INFECTIOUS BURSAL DISEASE (IBD / GUMBORO)

RINGKASAN

Deskripsi Penyakit: Virus penyakit bursa infeksius (Infectious bursal disease virus atau IBDV, genus Avibirnavirus, famili Birnaviridae) menginfeksi ayam, kalkun, bebek, burung mutiara, dan burung unta, tetapi penyakit klinis hanya terjadi pada ayam muda.

 

Penyakit akut yang parah, biasanya pada ayam berusia 3 hingga 6 minggu, terkait dengan angka kematian tinggi, sementara infeksi subklinis atau yang kurang akut lebih umum terjadi pada usia lebih muda. IBDV menyebabkan penurunan limfoid pada bursa Fabricius, yang dapat menekan respons antibodi humoral secara signifikan, sehingga mempermudah terjadinya infeksi sekunder. Dua serotipe IBDV telah diidentifikasi, yaitu serotipe 1 dan 2. Penyakit klinis hanya terkait dengan serotipe 1, yang menjadi dasar pengembangan semua vaksin komersial. Beberapa varian antigenik dari serotipe 1 mungkin memerlukan vaksin khusus untuk memberikan perlindungan maksimal. Strain sangat virulen (very virulent) dari serotipe 1 umum ditemukan di seluruh dunia dan menyebabkan penyakit serius.

 

Penyakit IBD klinis, yang juga dikenal sebagai penyakit Gumboro, dapat didiagnosis melalui kombinasi tanda-tanda klinis khas dan lesi pascamati. IBD subklinis dapat dikonfirmasi di laboratorium dengan mendeteksi respons imun humoral pada ayam yang tidak divaksinasi atau dengan mendeteksi antigen atau genom virus dalam jaringan. Jika tidak tersedia tes tersebut, pemeriksaan histologis pada bursa dapat membantu.

 

DETEKSI AGEN

 

Isolasi IBDV jarang dilakukan dalam diagnosis rutin. Ayam tanpa antibodi spesifik (specific antibody-negative, SAN), telur berembrio dari sumber SAN, atau kultur sel dapat digunakan, meskipun adaptasi IBDV pada dua sistem terakhir bisa sulit. Identitas virus yang diisolasi harus dikonfirmasi melalui uji netralisasi virus (VN).

 

Antigen virus dapat dideteksi pada bursa Fabricius sebelum antibodi anti-IBDV terbentuk, sehingga berguna untuk diagnosis dini. Pada uji imunodifusi agar gel (AGID), homogenat bursa digunakan sebagai antigen terhadap antisera positif yang telah diketahui. Uji ELISA berbasis tangkapan antigen (antigen-capture ELISA, AC-ELISA) dengan pelat yang dilapisi antibodi spesifik IBDV juga dapat mendeteksi antigen IBDV dalam homogenat bursa. Antigen IBDV dapat diidentifikasi melalui imunostaining jaringan yang terinfeksi menggunakan antisera ayam spesifik terhadap IBDV. Metode reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) dapat digunakan untuk mendeteksi RNA virus.

 

TEKNIK DIAGNOSTIK

 

Isolasi dan identifikasi agen memberikan diagnosis paling pasti untuk IBD, tetapi jarang dilakukan dalam diagnosis rutin karena kesulitan isolasi virus. Dalam praktiknya, diagnosis laboratorium IBD bergantung pada deteksi antibodi spesifik terhadap virus atau pada deteksi virus dalam jaringan menggunakan metode imunologi atau molekuler. Beberapa metode tersedia untuk diagnosis, tergantung pada tujuan (Tabel 1).

 

Karakterisasi Strain: Strain IBDV dapat dikarakterisasi melalui pathotyping pada ayam SAN, pengetikan antigenik melalui uji VN silang atau tes berbasis antibodi monoklonal, atau dengan penentuan urutan nukleotida dari produk amplifikasi RT-PCR dari kedua segmen genom IBDV. Tes ini harus dilakukan oleh laboratorium khusus dengan memasukkan strain kontrol referensi.

 

Tes Serologis: AGID, VN, atau ELISA dapat dilakukan. Infeksi IBDV biasanya menyebar cepat dalam satu kawanan, sehingga hanya sebagian kecil kawanan yang perlu diuji untuk antibodi. Jika ditemukan reaksi positif pada ayam yang tidak divaksinasi, maka seluruh kawanan dianggap terinfeksi.

 

PERSYARATAN VAKSIN

 

Vaksin hidup yang dilemahkan, vaksin inaktif (mati), vaksin rekombinan hidup yang mengekspresikan antigen kapsid (VP2) IBDV, atau vaksin kompleks imun (immune-complex, Icx) tersedia. Vaksin hidup yang dilemahkan, rekombinan, atau Icx digunakan untuk mengimunisasi ayam muda secara aktif. Pendekatan pelengkap adalah memberikan perlindungan pasif pada ayam muda dengan memvaksinasi induknya menggunakan kombinasi vaksin hidup dan mati. Oleh karena itu, vaksinasi yang efektif pada induk sangat penting.

 

Vaksin hidup IBDV yang dilemahkan harus stabil tanpa kecenderungan kembali menjadi virulen. Vaksin hidup diklasifikasikan sebagai ringan, sedang, atau "sedang plus" ("panas" atau "invasif"), berdasarkan kemampuan mereka i) untuk bereplikasi dan menyebabkan deplesi limfosit pada bursa dan ii) mengatasi antibodi maternal yang tersisa (maternally derived antibodies, MDA). Vaksin ringan jarang digunakan pada broiler, tetapi sering digunakan untuk mempersiapkan induk broiler sebelum diinokulasi dengan vaksin inaktif. Jika MDA masih ada pada usia 1 hari, vaksinasi dengan vaksin hidup harus ditunda hingga MDA pada sebagian besar kawanan menurun. Jadwal terbaik dapat ditentukan melalui pengujian serologis untuk mengetahui kapan MDA turun ke tingkat rendah. Vaksin hidup biasanya diberikan melalui semprotan atau air minum.

 

Vaksin rekombinan dan Icx memungkinkan administrasi otomatis melalui injeksi, baik in ovo pada hari ke-18 inkubasi, atau pada ayam usia 1 hari, bahkan di hadapan MDA.

 

Vaksin mati membutuhkan kandungan antigen yang tinggi untuk efektif. Vaksin ini terutama digunakan untuk merangsang tingkat antibodi yang tinggi dan seragam pada induk ayam, yang kemudian ditransfer ke keturunannya. Kadang-kadang, vaksin mati dapat digunakan pada ayam muda yang berharga dengan MDA. Vaksin mati diproduksi dalam adjuvan emulsi minyak dan diberikan melalui injeksi. Vaksin ini harus digunakan pada ayam yang sebelumnya telah disensitisasi oleh vaksin hidup atau virus lapangan. Hal ini dapat diperiksa secara serologis. Tingkat MDA yang tinggi dapat diperoleh pada ayam induk dengan memberikan vaksin hidup sekitar usia 8 minggu, diikuti dengan vaksin inaktif pada usia sekitar 18 minggu.

 

A. PENDAHULUAN

 

Penyakit bursal infeksius (Infectious Bursal Disease atau IBD), juga dikenal sebagai penyakit Gumboro, disebabkan oleh virus yang merupakan anggota genus Avibirnavirus (famili Birnaviridae). Meskipun kalkun, bebek, ayam mutiara, burung pegar, dan burung unta dapat terinfeksi, penyakit klinis hanya terjadi pada ayam. Ayam yang biasanya terkena dampak klinis adalah yang berusia kurang dari 10 minggu. Ayam yang lebih tua umumnya tidak menunjukkan tanda klinis.

 

Penyakit akut yang parah pada ayam berusia 3 hingga 6 minggu biasanya disertai tingkat kematian tinggi, dengan gejala seperti kelemahan, diare, dan kematian mendadak. Pemeriksaan pascakematian pada kasus IBD akut menunjukkan kombinasi perdarahan pada otot dan proventriculus, nefritis, serta peradangan bursa, dengan edema atau perdarahan bursa dalam 4 hari pertama yang kemudian diikuti oleh atrofi bursa pada tahap berikutnya dari penyakit (lihat Bagian B.1, Identifikasi Agen untuk detail). Diagnosis banding IBD akut harus mempertimbangkan penyakit lain yang dapat menyebabkan kematian mendadak pada ayam muda, dengan perdarahan, nefritis, atau lesi bursa. Ini termasuk penyakit menular seperti penyakit Newcastle (Newcastle Disease atau ND), anemia infeksius ayam (Chicken Infectious Anaemia atau CIA), dan infeksi virus bronkitis infeksius (Infectious Bronchitis Virus atau IBV) yang bersifat nefropatogenik. Lesi bursa pada tahap awal penyakit sangat penting untuk identifikasi banding IBD akut.

 

Penyakit yang kurang akut atau subklinis umum terjadi pada ayam berusia 0 hingga 3 minggu. Penyakit ini dapat menyebabkan masalah sekunder akibat pengaruh virus terhadap bursa Fabricius. Virus IBD (IBD virus atau IBDV) menyebabkan deplesi limfoid pada bursa, yang terutama jika terjadi dalam 2 minggu pertama kehidupan, dapat menyebabkan depresi signifikan pada respons antibodi humoral. Satu-satunya lesi yang terkait dengan IBD subklinis mungkin berupa atrofi bursa dan lesi yang terkait dengan infeksi sekunder. Karakterisasi perubahan histopatologis yang terkait dengan atrofi bursa sangat penting dalam mengidentifikasi IBD subklinis.

 

Terdapat dua serotipe virus penyakit bursal infeksius (IBDV) yang diketahui. Virus serotipe 1 bereplikasi dalam bursa Fabricius, dan beberapa virus serotipe 1 menyebabkan penyakit klinis pada ayam. Antibodi atau virus kadang ditemukan pada spesies burung lain, tetapi tidak ada tanda infeksi yang terlihat. Virus serotipe 2 telah terdeteksi pada saluran pernapasan kalkun, usapan kloaka bebek, atau pada bursa Fabricius ayam. Antibodi terhadap virus serotipe 2 sangat luas pada kalkun dan kadang ditemukan pada ayam serta bebek. Tidak ada laporan mengenai penyakit klinis yang disebabkan oleh infeksi virus serotipe 2 (Eterradossi & Saif, 2013).

IBD tidak dilaporkan memiliki potensi zoonosis (Eterradossi & Saif, 2013).

