Klamidiosis Unggas Referensi dari WOAH

 

RINGKASAN

Deskripsi dan pentingnya penyakit: Klamidiosis avian (AC) disebabkan oleh spesies Chlamydia pada burung. Taksonomi keluarga Chlamydiaceae baru-baru ini ditinjau kembali. Genus Chlamydia saat ini mencakup 11 spesies yang diakui, dan di antaranya C. psittaci, C. avium, dan C. gallinacea telah diisolasi dari burung.

 

Wabah AC pada burung psittacine dan peternakan unggas domestik menyebabkan kerugian ekonomi yang cukup besar. Infeksi ini dapat menyebabkan penyakit sistemik dan kadang-kadang fatal pada burung. Tanda klinis umumnya tidak spesifik dan sangat bervariasi dalam tingkat keparahannya, tergantung pada spesies dan usia burung serta virulensi strain Chlamydia, tetapi gangguan pernapasan paling sering terlibat. Banyak burung, terutama burung psittacine yang lebih tua dan unggas, mungkin tidak menunjukkan tanda-tanda klinis; meskipun demikian, mereka sering kali dapat menyebarkan agen tersebut untuk jangka waktu yang lama.

 

Penanganan laboratorium khusus yang ditentukan oleh analisis risiko biologis (lihat Bab 1.1.4 Biosafety and Biosecurity: Standar untuk Pengelolaan Risiko Biologis di Laboratorium Veteriner dan Fasilitas Hewan) direkomendasikan dan bahkan wajib di banyak negara karena strain klamidia avian dapat menyebabkan penyakit serius (pneumonia) dan kematian pada manusia jika tidak diobati.

 

Identifikasi agen: Metode yang lebih disukai untuk identifikasi AC saat ini bukan lagi isolasi organisme. Mengingat waktu yang dibutuhkan, kebutuhan akan sampel berkualitas tinggi, fakta bahwa beberapa strain tidak akan pernah tumbuh secara in vitro, serta bahaya bagi personel laboratorium, tes amplifikasi asam nukleat (NAAT) saat ini direkomendasikan untuk diagnosis yang cepat, sensitif, dan spesifik. Metode ini mencakup reaksi berantai polimerase (PCR) konvensional dan real-time, deteksi berbasis DNA microarray, dan sekuensing DNA. Isolasi, pewarnaan sitologi dari apusan eksudat atau feses, dan apusan kesan jaringan, pewarnaan imunohistokimia dari preparat sitologis dan histologis, serta enzim-linked immunosorbent assays (ELISA) untuk menangkap antigen dapat digunakan jika NAAT tidak tersedia.

 

Tes serologi: Serologi saja tidak terlalu berguna dalam mendiagnosis infeksi klamidia yang sedang berlangsung pada burung karena tingginya prevalensi infeksi ini pada burung dan persistensi jangka panjang (hingga beberapa bulan) antibodi antiklamidia. Pada sebagian besar spesies burung, terdapat tingkat latar belakang yang tinggi dari antibodi antiklamidia. Oleh karena itu, untuk menentukan apakah seekor burung terinfeksi, serologi harus selalu digunakan bersamaan dengan deteksi gen atau antigen, atau pemeriksaan dilakukan pada sera yang diambil berpasangan. Hasil tes positif menunjukkan bahwa burung tersebut pernah terinfeksi bakteri, tetapi tidak selalu menunjukkan infeksi aktif. Hasil negatif palsu dapat terjadi pada burung dengan infeksi akut yang diambil sampelnya sebelum terjadi serokonversi. Pengobatan dengan antibiotik juga dapat menunda atau mengurangi respons antibodi.

 

Metode serologi utama yang digunakan untuk mendeteksi antibodi klamidia adalah:

(1) berbagai metode aglutinasi badan elementer (EBA),

(2) uji fiksasi komplemen, dan

(3) ELISA. ELISA sangat sensitif dan spesifik ketika menggunakan protein/peptida rekombinan sebagai target antigen, serta dapat mendeteksi IgM, IgG, dan IgA.

 

Persyaratan untuk vaksin: Tidak ada vaksin komersial yang tersedia untuk pengendalian klamidiosis pada unggas.

 

A. PENDAHULUAN

Klamidiosis avian (AC) disebabkan oleh infeksi spesies Chlamydia pada burung. Pada tahun 2015, taksonomi keluarga Chlamydiaceae ditinjau kembali oleh Sachse dkk. (Sachse dkk., 2015). Genus Chlamydia saat ini mencakup 11 spesies yang diakui, yaitu C. abortus (domba, kambing, sapi), C. caviae (kelinci percobaan), C. felis (kucing), C. muridarum (tikus, hamster), C. psittaci (burung dan lainnya), C. pecorum (domba, sapi), C. pneumoniae (manusia dan lainnya), C. suis (babi), C. trachomatis (manusia), serta dua spesies yang baru saja diidentifikasi dari burung, yaitu C. avium dan C. gallinacea (Sachse dkk., 2014). Meskipun sebagian besar organisme ini sangat spesifik terhadap inangnya, C. pneumoniae dan C. psittaci memiliki rentang inang yang lebih luas. C. psittaci tidak hanya dilaporkan terjadi pada burung dan manusia, tetapi juga pada sapi, domba, babi, kuda, dan hewan lainnya.
Hingga baru-baru ini, C. psittaci dianggap sebagai satu-satunya agen penyebab penyakit pada burung. Awalnya disebut psittacosis, istilah ornithosis diperkenalkan kemudian untuk membedakan penyakit pada unggas domestik dan liar dari penyakit pada burung psittacine. Kedua sindrom tersebut saat ini dianggap sama (Andersen & Vanrompay, 2008). Pemisahan sebelumnya didasarkan pada asumsi bahwa pada manusia, ornithosis adalah penyakit yang lebih ringan daripada psittacosis. Namun, perlu dicatat bahwa penyakit pada manusia yang tertular dari kalkun dan bebek seringkali sama beratnya dengan yang tertular dari burung psittacine.

 

Infeksi burung dengan C. psittaci umum terjadi di seluruh dunia dan telah ditemukan pada sekitar 465 spesies burung (Kaleta & Taday, 2003). Wabah AC pada burung psittacine dan peternakan unggas domestik menyebabkan kerugian ekonomi yang cukup besar. Infeksi ini dapat menyebabkan penyakit sistemik dan kadang-kadang fatal pada burung. Tanda klinis umumnya tidak spesifik dan sangat bervariasi dalam tingkat keparahan, tergantung pada spesies dan usia burung serta strain klamidia. AC dapat menyebabkan lesu, hipertermia, ekskresi abnormal, keluarnya cairan dari hidung dan mata, serta penurunan produksi telur. Tingkat kematian sangat bervariasi. Pada burung peliharaan, tanda klinis yang paling umum adalah konjungtivitis, anoreksia dan penurunan berat badan, diare, kotoran berwarna kuning, sinusitis, biliverdinuria, keluarnya cairan hidung, bersin, lakrimasi, dan gangguan pernapasan. Banyak burung, terutama burung psittacine yang lebih tua dan unggas, mungkin tidak menunjukkan tanda klinis; meskipun demikian, mereka seringkali dapat menyebarkan agen tersebut untuk jangka waktu yang lama. Nekropsi pada burung yang terkena dampak sering kali mengungkapkan nekrosis hati multifokal, pembesaran limpa dan hati, airsaculitis fibrinosa, perikarditis, dan peritonitis (Andersen & Vanrompay, 2008; Vanrompay, 2013). Lesi histologis menunjukkan adanya infeksi, tetapi tidak patognomonik kecuali terdapat klamidia yang dapat diidentifikasi.

