Desain dan Pengujian Donor Babi
yang Disesuaikan untuk Transplantasi Silang Spesies (Xenotransplantasi)
ABSTRAK
Studi terbaru pada model manusia yang telah meninggal
dunia (1,2) dan penggunaan xenograft secara belas kasih (3) telah
mengeksplorasi potensi organ babi untuk transplantasi pada manusia. Untuk
melanjutkan ke studi klinis, diperlukan donor babi yang siap secara klinis yang
harus direkayasa dan xenograft-nya berhasil diuji pada primata nonmanusia. Di
sini, kami menjelaskan desain, pembuatan, dan fungsi pendukung kehidupan jangka
panjang dari cangkok ginjal yang berasal dari donor babi yang direkayasa secara
genetik dan ditransplantasikan pada model monyet cynomolgus. Donor babi ini
direkayasa untuk membawa 69 pengeditan genom, menghilangkan antigen glikan,
mengekspresikan transgen manusia secara berlebih, dan menonaktifkan retrovirus
endogen babi. Analisis fungsional in vitro menunjukkan bahwa sel endotel ginjal
yang telah diedit dapat memodulasi inflamasi hingga mencapai tingkat yang tidak
dapat dibedakan dari sel endotel manusia, menunjukkan bahwa sel yang telah
diedit ini memiliki tingkat kompatibilitas imun manusia yang tinggi. Ketika
ditransplantasikan pada monyet cynomolgus, ginjal dengan tiga penghapusan
antigen glikan saja menunjukkan kelangsungan hidup cangkok yang buruk,
sedangkan ginjal dengan penghapusan antigen glikan dan ekspresi transgen manusia
menunjukkan waktu kelangsungan hidup yang jauh lebih lama, menunjukkan manfaat
ekspresi transgen manusia in vivo. Hasil ini menunjukkan bahwa studi praklinis
xenotransplantasi ginjal dapat berhasil dilakukan pada primata nonmanusia dan
membawa kita lebih dekat ke uji klinis cangkok ginjal babi yang direkayasa
secara genetik.
PENDAHULUAN
Xenotransplantasi dapat menawarkan solusi transformatif
terhadap krisis kekurangan organ di seluruh dunia (1,2,3). Untuk melanjutkan ke
studi klinis, diperlukan donor babi yang siap secara klinis yang harus
direkayasa dan xenograft-nya berhasil diuji pada model primata nonmanusia (NHP)
untuk menilai keamanan dan efektivitasnya.
Selama bertahun-tahun, berbagai donor babi yang
direkayasa secara genetik telah diciptakan, dan ginjal mereka
ditransplantasikan pada monyet Dunia Lama (OWM) (4,5,6). Meskipun donor-donor
ini memberikan pemahaman tentang ketidakcocokan molekuler dalam
xenotransplantasi, mereka belum siap secara klinis. Pertama, donor sering kali
dibuat pada jenis babi komersial yang ukuran jantung dan ginjalnya terlalu
besar untuk aplikasi manusia. Walaupun eliminasi ekspresi gen reseptor hormon
pertumbuhan dapat mengurangi ukuran organ (2,3), hal ini juga menyebabkan
konsekuensi biologis yang tidak diinginkan (7). Kedua, donor dirancang untuk
pengujian pada OWM (4,5,6). Donor ini tidak memiliki α-Gal
(galaktosa-α-1,3-galaktosa) atau α-Gal dan Sd(a)
(Sia-α2.3-[GalNAc-β1.4]Gal-β1.4-GlcNAc) tetapi masih mengekspresikan Neu5Gc
(N-glycolylneuraminic acid) untuk mencocokkan ekspresi Neu5Gc pada OWM. Namun,
analisis in vitro menunjukkan bahwa donor babi yang kompatibel dengan manusia
idealnya harus memiliki ketiga glikan ini dihilangkan untuk mencocokkan
ketiadaan ketiga glikan tersebut pada manusia (8,9). Meskipun cangkok ginjal
dari donor babi yang tidak memiliki ketiga glikan ini dan membawa berbagai
transgen manusia telah diuji pada OWM, kelangsungan hidup cangkoknya pendek (8)
atau tidak semua transgen manusia diekspresikan (10). Ketiga, donor membawa
sekuens retrovirus endogen babi (PERV) dalam genom mereka, yang menghadirkan
risiko zoonosis, karena transmisi PERV ke sel manusia dalam kultur dan
integrasinya ke dalam genom manusia telah terbukti (11,12).
Di sini, kami menciptakan donor babi yang disesuaikan
dengan manusia pada jenis babi miniatur Yucatan dan mentransplantasikan cangkok
ginjal babi yang tidak memiliki tiga glikan dengan atau tanpa penghapusan PERV
(inaktivasi retrovirus (RI)) (disebut 3KO.RI atau 3KO), atau 3KO dengan tujuh
transgen manusia dengan atau tanpa RI (disebut 3KO.7TG.RI atau 3KO.7TG) ke
dalam monyet cynomolgus (Macaca fascicularis). Kami menunjukkan bahwa cangkok
ginjal babi yang disesuaikan dengan manusia, dikombinasikan dengan rejimen
imunosupresif yang relevan secara klinis, mendukung kelangsungan hidup NHP
jangka panjang hingga 2 tahun (758 hari).
Ketidakcocokan Molekuler Babi
Terdapat ketidakcocokan molekuler yang substansial antara
babi dan manusia. Ketidakcocokan ini terutama berfokus pada antigen permukaan
sel dan regulator kaskade komplemen, jalur koagulasi, serta proses inflamasi
(13,14)(Tab Tambahan 1).
Sel babi menampilkan tiga antigen glikan utama pada
permukaan selnya — α-Gal (15), Neu5Gc (16), dan Sd(a) (17) — yang merupakan
produk dari gen sintesis glikan terkait, yaitu glycoprotein
α-galactosyltransferase 1 (GGTA1), cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid
hydroxylase (CMAH), dan β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2
(B4GALNT2)/B4GALNT2-like (B4GALNT2L). Pada manusia, GGTA1 (18) dan CMAH (19)
berkembang menjadi pseudogen, sehingga epitope α-Gal dan Neu5Gc tidak
diekspresikan (Gambar 1a).
Setelah lahir, manusia
mengembangkan antibodi terhadap α-Gal dan Neu5Gc, yang disebut sebagai antibodi
bawaan, akibat paparan terhadap molekul yang menyerupai kedua antigen ini (16,20,21).
Meskipun gen B4GALNT2 pada manusia bersifat fungsional
(22), tingkat ekspresinya bervariasi, dan mutasi alami telah diidentifikasi
yang berkorelasi dengan fenotipe Sd(a-) (23). Tingkat rendah antibodi yang
bereaksi dengan Sd(a) telah terdeteksi pada manusia (24). Sama seperti manusia,
monyet Dunia Lama (Old
World Monkeys,
OWM) memiliki antibodi bawaan terhadap α-Gal dan Sd(a), tetapi berbeda dengan
manusia, mereka tidak memiliki antibodi bawaan terhadap Neu5Gc karena mereka
memiliki gen CMAH yang fungsional (25) (Gambar
1a).
Gambar 1. Ketidakcocokan fungsional antara
donor babi dan penerima primata.
a. Analisis imunohistokimia (IHC) mengonfirmasi bahwa
tiga antigen glikan diekspresikan pada ginjal babi tipe liar (WT), tetapi telah
dieliminasi dari ginjal 3KO.7TG (ID donor 21077) dan 3KO.7TG.RI (ID donor
A9161), dengan pola yang serupa dengan ginjal manusia. Sebagai perbandingan,
monyet Dunia Lama (Old
World Monkeys,
OWM) mengekspresikan antigen Neu5Gc. Analisis IHC untuk 3KO dilakukan pada
semua sampel ginjal kontralateral yang disertakan dalam studi ini, dan fenotipe
3KO dikonfirmasi pada semua sampel.
b. Sel endotel ginjal babi tipe liar (WT KEC) mengikat
antibodi bawaan manusia dan primata non-manusia (NHP), sementara sel endotel
ginjal babi 3KO menunjukkan pengikatan antibodi yang berkurang secara
signifikan. Setiap sampel diuji dalam tiga replikasi teknis. Garis kesalahan
menunjukkan standar deviasi (s.d.).
c. Sel endotel yang berasal dari aorta 3KO (3KO AECs)
mengikat IgG dan IgM secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan WT AECs
ketika diinkubasi dengan 96 sampel serum individu dari monyet cynomolgus. Perlu
dicatat bahwa 3KO AECs masih menunjukkan tingkat pengikatan IgG dan IgM yang
substansial. Analisis statistik dilakukan menggunakan uji Wilcoxon
matched-pairs signed rank.
d. WT KECs menunjukkan deposisi C3b yang signifikan dalam
serum manusia dibandingkan dengan sel endotel vena umbilikalis manusia
(HUVECs). Meskipun berkurang secara signifikan, 3KO KECs tetap menunjukkan
tingkat deposisi C3b yang substansial (panel kanan). Garis kesalahan
menunjukkan standar error mean (s.e.m.).
e. WT KECs menunjukkan deposisi C3b, sementara 3KO KECs
menunjukkan deposisi yang lebih rendah ketika diinkubasi dalam serum monyet
cynomolgus. Garis kesalahan menunjukkan s.e.m.
f. Sel endotel ginjal babi (WT atau 3KO) tidak
menghasilkan protein C teraktivasi (aPC), sementara HUVECs dengan mudah
menghasilkan aPC. Untuk d–f, WT KECs (n = 1), 3KO KECs (n = 3), dan HUVECs (n =
1). OD405, densitas optik pada panjang gelombang 405 nm.
g. Ketika diinkubasi dengan darah utuh manusia, WT (n =
1) dan 3KO (n = 1) KECs babi memicu pembekuan, yang diukur sebagai pembentukan
kompleks trombin-antitrombin (TAT). Garis kesalahan menunjukkan s.e.m. Untuk
d–g, setiap titik mewakili replikasi biologis yang diperiksa dalam setidaknya
dua eksperimen independen. Kecuali untuk c, analisis statistik dilakukan
menggunakan uji t dua sisi tanpa pasangan. ****P < 0,0001, ***P < 0,001,
**P < 0,01, *P < 0,05.
Ketika sel babi terpapar serum primata, antigen glikan
dikenali oleh antibodi bawaan primata, yang mengarah pada penolakan yang
dimediasi antibodi (antibody-mediated
rejection,
AMR) (13). Dalam uji pengikatan antibodi, sel endotel ginjal babi tipe liar (WT
KECs) mengikat tingkat tinggi IgG dan IgM manusia, dan pengikatan ini berkurang
secara signifikan ketika tiga xenoantigen dieliminasi (3KO KECs) (Gambar 1b).