 

B. TEKNIK DIAGNOSTIK

 

Isolasi dan identifikasi agen merupakan metode diagnosis IBD yang paling pasti, tetapi jarang dilakukan untuk keperluan diagnostik rutin karena virus ini sulit diisolasi. Dalam praktiknya, diagnosis laboratorium IBD bergantung pada deteksi antibodi spesifik terhadap virus atau deteksi virus dalam jaringan menggunakan metode imunologis atau molekuler. Beberapa metode tersedia untuk diagnosis, tergantung pada tujuan diagnostik (lihat Tabel 1).

Berikut adalah penjelasan singkatan dan kategori rekomendasi dalam tabel teknik diagnostik untuk penyakit bursal infeksius (IBD):

Kunci Interpretasi Rekomendasi

• +++ = Direkomendasikan untuk tujuan ini.
• ++ = Direkomendasikan, tetapi memiliki keterbatasan.
• + = Cocok hanya dalam kondisi yang sangat terbatas.
• – = Tidak sesuai untuk tujuan ini.

 

Singkatan Metode Diagnostik

• AGID = Agar Gel Immunodiffusion Assay (Uji imunodifusi agar gel).
• AC-ELISA = Antigen Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA tangkap antigen).
• RT-PCR = Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Transkripsi balik – reaksi berantai polimerase).

Catatan Penting (a–h):

• (a) Kombinasi metode identifikasi agen yang diterapkan pada sampel klinis yang sama direkomendasikan.
• (b) Digunakan pada skala besar dan selalu negatif di wilayah tanpa vaksinasi hidup, atau untuk mendeteksi IBD subklinis.
• (c) Dapat digunakan setelah vaksinasi untuk memeriksa replikasi vaksin hidup di bursa Fabricius.
• (d) Tidak cocok, karena hasilnya dapat negatif jika infeksi terjadi beberapa minggu sebelum pengujian.
• (e) Membutuhkan banyak tenaga kerja dan perlu dilengkapi dengan karakterisasi virus untuk membedakan antara vaksin hidup dan isolat lapangan.
• (f) Mungkin diperlukan jika vaksin hidup digunakan di wilayah yang diselidiki.
• (g) Tidak cocok, karena biasanya tidak dapat membedakan antara vaksin hidup dan isolat lapangan.
• (h) Membutuhkan banyak tenaga kerja, namun merupakan metode referensi untuk burung non-unggas, spesies non-avians, atau jika jumlah ayam yang diuji kecil, atau jika penting untuk menghubungkan keberadaan antibodi yang terdeteksi dengan perlindungan.
  

 

1. Deteksi Agen

 

Infectious Bursal Diasease (IBD) memiliki tanda klinis dan lesi post-mortem yang sangat khas. Sebuah kawanan menunjukkan morbiditas yang sangat tinggi disertai depresi berat pada sebagian besar ayam selama 5–7 hari. Mortalitas meningkat tajam selama 2 hari dan menurun cepat dalam 2–3 hari berikutnya. Biasanya, 5–10% ayam mati, tetapi mortalitas dapat mencapai 30–40% atau lebih pada IBDV yang sangat virulen (very virulent IBDV, vvIBDV). Tanda-tanda klinis utama meliputi diare cair, bulu kusut, enggan bergerak, anoreksia, gemetar, dan prostrasi.

 

Lesi post-mortem meliputi dehidrasi otot dengan banyak perdarahan ekimosis, pembesaran dan perubahan warna ginjal dengan urat dalam tubulusnya. Bursa Fabricius menunjukkan lesi diagnostik utama. Pada ayam yang mati pada puncak wabah, bursa membesar dan tegang dengan perubahan warna kuning pucat. Perdarahan intrafolikular mungkin terlihat, dan dalam beberapa kasus, bursa sepenuhnya mengalami perdarahan sehingga menyerupai ceri hitam. Edema peribursal berwarna jerami juga sering terlihat.

 

Konfirmasi penyakit klinis atau deteksi penyakit subklinis paling baik dilakukan menggunakan metode imunologi karena isolasi IBDV sulit dilakukan. Untuk isolasi virus, metode yang dijelaskan di bawah ini harus diikuti. Diferensiasi antara serotipe 1 dan 2 atau antara subtipe atau patotipe serotipe 1 harus dilakukan oleh laboratorium khusus (misalnya, Laboratorium Referensi WOAH untuk penyakit bursal infeksius).

 

1.1. Persiapan Sampel

 

Ambil bursa Fabricius secara aseptis dari sekitar lima ayam yang terinfeksi pada tahap awal penyakit. Cincang bursa menggunakan dua pisau bedah, tambahkan sedikit kaldu pepton yang mengandung penisilin dan streptomisin (masing-masing 1000 µg/ml), lalu homogenkan menggunakan blender jaringan. Sentrifugasi homogenat pada kecepatan 3000 g selama 10 menit. Ambil cairan supernatan untuk investigasi berikut. Penyaringan melalui filter 0,22 µm mungkin diperlukan untuk mengontrol kontaminasi bakteri lebih lanjut, meskipun dapat mengurangi titer virus.

 

1.2. Identifikasi dengan Uji Imunodifusi Agar Gel (AGID)

 

Protokol uji AGID dijelaskan di bagian B.2.1. Untuk deteksi antigen di bursa Fabricius menggunakan AGID, bursa harus diambil secara aseptis dari sekitar sepuluh ayam pada tahap akut infeksi. Bursa dicincang menggunakan dua pisau bedah dengan gerakan seperti gunting, lalu potongan kecil ditempatkan di sumur pada pelat AGID melawan serum positif yang diketahui. Siklus pembekuan-pencairan jaringan cincang dapat meningkatkan pelepasan antigen IBDV dari jaringan bursal yang terinfeksi, dan eksudat hasil pembekuan-pencairan dapat digunakan untuk mengisi sumur.

 

1.3. Identifikasi dengan Imunofluoresensi

 

Bagian bursa dipersiapkan menggunakan mikrotom kriostat, dikeringkan pada suhu kamar, lalu difiksasi dalam aseton dingin. Antiserum spesifik IBDV berlabel fluoresen diaplikasikan pada potongan tersebut, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam dalam suasana lembap. Setelah periode inkubasi, bagian tersebut dicuci selama 30 menit menggunakan larutan salin buffer fosfat (PBS) pH 7,2, lalu dibilas dengan air suling. Bagian tersebut kemudian dipasang menggunakan gliserol buffer pH 7,6 dan diperiksa menggunakan mikroskop UV untuk fluoresensi spesifik IBDV (Meulemans et al., 1977).

 

1.4. Identifikasi dengan Antigen-Capture ELISA (AC-ELISA)

 

Sejak protokol pertama dijelaskan oleh Snyder et al. (1988) untuk deteksi serotipe 1 IBDV menggunakan AC-ELISA, berbagai uji lainnya telah dikembangkan (Eterradossi & Saif, 2013). Secara singkat, pelat ELISA dilapisi dengan antibodi spesifik IBDV. Tergantung pada protokol AC-ELISA yang dipilih, antibodi tangkap dapat berupa antibodi monoklonal (monoclonal antibody, MAb) tikus anti-IBDV, campuran MAb, atau serum poliklonal ayam pasca-infeksi anti-IBDV.

 

Telah disarankan bahwa AC-ELISA yang menggunakan antibodi poliklonal mungkin memiliki sensitivitas lebih tinggi. Sampel homogenat bursa (lihat di atas) yang diencerkan 1/10 hingga 1/25 (berat/volume) dalam larutan pengencer yang sesuai diinkubasi dalam sumur yang telah dilapisi antibodi. Antigen yang tidak terikat dibuang setelah periode inkubasi dengan pencucian menggunakan buffer pencuci yang sesuai (misalnya, PBS pH 7,2 + 0,2% Tween 20). Antigen yang tertangkap kemudian diungkapkan, seperti dalam ELISA tidak langsung, dengan antibodi deteksi (yang harus berasal dari spesies hewan berbeda dari antibodi tangkap), diikuti oleh konjugat enzim yang hanya mengikat antibodi deteksi (dalam beberapa protokol antibodi deteksi dapat langsung dikonjugasikan dengan enzim), diikuti oleh substrat enzim.

Akhirnya, densitas optik, yang sebanding dengan jumlah antigen IBDV yang tertangkap, dibaca menggunakan pembaca ELISA.

 

AC-ELISA didasarkan pada penggunaan sampel yang kemungkinan mengandung virus hidup, sehingga harus dilakukan hanya di fasilitas dengan tingkat penahanan yang sesuai, seperti kabinet keselamatan kelas II. Semua limbah cair (seperti larutan pencuci) dan limbah padat harus dianggap terkontaminasi oleh IBDV dan harus didekontaminasi sebelum dibuang.

 

Langkah-langkah penting dalam pelaksanaan atau penilaian AC-ELISA meliputi:

i) perlunya melakukan pencucian menyeluruh di antara setiap tahap reaksi untuk menjaga reaksi latar belakang tetap rendah;

ii) kewajiban untuk menyertakan sampel positif dan negatif yang diketahui dalam setiap pengujian sebagai kontrol; dan

iii) kebutuhan agar antibodi tangkap dan deteksi dapat bereaksi positif dengan semua galur serotipe 1 IBDV (artinya, reaktivitas antibodi tangkap maupun deteksi tidak boleh bergantung secara kritis pada variasi antigenik IBDV yang terjadi di antara galur serotipe 1).

 

1.5. Identifikasi dengan Teknik Molekuler

 

Teknik virologi molekuler telah dikembangkan yang memungkinkan identifikasi IBDV lebih cepat dibandingkan dengan isolasi virus. Metode molekuler yang paling sering digunakan adalah deteksi genom IBDV dengan reaksi rantai polimerase transkripsi balik (RT-PCR) (Lin et al., 1993; Wu et al., 1992). Metode ini dapat mendeteksi genom virus yang tidak berkembang biak dalam kultur sel, karena tidak perlu menumbuhkan virus sebelum amplifikasi.

 

RT-PCR dilakukan dalam tiga langkah: ekstraksi asam nukleat dari sampel yang diuji, transkripsi balik (RT) RNA IBDV menjadi cDNA, dan amplifikasi cDNA yang dihasilkan melalui PCR. Dua langkah terakhir memerlukan pemilihan primer oligonukleotida, yang merupakan urutan pendek yang komplementer dengan urutan nukleotid spesifik virus. Berbagai area genom akan diamplifikasi tergantung pada lokasi dari mana primer tersebut dipilih. Contoh di bawah ini memungkinkan amplifikasi sepertiga bagian tengah gen yang mengkode protein kapsid luar VP2 (Eterradossi et al., 1998) atau amplifikasi sebagian dari ujung 5' gen VP1 pada segmen B IBDV (Le Nouen et al., 2006).