 

Hingga saat ini, sembilan genotipe berbeda berdasarkan gen ompA yang mengkode protein membran luar utama (MOMP) telah dibedakan dalam strain C. psittaci. Tujuh dari genotipe ini diduga muncul terutama pada urutan atau kelas burung tertentu, dan dua lainnya pada inang non-avian, yaitu genotipe A pada burung psittacine, B pada merpati, C pada bebek dan angsa, D pada kalkun, E pada merpati, bebek, dan lainnya, E/B pada bebek, kalkun, dan merpati, F pada parkit, WC pada sapi, dan M56 pada hewan pengerat. Sebagian besar genotipe avian juga telah diidentifikasi secara sporadis pada isolat dari kasus penularan zoonosis ke manusia, khususnya genotipe A, B, dan E/B (Heddema dkk., 2006; Vanrompay dkk., 2007). Sementara itu, subkelompok untuk tiga genotipe yang lebih heterogen telah diperkenalkan, yaitu A-VS1, A-6BC, A8455, EB-E30, EB-859, EB-KKCP, D-NJ1, D-9N, dan genotipe sementara untuk menampung strain yang sebelumnya tidak dapat ditentukan genotipenya telah disarankan (Sachse dkk., 2008).

 

Antibiotik adalah satu-satunya cara pengendalian saat ini. Chlamydia psittaci rentan terhadap sejumlah antibiotik: obat pilihan bervariasi di tiap negara. Chlortetrasiklin, doksisiklin, dan tetrasiklin lainnya adalah yang paling sering digunakan. Pengobatan perlu dilakukan dalam jangka waktu yang lama. Untuk burung peliharaan, sering disarankan selama 45 hari (Vanrompay, 2013).

 

Bukti menunjukkan bahwa spesies klamidia lainnya, seperti C. abortus, C. pecorum, C. trachomatis, C. suis, dan C. muridarum juga dapat dibawa oleh burung (Guo dkk., 2016; Pantchev dkk., 2009), serta spesies avian C. avium dan C. gallinacea yang dijelaskan oleh Sachse dkk., pada tahun 2014. Pentingnya secara epidemiologis masih belum jelas, namun C. avium dan C. gallinacea tampaknya cukup tersebar luas pada merpati dan burung psittacine atau unggas, masing-masing. Patogenisitas dari kedua spesies baru ini masih belum diselidiki secara sistematis. Dalam survei yang dilaporkan hingga saat ini, tidak ada tanda klinis yang diamati pada ayam yang membawa C. gallinacea (Guo dkk., 2016; Laroucau dkk., 2009), maupun pada sebagian besar pembawa C. avium di antara merpati. Namun, dari data yang tersedia saat ini, tampaknya C. avium dapat menyebabkan penyakit pernapasan pada burung beo dan merpati (Sachse dkk., 2014). Saat ini direkomendasikan untuk melakukan diagnosis banding dan menggunakan metode diagnostik yang mampu membedakan antara C. psittaci dan spesies lainnya yang dapat dibawa oleh burung. Hingga saat ini, hanya metode molekuler yang dapat membuat perbedaan ini.

 

1. Risiko Zoonosis dan Persyaratan Biosafety

 

Strain Chlamydia pada burung dapat menginfeksi manusia dan harus ditangani dengan prosedur biosafety dan containment yang tepat (lihat Bab 1.1.4 Biosafety dan biosecurity: Standar untuk mengelola risiko biologis di laboratorium veteriner dan fasilitas hewan). Penilaian dan pengelolaan risiko sangat penting saat melakukan diagnosis avian chlamydiosis (AC). Disarankan adanya informasi yang memadai, komunikasi, dan pemantauan kesehatan oleh dokter tenaga kerja.

 

Sebagian besar infeksi terjadi melalui inhalasi aerosol infeksius. Meskipun penyakit dari burung psittacine lebih dikenal, infeksi pada unggas patut diperhatikan karena penularan ke manusia sering terjadi selama penanganan dan pemotongan unggas (Dickx dkk., 2010; Lagae dkk., 2014). Pemeriksaan post-mortem pada burung yang terinfeksi dan penanganan kultur harus dilakukan di dalam lemari aliran laminar Kelas II yang bersertifikat bila memungkinkan, atau dengan peralatan pelindung yang sesuai. Prosedur dekontaminasi yang tepat terhadap agen zoonosis harus diikuti karena infeksi pada manusia dapat terjadi dari paparan sementara. Masa inkubasi biasanya 5–14 hari; namun, masa inkubasi yang lebih lama juga diketahui. Infeksi pada manusia bervariasi dari yang tidak tampak hingga penyakit sistemik yang parah dengan pneumonia interstisial dan ensefalitis. Penyakit ini jarang berakibat fatal pada pasien yang diobati dengan benar; oleh karena itu, kesadaran akan bahaya dan diagnosis dini sangat penting. Manusia yang terinfeksi biasanya mengalami sakit kepala, menggigil, rasa lemah, dan nyeri otot, dengan atau tanpa gejala gangguan pernapasan. Gangguan paru-paru umum terjadi, tetapi temuan auskultasi mungkin tampak normal atau meremehkan tingkat keparahan gangguan. Diagnosis bisa sulit, dan di masa lalu biasanya ditegakkan melalui pengujian serum berpasangan untuk antibodi terhadap chlamydia dengan uji fiksasi komplemen (CFT). Namun, beberapa pasien tetap seronegatif meskipun dirawat di rumah sakit dengan psittacosis; karena itu, serologi semakin digantikan oleh tes amplifikasi asam nukleat (NAAT), yang juga memungkinkan penelusuran sumber burung. Pada manusia, tetrasiklin, doksisiklin, atau azitromisin biasanya merupakan obat pilihan kecuali ada kontraindikasi. Lamanya pengobatan bervariasi tergantung obatnya, tetapi untuk tetrasiklin harus dilanjutkan setidaknya selama 14 hari.

 

                                                                           B. TEKNIK DIAGNOSTIK

 

1.    Identifikasi Agen

 

Metode yang disarankan untuk identifikasi avian chlamydiosis (AC) saat ini tidak lagi melalui isolasi organisme. Mengingat waktu yang dibutuhkan, kebutuhan akan sampel berkualitas tinggi, beberapa strain yang tidak dapat tumbuh secara in vitro, dan risiko bagi petugas laboratorium, NAATs (tes amplifikasi asam nukleat) saat ini direkomendasikan untuk diagnosis yang cepat, sensitif, dan spesifik. Metode ini mencakup PCR konvensional dan real-time, deteksi berbasis DNA microarray, dan sequencing DNA. Isolasi, pewarnaan sitologi dari apusan eksudat atau feses, serta apusan jaringan, pewarnaan imunohistokimia dari preparat sitologi dan histologi, dan uji tangkap antigen ELISA dapat digunakan jika NAATs tidak tersedia.

 

Sampel yang diambil bergantung pada tanda-tanda penyakit yang muncul. Spesimen dari kasus akut harus mencakup eksudat inflamasi atau fibrin yang terdapat di sekitar organ yang menunjukkan lesi, eksudat mata dan hidung, apusan hati, sampel darah utuh, serta sampel jaringan dari ginjal, paru-paru, perikardium, limpa, dan hati. Pada kasus dengan diare, isi kolon atau tinja harus digunakan. Pada burung yang masih hidup, sampel yang paling disarankan adalah usapan faring dan hidung. Kotoran usus, usapan kloaka, kerokan konjungtiva, dan eksudat peritoneum juga bisa diambil.

 

1.1.  Metode molekuler – deteksi asam nukleat

 

Chlamydia psittaci dapat diidentifikasi dan ditentukan sub-tipe-nya menggunakan:

(1) PCR konvensional spesifik spesies;

(2) real-time PCR (ditinjau dalam Sachse dkk., 2009);

(3) ompA-sequencing (Sachse dkk., 2008);

(4) multi-locus sequence typing (MLST) (Pannekoek dkk., 2010); dan

(5) DNA microarray (Sachse dkk., 2005, 2008).