Pengikatan IgG dan IgM serum OWM serupa, meskipun pengikatan antibodi residual
yang substansial (terutama pengikatan IgM) terdeteksi pada 3KO KECs (Gambar 1b).
Hal ini konsisten dengan laporan lain bahwa sel babi 3KO memiliki xenoantigen
tambahan yang dikenali oleh serum OWM (8,9). Sel endotel yang berasal dari
aorta (AECs) tipe liar dan 3KO menunjukkan perilaku serupa dengan KECs ketika
diinkubasi dengan 96 sampel serum individu dari monyet cynomolgus (Gambar 1c).
Pengikatan antibodi memicu aktivasi komplemen,
menghasilkan C3b yang terikat pada permukaan dan C3a yang larut. Ketika
diinkubasi dengan serum manusia, HUVECs tidak menunjukkan deposisi C3b (Gambar
1d), yang menunjukkan tidak adanya pengikatan antibodi dan/atau mitigasi
lengkap aktivasi komplemen. Ketika WT KECs babi diinkubasi dengan serum
manusia, deposisi C3b yang signifikan diamati. Meskipun 3KO KECs menunjukkan
pengurangan signifikan dalam deposisi C3b dibandingkan dengan WT KECs, mereka
masih menunjukkan deposisi C3b residual yang substansial (Gambar 1d),
menunjukkan bahwa regulator komplemen babi kurang efektif dalam mengurangi
aktivasi komplemen manusia. Ketika WT dan 3KO KECs babi diinkubasi dengan serum
monyet cynomolgus, hasil yang serupa diperoleh, meskipun tingkat C3b residual
yang lebih tinggi pada sel babi 3KO dibandingkan dengan serum manusia (Gambar
1e).
Dalam kondisi fisiologis, trombomodulin dan reseptor
protein C endotel (EPCR) diekspresikan pada permukaan sel endotel dan
menghambat pembekuan dengan memungkinkan regulasi yang dimediasi aPC (26,27).
Ketika trombin manusia dan protein C diberikan ke HUVECs, aPC dengan mudah
dihasilkan (Gambar 1f). Sebaliknya, produksi aPC tidak diamati ketika reagen
ini diberikan ke WT atau 3KO KECs babi (Gambar 1f), menunjukkan bahwa trombin
dan protein C manusia tidak kompatibel dengan trombomodulin dan/atau EPCR babi.
Pembekuan darah utuh manusia secara eks vivo yang ditingkatkan diamati, diukur sebagai
pembentukan kompleks trombin-antitrombin (TAT), yang kemungkinan disebabkan
oleh ketidakmampuan sel babi untuk menghasilkan aPC (Gambar 1g).
Donor Babi yang Dimanusiakan
Ras babi mini Yucatan dipilih karena ukuran organnya
sebanding dengan organ manusia (28). Selain itu, babi dengan golongan darah OO
dipilih untuk menghilangkan ketidakcocokan golongan darah ABO (29).
Babi-babi ini direkayasa untuk membawa 69 modifikasi
genomik menggunakan teknik clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) dan protein terkait
CRISPR-9 (Cas9) melalui mekanisme penyambungan ujung yang tidak homolog (nonhomologous
end joining)
serta perbaikan yang diarahkan oleh homologi (homology-directed
repair)
(30,31), dan pertukaran kaset yang dimediasi oleh rekombinase (recombinase-mediated
cassette exchange)
(32) (Gambar 2a, Gambar Data Ekstensi 1a, dan Tabel Tambahan 2). Modifikasi ini
mengganggu tiga gen sintesis glikan (delapan alel; Gambar Data Ekstensi 1b)
(3KO), menyisipkan konstruksi transgenik yang disebut Payload 15S (PL15S)
secara hemizigot di lokasi AAVS1 (Gambar Data Ekstensi 1a) (7TG), serta
menonaktifkan elemen PERV (59 salinan) (RI) (Gambar Data Ekstensi 1c) yang
dibawa dalam sel betina Yucatan Yuc25F.
Gambar 2: Donor Porcine Yucatan Direkayasa
untuk Membawa 69 Modifikasi Genomik
a. Ginjal donor Babi, 3KO.7TG.RI, direkayasa untuk
menghilangkan tiga antigen glikan (3KO), mengekspresikan tujuh transgen manusia
secara berlebih (PL15S), dan menonaktifkan elemen PERV (RI) melalui tiga tahap
pengeditan dan kloning. Ginjal donor, 3KO.7TG, membawa 3KO dan PL15S tanpa RI.
KI adalah knock
in, sedangkan RMCE adalah
pertukaran kaset yang dimediasi oleh rekombinase (recombinase-mediated
cassette exchange).
b. Pembacaan dari sekuensing genom lengkap berbasis
Nanopore pada donor 3KO.7TG.RI, A9161, disejajarkan dengan kromosom kustom yang
membawa PL15S yang disisipkan pada situs aman genomik AAVS1 (atas). Pembacaan
dari sekuensing RNA langsung berbasis Nanopore (dRNA-seq) pada mRNA ginjal
A9161 disejajarkan dengan kromosom kustom (bawah). Ketiga unit transkripsi
ditranskripsi.
c. Ketujuh protein transgenik manusia terdeteksi di
ginjal kontralateral (contra) A9161 yang diambil saat transplantasi (baris 1),
dan di ginjal xenograft (xeno) yang diambil saat nekropsi pada hari ke-176
pasca-transplantasi (baris 2). HRP: horseradish peroxidase; TM: trombomodulin; Ms–HRP: antibodi
sekunder anti-tikus yang terkonjugasi dengan HRP; Rb–HRP: antibodi sekunder
anti-kelinci yang terkonjugasi dengan HRP.
d. Tiga jenis sel endotelial diidentifikasi dari populasi
sel ginjal yang terdisosiasi menggunakan sekuensing RNA sel tunggal
(single-cell RNA-seq), yaitu sel endotelial (ECs) (PECAM1+PLVAP−EHD3−GATA5−), sel endotelial glomerulus
(GECs) (PECAM1+EHD3+GATA5+), atau sel endotelial
berfenestrasi (FECs) (PECAM1+PLVAP+) (bawah), dan ekspresi transgen dianalisis pada ketiga
jenis sel tersebut (atas). Rata-rata log2-normalisasi unique
molecular identifier
diplot terhadap tiga unit transkripsi PL15S (ssUBC, ssEEF1A1, dan CAG). UMAP: uniform
manifold approximation and projection.
e. Donor porcine 3KO.7TG (n=3) menunjukkan tingkat
filtrasi glomerulus terukur (mGFR) yang normal dibandingkan dengan babi Yucatan
tipe liar (WT) seusia (n=4). Unpaired two-tailed Student’s t-test; garis kesalahan adalah s.e.m.
Titik-titik menunjukkan replikasi biologis, dan data dihasilkan dari satu
eksperimen.
PL15S membawa tujuh gen manusia (Tabel Tambahan 3),
termasuk CD46 dan CD55 dari jalur komplemen, THBD dan PROCR dari jalur koagulasi, CD47 yang terlibat dalam imunitas
bawaan, serta TNFAIP3 dan HMOX1 yang mengurangi cedera
iskemia-reperfusi, apoptosis, dan inflamasi. Konstruksi transgenik ini
dirancang dalam format polikistronik, di mana dua sekuens DNA komplementer
dihubungkan dengan sekuens viral 2A (33), dan tujuh DNA komplementer dipisahkan
ke dalam tiga kaset transkripsi (Gambar Data Ekstensi 1a).
Sekuensing generasi berikutnya dilakukan pada sel-sel
yang diedit dan/atau babi yang dikloning setelah setiap tahap pengeditan dan
kloning. Data yang disajikan berasal dari donor porcine A9161 dengan genotipe
3KO.7TG.RI, yang ginjalnya ditransplantasikan ke penerima NHP M6521 dan
mencapai waktu kelangsungan cangkok selama 176 hari. Sekuensing genom lengkap
berbasis bacaan panjang menunjukkan bahwa satu salinan utuh dari sekuens PL15S
disisipkan ke dalam intron 1 gen PPP1R12C pada babi (ortholog dengan gen AAVS1 pada manusia)
(Gambar 2b, atas). Sekuensing RNA langsung (dRNA-seq) pada sampel ginjal A9161
menunjukkan bahwa ketiga unit transkripsi dalam PL15S ditranskripsi dengan
inisiasi transkripsi, eksisi intron, dan poliadenilasi mRNA yang sesuai (Gambar
2b, bawah). Di antara ketiga unit tersebut, ekspresi unit CAG dan ssUBC lebih
tinggi, sedangkan ekspresi unit ssEEF1A1 berada pada tingkat yang lebih rendah.
Genotipe 3KO dan RI diverifikasi melalui sekuensing produk PCR yang mencakup
situs target CRISPR–Cas9 (Gambar Data Ekstensi 1b,c dan Tabel Tambahan 4).
RNA-seq dan imunohistokimia
(IHC)
dilakukan pada semua transplantasi ginjal 3KO.7TG ± RI yang telah selesai,
kecuali untuk donor 21405 yang tidak memiliki sampel biopsi ginjal
kontralateral (n = 11). Untuk RNA-seq, sampel kontralateral, biopsi, dan
nekropsi dianalisis dan menunjukkan bahwa semua transgen manusia diekspresikan,
dengan ekspresi yang lebih tinggi di bawah promoter CAG dan ssUBC, sementara ekspresi di bawah
promoter ssEEF1A1 lebih rendah (Extended Data Fig.
2a). Untuk analisis IHC (Supplementary Table 5), dua sampel dari setiap
eksperimen transplantasi ginjal, yaitu ginjal kontralateral yang diambil saat
transplantasi dan ginjal transplantasi yang diambil saat nekropsi, dianalisis.
Sebagai contoh, gambar IHC dari A9161 ditampilkan (Fig. 2c). Semua tujuh
protein transgenik terdeteksi di ginjal kontralateral, baik di glomeruli maupun
sel tubulus, dan ekspresi tetap dipertahankan di cangkok ginjal pada hari
ke-176 setelah transplantasi. Fotomikrograf IHC dari semua studi NHP yang
selesai dipindai dan dihitung (Extended Data Fig. 2b–e), menunjukkan bahwa
semua protein transgenik terdeteksi. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa
ekspresi transgenik bersifat tahan lama.
Jaringan ginjal kontralateral dari dua donor babi, A9161
dan 21077 (donor 3KO.7TG), diisolasi menjadi sel tunggal, dan RNA-seq sel
tunggal
dilakukan. Tiga jenis KEC diidentifikasi, termasuk sel endotelial
(PECAM1+PLVAP−EHD3−GATA5−), sel endotelial berfenestra (PECAM1+PLVAP+), dan sel
endotelial glomerular (PECAM1+EHD3+GATA5+) (Fig. 2d). Transkrip dari kaset CAG dan ssUBC terdeteksi dengan jelas pada
ketiga jenis sel endotelial, sementara transkrip kaset ssEEF1A1 ditemukan pada sel endotelial
dan sel endotelial berfenestra, tetapi tidak pada sel endotelial glomerular.