 

1.5.1. Ekstraksi Asam Nukleat

 

Berbeda dengan RNA untai tunggal, genom RNA dua untai (dsRNA) IBDV tahan terhadap degradasi oleh RNase. Namun, sel yang terinfeksi juga mengandung spesies RNA untai tunggal positif yang berasal dari IBDV yang dapat digunakan sebagai template pada langkah RT dan dapat berkontribusi dalam meningkatkan sensitivitas uji. Oleh karena itu, penting untuk melakukan ekstraksi RNA menggunakan sarung tangan dan reagen serta peralatan laboratorium yang bebas RNase.

 

RNA IBDV dapat diekstraksi dari jaringan yang terinfeksi menggunakan beberapa kit yang tersedia dari pemasok reagen biologi molekuler komersial. Sebagai alternatif, RNA IBDV dapat diekstraksi dengan menambahkan 1% (konsentrasi akhir berat/volume) natrium dodecil sulfat dan 1 mg/ml proteinase K ke dalam 700 µl suspensi virus (misalnya homogenat bursa). Inkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C. Asam nukleat diperoleh dengan menggunakan protokol standar ekstraksi fenol/kloroform (perhatian: fenol bersifat toksik dan harus ditangani dan dibuang sesuai prosedur). Asam nukleat dipanen dari fase aqueus akhir dengan presipitasi etanol dan dilarutkan kembali dalam air distilasi bebas RNase atau buffer yang sesuai. RNA yang telah diencerkan dengan air harus disimpan dalam keadaan beku pada suhu di bawah –20°C hingga digunakan.

 

1.5.2. Transkripsi Balik

 

Berbagai jenis enzim transkriptase balik tersedia secara komersial. Ikuti petunjuk pemasok untuk menyiapkan campuran reaksi RT. Gunakan primer PCR ‘bawah’ (komplementer dengan untai positif genom IBDV, lihat di bawah) untuk transkripsi balik, karena ini memungkinkan sintesis cDNA baik dari untai positif genom dsRNA IBDV maupun dari RNA untai tunggal positif yang berasal dari IBDV yang sebelumnya terkandung dalam sel yang terinfeksi. Sebagai alternatif, primer acak (heksanukleotida) dapat digunakan untuk memulai sintesis cDNA.

 

Matriks RNA IBDV harus dinaturasi sebelum dipindahkan ke dalam campuran reaksi RT. Tambahkan satu bagian (berdasarkan volume) dimetilsulfoxida kelas biologi molekuler ke empat bagian larutan RNA IBDV yang belum dibekukan. Panaskan selama 3 menit pada suhu 92°C dan dinginkan di atas es; metode alternatif adalah memanaskan selama 5 menit dan segera menginkubasi campuran dalam nitrogen cair. Pindahkan volume matriks yang telah dinaturasi ke dalam campuran reaksi. Inkubasi sesuai petunjuk dari pemasok enzim.

 

Larutan cDNA yang diperoleh setelah langkah RT harus disimpan dalam keadaan beku pada suhu di bawah –20°C. Menunda langkah PCR selama beberapa minggu setelah sintesis cDNA dapat menyebabkan hasil PCR negatif palsu.

 

1.5.3. Reaksi Rantai Polimerase (PCR)

 

Berbagai jenis polimerase DNA yang sesuai untuk PCR tersedia secara komersial. Ikuti petunjuk produsen untuk menyiapkan campuran reaksi PCR. Protokol untuk amplifikasi dan pengetikan molekuler IBDV telah ditinjau baru-baru ini (Wu et al., 2007). Sebagai contoh, pasangan primer PCR U3/L3 dan +290/–861 yang ditunjukkan di bawah ini dapat disarankan dan telah terbukti berguna untuk amplifikasi sepertiga bagian tengah gen VP2 pada segmen A galur serotipe 1 IBDV (Eterradossi et al., 1998), dan daerah pada ujung 5’ segmen B IBDV (Le Nouen et al., 2006), masing-masing. Kedua daerah ini telah terbukti cocok untuk studi epidemiologi molekuler (Le Nouen et al., 2006), dan wilayah yang diamplifikasi pada segmen B mencakup penanda B yang kemudian dikonfirmasi dapat mewakili informasi filogenetik yang diperoleh dari segmen B penuh (Alfonso-Morales et al., 2015). Meskipun sejumlah besar galur IBDV memiliki dua perubahan nukleotida pada posisi 35 (G–A) dan 38 (T–C) pada primer U3 (termasuk isolat dari Jepang [OKYM], Hong Kong [HK46], Inggris [UK661], Nigeria [N4]), telah terbukti bahwa pasangan primer U3-L3 berhasil mengamplifikasi beberapa virus yang menunjukkan kedua mutasi ini. Hal ini mungkin karena ekstemitas 3' dari U3 sangat terjaga. Namun, seperti halnya dengan sebagian besar uji PCR, galur IBDV mungkin ada dengan perubahan nukleotida pada posisi penyambungan primer, sehingga memerlukan penggunaan primer lain untuk deteksi RT-PCR yang dioptimalkan.

 

Kombinasi protokol RT-PCR yang menargetkan segmen A dan segmen B meningkatkan kemungkinan bahwa, jika ada, IBDV serotipe 1 akan terdeteksi; ini juga memungkinkan karakterisasi genetik menyeluruh dari galur IBDV yang terdeteksi.

 

Urutan nukleotida dari primer PCR spesifik IBDV U3 dan L3 (spesifik untuk Segmen A, gen VP2):

Primer Atas U3: 5’-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTGAC-3’

Primer Bawah L3: 5’-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTTTC-3’

Urutan nukleotida dari primer PCR spesifik IBDV +226 dan –793 (spesifik untuk Segmen B, gen VP1):

Primer Atas +290: 5’-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GAA-TTC-AGA-TTC-TGC-AGC-CAC-GGTCTC-T-3’

Primer Bawah -861: 5’-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-CTG-CAG-TTG-ATG-ACT-TGA-GGT-TGATTT-TG-3’

 

Primer U3 dan L3 masing-masing terdiri dari 44 nukleotida, sedangkan primer +290 dan –861 masing-masing terdiri dari 46 dan 47 nukleotida. Keempat primer tersebut mencakup eksterimitas 3’ spesifik IBDV (dalam huruf miring pada urutan yang ditampilkan di atas) yang sesuai dengan posisi nukleotida 657–676 dan 1193–1212 dari segmen A IBDV pada primer U3 dan L3, masing-masing (penomoran sesuai dengan segmen A dari strain P2, Acc No X84034), dan dengan posisi nukleotida 290–311 dan 861–883 dari segmen B IBDV pada primer +290 dan –861, masing-masing (penomoran sesuai dengan segmen B dari strain D6948, Acc No AF240687). Eksterimitas spesifik IBDV ini dipasangkan dengan eksterimitas 5’ non-IBDV (tebal pada urutan di atas) yang sesuai dengan primer universal M13 dan RM13 pada primer atas dan bawah, berturut-turut. Primer universal M13 dan RM13 umum digunakan sebagai primer dalam reaksi sekuensing DNA, sehingga produk PCR yang telah dipurnakan dari amplifikasi dengan pasangan primer U3/L3 dan +290/–861 dapat dengan mudah disekuensing dalam kedua arah. Akhirnya, situs restriksi (garis bawah pada urutan di atas) disertakan untuk enzim restriksi berikut: SphI (pada primer U3), EcoRI (pada primer L3 dan +290), dan Pst I (pada primer –861). Situs restriksi ini diposisikan sedemikian rupa sehingga produk PCR yang dihasilkan dari amplifikasi dengan pasangan U3/L3 atau +290/–861 dapat dikloning jika diperlukan. Pasangan primer U3/L3 menghasilkan produk sepanjang 604 pasang basa (bp), 516 bp di antaranya spesifik untuk urutan IBDV yang diamplifikasi dan mencakup wilayah yang mengkodekan daerah hipervariabel dari protein VP2. Pasangan +290/–861 menghasilkan produk sepanjang 642 bp, 549 bp di antaranya spesifik untuk urutan IBDV yang diamplifikasi. Kedua produk ini berasal dari wilayah genom yang cocok untuk analisis filogenetik (Eterradossi et al., 1998; Le Nouen et al., 2006).

 

Lakukan langkah denaturasi awal seperti yang disarankan oleh pemasok DNA polimerase, diikuti dengan 35 siklus, masing-masing mencakup satu langkah denaturasi, satu langkah annealing, dan satu langkah elongasi. Dalam siklus ini, denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik dan annealing pada suhu 64°C selama 45 detik dapat digunakan dengan pasangan primer U3/L3 dan +290/–861 (suhu annealing harus disesuaikan jika menggunakan primer lain). Parameter untuk langkah elongasi harus diatur sesuai dengan rekomendasi pemasok.

 

Pemeriksaan hasil dapat dilakukan dengan elektroforesis menggunakan produk PCR dan penanda berat molekul DNA dalam gel agarosa 1% yang diwarnai dengan etidium bromida (perhatian: etidium bromida bersifat toksik dan karsinogenik. Harus ditangani dan dibuang dengan hati-hati). Tiga reaksi PCR harus dilakukan untuk setiap sampel cDNA (cDNA murni, dilusi 10- dan 100-kali) untuk menghindari hasil negatif palsu akibat penghambatan PCR dalam campuran yang mengandung jumlah cDNA yang tinggi. Setiap PCR harus mencakup reaksi kontrol negatif dan positif. Protokol yang mencakup kontrol internal untuk menguji keberadaan penghambat PCR telah dikembangkan (Smiley et al., 1999). Menunda PCR selama beberapa minggu setelah langkah RT dapat menyebabkan hasil PCR negatif palsu.

One-step RT-PCR juga dapat digunakan untuk diagnosis IBD dengan metode konvensional dan real-time.

 

1.6. Isolasi virus dalam kultur sel 

 

Inokulasi 0,5 ml sampel ke dalam setiap empat kultur fibroblas embrio ayam (CEF) yang baru konfluens (dari sumber spesifik patogen bebas [SPF]) dalam botol 25 cm². Adsorpsi pada suhu 37°C selama 30–60 menit, cuci dua kali dengan larutan garam seimbang Earle, dan tambahkan medium pemeliharaan ke setiap botol. Inkubasi kultur pada suhu 37°C, amati setiap hari untuk melihat tanda-tanda efek sitopatik (CPE). Ini ditandai dengan sel-sel bulat kecil yang refraktif. Jika tidak ada CPE yang diamati setelah 6 hari, buang medium, lalu bekukan-cairkan kultur dan inokulasi lisat yang dihasilkan ke dalam kultur baru. Prosedur ini mungkin perlu diulang setidaknya tiga kali. Jika CPE teramati, virus harus diuji dengan antisera monospecific IBDV dalam uji netralisasi virus kultur jaringan (lihat Bagian B.2.2 Uji netralisasi virus). Strain IBDV yang lebih patogenik biasanya tidak dapat beradaptasi untuk tumbuh di CEF kecuali virus tersebut telah terlebih dahulu dilakukan passage serial ekstensif pada embrio (lihat di bawah).