 

Seperti disebutkan di atas, C. psittaci bukan satu-satunya agen klamidia yang ditemukan pada burung. Agen klamidia baru yang dijelaskan oleh Sachse dkk. pada tahun 2014 harus dipertimbangkan ketika sampel burung tertentu positif dalam tes klamidia umum, misalnya PCR spesifik Chlamydiaceae atau imunohistokimia, tetapi negatif dalam tes spesifik spesies untuk C. psittaci. Dalam kasus seperti itu, sekuensing parsial atau lengkap dari gen ompA dan operon rRNA atau uji PCR spesifik spesies alternatif akan mengungkapkan identitas strain. Keberadaan strain Chlamydia yang secara filogenetik berada di antara C. psittaci dan C. abortus juga telah dijelaskan (Van Loock dkk., 2003; Pannekoek dkk., 2010), dan harus dipertimbangkan sebagai diagnosis banding yang mungkin.

 

Reagen yang dirancang untuk menstabilkan DNA harus dipertimbangkan jika diperkirakan akan ada keterlambatan dalam pemrosesan sampel (DeGraves dkk., 2003). Sampel DNA dapat dipersiapkan menggunakan reagen yang murah atau kit yang tersedia secara komersial.

 

1.1.1. Polymerase chain reaction (PCR) konvensional

 

Teknik PCR telah menggantikan isolasi untuk mendeteksi klamidia dari jaringan hewan. Risiko infeksi terhadap staf laboratorium dapat dihindari dengan menginaktivasi sampel sebelum pengujian. Sensitivitas uji PCR konvensional biasanya melebihi isolasi. Uji PCR konvensional saat ini untuk mendeteksi C. psittaci menargetkan gen 16S–23S rRNA atau ompA (ditinjau dalam Sachse dkk., 2009). Sensitivitas dan spesifisitas bervariasi tergantung pada persiapan sampel dan uji PCR, tetapi dianggap lebih rendah jika dibandingkan dengan uji PCR real-time kuantitatif. Sensitivitas meningkat dengan menargetkan segmen DNA yang relatif pendek atau menggunakan prosedur bertingkat (nested). Namun, ada risiko kontaminasi jika tidak dilakukan dengan sangat hati-hati dalam menangani reaksi (lihat Bab 1.1.6 Validasi uji diagnostik untuk penyakit menular hewan darat).

 

1.1.2. PCR Real-time

 

PCR real-time telah menjadi metode yang disukai di laboratorium diagnostik karena kecepatan, kapasitas tinggi, potensi untuk kuantifikasi, dan kemudahan standardisasi (Sachse dkk., 2009). Teknologi ini memerlukan probe yang diberi label fluoresen dan peralatan khusus, yang meningkatkan biaya. Sensitivitasnya dapat setara dengan sistem bertingkat (nested), tetapi masalah kontaminasi dan tenaga kerja berkurang karena berbasis pada satu reaksi dalam sistem tertutup.

 

Pendekatan hierarkis direkomendasikan untuk deteksi dan identifikasi DNA C. psittaci. Pendekatan tersebut mencakup uji skrining PCR spesifik Chlamydiaceae berdasarkan urutan 23S-rRNA pada kasus positif (DeGraves dkk., 2003; Ehricht dkk., 2006; Everett dkk., 1999), diikuti oleh uji PCR spesifik C. psittaci berdasarkan urutan protein membran luar (ompA) (Pantchev dkk., 2009) atau gen incA (Ménard dkk., 2006). Probe Minor Groove Binding (MGB) digunakan untuk menyingkirkan reaksi silang dengan C. abortus.

 

Protokol untuk uji spesifik C. psittaci berbasis ompA (Pantchev dkk., 2009) akan dijelaskan lebih lanjut di bawah ini. Uji ini dilakukan sebagai amplifikasi dupleks yang mencakup kontrol amplifikasi internal (IAC). Batas deteksi ditentukan pada 2 unit pembentuk inklusi per campuran reaksi.

 

i) Oligonukleotida spesifik C. psittaci adalah primer CppsOMP1-F (5’-CAC-TAT-GTG-GGAAGG-TGC-TTC-A-3’) dan CppsOMP1-R (5’-CTG-CGC-GGA-TGC-TAA-TGG-3’), serta probe MGB® CppsOMP1-S (FAM-CGC-TAC-TTG-GTG-TGA-C-TAMRA). Sistem IAC mencakup primer EGFP1-F (GAC-CAC-TAC-CAG-CAG-AAC-AC) dan EGFP10-R (CTT-GTACAG-CTC-GTC-CAT-GC), serta probe TaqMan EGFP-HEX (HEX-AGC-ACC-CAG-TCCGCC-CTG-AGC-A-BHQ1). Plasmid IC2 (tersedia secara komersial) berfungsi sebagai template IAC.

 

ii) Amplifikasi dilakukan dalam pelat mikro 96-well pada termocycler Mx3000P atau peralatan sebanding. Setiap reaksi 25-µl mengandung 12.5 µl dari 2 × universal real-time PCR Master Mix. Konsentrasi akhir adalah 0.8 µM untuk setiap primer C. psittaci, 0.4 µM untuk setiap primer IAC, dan 0.2 µM untuk setiap probe.

 

iii) DNA template IAC (500 salinan) ditambahkan ke setiap reaksi sebelum volume akhir dilengkapi dengan air.

 

iv) Parameter siklus berikut digunakan: siklus pemanasan awal pada 95°C selama 10 menit (langkah denaturasi tunggal), 45 siklus pada 95°C selama 15 detik dan 60°C selama 1 menit (pengikatan dan perpanjangan).

 

v) Nilai ambang siklus (Ct = siklus kuantifikasi Cq) yang dihitung secara otomatis oleh perangkat lunak harus digunakan. Nilai Cq 35 atau lebih rendah dianggap positif. Nilai Cq yang lebih tinggi dari 35 harus diperlakukan dengan hati-hati karena mungkin mewakili reaksi silang dengan mikroorganisme terkait. Dalam kasus seperti itu, sampel harus diperiksa ulang, sebaiknya dengan tes alternatif yang menggunakan target genomik yang berbeda (Ménard dkk., 2006; Opota dkk., 2015). Sampel juga dapat diuji ulang dalam PCR real-time. Dalam hal ini, hanya sampel yang positif berulang kali yang dianggap positif nyata.

 

Protokol PCR real-time berbasis ompA lainnya telah dikembangkan untuk membedakan antara genotipe C. psittaci (Geens dkk. 2005, Heddema dkk., 2015). PCR terakhir juga divalidasi untuk digunakan pada sampel manusia dalam kasus infeksi zoonosis dan dengan demikian berguna untuk melacak rantai transmisi zoonosis.

 

Protokol PCR real-time tersedia untuk deteksi spesifik C. avium (Zocevic dkk., 2013) dan spesies C. gallinacea (Laroucau dkk., 2015).

 

1.1.3. Mikroarray DNA

 

Teknologi mikroarray DNA telah terbukti menjadi alat yang kuat dalam diagnosis infeksi klamidia (Sachse dkk., 2005). Uji untuk deteksi dan identifikasi spesies Chlamydiaceae didasarkan pada amplifikasi PCR dari gen rRNA 23S dan identifikasi selanjutnya dari C. psittaci serta agen avian lainnya, C. avium dan C. gallinacea, melalui hibridisasi dengan probe spesifik spesies. Metode ini telah divalidasi dan terbukti cocok untuk diagnosis rutin (Borel dkk., 2008). Pendekatan metodologis ini memungkinkan deteksi infeksi klamidia campuran dan identifikasi spesies klamidia yang tidak terduga secara langsung dari sampel klinis. Versi yang lebih luas dari mikroarray DNA memungkinkan genotipisasi berbasis ompA dari strain C. psittaci dan sampel klinis (Sachse dkk., 2008).

 

1.2. Visualisasi langsung – pewarnaan sitologis

 

Klamidia dapat terdeteksi dalam sediaan dari swab kloaka atau konjungtiva dan dalam sediaan impresi dari jaringan (paru-paru, hati, limpa, ginjal, dan kantung udara jika bahan cukup tersedia) dengan menggunakan pewarnaan sitologis seperti Giemsa, Giménez, Giménez modifikasi, Ziehl–Neelsen, dan pewarnaan Macchiavello (Campbell dkk., 2015). Teknik Giménez modifikasi paling sering digunakan (Andersen & Vanrompay, 2008). Namun, tidak satu pun dari pewarnaan ini secara spesifik mendeteksi klamidia. Semua metode ini memiliki sensitivitas yang lebih rendah dibandingkan dengan metode deteksi antigen berbasis antibodi atau NAAT spesifik. Oleh karena itu, penggunaan pewarnaan sitologis semakin kehilangan popularitas.

