 1984;97:437–441. [PubMed] [Google Scholar]

8. Kox L F, Rhietong D, Miranda A M, Udomsantisuk N, Ellis K, van Leeuwen J, van Heusden S, Kuijper S, Kolk A H. A more reliable PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. J Clin Microbiol. 1994;32:672–678. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

9. Lang G H. Coxiellosis (Q-fever) in animals. In: Marrie T J, editor. Q-fever: The disease. Boca Raton, Fla: CRC Press; 1990. pp. 23–48. [Google Scholar]

10. Lange S, Söllner H, Hofmann J, Lange A. Q-Fieber-Antikörper-Verlaufsuntersuchung beim Rind unter besonderer Berücksichtigung der Trächtigkeit. Berl Muench Tieraerztl Wochenschr. 1992;105:260–263. [PubMed] [Google Scholar]

11. Luoto L. A capillary agglutination test for bovine Q-fever. J Immunol. 1953;71:226–231. [PubMed] [Google Scholar]

12. Marrie T J. Epidemiology of Q-fever. In: Marrie T J, editor. Q-fever: the disease. Boca Raton, Fla: CRC Press; 1990. pp. 49–70. [Google Scholar]

13. Muramatsu Y, Maruyama M, Yanase T, Ueno H, Morita C. Improved method for preparation of samples for the polymerase chain reaction for detection of Coxiella burnetii in milk using immunomagnetic separation. Vet Microbiol. 1996;51:179–185. [PubMed] [Google Scholar]

14. Muramatsu Y, Yanase T, Okabayashi T, Ueno H, Morita C. Detection of Coxiella burnetii in cow’s milk by PCR–enzyme-linked immunosorbent assay combined with a novel sample preparation method. Appl Environ Microbiol. 1997;63:2142–2146. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

15. Noordhoek G T, Kaan J A, Mulder S, Wilke H, Kolk A H J. Routine application of the polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. J Clin Pathol. 1995;48:810–814. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

16. Ormsbee R, Peacock M, Gerloff R, Tallent G, Wilke D. Limits of rickettsial infectivity. Infect Immun. 1978;19:239–245. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

17. Raoult D, Levy P Y, Harlé J R, Etienne J, Massip P, Goldstein F, Micoud M, Beytout J, Gallais H, Remy G, Capron J P. Chronic Q fever: diagnosis and follow up. Ann NY Acad Sci. 1990;590:51–60. [PubMed] [Google Scholar]

18. Raoult D, Vestris G, Enea M. Isolation of 16 strains of Coxiella burnetii from patients by using a sensitive centrifugation cell culture system and establishment of the strains in HEL cells. J Clin Microbiol. 1990;28:2482–2484. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

19. Schaal E. Die hygienische Bedeutung von Rickettsien (Coxiella burnetii) in Lebensmitteln tierischer Herkunft. Dtsch Med Wochenschr. 1972;97:699–704. [PubMed] [Google Scholar]

20. Schaal E. Zur Kontamination der Milch mit Rickettsien. Tieraerztl Umsch. 1980;35:431–438. [Google Scholar]

21. Schaal E, Schaaf J. Erfahrungen und Erfolge bei der Sanierung von Rinderbeständen mit Q-Fieber. Zentbl Vetmed Reihe B. 1969;16:818–831. [PubMed] [Google Scholar]

22. Schaal E H, Schäfer J. Zur Verbreitung des Q-Fiebers in einheimischen Rinderbeständen. Dtsch Tieraerztl Wochenschr. 1984;91:52–56. [PubMed] [Google Scholar]

23. Schliesser T. Zur Epidemiologie und Bedeutung des Q-Fiebers bei Tieren. Wien Tieraerztl Monschr. 1991;78:7–12. [Google Scholar]

24. Thiele D, Karo M, Krauss H. Monoclonal antibody based capture-ELISA/ELIFA for detection of Coxiella burnetii in clinical specimen. Eur J Epidemiol. 1992;8:568–574. [PubMed] [Google Scholar]

25. Tola S, Angioi A, Rocchigiani A M, Idini G, Manunta D, Galleri G, Leori G. Detection of Mycoplasma agalactiae in sheep milk samples by polymerase chain reaction. Vet Microbiol. 1997;54:17–22. [PubMed] [Google Scholar]

26. Willems H, Thiele D, Fröhlich-Ritter R, Krauss H. Detection of Coxiella burnetii in cow’s milk using the polymerase chain reaction (PCR) J Vet Med Ser B. 1994;41:580–587. [PubMed] [Google Scholar]

27. Yuasa Y, Yoshiie K, Takasaki T, Yoshida H, Oda H. Retrospective survey of chronic Q fever in Japan by using PCR to detect Coxiella burnetii DNA in paraffin-embedded clinical samples. J Clin Microbiol. 1996;34:824–827. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

 

Sumber:

Helga Lorenz, Cornelie Jäger, Hermann Willems, and Georg Baljer. 1998. PCR Detection of Coxiella burnetii from Different Clinical Specimens, Especially Bovine Milk, on the Basis of DNA Preparation with a Silica Matrix.  Appl Environ Microbiol. 1998 Nov; 64(11): 4234–4237.