 

1.7. Isolasi virus dalam embrio 

 

Inokulasi 0,2 ml sampel ke dalam kantung kuning telur dari lima embrio ayam spesifik antibodi negatif (SAN) berusia 6–8 hari dan ke membran korialoallantoic (American Association of Avian Pathologists, 2008) dari lima embrio ayam SAN berusia 9–11 hari. Embrio SAN berasal dari kawanan yang terbukti serologis negatif terhadap IBDV. Periksa setiap hari dan buang embrio yang mati hingga 48 jam setelah inokulasi. Embrio yang mati setelah waktu tersebut diperiksa untuk lesi. Serotipe 1 IBD menghasilkan kerdilnya embrio, edema subkutan, kongesti, dan perdarahan subkutan atau intrakranial. Hati biasanya membengkak, dengan kongesti bercak yang menghasilkan efek berbintik. Pada kematian yang lebih lama, hati bisa membengkak dan kehijauan, dengan area nekrosis. Limpa membesar dan ginjal membengkak serta terkongesti, dengan efek berbintik. Jika lesi diamati, virus kemudian harus diuji terhadap serum anti-IBDV monospecific dalam uji netralisasi virus yang terungkap pada embrio.

 

Serotipe 1 IBDV biasanya menyebabkan kematian pada sebagian embrio saat isolasi primer. Serotipe 2 IBDV tidak menyebabkan edema subkutan atau perdarahan pada embrio yang terinfeksi, tetapi embrio berukuran lebih kecil dengan perubahan warna kekuningan pucat.

 

Untuk persiapan stok virus yang dipropagasi pada embrio atau untuk pasase selanjutnya, embrio dengan lesi atau embrio yang diduga terinfeksi dipanen secara aseptik. Kepala dan anggota tubuh dibuang dan tubuh utama dipotong seperti yang dijelaskan pada Bagian B.1.1 Persiapan sampel untuk persiapan suspensi virus.

 

1.8. Isolasi virus pada ayam

 

Metode ini pernah digunakan di masa lalu, namun tidak lagi direkomendasikan karena masalah kesejahteraan hewan. Lima ayam rentan dan lima ayam yang kebal terhadap IBD (berusia 3-7 minggu) diinokulasi melalui tetes mata dengan 0,05 ml sampel. Euthanasia ayam dilakukan secara manusiawi 72-80 jam setelah inokulasi, dan bursa Fabricius mereka diperiksa. Bursa pada ayam yang terinfeksi dengan IBDV serotipe 1 virulen tampak kekuningan (terkadang berdarah) dan membengkak, dengan garis-garis yang menonjol. Edema peri-bursal kadang-kadang terlihat, dan kadang ditemukan sumbatan material kaseosa. Plica pada bursa tampak petechial.

 

Keberadaan lesi pada bursa ayam rentan, bersamaan dengan tidak adanya lesi pada ayam yang kebal, menjadi indikasi diagnostik dari IBD. Bursa dari kedua kelompok dapat digunakan sebagai antigen dalam tes AGID terhadap antiserum IBD yang positif (lihat Bagian B.1.2 Identifikasi dengan tes imunodifusi gel agar). Tingkat kerusakan bursa dapat bervariasi secara signifikan dengan patogenisitas strain IBDV yang diteliti. Namun, karena sampel yang diajukan untuk isolasi virus mungkin bervariasi dalam kandungan virus, tingkat kerusakan bursa yang diamati pada ayam rentan pada tahap isolasi hanya memberikan indikasi terbatas mengenai patogenisitas strain tersebut. Bursa pada ayam yang terinfeksi dengan IBDV serotipe 2 tidak menunjukkan lesi yang terlihat.

 

1.9. Diferensiasi Strain

 

Strain IBDV dapat diidentifikasi lebih lanjut dengan menguji patogenisitasnya pada ayam SAN, dengan memeriksa reaktivitas antigennya dalam tes VN silang atau menggunakan MAbs, dengan menentukan urutan nukleotida produk amplifikasi RT-PCR yang berasal dari genom IBDV, atau dengan mempelajari jumlah dan ukuran fragmen restriksi yang diperoleh setelah pencernaan produk RT-PCR tersebut dengan enzim restriksi. Beberapa protokol telah dijelaskan untuk setiap pendekatan ini. Tes harus dilakukan oleh laboratorium khusus dan harus mencakup panel strain referensi sebagai kontrol. Meskipun dasar molekuler untuk variasi antigenik sekarang lebih dipahami, marker virulensi yang tervalidasi belum dijelaskan.

 

1.9.1. Pengujian Patogenisitas

 

Studi untuk membandingkan patogenisitas strain IBDV harus dilakukan di fasilitas biokontainer yang aman untuk menghindari penyebaran virus yang diteliti (lihat Bab 1.1.4 Keamanan Biologis dan Biosekuriti: Standar untuk mengelola risiko biologis di laboratorium kedokteran hewan dan fasilitas hewan). Burung SAN dengan status mikroba yang diketahui (idealnya ayam SPF) harus digunakan untuk menghindari gangguan oleh agen kontaminan.

 

Variabel utama saat membandingkan hasil percobaan patogenisitas adalah ras, usia, dan status imun ayam yang diuji, dosis dan rute inokulasi virus tantangan, dan kemungkinan adanya agen kontaminan dalam inokulum. Ras ayam layer ringan telah dilaporkan lebih rentan dibandingkan ayam broiler berat (Van den Berg & Meulemans, 1991). Perbedaan dalam kerentanannya juga dapat terjadi antara berbagai garis ayam SPF. Kerentanannya paling tinggi pada ayam yang berusia antara 3 dan 6 minggu (Eterradossi & Saif, 2013). (Pengaruh status imun dijelaskan dalam Bagian C.) Dosis virus tantangan yang tinggi, seperti yang direkomendasikan dalam Bagian C.1.3 Vaksin vektor rekombinan hidup: metode penggunaan, diperlukan agar semua ayam yang diinokulasi terinfeksi sekaligus tanpa memerlukan transmisi virus dari ayam ke ayam. Akhirnya, keberadaan agen kontaminan dalam inokulum, seperti adenovirus atau virus anemia infeksius ayam, dapat mengubah tingkat keparahan IBD dan gejala yang diamati setelah tantangan (Rosenberger et al., 1975).

 

Istilah 'varian', 'klasik', dan 'sangat virulen' telah digunakan untuk menggambarkan strain IBDV yang menunjukkan perbedaan dalam patogenisitas. Berdasarkan tanda-tanda dan lesi yang diamati pada dua garis ayam White Leghorn SPF selama IBD eksperimental akut setelah tantangan dengan dosis infeksi embrio 50% (EID₅₀) 10⁵, IBDV 'varian' di Amerika Utara hanya menyebabkan sedikit gejala klinis atau bahkan tidak ada sama sekali dan tidak ada kematian, tetapi lesi bursa yang mencolok, sementara IBDV 'klasik' menyebabkan sekitar 10-50% kematian dengan gejala dan lesi yang khas, sedangkan IBDV 'sangat virulen' menyebabkan sekitar 50-100% kematian dengan gejala dan lesi yang khas (Eterradossi et al., pengamatan pribadi).

 

1.9.2. Pengujian Antigenisitas

 

Hubungan antigenik antara strain IBDV dapat diuji dalam tes VN silang, yang memiliki korelasi terbaik dengan perlindungan silang. Tes tersebut harus dilakukan pada telur embrio SAN ketika virus yang dipelajari tidak tumbuh di CEF (misalnya vvIBDV). Perbedaan hasil tes VN silang antara strain IBDV serotipe 1 telah menyebabkan definisi 'subtipe' serotipe 1, beberapa di antaranya mencakup isolat IBDV 'varian' dari Amerika Utara (Jackwood & Saif, 1987).

 

Pendekatan lain untuk mempelajari hubungan genetik adalah dengan menggunakan MAbs tikus yang mengikat epitop penetralisasi IBDV. Beberapa panel MAbs tersedia di seluruh dunia untuk digunakan dalam AC-ELISA (Eterradossi et al., 1999; Snyder et al., 1992). Beberapa MAbs telah dimasukkan dalam kit yang tersedia secara komersial, tetapi belum ada panel MAb yang disatukan. Semua epitop penetralisasi IBDV yang telah dikarakterisasi hingga saat ini telah dipetakan ke dalam domain imunogenik utama pada sepertiga tengah (posisi asam amino 200 hingga 340) dari protein kapsid VP2 (Eterradossi et al., 1998; Schnitzler et al., 1993; Vakharia et al., 1994). Wilayah ini disebut 'domain variabel VP2' karena sebagian besar perubahan asam amino yang diamati di antara strain IBDV terkelompok di dalamnya. Dalam vVP2, empat urutan asam amino sangat penting untuk antigenisitas dan disebut puncak hidrofobik vVP2. Ini adalah posisi asam amino 210 hingga 225 (puncak utama A), 249 hingga 252 (puncak minor 1), 281 hingga 292 (puncak minor 2), dan 313 hingga 324 (puncak utama B) (Van den Berg et al., 1996). Berdasarkan struktur kristal protein VP2 dan partikel IBDV, urutan asam amino yang sebelumnya dikenal sebagai “puncak hidrofobik VP2” berhubungan dengan loop asam amino yang paling terpapar di domain proyeksi dari protein VP2 (Coulibaly et al., 2005). Baik IBDV ‘varian’ Amerika Utara maupun IBDV ‘sangat virulen’ menunjukkan perubahan asam amino di area ini yang berkorelasi dengan variasi epitop (Eterradossi et al., 1998; Vakharia et al., 1994). Hingga saat ini, belum ada marker antigenik yang terbukti berkorelasi secara ketat dengan patogenisitas IBDV.