 

1.2.1. Pewarnaan Giménez Modifikasi

 

i) Reagen

a) Larutan 1

Air distilasi (450,0 ml) dan fenol (5,0 ml) ditambahkan ke fuksin dasar (2,5 g) dan etanol 95% (50,0 ml). Inkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Saring dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang.

b) Larutan 2

Na₂HPO₄ (11,65 g); Na₂HPO₄·H₂O (2,47 g); air distilasi, pH 7,5 (dijadikan 1,0 liter).

c) Larutan 3

Larutan 1 (20,0 ml); dan larutan 2 (25,0 ml). Diamkan selama 10 menit, saring, dan gunakan.

d) Larutan 4

Asam sitrat 0,5%.

e) Larutan 5

Fast Green (0,2 g); air distilasi (100,0 ml); dan asam asetat glasial (0,2 ml).

f) Larutan 6

Larutan 5 (20,0 ml); dan air distilasi (50,0 ml).

ii) Prosedur untuk Sediaan

a) Perbaiki dengan metanol selama 5 menit.

b) Pewarnaan dalam larutan 3 selama 10 menit dan bilas dengan air keran.

c) Pewarnaan kontras dalam larutan 6 selama 2 menit.

d) Bilas dengan air keran dan biarkan mengering di udara.

iii) Prosedur untuk Slices Paraffin

a) Deparafinasi dan hidrasi dengan air distilasi.

b) Pewarnaan dalam larutan 3 selama 10 menit dan bilas dengan air keran.

c) Celupkan dalam larutan 4 hingga tidak ada lagi warna merah yang keluar dari potongan. Bilas dengan air keran.

d) Pewarnaan kontras dalam larutan 6 selama 20 kali celup.

e) Celupkan dua perubahan dalam alkohol 95%, masing-masing lima kali celup. Dehidrasi, jelas, dan pasang.

 

Catatan: Prosedur yang lebih singkat dengan "siap pakai" karbol fuksin (1/10 dalam air distilasi), asam asetat (0,1%), dan pewarna kontras hijau malakit (0,8%) juga tersedia (Vanrompay dkk., 1992). Klamidia akan muncul merah di latar belakang hijau.

 

1.3. Isolasi dalam Kultur Sel

 

1.3.1. Perlakuan Sampel untuk Isolasi

Penanganan yang tepat terhadap sampel klinis sangat penting untuk mencegah hilangnya infektivitas klamidia selama pengiriman dan penyimpanan. Medium khusus yang terdiri dari sukrosa/fosfat/glutamat (SPG) telah dikembangkan untuk riketsia dan terbukti memadai untuk transportasi sampel lapangan klamidia. Medium yang direkomendasikan untuk klamidia terdiri dari buffer SPG: sukrosa (74,6 g/liter); KH₂PO₄ (0,52 g/liter); K₂HPO₄ (1,25 g/liter); asam L-glutamat (0,92 g/liter), dan albumin serum sapi – fraksi V (1 g/liter), yang dapat disterilkan dengan filtrasi. Ditambahkan ke dalamnya adalah streptomisin, vankomisin (25-100 µg/ml), amfoterisin B, dan gentamisin (50 µg/ml masing-masing). Penambahan antibiotik mengurangi efek kontaminasi, bahkan ketika sampel dikirim pada suhu lingkungan. Organisme tetap viabel selama beberapa hari meskipun tanpa penyimpanan dalam pendingin. Medium ini juga dapat digunakan sebagai pengencer laboratorium dan untuk membekukan klamidia.

 

Sampel yang terkontaminasi harus diperlakukan terlebih dahulu sebelum digunakan untuk inokulasi kultur sel. Ada tiga metode dasar: perlakuan dengan antibiotik, perlakuan dengan antibiotik bersama dengan sentrifugasi kecepatan rendah (Andersen & Vanrompay, 2008), dan perlakuan dengan antibiotik dengan filtrasi (Andersen & Vanrompay, 2008). Sejumlah antibiotik yang tidak menghambat klamidia dapat digunakan. Sampel dihomogenisasi dalam larutan saline buffered fosfat (PBS), pH 7,2, yang mengandung maksimum yang berikut: streptomisin, vankomisin (100 µg/ml masing-masing), dan gentamisin (50–200 µg/ml). Amfoterisin B atau nistatin (50 µg/ml masing-masing) dapat ditambahkan untuk mengendalikan pertumbuhan ragi dan jamur. Penisilin, tetrasiklin, dan kloramfenikol sebaiknya dihindari karena menghambat pertumbuhan klamidia. Dalam beberapa kasus, seperti sampel feses babi, perlakuan dengan penisilin G (500 IE/ml) dapat berguna.

 

Ketika kontaminasi ringan, sampel harus dihomogenisasi dalam larutan antibiotik sebelum inokulasi ke kultur jaringan. Sampel sering dibiarkan dalam larutan antibiotik selama 24 jam pada suhu 5°C sebelum inokulasi. Sampel yang terkontaminasi berat, seperti sampel feses, harus dihomogenisasi dalam antibiotik dan kemudian disentrifugasi pada 500 g selama 20 menit. Lapisan permukaan dan lapisan bawah dibuang. Cairan supernatan dikumpulkan dan disentrifugasi ulang. Cairan supernatan akhir digunakan untuk inokulasi. Sampel harus disaring melalui filter dengan ukuran pori rata-rata 450–800 µm jika kontaminasi tetap ada.

 

Kultur sel adalah metode yang paling nyaman untuk isolasi C. psittaci. Garis sel yang paling umum adalah monyet hijau bison (BGM), McCoy, HeLa, ginjal monyet hijau Afrika (Vero), dan sel L (Vanrompay dkk., 1992). Sel-sel tersebut dibudidayakan sebagai monolayer menggunakan media kultur jaringan standar yang mengandung 5–10% serum fetus sapi dan antibiotik yang tidak menghambat klamidia (seperti yang telah dijelaskan sebelumnya).

 

Ketika memilih peralatan kultur sel, penting untuk diingat bahwa:

i) Klamidia dapat diidentifikasi melalui imunofluoresensi langsung atau tidak langsung atau beberapa teknik pewarnaan yang sesuai lainnya;

ii) Inokulum biasanya disentrifugasi ke monolayer untuk meningkatkan infektivitasnya;

iii) Sampel mungkin perlu dipassase secara buta setiap 4–5 hari untuk meningkatkan sensitivitas isolasi;

iv) Sampel perlu diperiksa dua hingga tiga kali selama satu kali passase; dan v) Klamidia dapat menular ke manusia.

 

Botol kecil dengan dasar datar, seperti vial shell 1 dram (3,7 ml, 15 × 45 mm) atau botol yang berisi kaca penutup berdiameter 12 mm, akan memenuhi persyaratan ini. Sejumlah vial, sering kali empat hingga enam, diinokulasi dengan setiap sampel untuk memungkinkan perbaikan dan pewarnaan pada interval yang berbeda, dan untuk memungkinkan repassaging sampel yang tampak negatif 6 hari setelah inokulasi. Ketika menguji beberapa sampel, piring multiwell 24-well juga dapat digunakan karena memiliki keuntungan dalam penghematan tenaga kerja. Namun, perlu dicatat bahwa kontaminasi silang antara sampel bisa menjadi masalah.

 

Klamidia dapat diisolasi dari sel yang bereplikasi normal, tetapi penggunaan sel yang tidak bereplikasi lebih disukai karena ini dapat memberikan nutrisi tambahan untuk pertumbuhan klamidia. Sel yang tertekan juga dapat diamati dalam jangka waktu yang lebih lama. Pembelahan sel inang dapat ditekan dengan bahan kimia sitotoksik, seperti sikloheksimid, yang dapat ditambahkan ke medium dengan laju 0,5–2,0 µg/ml pada saat inokulasi monolayer (Andersen & Vanrompay, 2008). Efek sitostatik serupa yang akan meningkatkan pertumbuhan sebagian besar strain klamidia dapat dicapai dengan penggunaan medium kultur jaringan bebas serum.