Hal ini mungkin mencerminkan tingkat ekspresi kaset ssEEF1A1 yang lebih rendah sebagaimana
ditunjukkan oleh RNA-seq langsung (Fig. 2b). Namun demikian, baik protein
manusia TNFAIP3 maupun HMOX1 terdeteksi di ginjal melalui IHC
(Fig. 2c), dan TNFAIP3 juga terdeteksi melalui western
blot (Extended Data Fig. 5c).
Mengingat jumlah pengeditan genom yang relatif besar pada
donor babi, kami ingin mengetahui apakah fungsi ginjal terganggu. Tingkat
filtrasi glomerulus yang terukur pada donor 3KO.7TG tidak berbeda dari babi
Yucatan WT yang cocok berdasarkan usia dan jenis kelamin (Fig. 2e). Selain itu,
ketika dilakukan studi tantangan cairan, kedua kelompok memberikan respons yang
serupa, memberikan bukti lebih lanjut bahwa ginjal 3KO.7TG berfungsi secara
normal (Extended Data Fig. 1d).
Pengeditan Genom Memberikan Perlindungan
Kami mengisolasi KEC primer dari babi (Extended Data Fig. 3a,b)
dan melakukan analisis in vitro. Seperti yang diharapkan, KEC 3KO tidak memiliki α-Gal,
Neu5Gc, dan Sd(a) (Extended Data Fig. 3c), dan KEC 3KO.7TG ± RI mengekspresikan
transgen manusia, sebagaimana dianalisis melalui flow cytometry (Extended Data
Fig. 4a, CD46, CD55, EPCR, dan trombomodulin; Extended Data Fig. 5a, CD47) dan
melalui western blot (Extended Data Fig. 5c, TNFAIP3).
Ketika diinkubasi dalam serum manusia atau monyet
cynomolgus, KEC 3KO.7TG ± RI menunjukkan penurunan yang signifikan pada
deposisi C3b dibandingkan dengan sel 3KO,
menunjukkan bahwa transgen (atau transgen-transgen) menghambat aktivasi
komplemen (Fig. 3a,b). Ketika diinkubasi dengan serum manusia atau monyet
cynomolgus selama 45 menit, sel WT terlisis, sedangkan modifikasi 3KO hampir sepenuhnya
menghilangkan sitotoksisitas yang bergantung pada komplemen dari serum manusia,
tetapi tidak pada serum monyet cynomolgus (Fig. 3c dan Extended Data Fig.
4b,c). Hal ini menunjukkan bahwa serum monyet cynomolgus memiliki aktivitas
sitotoksik anti-babi yang lebih kuat dibandingkan dengan serum manusia. Ketika
waktu inkubasi diperpanjang menjadi 15 jam, modifikasi 3KO tidak cukup untuk
sepenuhnya melindungi sel bahkan dari kematian sel akibat serum manusia,
sedangkan KEC 3KO.7TG ± RI terlindungi dari sitotoksisitas serum manusia dan
monyet cynomolgus, melampaui perlindungan yang diberikan oleh 3KO (Extended
Data Fig. 4b). Kontribusi transgen CD46 dan CD55 diverifikasi dengan antibodi penghambat (Fig. 3d dan
Extended Data Fig. 4d,e). Selain itu, ketika CD46, CD55, atau keduanya diekspresikan
dalam KEC 3KO, masing-masing terbukti secara fungsional kompeten untuk
mengurangi aktivasi komplemen (Fig. 3e). Secara kolektif, data ini menunjukkan
bahwa protein manusia transgenik CD46 dan CD55 mengatur aktivitas komplemen ketika diekspresikan pada
KEC babi. Dengan memasukkan kedua transgen, kami meniru redundansi bawaan
alami, yang dapat membuat sistem lebih tangguh jika salah satu regulator hilang
akibat pelepasan (CD46) atau oleh pemotongan enzimatik (CD55) selama peradangan
atau cedera jaringan (34,35).
Gambar 3: Gen Transgenik Manusia Memberikan
Perlindungan
a, b. Dalam serum manusia (a) atau monyet
cynomolgus (b), deposisi C3b pada sel endotel ginjal babi yang dimodifikasi
(3KO.7TG ± RI KECs) semakin berkurang. Garis putus-putus menunjukkan rata-rata
deposisi C3b (serum + EDTA).
c. Dalam serum manusia atau monyet cynomolgus,
3KO.7TG ± RI KECs terlindungi dari sitotoksisitas yang bergantung pada
komplemen. Sel 3KO KECs menunjukkan sisa sitotoksisitas komplemen dalam serum
monyet cynomolgus.
d. Sel 3KO.7TG ± RI KECs mengurangi deposisi
C3b ketika CD46, CD55 manusia, atau keduanya tidak diblokir oleh antibodi. NHS:
serum manusia normal.
e. Sel 3KO KECs yang membawa gen polisitronik
CD46, CD55, atau CD46–CD55–CD47 mengatur deposisi C3b dalam serum manusia atau
monyet cynomolgus. Garis putus-putus menunjukkan rata-rata deposisi C3b dari
serum yang diolah EDTA.
f. Sel 3KO.7TG ± RI KECs dengan mudah
menghasilkan aPC. Produksi aPC berkurang ketika EPCR atau trombomodulin (TM)
diblokir dengan antibodi, dengan pemblokiran trombomodulin memberikan efek yang
lebih besar. Garis putus-putus menunjukkan rata-rata produksi aPC tanpa sel.
g. Sel 3KO.7TG ± RI KECs mengatur pembentukan
TAT dalam darah utuh. Garis putus-putus menunjukkan baseline TAT dalam darah
donor.
h. CD47 manusia (hCD47) pada 3KO.7TG ± RI KECs
memberi sinyal melalui SIRPα pada sel Jurkat manusia. Sel WT KECs (n = 1), 3KO
KECs (n = 1), 3KO.7TG ± RI (n = 2 untuk 3KO.7TG dan n = 1 untuk 3KO.7TG.RI).
mAb: antibodi monoklonal; RLU: unit cahaya relatif.
i. Sel 3KO.7TG ± RI KECs terlindungi dari
aktivasi kaspase 3/7 yang diinduksi TNF manusia.
j. Sel korteks ginjal 3KO yang mengekspresikan
TNFAIP3, HMOX1, atau gen polisitronik TNFAIP3–HMOX1 terlindungi dari aktivasi
kaspase 3/7 yang diinduksi TNF manusia.
Pada a–d, f–i: WT (n = 1), 3KO (n = 3), 3KO.7TG (n = 3, lingkaran biru
solid), 3KO.7TG.RI (n = 2, lingkaran terbuka), kontrol manusia (HC), dan sel
endotel vena umbilikalis manusia (n = 1, segitiga abu-abu). Dalam a–d, f, g: sel endotel mikrovasikular
glomerular manusia (n = 1, segitiga terbalik abu-abu). Data berasal dari
replikasi biologis yang diulang minimal dua kali untuk a–d, f–i. Untuk e, j, data berasal dari replikasi
teknis. Bilah kesalahan menunjukkan s.e.m. Analisis statistik menggunakan uji t
Student dua sisi, berpasangan (3KO.7TG ± RI dengan versus tanpa antibodi
pemblokir (f)) dan tidak berpasangan
(perbandingan lainnya). ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01; NS:
tidak signifikan.
Berbeda dengan sel babi WT atau 3KO, 3KO.7TG ± RI KECs
dengan mudah menghasilkan aPC (Gambar 3f), mengurangi pembentukan TAT (Gambar
3g), dan mengatur koagulasi darah utuh manusia seefisien sel kontrol manusia
(Gambar Data Tambahan 4h). Dengan menggunakan antibodi pemblokir (Gambar Data
Tambahan 4f), kami menunjukkan bahwa EPCR dan trombomodulin berkontribusi pada
produksi aPC (Gambar 3f), dengan trombomodulin memiliki efek lebih signifikan.
Selain itu, sel 3KO KECs yang mengekspresikan EPCR, trombomodulin, atau
keduanya menunjukkan bahwa keduanya berkontribusi pada produksi aPC, dengan
trombomodulin memiliki efek yang lebih besar dalam sistem eksperimental ini
(Gambar Data Tambahan 4g).
CD47 babi tidak dapat berinteraksi secara efektif dengan
reseptor SIRPα manusia. Menggunakan garis sel reporter SIRPα, kami menemukan
bahwa 3KO.7TG ± RI KECs yang mengekspresikan transgen CD47 manusia mengaktifkan
jalur sinyal SIRPα, dan pra-inkubasi dengan antibodi anti-CD47 manusia
memblokir sinyal SIRPα secara bergantung dosis (Gambar 3h).
Akhirnya, aktivasi sel imun bawaan dalam xenograft memicu
peradangan dan apoptosis sel endotel. Untuk meningkatkan ketahanan jaringan,
TNFAIP3 dan HMOX1 manusia diekspresikan dalam ginjal 3KO.7TG ± RI (Gambar 2c).
Analisis Western blot mengonfirmasi ekspresi TNFAIP3 dalam sel 3KO.7TG ± RI
KECs (Data Tambahan Gambar 5c). Efek ekspresi transgenik TNFAIP3 dan HMOX1
terhadap apoptosis dinilai menggunakan uji caspase 3/7, yang menunjukkan bahwa
tingkat protein transgenik dalam sel 3KO.7TG cukup untuk mengurangi aktivasi
caspase 3/7 setelah perlakuan dengan TNF manusia, dibandingkan dengan sel KEC
3KO (Gambar 3i). Selain itu, sel-sel yang berasal dari korteks ginjal yang
mengekspresikan secara berlebihan TNFAIP3, HMOX1, atau keduanya secara efektif
menghambat aktivasi caspase 3/7 yang diinduksi TNF dalam uji in vitro (Gambar
3j). Meskipun memiliki aktivitas anti-apoptotik yang tumpang tindih, TNFAIP3
dan HMOX1 mencapai hasil tersebut melalui fungsi biologisnya yang unik dan
mengurangi peradangan dalam keadaan yang berbeda. TNFAIP3 adalah enzim
deubiquitinasi yang menghambat apoptosis yang dimediasi TNF (38), sedangkan
HMOX1 terlibat dalam langkah awal degradasi heme dan telah terbukti memiliki
efek antioksidan dan anti-inflamasi (38,39). Kami memasukkan TNFAIP3 dan HMOX1
dalam donor kami, karena kedua transgen ini telah terbukti memberikan manfaat
dalam uji in vitro maupun in vivo (40,41).