 

1.9.3. Identifikasi Molekuler

 

Sebagian besar upaya identifikasi molekuler telah difokuskan pada karakterisasi segmen IBDV yang lebih besar (segmen A) dan terutama pada wilayah pengkode vVP2. Upaya pertama kali dilakukan untuk mengkarakterisasi produk RT-PCR menggunakan endonuklease restriksi (Lin et al., 1993). Pendekatan ini dikenal sebagai RT-PCR/RE atau RT-PCR-RFLP (polimorfisme panjang fragmen restriksi). Kegunaan informasi yang diberikan bergantung pada identifikasi enzim yang memotong pada situs restriksi yang relevan secara fenotipik. Beberapa protokol RE atau RFLP menghasilkan definisi banyak profil, yang dapat membingungkan untuk digunakan dalam studi epidemiologi molekuler dan sulit untuk dikorelasikan dengan antiginitas atau patogenisitas. Urutan nukleotida produk RT-PCR menyediakan pendekatan untuk menilai lebih tepat hubungan genetik antar strain IBDV. Dengan menggunakan pendekatan genetika balik, telah dibuktikan bahwa adaptasi kultur sel dari strain IBDV sangat bergantung pada pasangan asam amino VP2 279 N–284 T atau 253 H–284 T (Mundt, 1999). Pada sebagian besar virus sangat virulen, terdapat empat asam amino khas (222 A, 256 I, 294 I, dan 299 S) (Brown et al., 1994; Lin et al., 1993). Beberapa studi terbaru menunjukkan bahwa meskipun VP2 adalah penentu virulensi yang penting, segmen B juga tampaknya penting (Boot et al., 2000; Escaffre et al., 2013; Jackwood et al., 2011). Telah dilaporkan bahwa segmen A dan B dari IBDV sebagian besar berkembang bersama (yaitu sebagian besar kluster IBDV yang signifikan, seperti strain terkait vvIBDV, dapat diidentifikasi dengan analisis kedua segmen genom). Namun, beberapa virus reassortan potensial telah diidentifikasi. Patogenisitas IBDV reassortan yang diduga sering dimodifikasi, dibandingkan dengan apa yang diharapkan dari karakterisasi hanya segmen A mereka (Le Nouen et al., 2006; Jackwood et al., 2011; Wei et al., 2008). Oleh karena itu, identifikasi molekuler isolat IBDV berdasarkan urutan kedua segmen genom sangat disarankan.

 

2. Tes Serologis

 

Sampel darah harus diambil pada awal penyakit, dan sampel ulang harus diambil 3 minggu kemudian. Karena virus menyebar dengan cepat, hanya sebagian kecil dari kawanan yang perlu diambil sampelnya. Biasanya, 20 sampel darah sudah cukup.

 

2.1. Tes Imunodifusi Gel Agar (AGID)

Tes AGID adalah tes serologis yang paling sederhana untuk mendeteksi antibodi spesifik dalam serum.

 

2.1.1. Persiapan Antigen Kontrol Positif

Inokulasi ayam rentan yang berusia 3–5 minggu, melalui tetes mata, dengan homogenat bursae 10% (w/v) yang telah dijernihkan dan diketahui mengandung IBDV hidup. Euthanasi secara manusiawi ayam tersebut 3 hari setelah inokulasi, dan ambil bursae secara aseptik. Buang bursae yang berdarah dan kumpulkan sisanya, timbang, dan tambahkan volume yang setara dengan air suling dingin (atau buffer yang sesuai seperti PBS atau tryptose phosphate broth) dan volume yang setara dengan metilen klorida yang tidak diencerkan. (Perhatian: metilen klorida bersifat toksik dan mungkin karsinogenik. Harus ditangani dan dibuang dengan hati-hati. Alternatif yang mungkin untuk menghindari bahaya kesehatan yang disebabkan oleh metilen klorida adalah menggunakan trikloro-trifluoroetana, yang namun merupakan bahaya lingkungan dan harus ditangani serta dibuang dengan hati-hati). Homogenkan campuran secara menyeluruh dalam blender jaringan dan sentrifugasi pada 2000 g selama 30 menit. Ambil cairan supernatan dan bagi ke dalam aliquot untuk disimpan pada –40°C. Antigen mengandung virus hidup dan hanya boleh ditangani di fasilitas pengamanan yang sesuai seperti kabinet keamanan kelas II. Jika diperlukan, antigen dapat dinonaktifkan sebelum dibagikan: tambahkan 0,3% (v/v) ß-propiolakton ke dalam supernatan yang dipanen, lalu inkubasi lebih lanjut pada suhu 37°C selama 2 jam. Penting untuk memastikan inkubasi dilakukan pada shaker orbital atau rocker mekanik, sehingga bagian dalam vial yang telah bersentuhan dengan virus hidup benar-benar bersentuhan dengan ß-propiolakton. Bagi dan simpan seperti di atas. Periksa efektivitas proses inaktivasi dengan mencoba isolasi IBDV dari antigen yang diinaktivasi, dengan tiga passage berurutan pada telur embrio SAN (lihat Bagian B.1.7 Isolasi virus dalam embrio).

 

2.1.2. Persiapan Antiserum Kontrol Positif

Inokulasi ayam rentan yang berusia 4–5 minggu, melalui tetes mata, dengan 0,05 ml homogenat bursae 10% (w/v) yang telah dijernihkan dan diketahui mengandung IBDV hidup (lihat catatan kaki 2). Lakukan eksangguinasi 28 hari setelah inokulasi. Kumpulkan dan simpan serum dalam aliquot pada –20°C.

 

2.1.3. Persiapan Agar

Larutkan natrium klorida (80 g) dan fenol (5 g) dalam air suling (1 liter) (perhatian: fenol bersifat toksik dan harus ditangani serta dibuang dengan hati-hati). Tambahkan agar (12,5 g) dan kukus hingga agar larut. Untuk menghindari bahaya kesehatan dan lingkungan yang disebabkan oleh penggunaan fenol, resep lain yang sesuai untuk persiapan agar adalah sebagai berikut: natrium klorida (80 g), kalium dihidrogenofosfat (0,45 g), natrium hidrogenofosfat dihidrat (1,19 g), agar (10 g) dan air suling hingga volume akhir 1 liter (pH akhir 7,1 pada suhu 20–25°C). Resep kedua ini dapat dihomogenkan dengan pemanasan hingga 90°C dengan agitasi. Sementara campuran masih sangat panas, saring melalui pad kapas selulosa yang dilapisi beberapa lapisan muslin dan bagi medium ke dalam botol kaca masing-masing 20 ml. Medium tanpa fenol dapat disterilkan lebih lanjut dengan autoklaf pada suhu (paling banyak) 115°C selama 15 menit. Simpan botol pada suhu 4°C hingga siap digunakan.

 

2.1.4. Prosedur Tes

i) Siapkan piringan dari 24 jam hingga 7 hari sebelum digunakan. Larutkan agar dengan meletakkannya dalam pengukus atau bak air mendidih. Hati-hati untuk menghindari air masuk ke dalam botol.

ii) Tuangkan isi satu botol ke dalam setiap piring Petri plastik 9 cm yang diperlukan, ditempatkan di permukaan datar. (Beberapa laboratorium lebih suka menuangkan gel di slide kaca 25 × 75 mm, setebal 3 mm.)

iii) Tutup piring dan biarkan agar mengeras, kemudian simpan piring di suhu 4°C. Piring yang dituangkan dapat disimpan hingga 7 hari pada suhu 4°C. (Jika piring akan digunakan pada hari yang sama dengan penuangannya, keringkan dengan meletakkannya terbuka namun terbalik pada suhu 37°C selama 30 menit hingga 1 jam.)

Catatan:

1. Pola linier dari sumur lebih disukai meskipun pola heksagonal juga dapat digunakan. Setiap serum uji atau bursae uji (T pada Gambar 1 dan 2 di atas) harus ditempatkan berdekatan dengan antibodi kontrol positif (AB) atau antigen (AG), masing-masing.

2.   Sumur, dengan kedalaman 3 mm, diameter 6 mm, dan jarak antar sumur 3 mm (atau sumur dengan ukuran lain yang sebelumnya digunakan terbukti efektif). iv) Buat tiga baris vertikal sumur dengan diameter 6 mm dan jarak 3 mm, menggunakan template dan pemotong tabung. v) Keluarkan agar dari sumur dengan aspirasi atau menggunakan pena dan ujungnya, berhati-hatilah untuk tidak merusak dinding sumur. vi) Menggunakan pipet, teteskan 50 µl serum uji ke dalam sumur seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Atau, untuk deteksi antigen IBDV pada bursae: Teteskan potongan kecil bursae uji yang dicincang halus menggunakan penjepit ujung halus yang melengkung ke dalam sumur, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, untuk mengisi sumur. Sebagai alternatif, eksudat hasil pembekuan-pencairan dari jaringan yang dicincang dapat digunakan untuk mengisi sumur. vii) Teteskan 50 µl reagen kontrol positif dan negatif ke dalam sumur yang relevan. viii) Inkubasi pelat pada suhu antara 22°C hingga 37°C selama maksimal 48 jam dalam ruang lembab untuk menghindari agar menjadi kering. ix) Periksa pelat terhadap latar belakang gelap dengan sumber cahaya miring setelah 24 dan 48 jam.

 

2.1.5. Uji Imunodifusi Agar Gel Kuantitatif

Uji AGID juga dapat digunakan untuk mengukur kadar antibodi dengan menggunakan pengenceran serum pada sumur uji dan mengambil titer sebagai pengenceran tertinggi yang menghasilkan garis presipitasi (Cullen & Wyeth, 1975). Ini bisa berguna untuk mengukur antibodi maternalis atau vaksinasi dan untuk menentukan waktu terbaik untuk vaksinasi; namun, penentuan kuantitatif AGID ini kini sebagian besar telah digantikan oleh ELISA.

 

2.2. Uji Netralisasi Virus

 

Uji VN dilakukan dalam kultur sel. Uji ini lebih memakan waktu dan mahal dibandingkan dengan uji AGID, tetapi lebih sensitif untuk mendeteksi antibodi. Sensitivitas ini tidak diperlukan untuk tujuan diagnostik rutin, tetapi dapat berguna untuk mengevaluasi respons vaksin atau untuk membedakan antara serotipe IBDV 1 dan 2. Uji ini menggunakan sel fibroblas embrio ayam SPF, atau lini sel kontinu yang sesuai (seperti QT35, BGM-70, MA-104, Vero atau DF1), bersama dengan strain IBDV yang telah disesuaikan. Pertama, 0,05 ml virus yang diencerkan dalam medium kultur sel yang mengandung 100 TCID₅₀ (dosis infeksi kultur sel 50%) per 0,05 ml ditempatkan di setiap sumur pada pelat mikrotiter grade kultur sel (Lihat American Association of Avian Pathologists, 2008, untuk metode titrasi virus). Serum uji dipanaskan pada 56°C selama 30 menit untuk inaktivasi. Pengenceran serial ganda dari serum dibuat dalam virus yang telah diencerkan. Setelah 30 menit pada suhu ruang, 0,2 ml suspensi sel, dengan kepadatan sel yang memungkinkan lapisan konfluens setelah 24 jam inkubasi, dispenseskan ke dalam setiap sumur. Pelat disegel dan diinkubasi pada 37°C selama 4–5 hari, setelah itu monolayer diamati secara mikroskopis untuk CPE khas. Titik akhir (titer serum) diekspresikan sebagai kebalikan dari pengenceran serum tertinggi yang tidak menunjukkan CPE. Untuk mengurangi variasi antara uji dan antara operator, antiserum referensi standar dapat disertakan dengan setiap batch uji dan titer suspensi virus harus dievaluasi kembali dalam setiap eksperimen baru dengan menggunakan jumlah pengulangan (sumur) yang cukup per pengenceran virus.