 

Penempelan klamidia pada sel meningkat dengan menyentrifugasi inokulum ke monolayer pada 2000–3500 g selama 30–90 menit pada 37°C. Setelah periode inkubasi selama 2 jam pada 37°C dan 5% CO₂, inokulum dihilangkan dan diganti dengan medium kultur jaringan bebas serum atau yang mengandung sikloheksimid, dan kultur diinkubasi pada 37–39°C. Kultur harus diperiksa untuk klamidia pada interval reguler menggunakan metode pewarnaan yang sesuai. Ini biasanya dilakukan pada hari ke-2 atau ke-3, serta pada hari ke-4 atau ke-5. Kultur yang tampak negatif pada hari kelima dipanen dan dipassase ulang. Ketika melakukan repassaging klamidia, sel dan media kultur harus dipassase tanpa menggunakan pembekuan–pencairan untuk menghancurkan sel, karena ini akan merusak klamidia.

 

Sebelum mewarnai kultur, medium terlebih dahulu dihilangkan, kultur dicuci dengan PBS, dan kemudian difiksasi dengan asetona atau metanol selama 2–10 menit. Waktu fiksasi akan tergantung pada wadah kultur jaringan yang digunakan. Karena asetona akan melunakkan sebagian besar plastik, penggunaan campuran 50% asetona dan 50% metanol mungkin lebih disukai. Sejumlah metode pewarnaan dapat digunakan untuk menunjukkan inklusi klamidia. Metode yang disukai adalah imunofluoresensi langsung (Andersen & Vanrompay, 2008). Serum antiklamidia yang terkonjugasi dengan fluorescein diterapkan pada sel yang terinfeksi dan diinkubasi dalam ruang lembab selama 30 menit pada 37°C. Kaca penutup kemudian dicuci tiga kali dengan PBS, dipasang segera, dan diperiksa. Inklusi klamidia berfluoresensi hijau. Persiapan konjugat komersial menggunakan antibodi monoklonal (MAbs) tersedia dan sangat spesifik. Konjugat juga dapat disiapkan dari serum poliklonal, tetapi penting untuk mendapatkan antisera yang spesifik dan bertiter tinggi. Antisera poliklonal dapat disiapkan dari kelinci, marmut, domba, atau kambing. Konjugat kemudian disiapkan menggunakan teknik standar (Andersen & Vanrompay, 2008). Inklusi klamidia juga dapat ditunjukkan dengan teknik antibodi fluoresen tidak langsung dan imunoperoksidase (Andersen & Vanrompay, 2008). Pewarnaan langsung dapat dilakukan dengan pewarna Gimenez (lihat Bagian B.1.2.1), Giemsa, Ziehl–Neelsen, atau pewarna Macchiavello. Kecuali imunofluoresensi, semua pewarnaan ini memiliki keuntungan karena dapat menggunakan mikroskop cahaya standar.

 

1.4. Isolasi dalam telur ayam berembrio (TAB)

 

Telur ayam bermbrio (TAB) masih digunakan untuk isolasi primer klamidia. Sampel harus ditangani dan diperlakukan sebelumnya dengan antibiotik seperti yang dijelaskan di Bagian B.1.3. Prosedur inokulasi standar adalah menyuntikkan hingga 0,5 ml inokulum ke dalam kantung kuning telur berembrio berumur 6–7 hari yang bebas patogen spesifik (Andersen & Vanrompay, 2008). Telur kemudian diinkubasi dalam atmosfer lembab pada 39°C, bukan pada 37°C, karena perkalian klamidia meningkat secara signifikan pada suhu yang lebih tinggi. Replikasi organisme biasanya menyebabkan kematian embrio dalam waktu 3–10 hari. Jika tidak ada kematian yang terjadi, biasanya dilakukan dua passase buta tambahan sebelum menyatakan sampel sebagai negatif. Infeksi klamidia akan menyebabkan kongesti vaskular yang khas pada membran kantung kuning telur. Membran ini dipanen dan dihomogenkan sebagai suspensi 20% (w/v) dalam buffer SPG, dan dapat dibekukan untuk melestarikan strain, atau diinokulasi ke dalam telur atau ke kultur sel.

 

Organisme dapat diidentifikasi dengan menyiapkan antigen dari kantung kuning telur yang terinfeksi dan mengujinya dengan pewarnaan langsung dari smear menggunakan pewarna yang sesuai atau dengan menggunakan antigen dalam uji serologis.

 

Monolayer kultur sel dapat diinokulasi dengan suspensi kantung kuning telur dan diperiksa dengan imunofluoresensi langsung 48–72 jam kemudian untuk keberadaan inklusi klamidia. Inklusi yang khas adalah badan bulat atau berbentuk topi yang intracytoplasmik. Dengan beberapa strain virulen, inklusi cepat terpecah dan antigen klamidia terdispersi di seluruh sitoplasma.

 

1.5. Deteksi Antigen

 

1.5.1. Pewarnaan Imunohistokimia

 

Pewarnaan imunohistokimia dapat digunakan untuk mendeteksi klamidia dalam persiapan sitologi dan histologi, dan merupakan alat yang tidak tergantikan untuk menunjukkan asosiasi antara agen klamidia dan lesi patologis dalam jaringan. Teknik ini lebih sensitif dan spesifik dibandingkan dengan pewarnaan histokimia. Deteksi antigen dapat dilakukan menggunakan antibodi anti-Chlamydia yang tersedia secara komersial yang diarahkan terhadap LPS atau MOMP (protein membran luar utama). Pemilihan antibodi primer sangat penting. Baik antibodi poliklonal maupun monoklonal telah digunakan. Karena formalin memengaruhi antigen klamidia, disarankan agar antibodi poliklonal dibuat terhadap klamidia yang dimurnikan dan dinonaktifkan dengan formalin. Strain klamidia yang digunakan tidaklah penting, karena antibodi akan bereaksi terutama terhadap antigen spesifik kelompok. MAbs juga harus dipilih untuk reaksi terhadap klamidia yang diperbaiki dengan formalin. Sebuah kumpulan MAbs reaktif kelompok dapat digunakan.

 

1.5.2. Uji Imunoserben taut-enzim atau Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

 

ELISA telah dipromosikan secara luas dalam format kit untuk digunakan dalam diagnosis klamidiosis pada manusia. Kit uji ini mendeteksi antigen lipopolisakarida (LPS) (reaktif kelompok) dan akan mendeteksi semua spesies Chlamydiaceae. Sejumlah kit ini telah diuji untuk digunakan dalam mendeteksi klamidia pada burung (Vanrompay dkk., 1994), tetapi tidak ada kit yang telah disetujui untuk deteksi C. psittaci. Salah satu masalah dengan beberapa uji ini adalah bahwa LPS klamidia memiliki beberapa epitop yang sama dengan bakteri Gram-negatif lainnya, dan epitop ini dapat mengalami reaksi silang, menghasilkan jumlah hasil positif palsu yang tinggi. Masalah ini telah berkurang atau dihilangkan pada kit yang baru dikembangkan melalui pemilihan MAbs yang hati-hati. Namun, kit ini masih kurang sensitif karena beberapa ratus organisme masih diperlukan untuk memberikan reaksi positif. Kebanyakan diagnostik percaya bahwa diagnosis AC dapat dibuat ketika reaksi ELISA positif kuat diperoleh dari burung dengan tanda-tanda psittakosis. Karena jumlah hasil positif palsu, hasil positif pada burung individu tanpa tanda-tanda penyakit tidak dianggap signifikan, tetapi menunjukkan perlunya pengujian lebih lanjut menggunakan metode yang berbeda.