Ginjal babi direkayasa
untuk mendukung kehidupan
Sekelompok monyet cynomolgus disaring untuk mendeteksi
ikatan antibodi preformed yang reaktif terhadap babi. Secara umum, monyet
dengan tingkat ikatan antibodi yang lebih rendah terhadap AEC atau KEC 3KO
dipilih (Gambar Data Tambahan 6a–d).
Karena primata non-manusia (NHP) mahal, sangat diatur,
dan terbatas ketersediaannya, tidak memungkinkan untuk melakukan eksperimen
dengan kekuatan statistik yang cukup. Oleh karena itu, jumlah transplantasi NHP
per kelompok genotipe donor babi ditentukan secara empiris, berdasarkan data
historis yang dilaporkan dalam literatur dan apa yang dapat dicapai secara
wajar. Penjodohan antara donor babi dan penerima NHP ditentukan berdasarkan
ketersediaan. Selain itu, studi ini tidak dilakukan secara buta untuk semua
pihak yang terlibat. Para penerima diberikan regimen imunosupresi berupa terapi
induksi dengan deplesi limfosit B dan T, terapi pemeliharaan dengan antibodi
anti-CD154 dan mycophenolate mofetil, serta terapi singkat pasca-transplantasi
menggunakan tacrolimus dan steroid (Gambar Tambahan 1). Ginjal babi yang
direkayasa secara genetik ditransplantasikan bersamaan dengan nefrektomi kedua
ginjal asli monyet cynomolgus.
Mengingat kinerja serupa dari KEC yang diisolasi dari
donor 3KO.7TG atau 3KO.7TG.RI dalam uji fungsional (Gambar 3 dan Gambar Data
Tambahan 3–5), kami menganalisis transplantasi yang dilakukan dengan ginjal 3KO
dengan dan tanpa RI sebagai satu kelompok, serta ginjal 3KO.7TG dan 3KO.7TG.RI
sebagai kelompok kedua. Kelangsungan hidup enam penerima transplantasi ginjal
3KO ± RI relatif pendek, dengan akhir studi pada hari ke-4 dan ke-6 (gagal
ginjal), hari ke-21 (koagulasi intravaskular diseminata), serta hari ke-26,
ke-35, dan ke-50 (edema berat dan proteinuria) (Tabel 1). Sebaliknya,
transplantasi 3KO.7TG (n = 8) dan 3KO.7TG.RI (n = 7) menunjukkan kelangsungan
hidup cangkok yang secara signifikan lebih lama dibandingkan xenograft 3KO ± RI
(n = 6) (median waktu kelangsungan hidup 176 hari versus 24 hari; P = 0,026, uji
log-rank) (Tabel 1 dan Gambar 4a). Filtrasi metabolit seperti kreatinin oleh
ginjal babi tunggal yang ditransplantasikan cukup untuk mengimbangi ketiadaan
dua ginjal asli (Gambar 4b), sebagaimana yang rutin diamati pada
alotransplantasi ginjal manusia. Parameter lain, termasuk albumin serum, kalium
serum, dan jumlah trombosit darah, umumnya tetap dalam rentang normal, kecuali
saat terjadi gagal ginjal (albumin dan kalium serum) (Gambar Tambahan 5).
Tabel 1. Ginjal Cangkok Mendukung Kehidupan
pada Xenotransplantasi Babi ke Primata Non-Manusia (NHP)
(Dari: Desain dan pengujian donor babi yang disesuaikan
untuk transplantasi silang spesies)
|
Genotipe
|
ID Hewan
|
Lama Hidup
(hari)a
|
Alasan
Eutanasib
|
EOS
|
Pola
Cedera Xenograft
|
De novo
DSAc
|
|
3KO.RI
|
M13021
|
4
|
Gagal ginjal
|
–
|
ATI
|
Tidak
|
|
M12121
|
6
|
Gagal ginjal
|
T
|
AMR, TMA
|
Ya
|
|
CY1061d
|
21
|
HE — perdarahan intra-abdomen,
DIC dengan anemia refrakter dan insufisiensi ginjal
|
I, C/A, T, U
|
ATI, TMA
|
Tidak
|
|
CY1062d
|
26
|
HE — insufisiensi pernapasan
dengan hemoptisis, edema perifer, dan insufisiensi ginjal
|
I, C/A
|
ATI, TMA
|
Tidak
|
|
MB1027d
|
35
|
HE — edema perifer dan
insufisiensi ginjal
|
–
|
ATI, TMA
|
Ya
|
|
3KO
|
M11521e
|
50
|
HE — edema perifer
|
C/A, T, BH
|
ATI, TCMR-IA
|
Ya
|
|
3KO.7TGf
|
M2220
|
8
|
HE — insufisiensi pernapasan
dengan efusi pleura dan insufisiensi ginjal
|
–
|
AMR, TMA
|
Tidak
|
|
M10619
|
9
|
Gagal ginjal
|
C/A, T
|
AMR, TMA
|
Tidak
|
|
M11421
|
25
|
Gagal ginjal
|
BH
|
AMR, ATI, TMA
|
Tidak
|
|
M8220g,h
|
103
|
Gagal ginjal
|
I, BH
|
CAMR, TCMR-III, TMA
|
Ya
|
|
M7721
|
365
|
Gagal ginjal
|
C/A
|
CAMR, TMA
|
Ya
|
|
M2519
|
511
|
HE — epistaksis dengan anemia
refrakter dan insufisiensi ginjal
|
I, C/A, T
|
TMA
|
Ya
|
|
M2420
|
758
|
HE — edema perifer dan
insufisiensi ginjal
|
I, C/A
|
CAMR, TMA
|
Ya
|
|
M8320
|
>673, sedang berlangsung
|
–
|
–
|
–
|
NC
|
|
3KO.7TG.RIf
|
M6421g,i
|
6
|
Gagal ginjal
|
T
|
ATI, TMA
|
Tidak
|
|
M12621g,i
|
9
|
Gagal ginjal
|
–
|
AMR, ATI, TMA
|
Tidak
|
|
M12021
|
16
|
Gagal ginjal
|
I
|
TMA
|
Tidak
|
|
M6521h
|
176
|
Gagal ginjal
|
C/A
|
CAMR, TMA
|
Ya
|
|
M6121
|
283
|
HE — paraplegia akut
|
–
|
Tidak ada bukti penolakan
|
Tidak
|
|
M5722g,i
|
>247, sedang berlangsung
|
–
|
–
|
–
|
NC
|
|
M7621
|
>429, sedang berlangsung
|
–
|
–
|
–
|
NC
|
Keterangan:
1. HE: Hemoragi (Haemorrhage).
2. EOS: Akhir Studi (End of Study).
3. ATI: Cedera Tubulus Akut (Acute
Tubular Injury).
4. AMR: Penolakan yang Dimediasi
Antibodi (Antibody-Mediated Rejection).
5. TMA: Mikroangiopati Trombosis
(Thrombotic Microangiopathy).
6. TCMR: Penolakan yang Dimediasi Sel T
(T-Cell Mediated Rejection).
7. NC: Tidak Diklasifikasikan (Not
Classified).
Genotipe tambahan:
- 3KO: Tiga gen yang dieliminasi (GGTA1, CMAH,
dan B4GALNT2/B4GALNT2L).
- 7TG: Tujuh transgen manusia (CD46, CD55,
THBD, PROCR, CD47, TNFAIP3, dan HMOX1).
Gambar 4: Ginjal babi yang direkayasa
mendukung kehidupan pada monyet cynomolgus.
a. Probabilitas kelangsungan hidup secara signifikan lebih baik (P = 0,026) pada penerima yang
ditransplantasi dengan cangkok ginjal 3KO.7TG ± RI (n = 15) dibandingkan dengan
3KO ± RI (n = 6). Analisis statistik
dilakukan menggunakan uji log-rank (42).
b. Kadar kreatinin serum umumnya tetap dalam rentang
normal, kecuali saat terjadi kegagalan cangkok. Kadar kreatinin di atas 6 mg/dl
memenuhi kriteria untuk eutanasia. Garis putus-putus menunjukkan rentang normal
kadar kreatinin serum (42).
c. Pewarnaan Periodic Acid–Schiff (PAS) pada sampel
biopsi ginjal dari penerima M2420, yang membawa cangkok ginjal 3KO.7TG pada
hari pasca-operasi (POD) 502, menunjukkan tampilan normal (42).
d, e. Pembuluh darah (d) dan glomerulus (e) dari biopsi
cangkok ginjal M2420 pada POD 502 tampak normal (42).
f. Pewarnaan positif C4d di glomerulus, tetapi tidak pada
kapiler peritubular, diamati pada biopsi cangkok ginjal M2420 pada POD 502
(42).
Penolakan dinilai melalui pemeriksaan histopatologi
berdasarkan klasifikasi Banff untuk patologi alograft ginjal (42), dengan
modifikasi untuk xenotransplantasi (Tabel 1 dan Tabel Data Tambahan 1). Lima
dari enam ginjal 3KO ± RI menunjukkan bukti cedera tubulus akut (ATI), fitur
yang tidak termasuk dalam kriteria Banff tetapi mewakili cedera ginjal umum.
Selain itu, penolakan yang dimediasi antibodi (AMR)/mikroangiopati trombotik
(TMA) (M12121), TMA (CY1061, CY1062, dan MB1027), dan penolakan yang dimediasi
sel T (TCMR) (M11521) juga diamati (42). Pada penerima ginjal 3KO.7TG ± RI yang
mengalami gagal ginjal, TMA dengan atau tanpa AMR diamati pada saat eutanasia,
dan hanya dua yang menunjukkan bukti ATI (42). Berbeda dengan alotransplantasi,
penolakan yang dimediasi sel T bukanlah patologi utama pada xenotransplantasi,
dengan hanya satu cangkok yang hilang memenuhi kriteria Banff untuk TCMR (42).
Masih perlu ditentukan apakah sistem penilaian Banff yang dikembangkan untuk
alotransplantasi pada manusia dapat diterapkan secara memadai pada
xenotransplantasi, mengingat mekanisme penolakan yang mungkin berbeda (43).
Pada alotransplantasi, TMA biasanya mencerminkan proses
yang dimediasi antibodi atau terkait obat, sedangkan pada xenotransplantasi,
ketidakcocokan yang signifikan pada protein koagulasi atau pengaturan komplemen
antarspesies dapat berkontribusi pada TMA, bahkan tanpa keberadaan antibodi
spesifik donor baru (de
novo donor-specific antibody, dnDSA). Dengan mempertimbangkan hal ini, sampel
patologi dinilai menggunakan kriteria yang disesuaikan untuk xenotransplantasi
(Tabel Data Tambahan 1 dan Tabel Tambahan 6) (42). Kriteria yang disesuaikan
ini mewakili upaya kami untuk memberikan skor dan diagnosis yang informatif
serta berguna dalam xenotransplantasi ginjal.