 

2.3. Uji Imunosorben Enzim yang Terikat (ELISA)

 

ELISA digunakan untuk deteksi antibodi terhadap IBD. Penyapuan pelat memerlukan persiapan virus yang telah dimurnikan, atau setidaknya semimurni, yang memerlukan keterampilan dan teknik khusus. Metode untuk persiapan reagen dan penerapan uji telah dijelaskan oleh Marquardt et al. (1980). Kit komersial tersedia. Serum uji diencerkan sesuai dengan protokol yang telah ditetapkan atau petunjuk kit dan masing-masing dispenseskan ke jumlah sumur yang diperlukan. Setelah inkubasi dalam kondisi yang sesuai, serum dibuang dari pelat, dan sumur dibersihkan dengan teliti. Anti-imunoglobulin ayam yang terkonjugasi dengan enzim dispenseskan ke dalam sumur, dan pelat diinkubasi kembali sesuai kebutuhan. Pelat dikosongkan dan dicuci kembali sebelum substrat yang mengandung kromogen yang memberikan perubahan warna saat enzim digunakan ditambahkan ke pelat. Setelah langkah inkubasi terakhir, reaksi substrat/kromogen dihentikan dengan penambahan larutan penghenti yang sesuai dan reaksi warna diukur dengan mengukur kerapatan optik setiap sumur. Rasio Sampel ke Positif (S/P) untuk setiap sampel uji dihitung.

 

2.4. Interpretasi Hasil

 

Uji AGID cukup sensitif, meskipun tidak se-sensitif uji VN; yang terakhir sering memberikan titer ketika uji AGID negatif. Reaksi positif menunjukkan infeksi pada burung yang tidak divaksinasi tanpa antibodi maternalis. Sebagai panduan, reaksi AGID positif pada burung yang telah divaksinasi atau burung muda dengan antibodi maternalis menunjukkan tingkat perlindungan antibodi. ELISA memberikan hasil yang lebih cepat daripada VN atau AGID dan lebih murah dalam hal tenaga kerja, meskipun reagen lebih mahal. Titer VN dan AGID berkorelasi dengan baik, tetapi karena VN lebih sensitif, titer AGID secara proporsional lebih rendah. Korelasi antara ELISA dan VN serta antara ELISA dan AGID lebih bervariasi tergantung pada sumber reagen ELISA, namun perlu diingat bahwa baik VN maupun ELISA sangat sensitif dan dapat terpengaruh oleh variasi intra- dan antar-laboratorium. Oleh karena itu sangat disarankan untuk memperkenalkan serum sentinel positif dengan titer yang diketahui dalam setiap uji di laboratorium yang melakukan uji ELISA atau VN secara rutin (De Wit et al., 2007; Kreider et al., 1991). Saat menguji untuk penurunan antibodi yang diperoleh secara maternalis (MDA), tidak jarang ditemukan antibodi VN sisa pada usia ketika hasil ELISA sudah negatif. Formula telah disusun yang memungkinkan titer ELISA digunakan untuk menghitung usia optimal untuk vaksinasi, yang akan bervariasi tergantung pada vaksin yang digunakan (Block et al., 2007). Reaksi positif nonspesifik mungkin terjadi pada sebagian besar ELISA karena biasanya dirancang untuk memantau respons vaksin, di mana sensitivitas dianggap lebih penting daripada spesifisitas. Hal ini harus dipertimbangkan ketika ELISA digunakan untuk diagnosis. Pada peternakan ayam komersial atau ayam yang terinfeksi secara eksperimental, antigen ELISA serotipe 1 juga mendeteksi antibodi yang diinduksi oleh IBDV serotipe 2 (Ashraf et al., 2006), namun reaktivitas silang ini belum terbukti mengganggu program pemantauan serologis IBD berdasarkan ELISA.

 

C. PERSYARATAN UNTUK VAKSIN

 

1.     Latar Belakang

Pedoman untuk produksi vaksin veteriner diberikan dalam Bab 1.1.8 Prinsip Produksi Vaksin Veteriner. Pedoman yang diberikan di bawah ini dan dalam bab 1.1.8 dimaksudkan untuk bersifat umum dan dapat dilengkapi dengan persyaratan nasional dan regional. Vaksin IBDV telah ditinjau baru-baru ini (Muller et al., 2012). Empat jenis vaksin utama tersedia untuk pengendalian IBD, yaitu: i) vaksin hidup attenuasi; ii) vaksin imun-kompleks; iii) vaksin rekombinan hidup dengan vektor yang mengekspresikan antigen IBDV; dan iv) vaksin inaktivasi dengan adjuvan emulsi minyak. Sampai saat ini, vaksin IBD dibuat hanya dengan IBDV serotipe 1, meskipun virus serotipe 2 telah terdeteksi pada unggas. Virus serotipe 2 tidak dikaitkan dengan penyakit, namun keberadaannya akan merangsang antibodi. Antibodi serotipe 2 tidak memberikan perlindungan terhadap infeksi serotipe 1, begitu juga tidak mengganggu respons terhadap vaksin serotipe 1. Ada banyak deskripsi varian antigen dari virus serotipe 1 (Rosenberger & Cloud, 1986). Studi proteksi silang menunjukkan bahwa vaksin inaktivasi yang disiapkan dari virus serotipe 1 'klasik' memerlukan kandungan antigen yang tinggi untuk memberikan perlindungan yang baik terhadap beberapa varian ini. Vaksin IBD yang mengandung virus IBD serotipe 1 klasik dan varian telah disetujui. Strain vvIBDV dengan perubahan antigen terbatas dibandingkan dengan virus serotipe 1 'klasik' telah muncul sejak 1986. Imunisasi aktif dengan virus serotipe 1 'klasik' atau vaksin memberikan perlindungan yang baik terhadap vvIBDV, namun virus terakhir ini lebih sedikit rentan terhadap netralisasi oleh MDA dibandingkan dengan virus patogen 'klasik' (Van den Berg & Meulemans, 1991).

 

1.1. Vaksin Hidup: Metode Penggunaan

 

Vaksin IBD hidup diproduksi dari strain virus yang sepenuhnya atau sebagian dilemahkan, yang dikenal sebagai ‘ringan’, ‘intermediat’, atau ‘intermediat plus’ (‘panas’), masing-masing. Vaksin ringan atau intermediat digunakan pada induk ayam untuk menghasilkan respons primer sebelum vaksinasi mendekati titik bertelur dengan menggunakan vaksin inaktivasi. Vaksin ini rentan terhadap pengaruh MDA, sehingga hanya harus diberikan setelah semua MDA hilang. Pemberian dilakukan melalui injeksi intramuskular, penyemprotan, atau dalam air minum, biasanya pada usia 8 minggu (Skeeles et al., 1979).

Vaksin intermediat atau intermediat plus digunakan untuk merangsang perlindungan pada ayam pedaging dan pengganti ayam petelur komersial. Beberapa vaksin ini juga digunakan pada induk ayam muda jika ada risiko tinggi infeksi alami dengan IBD virulen. Meskipun vaksin intermediat rentan terhadap keberadaan MDA, vaksin ini terkadang diberikan pada ayam berusia 1 hari, dalam bentuk semprotan kasar, untuk melindungi ayam di dalam kelompok yang mungkin tidak memiliki atau hanya memiliki sedikit MDA. Hal ini juga membentuk reservoir virus vaksin dalam kelompok yang memungkinkan transmisi lateral ke ayam lain ketika MDA mereka menurun. Pemberian dosis kedua dan ketiga biasanya dilakukan, terutama ketika ada risiko tinggi paparan bentuk penyakit yang virulen atau ketika anak ayam yang divaksinasi menunjukkan tingkat MDA yang tidak merata. Waktu pemberian aplikasi tambahan akan bergantung pada titer antibodi induk ayam pada saat telur dikeluarkan. Sebagai panduan, dosis kedua biasanya diberikan pada usia 10–14 hari ketika sekitar 10% dari kelompok rentan terhadap IBD, dan dosis ketiga diberikan 7–10 hari kemudian. Rute pemberian dilakukan melalui penyemprotan atau dalam air minum. Injeksi intramuskular atau tetes mata jarang digunakan. Jika vaksin diberikan dalam air minum, harus digunakan air bersih dengan pH netral yang bebas dari bau atau rasa klorin atau logam. Susu bubuk skim dapat ditambahkan dengan takaran 2 g per liter. Perhatian harus diberikan untuk memastikan semua ayam menerima dosis vaksin mereka. Untuk itu, seluruh air harus dipadamkan (diputus) selama 2–3 jam sebelum vaksin tersedia dan perlu dipastikan tidak ada sisa air yang tertinggal di pipa atau tempat minum. Air yang sudah diberi obat dapat dibagi menjadi dua bagian, dan bagian kedua diberikan 30 menit setelah bagian pertama.

 

Vaksin IBD hidup umumnya dianggap kompatibel dengan vaksin unggas lainnya. Namun, vaksin IBD hidup yang menyebabkan kerusakan bursa dapat mengganggu respons terhadap vaksin lain. Hanya ayam yang sehat yang harus divaksinasi. Vial vaksin harus disimpan pada suhu antara 2°C hingga 8°C hingga saat digunakan.

 

1.2. Vaksin Kompleks Imun: Metode Penggunaan

 

Untuk membuat vaksin IBD kompleks imun, virus vaksin IBDV infeksius hidup dicampurkan dengan antibodi spesifik IBDV. Vaksin seperti ini dapat diberikan di rumah penetasan melalui injeksi in-ovo pada hari ke-18 inkubasi. Telur kemudian menetas, dan virus vaksin diharapkan dilepaskan ketika anak ayam berusia sekitar 7–14 hari. Dengan cara ini, masalah antibodi IBD yang diturunkan dari induk dapat diatasi dan anak ayam akan efektif terimunisasi (Haddad et al., 1997). Vaksin kompleks imun juga dapat disuntikkan secara subkutan pada ayam berusia 1 hari di rumah penetasan (Ivan et al., 2005).