 

2. Uji Serologis

 

Serologi saja tidak terlalu berguna dalam mendiagnosis infeksi klamidia saat ini pada burung karena tingginya prevalensi infeksi ini pada burung dan keberadaan antibodi antiklamidia dalam jangka panjang (hingga beberapa bulan). Pada sebagian besar spesies burung, terdapat tingkat latar belakang antibodi antiklamidia yang tinggi. Oleh karena itu, untuk menentukan apakah seekor burung terinfeksi, serologi harus selalu digunakan bersamaan dengan deteksi antigen atau gen, atau serum berpasangan harus diperiksa (Vanrompay, 2013). Namun, pemeriksaan serum berpasangan yang wajib menghilangkan relevansi klinis segera dari serologi. Hasil uji positif adalah bukti bahwa burung tersebut terinfeksi oleh bakteri tetapi tidak serta merta menunjukkan infeksi aktif. Hasil negatif palsu dapat terjadi pada burung dengan infeksi akut yang diambil sampelnya sebelum serokonversi. Pengobatan dengan antibiotik juga dapat menunda atau mengurangi respons antibodi. Metode serologis utama yang digunakan untuk mendeteksi antibodi klamidia adalah: (1) berbagai metode aglutinin tubuh elemental (EBA), (2) CFT, dan (3) ELISA.

 

EBA (Elementary Body Agglutination)

 

EBA mendeteksi terutama antibodi IgM dan dengan demikian dapat mendeteksi infeksi dini. Hasil negatif tidak menjamin bahwa seekor burung bebas dari infeksi karena sensitivitas uji ini cukup rendah. Uji CFT langsung mendeteksi IgG avian tetapi tidak IgM, sehingga infeksi terbaru dapat ‘terlewatkan’. Kelemahan-kelemahan dari uji ini adalah: (1) antigen uji tidak tersedia secara komersial, (2) uji ini tidak dapat digunakan untuk menguji serum dari spesies avian yang imunoglobulinnya tidak memperbaiki komplemen, (3) sensitivitasnya hanya relatif, (4) tidak dapat digunakan untuk membedakan antara antibodi IgG dan IgM, dan (5) cukup memakan waktu jika terdapat sejumlah besar sampel yang harus diuji. CFT yang dimodifikasi lebih sensitif tetapi memiliki kelemahan yang sama dengan CFT.

 

CFT semakin banyak digantikan oleh ELISA yang sangat sensitif dan spesifik, yang berdasarkan penggunaan protein rekombinan (Verminnen dkk., 2006) atau antigen peptida (Sachse dkk., 2009). ELISA dapat mendeteksi IgM, IgG, dan IgA avian selama konjugat spesifik isotipe yang benar digunakan.

 

2.1. Uji fiksasi Komplemen Langsung yang Dimodifikasi untuk Klamidia

 

Untuk AC, digunakan metode CFT langsung yang dimodifikasi. Metode ini berbeda dari CFT langsung karena serum ayam normal yang tidak dipanaskan dari ayam tanpa antibodi klamidia ditambahkan ke dalam pengenceran komplemen. Serum normal ini meningkatkan sensitivitas prosedur CFT sehingga dapat digunakan untuk menguji serum dari spesies avian yang antibodinya biasanya tidak memperbaiki komplemen guinea pig.

 

2.1.1. Prosedur Uji

 

i) Serum yang akan diuji dipanaskan tidak aktif pada suhu 60°C selama 30 menit sebelum digunakan.

ii) Serum kemudian diencerkan 1/5 dalam larutan saline buffer veronal (VBS).

iii) Pengenceran dua kali lipat dari serum yang diencerkan disiapkan dalam pelat mikrotiter dengan 96 sumur bagian bawah bulat.

iv) Komplement guinea pig diencerkan dalam VBS sebelum penambahan antigen dan 2 unit hemolitik komplemen digunakan.

v) Serum yang dilengkapi dengan 5% serum ayam segar, komplemen, dan antigen direaksikan dalam pelat dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C (prosedur alternatif yang dapat diterima adalah inkubasi semalam pada suhu 4°C).

vi) Suspensi sel darah merah yang dicuci dan disensitisasi dengan konsentrasi 2–4% ditambahkan.

vii) Pelat diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C, dan kemudian disentrifugasi selama 5 menit pada 600 g.

 

Saat menggunakan antigen CFT yang tersedia secara komersial dan reagen CFT siap pakai, petunjuk dari produsen harus diterapkan. Kontrol yang direkomendasikan untuk memverifikasi kondisi uji:

i) Kontrol positif: serum kontrol yang memberikan reaksi positif;

ii) Kontrol serum negatif: serum kontrol yang memberikan reaksi negatif;

iii) Kontrol anti-komplementer (kontrol serum): pengencer + serum uji yang dinonaktifkan + komplemen + sistem hemolitik;

iv) Kontrol antigen: pengencer + antigen + komplemen + sistem hemolitik;

v) Kontrol sistem hemolitik: pengencer + sistem hemolitik;

vi) Kontrol komplemen: pengencer + titrasi komplemen + antigen + sistem hemolitik.

vii) Ketidakadaan aktivitas anti-komplementer harus diperiksa untuk setiap serum; serum anti-komplementer harus dikeluarkan dari analisis. Sampel yang menghasilkan 100% hemolisis pada pengenceran 1/5 dianggap negatif dan sampel yang menghasilkan 25–100% hemolisis dianggap positif.

 

2.1.2. Persiapan Antigen CFT

 

Metode yang paling sederhana dimulai dengan menumbuhkan klamidia dalam kultur sel. Dua metode yang dijelaskan di bawah ini menghasilkan antigen yang dapat digunakan dalam micro-CFT. Prosedurnya cukup mirip: keduanya mencakup pertumbuhan klamidia dalam kultur sel, inaktivasi klamidia, pemurnian parsial antigen, disrupsi mekanis, dan pengenceran ke dalam buffer yang sesuai. Metode yang dipilih akan bergantung pada peralatan yang tersedia.

 

Prosedur pertama (Grimes, 1985) dimulai dengan klamidia dan sisa kultur sel yang diambil saat efek sitopatik terlihat. Kultur diaktivasi dengan penambahan fenol hingga konsentrasi akhir 1,0%, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, dan dikonsentrasikan dengan sentrifugasi pada 10.000 g selama 1 jam. Endapan disuspensikan kembali hingga 10% dari volume asli menggunakan VBS, pH 7,2, yang mengandung 1,0% fenol dan 1,0% gliserol.

 

Endapan kemudian dihomogenisasi dalam omnimixer dengan kecepatan maksimum selama tiga kali 1 menit sambil didinginkan dalam air es. Homogenat disentrifugasi selama 15 menit pada 100 g untuk menghilangkan sisa-sisa.

 

Beberapa prosedur menyarankan pemanasan antigen selama 30 menit dalam bak air mendidih pada tahap ini. Supernatan disimpan dan diencerkan hingga konsentrasi yang diinginkan.

 

Dalam prosedur kedua untuk produksi antigen untuk CFT (Bracewell & Bevan, 1986), antigen dipersiapkan dari sel L yang terinfeksi dengan strain psittacine. Medium kultur sel dibuang, dan sel dipanaskan selama 40 menit pada 56°C. Sel-sel dilisiskan dalam air suling, klamidia dipecah dengan ultrasonikasi, dan kemudian dibuat isotonik dalam VBS. Antigen diuji terhadap serum konvalesen standar domba dan digunakan pada 2 unit dalam micro-CFT.