Deplesi limfosit dalam darah dibuktikan dengan pengukuran
jumlah sel B dan T yang bersirkulasi (Gambar Data Tambahan 7). Meskipun deplesi
sel B signifikan, dnDSA yang reaktif terhadap sel endotel 3KO terdeteksi pada
beberapa hewan seiring waktu (8 dari 18 transplantasi; Tabel 1 dan Gambar Data
Tambahan 8), dan fitur patologis dari cedera cangkok yang dimediasi antibodi
diamati (42). Pada penerima M2420, yang memiliki waktu kelangsungan hidup
xenograft terlama (758 hari), biopsi protokol menunjukkan histologi ginjal yang
sebagian besar normal pada hari ke-502 setelah transplantasi, dengan fibrosis
bercak (Gambar 4c–e dan Gambar Data Tambahan 9a). Namun, pewarnaan C4d diamati
di glomerulus, menunjukkan aktivasi C4 (Gambar 4f dan Gambar Data Tambahan 9b).
Aktivasi C4 adalah proses hilir dari intervensi CD46 dan CD55, sehingga
pewarnaan positif C4d dapat diharapkan pada sampel ginjal 3KO.7TG ± RI dalam
keberadaan dnDSA. Fotomikrograf histopatologi representatif dari sampel nekropsi
dengan waktu kelangsungan hidup 9 hari (M10619), 176 hari (M6521), dan 758 hari
(M2420) disediakan dalam Gambar Data Tambahan 9c–e. Di antara penerima dengan
kelangsungan hidup jangka panjang, kista ginjal sederhana yang tampak jinak
diamati. Etiologinya tidak diketahui dan saat ini sedang diselidiki.
Pada NHP dengan dnDSA, mungkin saja regimen imunosupresif
saat ini awalnya efektif, tetapi akhirnya gagal mencegah perkembangan respons
humoral spesifik porcine. TMA dan AMR pada penerima dengan kelangsungan hidup
jangka panjang sering kali dikaitkan dengan infeksi atau prosedur biopsi, yang
mungkin telah memicu respons imun. Meskipun pengamatan ini dapat memberikan
informasi untuk merancang regimen imunosupresif pada studi klinis (misalnya,
mempertimbangkan penghapusan dengan antibodi anti-CD19 dan desensitisasi atau
terapi penyelamatan dengan plasmapheresis atau terapi sel plasma terarah),
pendekatan yang dapat diterapkan dalam model NHP terbatas. Perlu dicatat, agen
yang menargetkan jalur CD40–CD40L telah menjadi standar perawatan dalam studi
xenotransplantasi NHP. Meskipun agen ini belum mendapat persetujuan FDA,
beberapa di antaranya sedang dalam pengembangan klinis dan akan menjadi dasar
dalam regimen imunosupresif, bersama dengan obat-obatan yang disetujui FDA yang
saat ini digunakan dalam transplantasi ginjal klinis.
DISKUSI
Dalam studi ini, kami menggambarkan donor porcine yang
membawa 69 suntingan genom, dengan ekspresi dan fungsi semua 7 transgen
manusia. Meskipun donor porcine yang membawa knockout CMAH dianggap tidak akan
bertahan hidup pada OWM karena komplikasi dari knockout CMAH (8,9), ginjal yang
diperoleh dari donor porcine 3KO.7TG ± RI mendukung kehidupan jangka panjang
pada monyet cynomolgus, hingga 758 hari.
Waktu kelangsungan hidup graft yang bervariasi mungkin
merupakan hal yang melekat pada xenotransplantasi ginjal dan/atau unik untuk
model OWM. Meskipun 3KO secara substansial mengurangi tingkat pengikatan
antibodi anti-porcine yang sudah terbentuk, xenoantigen minor tetap ada dan
berkontribusi pada pengikatan antibodi sisa (Gambar 1b). Selain itu, aktivitas
sitotoksisitas bergantung pada komplemen lebih tinggi pada serum monyet
cynomolgus daripada pada serum manusia (Gambar 3c dan Gambar Data Tambahan
4b,c). Selain itu, data menunjukkan bahwa inaktivasi CMAH dapat menghasilkan
antigen baru yang bersifat xenogenik bagi OWM, yang dapat menjadi target
pengikatan antibodi yang sudah terbentuk, yang menyebabkan aktivasi komplemen
pada serum OWM8,9. Perlu dicatat bahwa dalam pengaturan klinis, komplikasi
terkait knockout CMAH yang unik pada OWM tidak akan relevan, karena akan ada
kecocokan dengan genotipe pseudogen CMAH dari penerima manusia.
Salah satu keuntungan dari xenotransplantasi,
dibandingkan dengan allotransplantasi, adalah kesempatan untuk merekayasa
secara genetik organ donor. Oleh karena itu, untuk meningkatkan kelangsungan
hidup graft, beban imunosupresi yang berat pada penerima dapat dipindahkan ke
graft yang lebih optimal yang didonorkan dari donor porcine yang direkayasa
secara genetik. Mengingat ketidakcocokan molekuler yang substansial antara
kedua spesies, penambahan transgen manusia tambahan dapat dipertimbangkan,
seperti TFPI, CD39 (juga dikenal sebagai ENTPD1), HLA-E dan PDL1 (juga dikenal
sebagai CD274)14,44. Untuk meniru pola dan tingkat ekspresi gen-endogen
porcine, in
situ knock-in,
di mana urutan pengkode manusia menggantikan gen ortolog porcine, dapat
dipertimbangkan. Hal ini terutama relevan untuk THBD dan PROCR, yang biasanya
diekspresikan pada sel endotel. Kami menyadari bahwa selain antigen glikan,
berbagai protein porcine juga dapat bersifat xenogenik17 dan mungkin tidak
mungkin untuk mengidentifikasi dan mengeliminasi semuanya. Pada akhirnya, model
porcine yang direkayasa secara genetik, dengan fitur toleransi imun45, mungkin
merupakan tujuan akhir. Studi pembuktian prinsip yang berhasil dicapai dalam
penelitian ini membawa kita lebih dekat ke pengujian klinis graft ginjal
porcine untuk transplantasi pada manusia.
METODE
Perakitan Konstruksi Transgenik
Konstruksi landing pad membawa promotor EEF1A1 manusia
yang mengarah pada ekspresi gen penanda mTagBFP2, dibatasi oleh sepasang situs
loxP/lox2272. Lengan homologi kiri sepanjang 1.469 bp (koordinat kromosom 6,
dari 59.347.343–59.345.875, susScr11) dan lengan homologi kanan sepanjang
1.260 bp (koordinat kromosom 6, dari 59.345.874 hingga 59.344.615, susScr11)
diperkuat dari DNA genomik yang diisolasi dari ras Yucatan dan ditempatkan 5′
atau 3′ ke situs loxP/lox2272. Konstruksi transgenik PL15S dirakit melalui
rekombinasi homolog ragi (46). Singkatnya, urutan DNA pengkode manusia (Tabel
Suplemen 3), promotor, terminator, dan urutan poliadinilasi diatur ke dalam
salah satu dari tiga unit transkripsi polisitronik, yang kemudian diatur
menjadi molekul DNA linier dalam konfigurasi konvergen atau divergen (Gambar
Data Tambahan 1).
Desain RNA Panduan CRISPR–Cas9
Pustaka R DECIPHER47 digunakan untuk merancang RNA
panduan yang menargetkan urutan pengkode inti katalitik dari enzim pol pada
elemen PERV (Tabel Suplemen 2). Untuk menonaktifkan empat gen yang terlibat
dalam sintesis tiga antigen glikan utama, α-Gal, Neu5Gc, dan Sd(a), kami
menggunakan satu RNA panduan tunggal (sgRNA) per gen, yang menargetkan gen
GGTA1, CMAH atau B4GALNT2/B4GALNT2L. Untuk memasukkan DNA landing pad ke dalam
lokus genomik AAVS1, kami menggunakan satu RNA panduan yang menargetkan lokus
AAVS1. Urutan panduan disediakan dalam Tabel Suplemen 2. Semua sgRNA disintesis
dan disediakan oleh Synthego.
Mutasi CRISPR–Cas9 melalui penyambungan ujung
nonhomolog dan perbaikan yang diarahkan homologi
Sebuah sgRNA diinkubasi dengan enzim Cas9 (A36496, Thermo
Fisher) untuk membentuk kompleks ribonukleoprotein (RNP) segera sebelum
digunakan, sesuai dengan petunjuk dari pabrikannya. Untuk menghasilkan knockout
pada tiga gen xenoantigen dan penyisipan landing pad dalam reaksi multipelks,
plasmid donor landing pad AAVS1 ditambahkan ke kompleks RNP sebelum
elektroporasi. Untuk menonaktifkan elemen PERV, tiga sgRNA dikomplekskan dengan
protein Cas9 untuk membentuk RNP. Elektroporasi dilakukan menggunakan Neon
Transfection System 100 µl Kit (MPK10096, Thermo Fisher).
Pembuatan donor babi yang membawa 3KO,
penyisipan PL15S ke dalam situs AAVS1 (7TG) dan RI
Sebanyak 1 × 106 sel yang diperoleh dari tusukan telinga
(EPDCs) dielektroporasi (MPK10096, Thermo Fisher) dengan empat RNP yang
menargetkan gen GGTA1, CMAH, dan B4GALNT2/B4GALNT2L, serta lokus AAVS1, bersama
dengan plasmid donor landing pad AAVS1. Lima hari kemudian, sel-sel disortir
menjadi sel tunggal yang digate berdasarkan tidak adanya glikan α-Gal
(isolectin B4, konjugat FITC, ALX-650-001F-MC05, Enzo Life Sciences) dan adanya
gen penanda mTagBFP2 dan ditempatkan ke dalam sumur individu pada pelat
96-well. Populasi klonal sel kemudian dilakukan genotyping untuk
mengidentifikasi sel yang membawa editan yang benar dari 3KO dan penyisipan
landing pad yang berhasil ke dalam situs AAVS1 (Tabel Suplemen 4). Sel-sel yang
telah diedit tersebut kemudian digunakan sebagai donor nuklir dalam eksperimen
transfer nuklir sel somatik (SCNT) untuk menghasilkan babi yang membawa editan
ini.
EPDC yang membawa 3KO dan landing pad yang disisipkan
pada situs AAVS1 diisolasi dan dielektroporasi dengan konstruksi transgenik
PL15S, bersama dengan mRNA Cre recombinase (130-101-113, Miltenyi Biotec),
untuk memungkinkan pertukaran kaset yang dimediasi oleh rekombinase.