 

1.3. Vaksin Vektor Rekombinan Hidup: Metode Penggunaan

 

Vaksin rekombinan hidup yang menggunakan vektor virus (virus herpes kalkun) untuk mengekspresikan antigen VP2 dari IBDV pada ayam telah dikembangkan untuk penggunaan in-ovo atau pada ayam berusia satu hari dan saat ini telah disetujui di banyak negara di seluruh dunia. Aktivitas terhadap antibodi IBD yang diturunkan dari induk, dan kompatibilitas dengan vaksin penyakit Marek telah terdokumentasi (Le Gros et al., 2009, Lemiere et al., 2011). Respons antibodi anti-IBDV yang dipicu oleh vaksin IBDV rekombinan hidup yang mengekspresikan protein VP2 akan mengandung antibodi yang diarahkan hanya terhadap VP2 (berbeda dengan antibodi terhadap semua protein IBDV, terutama VP2 dan VP3, setelah infeksi oleh IBDV hidup). Sementara antibodi netralisasi terhadap protein VP2 akan terdeteksi dengan mudah dalam tes VN standar, deteksi respons antibodi spesifik VP2 dalam ELISA mungkin memerlukan kit khusus dengan sensitivitas yang lebih tinggi. Antibodi terhadap VP3 tidak ada pada ayam yang menerima vaksin IBDV rekombinan hidup, tetapi ada pada ayam yang terinfeksi IBDV hidup. Oleh karena itu, penggunaan bersama ELISA spesifik untuk antibodi anti-VP2 atau anti-VP3 akan memungkinkan penerapan strategi DIVA (deteksi infeksi pada hewan yang divaksinasi) pada ayam yang divaksinasi dengan vaksin rekombinan tersebut (Muller et al., 2012).

 

1.4. Vaksin Inaktivasi: Metode Penggunaan

 

Vaksin IBD inaktivasi sebagian besar digunakan untuk menghasilkan tingkat antibodi yang tinggi, tahan lama, dan seragam pada induk ayam yang sebelumnya telah diimunisasi dengan vaksin hidup atau dengan paparan alami terhadap virus lapangan selama pemeliharaan (Muller et al., 2012). Program yang biasa dilakukan adalah memberikan vaksin hidup pada usia sekitar 8 minggu. Ini diikuti dengan pemberian vaksin inaktivasi pada usia 16–20 minggu. Terkadang, vaksin inaktivasi digunakan dalam program yang menggabungkan vaksin inaktivasi dan vaksin hidup, pada ayam muda yang berharga dengan tingkat MDA tinggi yang dipelihara di daerah dengan risiko tinggi paparan terhadap IBDV virulen. Vaksin inaktivasi dibuat dalam bentuk emulsi air-dalam-minyak, dan harus disuntikkan ke setiap ayam. Rute pemberian yang disarankan adalah intramuskular pada otot kaki, menghindari dekat dengan sendi, tendon, atau pembuluh darah utama, atau secara subkutan. Syringe multi dosis dapat digunakan. Semua peralatan harus dibersihkan dan disterilkan antara kelompok, dan tim vaksinasi harus menjaga kebersihan yang ketat saat berpindah dari satu kelompok ke kelompok lain. Vaksin harus disimpan pada suhu antara 2°C hingga 8°C. Vaksin tidak boleh dibekukan atau terpapar cahaya terang atau suhu tinggi.

 

Hanya ayam sehat, yang telah sensitif akibat paparan sebelumnya terhadap IBDV, yang harus divaksinasi. Jika digunakan dengan cara ini, vaksin harus menghasilkan respons antibodi yang baik sehingga ayam yang menetas dari induk tersebut akan memiliki perlindungan pasif terhadap IBD hingga sekitar usia 30 hari (Wyeth & Cullen, 1979). Ini mencakup periode yang paling rentan terhadap penyakit dan mencegah kerusakan bursa pada saat yang dapat menyebabkan imunodefisiensi. Telah terbukti bahwa kerusakan bursa yang terjadi setelah usia 15 hari memiliki sedikit efek pada imunokompetensi karena pada saat itu sel imunokompeten telah bermigrasi ke jaringan limfoid perifer. Namun, jika ada ancaman paparan terhadap infeksi IBDV yang sangat virulen, vaksin hidup harus diterapkan seperti yang dijelaskan di atas. Tingkat dan durasi kekebalan yang diberikan oleh vaksin IBD inaktivasi akan bergantung pada konsentrasi antigen per dosis. Tujuan produksi vaksin adalah untuk memperoleh konsentrasi antigen yang tinggi dan dengan demikian vaksin yang sangat potent.

 

Vaksin Subunit, di mana antigen IBDV utuh yang diinaktivasi yang digunakan dalam vaksin inaktif digantikan dengan VP2 rekombinan yang diekspresikan baik dalam sistem baculovirus, Escherichia coli, atau ragi Pichia pastoris (Pitcovski et al., 2003), telah dijelaskan. Sama seperti vaksin inaktif, vaksin subunit juga memerlukan injeksi dan menghasilkan imunisasi yang lebih baik jika i) kandungan antigennya tinggi dan ii) diberikan sebagai penguat pada burung yang sebelumnya telah dipersiapkan dengan vaksin hidup (Muller et al., 2012).

 

2. Garis Besar Produksi dan Persyaratan Minimum untuk Vaksin

 

2.1. Karakteristik Benih

Lihat juga Bab 1.1.8 Prinsip Produksi Vaksin Veteriner dan Bab 1.1.9 Uji Sterilitas dan Kebebasan dari Kontaminasi Bahan Biologis yang Dimaksudkan untuk Penggunaan Veteriner.

 

2.1.1. Karakteristik Biologis dari Benih Utama

 

i) Vaksin Hidup

Strain virus yang digunakan dalam vaksin IBD hidup terkadang disebut sebagai "ringan", "intermediat", dan "intermediate plus" / "invasif" / "panas" tergantung pada kemampuan mereka untuk berkembang biak meskipun ada peningkatan jumlah antibodi anti-IBDV yang diturunkan secara maternally. Sesuai dengan kemampuan replikasi strain vaksin yang paling tidak terattenuasi, strain ini biasanya menyebabkan lesi bursa yang lebih parah yang diinduksi oleh vaksin (lesi mikroskopis dan ukuran bursa yang lebih kecil) dan dapat menunjukkan beberapa tingkat sifat imunosupresif residu (lihat Bagian C.2.1.3 Validasi sebagai Strain Vaksin).

 

ii) Vaksin Inaktif

Subtipe telah dilaporkan pada serotipe 1 IBDV, dan telah dibuktikan bahwa perlindungan terhadap subtipe tertentu menggunakan vaksin inaktif memerlukan antigen homolog atau kandungan antigen yang tinggi. Oleh karena itu, informasi mengenai subtipe strain yang digunakan sebagai antigen dalam vaksin inaktif mungkin akan sangat membantu.

 

2.1.2. Kriteria Kualitas

 

i) Kemurnian

Virus benih harus dibuktikan bebas dari virus eksternal, bakteri, mikoplasma, dan jamur, terutama patogen avian. Ini termasuk kebebasan dari kontaminasi dengan strain lain dari IBDV.

 

ii) Tidak Terjadinya Kembali ke Virulensi dari Vaksin Hidup

Untuk strain vaksin yang mengklaim sebagai terattenuasi dan memiliki sifat imunosupresif yang terbatas, virus benih harus dibuktikan stabil, tanpa kecenderungan untuk kembali ke virulensi. Ini dapat dikonfirmasi dengan melakukan passage berurutan melalui lima kelompok ayam SPF, pada interval 3 hingga 4 hari menggunakan suspensi bursa sebagai inokulum, pada ayam SPF dengan usia minimum yang direkomendasikan untuk vaksinasi. Harus dibuktikan bahwa virus ditularkan: jika virus pada tingkat pasase tidak ditemukan, pasase harus diulang dengan memberikan kepada sekelompok 10 ayam. Perbandingan histologis dilakukan untuk menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan antara bursa dari ayam yang diinokulasi dengan bahan pasase awal dan akhir. Penilaian bursa (Muskett et al., 1979) dan teknik pencitraan telah dikembangkan.

 

2.1.3. Validasi sebagai Strain Vaksin

 

i) Vaksin Hidup

Validasi strain IBDV sebagai vaksin hidup memerlukan evaluasi terhadap keamanannya, potensi imunosupresif, tidak adanya potensi kembali ke virulensi, dan imunogenitasnya.

 

Keamanan dapat diuji dengan beberapa cara. Beberapa negara merekomendasikan vaksinasi ayam SPF pada usia termuda yang direkomendasikan untuk vaksinasi menggunakan dosis tinggi (biasanya sepuluh kali lipat) dari vaksin pada tingkat passage yang paling tidak terattenuasi, kemudian memeriksa tidak adanya tanda-tanda dan biasanya lesi bursa yang moderat dan sementara setelah vaksinasi ini. Tidak ada laporan yang mendokumentasikan keamanan vaksin IBDV pada spesies non-target.

 

Potensi imunosupresif adalah karakteristik penting untuk dinilai, karena virus vaksin seharusnya tidak menyebabkan kerusakan pada bursa Fabricius yang dapat menyebabkan imunodisupresi pada burung yang rentan. Vaksin hidup tipe 'intermediate' atau 'intermediate plus' dapat disetujui meskipun dapat menyebabkan imunodisupresi. Protokol yang mungkin untuk penilaian eksperimental terhadap imunodisupresi adalah sebagai berikut: vaksin IBD diberikan melalui injeksi atau tetes mata, satu dosis lapangan per burung, kepada masing-masing 10 ayam SPF, pada usia 1 hari. Dua kelompok lainnya dari 10 burung dengan usia dan sumber yang sama dipelihara terpisah sebagai kontrol. Pada usia 2 minggu, setiap burung dalam kelompok yang divaksinasi IBDV dan pada salah satu kelompok kontrol diberikan satu dosis lapangan vaksin ND hidup melalui tetes mata. Sebagai alternatif, vaksin IBDV dapat diberikan pada usia minimum yang direkomendasikan untuk vaksinasi, dan vaksin ND pada waktu ketika lesi bursa yang diinduksi oleh vaksin IBDV mencapai puncaknya. Respons hemagglutinin inhibisi (HI) dari setiap burung terhadap vaksin ND diukur 2 minggu setelah pemberian vaksin ND, dan perlindungannya diukur terhadap tantangan dengan 10^5,0 hingga 10^6,5 ELD₅₀ (50% dosis embrio mematikan) strain Herts 33/56 (atau yang serupa) dari virus ND (NDV) (kelompok kontrol kedua, yang tidak diberikan vaksin IBDV atau NDV, digunakan pada tahap ini untuk memvalidasi tingkat tantangan NDV). Vaksin IBD gagal tes ini jika respons HI dan perlindungan yang diberikan oleh vaksin ND lebih rendah secara signifikan pada kelompok yang diberikan vaksin IBD dibandingkan dengan kelompok kontrol. Di negara-negara tempat NDV adalah eksotis, alternatifnya adalah menggunakan eritrosit domba atau antigen Brucella abortus yang dibunuh sebagai antigen uji, dengan mengukur respons menggunakan uji hemaglutinasi atau uji aglutinasi serum, masing-masing. Namun, vaksin hidup lain adalah sistem uji yang lebih disukai karena juga mengevaluasi kekebalan seluler.