 

Ada beberapa prosedur untuk menyiapkan antigen dari kantung kuning telur yang terinfeksi, beberapa di antaranya cukup rumit. Namun, dengan prosedur berikut ini, relatif mudah untuk menyiapkan antigen kantung kuning telur terinfeksi kasar yang bekerja dengan baik dalam CFT langsung yang dimodifikasi. Strain Chlamydia yang diadaptasi untuk telur digunakan untuk menginokulasi telur ayam berembrio yang berusia 6–7 hari melalui kantung kuning telur. Kantung kuning telur diambil dari embrio yang mati antara 3 hingga 7 hari pasca-inokulasi. Hasil panen kantung kuning telur diencerkan 1/3 dalam PBS, buffer Tris, atau medium kultur sel, kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 20 menit. Suspensi didinginkan dan kemudian dihomogenisasi dengan baik. Penggunaan homogeniser jaringan berkecepatan tinggi selama 3–5 menit dianjurkan. Setelah homogenisasi, fenol ditambahkan untuk mencapai konsentrasi akhir 0,5% fenol (siapkan larutan stok fenol 5% dan tambahkan 1 ml untuk setiap 9 ml antigen). Persiapan antigen ini disimpan selama 3 hari, kemudian supernatan digunakan setelah sentrifugasi selama 20 menit pada 1000 g. Antigen dapat disimpan dalam waktu lama pada suhu 4°C.

 

2.2. ELISA protein membran luar rekombinan

 

ELISA protein membran luar mayor (MOMP) rekombinan (Verminnen dkk., 2006) dapat dilakukan pada serum ayam dan kalkun yang telah diolah sebelumnya dengan kaolin untuk menghilangkan aktivitas latar belakang. Titer antibodi spesifik MOMP ditentukan menggunakan protokol ELISA standar dan pelat mikro yang dilapisi dengan MOMP rekombinan. Serum, yang diencerkan 1/100, ditambahkan ke dalam sumur yang telah dilapisi. MOMP rekombinan diproduksi dalam sel COS7 yang ditransfeksi dengan pcDNA4::MOMPHis (Vanrompay dkk., 1999). Secara singkat, sel COS7 dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco yang ditambah dengan 3,7 g natrium bikarbonat/liter, 1 mM L-glutamin, dan 10% serum anak sapi janin. Transfeksi dengan DNA plasmid dilakukan dengan metode diethylaminoethyl dextran. Produksi MOMP rekombinan dipantau 48 jam pasca-transfeksi dengan pewarnaan imunofluoresensi tidak langsung menggunakan antibodi monoklonal (MAbs) spesifik serovar dan genus. MOMP rekombinan berlabel His-tag dimurnikan melalui kromatografi afinitas, dan konsentrasi protein ditentukan dengan uji protein asam bicinchoninic. Untuk penentuan titer antibodi, digunakan pengenceran 1/2000 dan 1/4000 dari antibodi biotinilasi anti-IgG ayam/kalkun (H+L) dan streptavidin yang terkonjugasi dengan peroksidase, masing-masing. Hasilnya dinyatakan positif jika absorbansi melebihi nilai batas, yaitu rata-rata dari serum kontrol negatif ditambah tiga kali deviasi standar.

 

2.3. Tes Lainnya

 

Tes lainnya termasuk uji imunodifusi agar gel, uji aglutinasi lateks (LA), uji EBA (Grimes & Arizmendi, 1996), dan uji mikro-imunofluoresensi (MIFT). Uji imunodifusi kurang sensitif dibandingkan CFT. Uji LA dapat mendeteksi antibodi terhadap C. psittaci dan mudah serta cepat dilakukan (Grimes dkk., 1993). Manik-manik lateks dilapisi dengan antigen klamidia yang dimurnikan, kemudian dicampur dengan baik dengan serum uji pada pelat kaca, dan diputar selama 2 menit untuk meningkatkan aglutinasi. Uji dibaca di latar belakang yang gelap. Serum yang memberikan reaksi positif harus diuji ulang dengan manik-manik yang tidak dilapisi untuk menghilangkan kemungkinan aglutinasi nonspesifik. Uji LA dan CFT langsung berhubungan dalam 72,5% uji dengan serum berpasangan. Uji LA memiliki sensitivitas 39,1% dan spesifisitas 98,8% relatif terhadap CFT langsung (Grimes dkk., 1993). Uji ini mendeteksi baik IgM maupun IgG, tetapi paling baik untuk mendeteksi IgM. Uji ini direkomendasikan untuk mendeteksi infeksi baru atau aktif. Uji EBA hanya mendeteksi IgM dan menunjukkan adanya infeksi saat ini. Uji MIFT cepat dan mudah dilakukan; namun, serum anti-spesies yang terkonjugasi dengan fluoresensi tidak selalu tersedia.

 

C. PERSYARATAN UNTUK VAKSIN

 

Hingga saat ini, belum ada vaksin komersial yang tersedia untuk klamidiosis unggas, meskipun vaksinasi dengan plasmid DNA rekombinan yang mengandung gen C. psittaci ompA memberikan perlindungan yang signifikan (parsial) pada kalkun SPF (specific pathogen free) yang terinfeksi secara eksperimental (Verminnen dkk., 2010) dan burung parkit (Harkinezhad & Schautteet, 2009). Vaksinasi DNA memiliki keuntungan karena dapat digunakan di hadapan antibodi maternal (Van Loock dkk., 2004), dan antigen diproses dengan cara yang sama seperti selama infeksi alami, menghasilkan respons imun humoral dan seluler.

 

REFERENSI

1.        ANDERSEN A.A. & VANROMPAY D. (2008). Chapter 16, Chlamydiosis. In: A Laboratory Manual for the Isolation, Identification and Characterization of Avian Pathogens, Fifth Edition, Dufour-Zavala L., ed. The American Association of Avian Pathologists (AAAP), Jacksonville, Florida, USA.

2.        BOREL N., KEMPF E., HOTZEL H., SCHUBERT E., TORGERSON P., SLICKERS P., EHRICHT R., TASARA T., POSPISCHIL A. & SACHSE K. (2008). Direct identification of chlamydiae from clinical samples using a DNA microarray assay – a validation study. Mol. Cell. Probes, 22, 55–64.

3.        BRACEWELL C.D. & BEVAN B.J. (1986). Chlamydiosis in birds in Great Britain. 1. Serological reactions to chlamydia in birds sampled between 1974 and 1983. J. Hyg. (Camb.), 96, 447–451.

4.        CAMPBELL T.W. (2015). Normal avian cytology. In: Exotic Animal Hematology and Cytology, Fourth Edition, Campbell T.W., ed. Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, USA and Oxford, UK, 219–227.

5.        DEGRAVES F.J., GAO D. & KALTENBOECK B. (2003). High-sensitivity quantitative PCR platform. Biotechniques, 34, 106– 115.

6.        DICKX V., GEENS T., DESCHUYFFELEER T., TYBERGHIEN L., HARKINEZHAD T., BEECKMAN D.S., BRAECKMAN L. & VANROMPAY D. (2010). Chlamydophila psittaci zoonotic risk assessment in a chicken and turkey slaughterhouse. J. Clin. Microbiol., 48, 3244–3250.

7.        EHRICHT R., SLICKERS P., GOELLNER S., HOTZEL H. & SACHSE K. (2006). Optimized DNA microarray assay allows detection and genotyping of single PCR-amplifiable target copies. Mol. Cell Probes, 20, 60–63.

8.        EVERETT K.D.E., HORNUNG L.J. & ANDERSEN A.A. (1999). Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests. J. Clin. Microbiol., 37, 575–580.

9.        GEENS T., DEWITTEA., BOONN. & VANROMPAYD. (2005). Development of a Chlamydophila psittaci species-specific and genotype-specific real-time PCR. Vet. Res., 36, 1–11.

10.    GRIMES J.E. (1985). Direct complement fixation and isolation attempts for detecting Chlamydia psittaci infection of psittacine birds. Avian Dis., 29, 837–877.

11.    GRIMES J.E. & ARIZMENDI F. (1996). Usefulness and limitations of three serologic methods for diagnosing or excluding chlamydiosis in birds. J. Am. Vet. Med. Assoc., 209, 747–750.

12.    GRIMES J.E., PHALEN D.N. & ARIZMENDI F. (1993). Chlamydia latex agglutination antigen and protocol improvement and psittacine bird anti-chlamydial immunoglobulin reactivity. Avian Dis., 37, 817–824.

13.    GUO W., LI J., KALTENBOECK B., GONG J., FAN W. & WANG C. (2016). Chlamydia gallinacea, not C. psittaci, is the endemic chlamydial species in chicken (Gallus gallus). Sci. Rep., 6, 19638.