Selanjutnya, sel-sel disortir menjadi sel tunggal yang digate berdasarkan
ekspresi permukaan sel dari gen-gen yang dibawa pada payload (CD46, CD55,
PROCR, THBD, atau CD47), dan ditempatkan ke dalam sumur tunggal pada pelat
96-well. Populasi klonal sel kemudian dilakukan genotyping untuk
mengidentifikasi sel yang berhasil menggantikan landing pad dengan urutan PL15S
(Tabel Suplemen 4). Sel-sel yang telah diedit ini digunakan dalam eksperimen
SCNT dan dikloning ke dalam babi.
Untuk
menentukan jumlah salinan elemen PERV yang dibawa dalam genom Yucatan, PCR
digital tetesan dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (48). Dengan
menggunakan assay yang dirancang terhadap gen pol, garis betina Yucatan 25
(Yuc25F) ditemukan membawa 59 salinan urutan tersebut. Untuk menonaktifkan
elemen PERV, EPDC yang membawa 3KO dan PL15S yang disisipkan pada situs AAVS1
dihasilkan dan dielektroporasi dengan tiga RNP yang menargetkan inti katalitik
aktivitas reverse transcriptase dari gen pol (Tabel Suplemen 2), dan sel
tunggal disortir ke dalam sumur individu pada pelat 96-well. Populasi klonal
sel kemudian dilakukan genotyping dengan urutan amplikon (Tabel Suplemen 4) dan
sel-sel yang membawa mutasi indel pada semua salinan elemen PERV
diidentifikasi. Sel-sel yang telah diedit tersebut digunakan dalam eksperimen
SCNT dan dikloning ke dalam babi.
Produksi donor babi melalui
transfer inti sel somatik
Sel yang telah diedit genetiknya dikloning ke dalam babi
melalui SCNT49 dan kloning dilakukan oleh eGenesis Wisconsin dan Precigen
Exemplar. Kloning hewan dilakukan berdasarkan protokol yang disetujui oleh
Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (protokol eGenesis
Wisconsin HF2020-01, disetujui pada 24 November 2020; protokol Precigen
Exemplar MRP2018-003, disetujui pada 21 Juni 2018). Semua donor porcine Yucatan
yang dihasilkan (Sus scrofa domesticus) adalah betina Yucatan. Semua produksi
donor mengikuti pedoman perawatan dan penggunaan hewan laboratorium (National
Research Council of National Academies), khususnya prinsip 3R.
Pewarnaan IHC dan analisis ekspresi transgen
Ekspresi protein manusia (EPCR, thrombomodulin, TNFAIP3,
HMOX1, CD46, CD55, dan CD47) dinilai dari potongan jaringan yang diperbaiki
dengan formalin dan disematkan dalam parafin dari sampel ginjal porcine Yucatan
WT dan transgenik yang berusia 8 minggu berdasarkan protokol standar (amplifikasi
sinyal tyramide) menggunakan Cy5+-tyramide sebagai reagen deteksi. Setelah
semua target terdeteksi, potongan jaringan diberi pewarnaan kontra dengan
Hoechst 33258 dan dipasang dengan ProLong Glass antifade mountant. Potongan
jaringan yang telah diwarnai kemudian diambil gambarnya menggunakan pemindai
fluoresensi otomatis Zeiss Axio Scan.Z1 dengan parameter pemindaian yang sama
untuk setiap jaringan. Gambar-gambar dihasilkan menggunakan perangkat lunak
analisis gambar Zeiss Zen Blue 3.4. Daftar reagen dapat dilihat pada Tabel
Suplemen 5.
Intensitas
fluoresensi rata-rata (MFI) dari protein transgen pada seluruh jaringan ginjal,
glomerulus, tubulus, dan pembuluh darah dari kontrol positif dan negatif diukur
menggunakan perangkat lunak analisis gambar Zeiss ZEN Blue 3.4. Kontrol positif
terdiri dari sampel yang diwarnai dengan antibodi primer yang spesifik terhadap
protein transgen manusia, goat anti-mouse–horseradish peroxidase (HRP) atau
goat anti-rabbit–HRP konjugat, dan Cy5+-tyramide. Kontrol negatif terdiri dari
sampel yang diinkubasi dengan mouse–HRP atau rabbit–HRP konjugat dan
Cy5+-tyramide saja.
Pengukuran
jaringan seluruh tubuh dan biopsi jaringan dilakukan dengan menggambar sekitar
kontur seluruh jaringan. Nilai MFI sesuai dengan intensitas piksel di dalam
kontur yang dihitung oleh perangkat lunak. Untuk pengukuran MFI glomerulus dan
pembuluh darah pada jaringan seluruh tubuh, 20 glomerulus dan 8 pembuluh darah
dipilih secara acak dengan distribusi yang merata dalam jaringan, dan kontur
digambar untuk mendefinisikan struktur tersebut. Untuk biopsi jaringan kecil,
5–10 glomerulus dan 3–5 pembuluh darah dipilih. Nilai rata-rata MFI untuk
glomerulus dan pembuluh darah (per jaringan seluruh tubuh atau biopsi jaringan)
dihitung. Pengukuran MFI tubulus dilakukan menggunakan 20 persegi panjang
(diukur oleh perangkat lunak sebagai 500 × 500 piksel) dan 5–10 persegi panjang
(diukur oleh perangkat lunak sebagai 300 × 300 piksel) pada jaringan seluruh
tubuh dan biopsi jaringan, masing-masing. Nilai rata-rata MFI untuk 20 persegi
panjang (per jaringan) atau 5–10 persegi panjang (per biopsi jaringan)
dihitung. Nilai MFI yang dilaporkan dalam grafik batang sesuai dengan MFI
rata-rata yang dinormalisasi (yaitu, sinyal spesifik) dari 11 sampel. MFI
rata-rata yang dinormalisasi didefinisikan sebagai nilai MFI rata-rata dari
kontrol positif dikurangi nilai MFI rata-rata dari kontrol negatif (yaitu,
sinyal tidak spesifik).
Pewarnaan IHC untuk 3KO pada ginjal
Potongan jaringan ginjal yang diperbaiki dengan formalin
dan disematkan dalam parafin dari sampel ginjal Yucatan porcine, manusia,
cynomolgus, rhesus, dan babun diproses seperti yang dijelaskan di atas
menggunakan buffer sitrat Thermo Fisher 1X untuk pemulihan epitop yang dipicu
oleh panas dalam modul pretreatment (PT). Setelah pemulihan epitop yang dipicu
oleh panas, potongan jaringan diblokir dalam TBS ditambah dengan serum kambing
5% selama 30 menit, diikuti dengan inkubasi selama 2 jam dengan campuran reagen
pengikat dalam TBS dengan serum kambing 5%. Campuran reagen pengikat terdiri
dari pengenceran 1:100 isolectin B4-FITC (untuk mendeteksi antigen α-Gal),
pengenceran 1:100 antibodi anti-Neu5GC ayam (untuk mendeteksi antigen Neu5GC),
dan pengenceran 1:250 DBA-biotin (untuk mendeteksi antigen Sd(a)). Potongan
jaringan dicuci dengan TBS-T tiga kali selama 3 menit setiap kali dan
diinkubasi dengan campuran pengenceran 1:1.000 goat anti-chicken Alexa Fluor
647 dan pengenceran 1:1.000 streptavidin-Alexa Fluor 568 dalam TBS yang
disuplai dengan serum kambing 5%. Pewarnaan inti, pemasangan jaringan dengan
ProLong Glass antifade mountant, pencitraan, dan analisis gambar dilakukan
seperti yang dijelaskan di atas.
Analisis Laju Filtrasi Glomerulus yang Diukur
Sapi Yucatan WT dan 3KO.7TG yang berusia empat bulan
menerima dosis intravena tunggal Omnipaque 300 Iohexol sebanyak 64,7 mg kg−1
(00407141359, GE Healthcare). Sampel darah dikumpulkan pada 5, 15, dan 30 menit
serta 1, 2, 3, 6, 8, 10, dan 24 jam setelah pemberian dosis, dan plasma
dipisahkan menggunakan K2EDTA. Konsentrasi Iohexol diukur menggunakan
kromatografi cair kinerja tinggi dengan spektroskopi ultraviolet (HPLC-UV).
Berbagai parameter farmakokinetik termasuk klirens (ml menit kg−1) dihitung
menggunakan model dua kompartemen (Phoenix WinNonlin, perangkat lunak versi
8.1). Luas permukaan tubuh (BSA) dihitung dengan rumus BSA (m2) = 9 ×
BW2/3/100, dan laju filtrasi glomerulus yang diukur (ml menit m−2) dihitung
sebagai klirens Iohexol yang dinormalisasi terhadap BSA50. Data diplot dan
statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.
Analisis Antibodi Anti-Porcine IgG dan IgM
pada Primata
Sel endotel dari hewan porcine 3KO yang tidak mengandung
transgen manusia digunakan untuk mengukur antibodi anti-IgG dan IgM terhadap
porcine dalam serum yang diinaktivasi panas yang diperoleh dari penerima
cynomolgus sebelum dan setelah transplantasi, bersama dengan kumpulan serum
dari 96 hewan cynomolgus, dan serum manusia dari setidaknya 100 donor sehat
(SeraCare Life Sciences). Setiap sampel sel endotel (1 × 105 sel per uji)
diinkubasi dengan serum yang diencerkan 1:4 dalam 1× PBS dengan 1% BSA pada
suhu 4°C selama 30 menit. Sel-sel dicuci dan diinkubasi pada suhu 4°C selama 30
menit dengan antibodi sekunder F(ab′)2 anti-human IgG yang terkonjugasi dengan
Alexa Fluor 488 (109-546-098, Jackson ImmunoResearch) atau F(ab′)2 anti-human
IgM yang terkonjugasi dengan Alexa Fluor 647 (109-606-129, Jackson
ImmunoResearch) yang diencerkan 1:100. Sampel difiksasi dengan paraformaldehida
4,2%, diambil dalam waktu 3 hari menggunakan FACSymphony A3 (BD Bioscience),
dan dianalisis menggunakan perangkat lunak Flow Jo v10.6.1 (Flow Jo LLC).
Tingkat MFI IgG dan IgM dievaluasi dalam duplikat. Data MFI diplot dan
statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.
Uji Deposi C3b
Sel endotel (50.000 sel per sumur) diinokulasi dalam
pelat 96 sumur dengan buffer pengencer serum (SDB) (1× buffer annexin V
(51-66121E, BD Pharmingen), 1 mM MgCl2 (68475, Sigma) dan 1% BSA (A9576,
Sigma)). Serum manusia normal yang terkumpul (NHS, Complement Technology) atau
serum monyet cynomolgus (NHP01SRM, BioIVT) yang diencerkan dalam SDB
ditambahkan ke sumur yang sesuai dengan konsentrasi akhir 25% dan diinkubasi
selama 30 menit pada suhu 37°C. Untuk kontrol negatif, sel-sel diperlakukan
dengan serum 25% yang mengandung 10 mM EDTA (15575038, Thermo Fisher) untuk
menginaktivasi komplemen. Setelah inkubasi, sel-sel dicuci dan diwarnai dengan
antibodi anti-C3b yang terkonjugasi dengan phycoerythrin pada pengenceran 1:100
(846104, BioLegend) dan pewarna viabilitas Ghost Dye Red 780 pada pengenceran
1:500 (13-0865, Tonbo Biosciences) selama 30 menit pada suhu 4°C dalam
kegelapan. Sel-sel dicuci dua kali, segera diambil menggunakan cytometer BD
FACSymphony A3 dan dianalisis di Flow Jo. Deposi C3b diplot sebagai MFI dan statistik
dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.