14.    HARKINEZHAD T.&SCHAUTTEET K.(2009). Protection of budgerigars (Melopsittacus Undulatus) against Chlamydophila psittaci challenge by DNA vaccination. Vet. Res., 40, 61.

15.    HEDDEMA E., VAN HANNEN E.J., BONGAERTS M., DIJKSTRA F., TEN HOVE R.J., DE WEVER B. & VANROMPAY D. (2015). Typing of Chlamydia psittaci to monitor the epidemiology and to aid in the control of Psittacosis, The Netherlands, 2008– 2013. Eurosurveillance, 20, pii: 21026.

16.    HEDDEMA E.R., VAN HANNEN E.J., DUIM B., VANDENBROUCKE-GRAULS C.M. & PANNEKOEK Y. (2006). Genotyping of Chlamydophila psittaci in human samples. Emerg. Infect. Dis., 12, 1989–1990.

17.    KALETA E.F. & TADAY E.M. (2003). Avian host range of Chlamydophila spp. based on isolation, antigen detection and serology. Avian Pathol., 32, 435–462.

18.    LAGAE S., KALMAR I., LAROUCAU K., VORIMORE F. & VANROMPAY D. (2014). Emerging Chlamydia psittaci infections in chickens and examination of transmission to humans. J. Med., 63, 399–407.

19.    LAROUCAU K., AAZIZ R., MEURICE L., SERVAS V., CHOSSAT I., ROYER H., DE BARBEYRAC B., VAILLANT V., MOYEN J.L., MEZIANI F., SACHSE K. & ROLLAND P. (2015). Outbreak of psittacosis in a group of women exposed to Chlamydia psittaci-infected chickens. Eurosurveillance, 20, pii: 21155.

20.    LAROUCAU K., VORIMORE F., AAZIZ R., BERNDT A., SCHUBERT E. & SACHSE K. (2009). Isolation of a new chlamydial agent from infected domestic poultry coincided with cases of atypical pneumonia among slaughterhouse workers in France. Infect. Genet. Evol., 9, 1240–1247.

21.    MÉNARD A., CLERC M., SUBTIL A., MÉGRAUD F., BÉBÉAR C. & DE BARBEYRAC B. (2006). Development of a real-time PCR for the detection of Chlamydia psittaci. J. Med. Microbiol., 55, 471–473.

22.    OPOTA O., JATON K., BRANLEY J., VANROMPAY D., ERARD V., BOREL N., LONGBOTTOM D. & GREUB G. (2015). Improving the molecular diagnosis of Chlamydia psittaci and Chlamydia abortus infection with a species-specific duplex real-time PCR. J. Med. Microbiol., 64, 1174–1185.

23.    PANNEKOEK Y., DICKX V., BEECKMAN D.S.A., KEIJZERS W.C., VRETOU E., VANROMPAY D. & VAN DER ENDE A. (2010). Multi Locus Sequence Typing of Chlamydia reveals host species jumps by Chlamydia psittaci and Chlamydia abortus. PLoS One, 5, e14179.

24.    PANTCHEV A., STING R., BAUERFEIND R., TYCZKA J. & SACHSE K. (2009). New real-time PCR tests for species-specific detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus from tissue samples. Vet. J., 181, 145–150.

25.    SACHSE K., BAVOIL P.M., KALTENBOECK B., STEPHENS R.S., KUO C.C., ROSSELLÓ-MÓRA R. & HORN M. (2015). Emendation of the family Chlamydiaceae: proposal of a single genus, Chlamydia, to include all currently recognized species. Syst. Appl. Microbiol., 38, 99–103.

26.    SACHSE K., HOTZEL H., SLICKERS P., ELLINGER T. & EHRICHT R. (2005). DNA microarray-based detection and identification of Chlamydia and Chlamydophila. Mol. Cell Probes, 19, 41–50.

27.    SACHSE K., LAROUCAU K., HOTZEL H., SCHUBERT E., EHRICHT R.& SLICKERS P. (2008). Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes. BMC Microbiol., 8, 63.

28.    SACHSE K., LAROUCAU K., RIEGE K., WEHNER S., DILCHER M., CREASY H.H., WEIDMANN M., MYERS G., VORIMORE F., VICARI N., MAGNINO S., LIEBLER-TENORIO E.,RUETTGER A.,BAVOIL P.M., HUFERT F.T.,ROSSELLÓ-MÓRA R. & MARZ M. (2014). Evidence for the existence of two new members of the family Chlamydiaceae and proposal of Chlamydia avium sp and Chlamydia gallinacea sp. nov. Syst. Appl. Microbiol., 37, 79–88.

29.    SACHSE K., VRETOU E., LIVINGSTONE M., BOREL N., POSPISCHIL A. & LONGBOTTOM D. (2009). Recent developments in the laboratory diagnosis of chlamydial infections (review). Vet. Microbiol., 135, 2–21.

30.    VAN LOOCK M., LAMBIN S., VOLCKAERT G., GODDEERIS B.M. & VANROMPAY D. (2004). Influence of maternal antibodies on Chlamydophila psittaci-specific immune responses in turkeys elicited by naked DNA. Vaccine. 22, 1616–1623.

31.    VAN LOOCK M., VANROMPAY D., HERRMANN B., VANDER STAPPEN J., VOLCKAERT G., GODDEERIS B.M. & EVERETT K.D. (2003). Missing links in the divergence of Chlamydophila abortus from Chlamydophila psittaci. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53, 761–770.

32.    VANROMPAY D. (2013). Chapter 24, Avian Chlamydiosis. In: Diseases of Poultry, Thirteenth Edition, Swayne D., Glisson J.R., McDougald L.R., Nolan L.K., Suarez D.L. & Nair V.L., eds. Wiley-Blackwell Publishing, Hoboken, New Jersey, USA.

33.    VANROMPAY D., COX E., VOLCKAERT G. & GODDEERIS B. (1999). Turkeys are protected from infection with Chlamydia psittaci by plasmid DNA vaccination against the major outer membrane protein. Clin. Exp. Immunol., 118, 49–55.

34.    VANROMPAY D., DUCATELLE R. & HAESEBROUCK F. (1992). Diagnosis of avian chlamydiosis; specificity of the modified Gimenez staining on smears and comparison of the sensitivity of isolation in eggs and three different cell cultures. J. Vet. Med. [B]., 39, 105–112.

35.    VANROMPAY D., HARKINEZHAD T., VAN DE WALLE M., BEECKMAN D., VAN DROOGENBROECK C., VERMINNEN K., LETEN R., MARTEL A.&CAUWERTS K.(2007). Chlamydophila psittaci transmission from pet birds to humans. Emerg. Infect. Dis.,13, 1108– 1110.

36.    VANROMPAY D.,VAN NEROM A., DUCATELLE R. & HAESEBROUCK F. (1994). Evaluation of five immunoassays for detection of Chlamydia psittaci in cloacal and conjunctival specimens from turkeys. J. Clin. Microbiol., 32, 1470–1474.

37.    VERMINNEN K., VAN LOOCK M., HAFEZ H.M., DUCATELLE, R., HAESEBROUCK F. & VANROMPAY D. (2006). Evaluation of a recombinant enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Chlamydophila psittaci antibodies in turkey sera. Vet. Res., 37, 623–632.

38.    VERMINNEN K., BEECKMAN D., SANDERS N., DE SMEDT S. & VANROMPAY D. (2010). Vaccination of turkeys against Chlamydophila psittaci through optimised DNA formulations and administration. Vaccine, 28, 3095–3105.

39.    ZOCEVIC A.,VICARI N., GASPARINI J., JACQUIN L.,SACHSE K., MAGNINO S.& LAROUCAU K. (2013). A real-time PCR assay for the detection of atypical strains of Chlamydiaceae from pigeons. PLoS One, 8, e58741

 

SUMBER:

WOAH. Avian Chlamydiosis. 2018. https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.01_AVIAN_CHLAMYD.pdf