Uji Sitotoksisitas Bergantung pada Komplemen
Satu hari sebelum uji, sel endotel (3.000 sel per sumur)
diinokulasi dalam pelat 96 sumur (3595, Corning) dengan medium dasar sel
endotel. Pada hari berikutnya, sel-sel yang melekat dicuci sekali dengan SDB,
diperlakukan dengan serum yang diencerkan 25% (seperti yang dijelaskan
sebelumnya) yang mengandung pewarna viabilitas Cytotox Red 250 nM (4632, Essen
Biosciences), kemudian langsung dimasukkan ke dalam sistem analisis sel hidup
Incucyte SX5 (model S3, Sartorius) dan diinkubasi pada suhu 37°C dalam
inkubator CO2 selama durasi yang tercantum pada legenda gambar. Jumlah sel yang
positif Cytotox Red dihitung dengan perangkat lunak Incucyte, dan jumlah total sel
ditentukan secara manual dari gambar kontras fase. Sitotoksisitas bergantung
pada komplemen dihitung dengan menormalkan jumlah sel positif Cytotox Red
terhadap jumlah total sel. Data diplot sebagai persentase sel positif Cytotox
Red, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.
Uji aPC
Pada hari sebelum uji, sel endotel (20.000 sel per sumur)
diinokulasi dalam pelat 48 sumur (FB012930, Thermo Fisher) dengan medium dasar
sel endotel. Pada hari berikutnya, sel-sel yang melekat dicuci sekali dengan
buffer uji (10 mM Tris HCl (15567-027, Thermo Fisher), 150 mM NaCl (S5886,
Sigma), 5 mM CaCl2 (C1016, Sigma), 0,1% BSA (A9576, Sigma), pH 7,5), dan
kemudian, jika diperlukan, diinkubasi dengan 40 μg ml−1 RCR-252 (konsentrasi
akhir 2×; MA5-33375, Thermo Fisher) dan/atau 4 μg ml−1 PBS-01 (konsentrasi
akhir 2×; ab6980, Abcam) selama 1 jam pada suhu ruangan dalam buffer uji.
Setelah inkubasi dan tanpa mengeluarkan antibodi penghambat, sel-sel
diperlakukan dengan 0,1 U ml−1 trombin (605190, Sigma) dan 150 nM protein C
(539215, Sigma), keduanya diencerkan dalam buffer uji, selama 60 menit pada
suhu 37°C. Setelah inkubasi, 2 U ml−1 hirudin (H0393, Sigma) yang diencerkan
dalam buffer uji ditambahkan untuk menghentikan aktivitas trombin dan pelat
diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C. Larutan dari setiap sumur dipindahkan
ke pelat 96 sumur, bersama dengan pengenceran serial dari kompleks aPC manusia
yang dimurnikan (HCAPC-0080, Prolytix) yang diencerkan dalam buffer uji untuk
membuat kurva standar. Substrat kromogenik Spectrozyme PCa (336, Biomedica Diagnostics),
yang diencerkan hingga 1 mM dalam buffer imidazol (0,1985 g ml−1 imidazol
(I5513, Sigma), 0,03535 g ml−1 Tris (BP152, Thermo Fisher), 0,12675 g ml−1 NaCl
dan 250 mM HCl, pH 8,5), ditambahkan dan absorbansi dibaca pada 405 nm setiap
30 detik selama 15 menit dengan pembaca pelat mikro (FilterMax F5, Molecular
Devices). Kecepatan awal reaksi dihitung (kemiringan bagian linier awal dari
kurva), dan konsentrasi aPC ditentukan menggunakan kurva standar aPC. Data
konsentrasi diplot, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.
Uji Kompleks TAT Seluruh Darah
Pada hari sebelum uji, sel endotel (75.000 sel per sumur)
diinokulasi dalam pelat 24 sumur (353226, Corning) dengan medium dasar sel
endotel. Darah utuh segar dikumpulkan di dalam rumah oleh seorang phlebotomist
(Quadrant Health) dalam tabung pengumpulan serum Vacutainer (367820, BD
Biosciences) yang mengandung 0,5 U ml−1 heparin (H3393, Sigma), 225 μl
ditambahkan ke sel-sel yang melekat setelah dicuci dengan 1× PBS dan diinkubasi
pada suhu 37°C menggunakan pengocok pelat Orbitron (201100, Boekel Scientific)
selama 40 menit. Setelah inkubasi, darah yang tidak menggumpal dipindahkan ke
tabung Eppendorf dan disentrifugasi pada 1.500g selama 10 menit. Untuk
konsentrasi TAT dasar, darah utuh disentrifugasi pada saat yang sama darah
ditambahkan ke sel. Plasma dikumpulkan dan dibekukan dengan es kering hingga
digunakan. Sampel plasma digunakan dalam uji ELISA kompleks TAT (ab108907,
Abcam) sesuai dengan petunjuk produsen dengan konsentrasi TAT dihitung
berdasarkan kurva standar kompleks TAT manusia yang dimurnikan, dibaca
menggunakan Envision 2105 Multimode Plate Reader (2105-0010, Perkin Elmer).
Data konsentrasi diplot, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism
v8.2.0.
Uji Reporter SIRPα
Kit Uji Bioassay Sinyal SIRPα PathHunter Jurkat
(93-1135Y19, Eurofins DiscoverX) digunakan untuk menilai fungsi CD47 manusia.
Sel KEC babi (30.000 sel per sumur) diinkubasi dengan atau tanpa peningkatan
konsentrasi antibodi penghambat anti-CD47 manusia (klon B6H12.2) yang diikuti
dengan penambahan sel reporter SIRPα Jurkat (10.000 sel per sumur). Sel-sel
diinkubasi pada suhu 37°C dalam inkubator CO2 yang terhumidi (5% CO2) selama 24
jam, dan petunjuk kit diikuti untuk deteksi sinyal. Luminensia pelat dibaca
menggunakan pembaca pelat mikro (FilterMax F5, Molecular Devices) sesuai dengan
petunjuk produsen. Unit luminensia relatif diplot, dan statistik dihitung
menggunakan GraphPad Prism v8.2.0.
Uji Caspase 3/7
Sel endotel (70% konfluensi dalam cawan kultur jaringan
berlapis gelatin 10 cm) diperlakukan dengan 50 ng/ml TNF rekombinan manusia
(210-TA-100/CF, R&D Systems) dalam media sel endotel lengkap semalam.
Sel-sel dipanen dari pelat dan 10.000 sel ditambahkan ke dalam pelat putih 96
sumur dengan dasar datar (07200589, Thermo Fisher), dan aktivitas caspase 3/7
ditentukan menggunakan Sistem Uji Caspase-Glo 3/7 (G8093, Promega). Secara
singkat, volume yang sama dari reagen Caspase-Glo 3/7 segar ditambahkan ke
dalam sumur, pelat diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang dalam gelap dan
kemudian dibaca menggunakan Pembaca Pelat Multimode Envision 2105 (2105-0010,
Perkin Elmer). Data diplot, dan statistik dihitung menggunakan GraphPad Prism
v8.2.0.
Penerima NHP
Monyet cynomolgus jantan dan betina (Macaca fascicularis;
Bioculture US LLC dan Alpha Genesis) dengan berat 4–12 kg (perkiraan usia 3–8
tahun) digunakan. Monyet disaring untuk keberadaan anti-IgG dan IgM porcine
(yang dijelaskan di atas), dan hewan dengan kadar rendah anti-IgG dan anti-IgM
porcine dipilih sebagai penerima. Babi Yucatan dengan berat 5–27 kg digunakan
sebagai donor ginjal. Semua perawatan hewan, prosedur bedah, dan perawatan
pascaoperasi dilakukan sesuai dengan Pedoman NIH untuk perawatan dan penggunaan
primata serta Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dan disetujui
oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional di Duke University
(protokol A032-20-02, disetujui 27 Februari 2020), University of Wisconsin di
Madison (protokol G006507, disetujui 30 September 2021), dan Massachusetts
General Hospital (protokol 2017N000216, disetujui 20 November 2020). Semua
studi mengikuti prinsip 3R.
Transplantasi Ginjal
Untuk mempersiapkan monyet cynomolgus untuk prosedur,
saluran vena sentral dimasukkan melalui vena jugularis internal 2–7 hari
sebelum transplantasi ginjal. Melalui insisi garis tengah, xenograft ginjal
ditransplantasikan secara intraperitoneal dengan menganastomosis vena ginjal
dan arteri ke vena cava dan aorta abdominalis, masing-masing. Anastomosis
ureterovesikal dilakukan dengan teknik Lich–Gregoir tanpa memasang stent
ureter. Nefrektomi native bilateral dilakukan secara bersamaan pada mayoritas
penerima kecuali pada M8220 dan M6521, di mana satu ginjal native dibiarkan
utuh pada saat transplantasi dan kemudian diangkat sekitar hari pascaoperasi
(POD) ke-20. Pascaoperasi, ginjal yang ditransplantasikan dimonitor melalui
output urin, ultrasound, kimia klinis dan hematologi, serta biopsi protokol.
Saluran vena sentral diangkat dalam 2–4 minggu setelah hewan penerima memiliki
fungsi ginjal yang stabil, untuk menghindari risiko infeksi. Kelangsungan hidup
jangka panjang mengacu pada fungsi pendukung kehidupan lebih dari 3 bulan pada
penerima NHP.
Analisis Histopatologis
Biopsi ginjal protokol diperoleh setiap 2–4 bulan pada penerima
dengan fungsi stabil serta ketika penolakan dicurigai karena peningkatan
kreatinin. Jaringan diproses untuk mikroskopi cahaya. Setelah euthanasia
monyet, autopsi lengkap dilakukan untuk pemeriksaan histopatologis xenograft
ginjal, kelenjar getah bening, jantung, paru-paru, hati, pankreas, timus, dan
kulit. Sampel yang diwarnai dengan hematoksilin dan eosin serta dengan
pewarnaan asam periodik-Schiff pada xenograft dinilai berdasarkan kriteria
Banff terkini, termasuk deposisi C4d. (42)
REFERENSI
1.Montgomery,
R. A. et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N.
Engl. J. Med. 386, 1889–1898 (2022).
2.Porrett,
P. M. et al. First clinical‐grade porcine kidney xenotransplant using a human decedent
model. Am. J. Transplant. 22, 1037–1053 (2022).
3.Griffith,
B. P. et al. Genetically modified porcine-to-human cardiac xenotransplantation.
N. Engl. J. Med. 387, 35–44 (2022).
4. Adams,
A. B. et al. Anti-C5 antibody tesidolumab reduces early antibody-mediated rejection
and prolongs survival in renal xenotransplantation. Ann. Surg. 274,
473–480 (2021).
5.Iwase,
H. et al. Immunological and physiological observations in baboons with life-supporting
genetically engineered pig kidney grafts. Xenotransplantation 24,
e12293 (2017).
6.Kim,
S. C. et al. Long‐term survival of pig‐to‐rhesus macaque renal xenografts is dependent
on CD4 T cell depletion. Am. J. Transplant. 19, 2174–2185 (2019).
7.Hinrichs,
A. et al. Growth hormone receptor-deficient pigs resemble the pathophysiology of
human Laron syndrome and reveal altered activation of signaling cascades in the
liver. Mol. Metab. 11, 113–128 (2018).
8.
Yamamoto,
T. et al. Old World monkeys are less than ideal transplantation models for testing
pig organs lacking three carbohydrate antigens (triple-knockout). Sci. Rep.
10, 9771 (2020).
9.
Estrada,
J. L. et al. Evaluation of human and non-human primate antibody binding to pig cells
lacking GGTA1/CMAH/β4GalNT2 genes. Xenotransplantation 22, 194–202
(2015).
10.Ma,
D. et al. Successful long-term TMA- and rejection-free survival of a kidney xenograft
with triple xenoantigen knockout plus insertion of multiple human transgenes. Transplantation
https://doi.org/10.1097/01.tp.0000698660.82982.ca
(2020).
11.Niu,
D. et al. Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9.
Science 357, 1303–1307 (2017).
12.Patience,
C., Takeuchi, Y. & Weiss, R. A. Infection of human cells by an endogenous retrovirus
of pigs. Nat. Med. 3, 282–286 (1997).
13.Robson,
S. C., Am Esch, J. S. & Bach, F. H. Factors in xenograft rejection. Ann.
N. Y. Acad. Sci. 875, 261–276 (1999).
14. Wolf,
E., Kemter, E., Klymiuk, N. & Reichart, B. Genetically modified pigs as donors
of cells, tissues, and organs for xenotransplantation. Anim. Front. 9,
13–20 (2019).
15. Galili,
U., Shohet, S. B., Kobrin, E., Stults, C. L. & Macher, B. A. Man, apes, and
Old World monkeys differ from other mammals in the expression of α-galactosyl epitopes
on nucleated cells. J. Biol. Chem. 263, 17755–17762 (1988).
16.Bouhours,
D., Pourcel, C. & Bouhours, J.-F. Simultaneous expression by porcine aorta endothelial
cells of glycosphingolipids bearing the major epitope for human xenoreactive antibodies
(Galα1–3Gal), blood group H determinant and N-glycolylneuraminic acid. Glycoconj.
J. 13, 947–953 (1996).
17.Byrne,
G. W., Stalboerger, P. G., Du, Z., Davis, T. R. & McGregor, C. G. A. Identification
of new carbohydrate and membrane protein antigens in cardiac xenotransplantation.
Transplantation 91, 287–292 (2011).
18.Shaper,
N. L., Lin, S. P., Joziasse, D. H., Kim, D. Y. & Yang-Feng, T. L. Assignment
of two human alpha-1,3-galactosyltransferase gene sequences (GGTA1 and GGTA1P) to
chromosomes 9q33-q34 and 12q14-q15. Genomics 12, 613–615 (1992).
19.Irie,
A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T. & Suzuki, A. The molecular basis
for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J. Biol. Chem. 273,
15866–15871 (1998).
20.Galili,
U., Rachmilewitz, E. A., Peleg, A. & Flechner, I. A unique natural human IgG
antibody with anti-alpha-galactosyl specificity. J. Exp. Med. 160,
1519–1531 (1984).
21.Kappler,
K. & Hennet, T. Emergence and significance of carbohydrate-specific antibodies.
Genes Immun. 21, 224–239 (2020).
22.Montiel,
M.-D., Krzewinski-Recchi, M.-A., Delannoy, P. & Harduin-Lepers, A. Molecular
cloning, gene organization and expression of the human UDP-GalNAc:Neu5Acalpha2-3Galbeta-R
beta1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase responsible for the biosynthesis of the
blood group Sda/Cad antigen: evidence for an unusual extended cytoplasmic domain.
Biochem. J. 373, 369–379 (2003).
23.Stenfelt,
L. et al. Missense mutations in the C-terminal portion of the B4GALNT2-encoded glycosyltransferase
underlying the Sd(a−) phenotype. Biochem. Biophys. Rep. 19, 100659
(2019).
24.Renton,
P. H., Howell, P., Ikin, E. W., Giles, C. M. & Goldsmith, Dr. K. L. G. Anti-Sda,
a new blood group antibody. Vox. Sang. 13, 493–501 (1967).
25.Morozumi,
K. et al. Significance of histochemical expression of hanganutziu–deicher antigens
in pig, baboon and human tissues. Transplant. Proc. 31, 942–944 (1999).
26.Mohan
Rao, L. V., Esmon, C. T. & Pendurthi, U. R. Endothelial cell protein C receptor:
a multiliganded and multifunctional receptor. Blood 124, 1553–1562
(2014).
27.Esmon,
C. Do-all receptor takes on coagulation, inflammation. Nat. Med. 11,
475–477 (2005).
28.Panepinto,
L. M., Phillips, R. W., Wheeler, L. R. & Will, D. H. The Yucatan minature pig
as a laboratory animal. Lab. Anim. Sci. 28, 308–313 (1978).
29.Choi,
M.-K. et al. Determination of complete sequence information of the human ABO blood
group orthologous gene in pigs and breed difference in blood type frequencies. Gene
640, 1–5 (2018).
30.
Cong,
L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science
339, 819–823 (2013).
31.Mali,
P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339,
823–826 (2013).
32.Schlake,
T. & Bode, J. Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange
of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry 33,
12746–12751 (1994).
33.Kim,
J. H. et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1
in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS ONE 6, e18556 (2011).
34.Ni
Choileain, S. et al. TCR-stimulated changes in cell surface CD46 expression generate
type 1 regulatory T cells. Sci. Signal. 10, eaah6163 (2017).
35.Angeletti,
A. et al. Loss of decay-accelerating factor triggers podocyte injury and glomerulosclerosis.
J. Exp. Med. 217, e20191699 (2020).
36.Esmon,
C. T. The protein C pathway. Chest 124, 26S–32S (2003).
37.Ide,
K. et al. Role for CD47-SIRPα signaling in xenograft rejection by macrophages. Proc.
Natl Acad. Sci. USA 104, 5062–5066 (2007).
38.Lee,
E. G. et al. Failure to regulate TNF-induced NF-κB and cell death responses in A20-deficient
mice. Science 289, 2350–2354 (2000).
39.Kapturczak,
M. H. et al. Heme oxygenase-1 modulates early inflammatory responses. Am. J.
Pathol. 165, 1045–1053 (2004).
40.Oropeza,
M. et al. Transgenic expression of the human A20 gene in cloned pigs provides protection
against apoptotic and inflammatory stimuli. Xenotransplantation 16,
522–534 (2009).
41.Petersen,
B. et al. Transgenic expression of human heme oxygenase-1 in pigs confers resistance
against xenograft rejection during ex vivo perfusion of porcine kidneys. Xenotransplantation
18, 355–368 (2011).
42.Roufosse,
C. et al. A 2018 reference guide to the Banff Classification of Renal Allograft
Pathology. Transplantation 102, 1795–1814 (2018).
43.Rosales,
I. A. & Colvin, R. B. The pathology of solid organ xenotransplantation. Curr.
Opin. Organ Transplant. 24, 535 (2019).
44.Cooper,
D. K. C., Ezzelarab, M., Iwase, H. & Hara, H. Perspectives on the optimal genetically
engineered pig in 2018 for initial clinical trials of kidney or heart xenotransplantation.
Transplantation 102, 1974–1982 (2018).
45.Sachs,
D. H. Transplantation tolerance through mixed chimerism: from allo to xeno. Xenotransplantation
25, e12420 (2018).
46.Joska,
T. M., Mashruwala, A., Boyd, J. M. & Belden, W. J. A universal cloning method
based on yeast homologous recombination that is simple, efficient, and versatile.
J. Microbiol. Methods 100, 46–51 (2014).
47.Wright,
E. S. Using DECIPHER v2.0 to analyze big biological sequence data in R. R J.
8, 352 (2016).
48.Yang,
L. et al. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science
350, 1101–1104 (2015).
49.Campbell,
K. H. S., McWhir, J., Ritchie, W. A. & Wilmut, I. Sheep cloned by nuclear transfer
from a cultured cell line. Nature 380, 64–66 (1996).
50. Dhondt, L. et al. Development and validation of an ultra-high
performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the simultaneous
determination of iohexol, p-aminohippuric acid and creatinine in porcine and broiler
chicken plasma. J. Chromatogr. B Analyt.
Technol. Biomed. Life Sci. 1117, 77–85 (2019).
SUMBER:
Ranjith P. Anand, Jacob V. Layer,
David Heja, Takayuki Hirose, Grace Lassiter, Daniel J. Firl, Violette B.
Paragas, Adam Akkkad, Sagar Chhangawala, Robert B. Colvin, Russell J. Ernst,
Nicholas Esch, Kristen Getchell, Alexandra K. Griffin, Xiaoyum Guo, Kathherine
C. Hall, Paula Hamilton, Lokesh A. Kalekar, Yinan Kan, Ahmad Karadagi, Feng Li,
Susan C. Low, Rudy Matheson, Clamudia Nehring, Winning Qin. Design and testing of
a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature volume 622, pages393–401
(2023)
Ringkasan Pelaporan
Informasi lebih lanjut mengenai desain penelitian
tersedia dalam Nature Portfolio Reporting Summary yang terhubung dengan artikel
ini.
Ketersediaan Data
Semua data sekuensing mentah dan yang telah diproses yang
dihasilkan dalam penelitian ini telah diserahkan ke NCBI Gene Expression
Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
dan Sequence Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)
di bawah BioProject PRJNA870308. Data tambahan yang mendukung temuan penelitian
ini, termasuk data imunohistokimia (IHC) dari setiap transplantasi NHP,
tersedia dari penulis korespondensi berdasarkan permintaan yang wajar. Data
sumber disediakan bersama dengan makalah ini.
RSS Feed (xml)