Ketiadaan Potensi Kembali Menjadi Virulen pada Strain Vaksin

Potensi kembalinya strain vaksin menjadi virulen dapat dievaluasi seperti yang dijelaskan (lihat Bagian C.2.1.2. ii Ketiadaan Kembali Menjadi Virulen pada Vaksin Hidup).

 

a) Imunogenisitas

Vaksin harus diberikan kepada burung dengan cara yang akan digunakan di lapangan. Vaksin hidup dapat diberikan kepada burung muda dan responsnya diukur secara serologis serta dengan ketahanan terhadap tantangan eksperimental: berikan satu dosis vaksin dengan titer minimum yang disarankan kepada masing-masing dari 20 ayam SPF yang berumur minimal sesuai usia vaksinasi. Inokulasi dilakukan pada kelompok terpisah untuk setiap jalur aplikasi yang disarankan. Biarkan 20 ayam dari kelompok yang sama sebagai kontrol yang tidak diinokulasi. Setelah 14 hari, tantang setiap ayam dengan tetes mata menggunakan sekitar 100 CID₅₀ (50% dosis infeksi ayam) dari strain virulen IBDV yang disarankan oleh salah satu Laboratorium Referensi WOAH untuk IBD4. Amati ayam setiap hari selama 10 hari. Catat jumlah ayam yang mati atau menunjukkan tanda-tanda IBD. Lakukan pemeriksaan histologi pada bursa ayam yang bertahan hidup pada hari ke-10. Vaksin gagal dalam uji ini kecuali jika setidaknya 90% ayam yang divaksinasi bertahan hidup tanpa menunjukkan tanda-tanda klinis atau lesi berat pada bursa Fabricius pada akhir periode observasi. Jika lebih dari setengah kontrol tidak menunjukkan tanda IBD, atau satu atau lebih ayam kontrol tidak menunjukkan lesi berat pada bursa Fabricius, atau ayam kontrol atau yang diinokulasi mati karena sebab yang tidak terkait dengan uji, maka uji ini dianggap tidak sah. Lesi dianggap berat jika setidaknya 90% folikel menunjukkan pengurangan lebih dari 75% limfosit, atau jika setidaknya 51% folikel bursa menunjukkan skor histopatologi 3 atau lebih menurut Farmakope Eropa (2014).

 

ii) Vaksin Inaktif

 

Validasi vaksin IBDV inaktif memerlukan evaluasi terhadap keamanan dan imunogenisitasnya.

 

Keamanan vaksin inaktif harus diuji untuk semua jalur administrasi yang disarankan dan dengan batch vaksin yang aktivitasnya setidaknya setara dengan aktivitas maksimal dari batch komersial mendatang. Satu dosis, atau dua dosis untuk memastikan aktivitas maksimal, vaksin diberikan kepada ayam SAN atau SPF. Tanda-tanda klinis pada ayam yang divaksinasi diperiksa setiap hari selama 14 hari. Vaksin dinyatakan lolos uji jika tidak ditemukan tanda-tanda dan tidak ada kematian yang dapat dikaitkan dengan vaksin. Uji dianggap tidak sah jika terjadi kematian tidak spesifik.

 

Efikasi vaksin IBD inaktif harus dievaluasi pada ayam dewasa yang sudah mulai bertelur, menggunakan jadwal vaksinasi yang disarankan, sehingga keturunannya dapat diuji untuk menentukan ketahanan terhadap MDA pada awal dan akhir masa bertelur.

 

Setidaknya 20 ayam SPF yang belum divaksin diberikan satu dosis vaksin pada usia yang disarankan (mendekati titik bertelur) dan melalui setidaknya salah satu jalur yang disarankan; prosedur alternatif yang disarankan adalah menguji satu dosis vaksin pada jalur-jalur yang tercantum pada label, menggunakan 20 ayam SPF yang belum divaksin untuk setiap jalur. Respons antibodi diukur antara 4 hingga 6 minggu setelah vaksinasi dengan netralisasi serum menggunakan antiserum standar[5].

 

Telur dikumpulkan untuk penetasan 5–7 minggu setelah vaksinasi, dan 25 ayam keturunan kemudian ditantang pada usia 3 minggu dengan tetes mata menggunakan sekitar 100 CID50 dari strain IBDV virulen yang diakui. Sepuluh ayam kontrol dari jenis yang sama namun berasal dari orang tua yang tidak divaksin juga ditantang. Perlindungan dinilai 3–4 hari setelah tantangan dengan mengeluarkan bursa Fabricius dari setiap ayam; setiap bursa kemudian dilakukan pemeriksaan histologi atau diuji keberadaan antigen IBD dengan uji presipitasi agar gel. Tidak lebih dari tiga ayam dari orang tua yang divaksinasi yang harus menunjukkan bukti infeksi IBD, sedangkan semua ayam dari orang tua yang tidak divaksin harus terinfeksi.

 

Prosedur-prosedur ini dapat diulang pada akhir periode bertelur ketika ayam yang divaksinasi berusia minimal 60 minggu, namun pada kesempatan ini, tantangan terhadap keturunannya harus dilakukan ketika mereka berusia 15 hari.

 

Jika vaksin inaktif dimaksudkan untuk digunakan sebagai penguat setelah vaksinasi primer, uji efikasi harus diulang pada ayam yang telah dipriming dan divaksinasi sesuai jadwal yang disarankan. Dosis akhir vaksin inaktif diberikan pada usia yang paling awal yang disarankan. Ayam yang menetas dari telur fertil yang dikumpulkan pada awal dan akhir masa bertelur diuji untuk perlindungan terhadap tantangan seperti yang dijelaskan di atas.

 

2.2. Metode Pembuatan

 

2.2.1. Prosedur

Virus benih dapat diperbanyak dalam berbagai sistem kultur, seperti fibroblas embrio ayam SPF, atau embrio ayam. Dalam beberapa kasus, perbanyakan di bursa dapat digunakan. Massa virus dibagi dalam aliklot dan dikeringkan dengan pembekuan dalam wadah yang tertutup rapat. Ada klaim bahwa vaksin yang berasal dari bursa lebih baik sebagai imunogen dibandingkan dengan vaksin yang diperoleh dari kultur jaringan. Dalam studi yang terkontrol, disimpulkan bahwa kedua jenis virus, ketika disertakan dengan massa antigen yang serupa dalam vaksin inaktif, menghasilkan respons imun yang serupa; oleh karena itu, standarisasi massa antigen dalam vaksin inaktif tampaknya diinginkan (Maas et al., 2004).

Vaksin harus diproduksi di fasilitas yang bersih dan aman, terpisah dengan baik dari fasilitas diagnostik atau peternakan komersial.

 

Produksi vaksin harus dilakukan dengan sistem lot-benih menggunakan strain virus yang sesuai dengan asal dan riwayat passage yang diketahui. Vaksin hidup dibuat dengan pertumbuhan dalam telur atau kultur sel. Vaksin IBD inaktif dapat dibuat dengan menggunakan virus virulen yang tumbuh di bursa ayam muda, atau dengan menggunakan strain IBDV yang dilemahkan dan disesuaikan di laboratorium yang tumbuh dalam kultur sel atau telur embrionasi. Konsentrasi virus yang tinggi diperlukan. Vaksin inaktif dapat disiapkan dalam berbagai jenis emulsi. Formulasi air-dalam-minyak yang khas adalah dengan menggunakan 80% minyak mineral dan 20% suspensi material bursa dalam air, dengan agen emulsifier yang sesuai, namun vaksin yang disiapkan sebagai emulsi ganda atau mikro-emulsi juga ada.

 

2.2.2 Persyaratan untuk Bahan-bahan

i) Bahan asal hewan

Semua bahan asal hewan, termasuk serum dan sel, harus diperiksa untuk adanya bakteri, virus, jamur, atau mikoplasma yang masih hidup. Bahan asal hewan sebaiknya diperoleh dari negara yang memiliki risiko yang sangat rendah terhadap encephalopathy spongiform transmissible (TSE).

Telur SPF harus digunakan untuk semua bahan yang digunakan dalam perbanyakan dan pengujian vaksin.

 

ii) Pengawet

Pengawet mungkin diperlukan untuk vaksin dalam wadah multidose. Konsentrasi pengawet dalam vaksin akhir dan efektivitasnya hingga akhir masa simpan harus diperiksa. Pengawet yang sesuai yang sudah terbukti efektif untuk tujuan tersebut harus digunakan.

 

2.2.3. Kontrol Proses

 

i) Kandungan antigen

Setelah virus tumbuh hingga konsentrasi tinggi, titer virus tersebut harus diuji menggunakan kultur sel, embrio, atau ayam, sesuai dengan jenis virus yang digunakan. Kandungan antigen yang diperlukan untuk menghasilkan batch vaksin yang memadai harus didasarkan pada penentuan yang dilakukan pada vaksin uji yang telah terbukti aman dan efektif dalam uji laboratorium dan uji lapangan.

 

ii) Inaktivasi vaksin inaktif

Proses ini sering dilakukan dengan menggunakan ß-propiolactone atau formalin. Agen inaktivasi dan prosedur inaktivasi harus dibuktikan dalam kondisi pembuatan vaksin untuk menginaktivasi virus vaksin dan potensi kontaminan, misalnya bakteri, yang mungkin muncul dari bahan baku. Sebelum inaktivasi, perhatian harus diberikan untuk memastikan suspensi yang homogen bebas dari partikel yang mungkin tidak dapat ditembus oleh agen inaktivasi. Uji inaktivasi vaksin harus dilakukan pada setiap batch, baik pada hasil panen massal setelah inaktivasi maupun produk akhir. Pendekatan alternatif adalah menguji inaktivasi pada hasil panen akhir atau massal, namun tidak keduanya. Uji yang dipilih harus sesuai dengan virus vaksin yang digunakan dan harus terdiri dari setidaknya dua passage dalam kultur sel yang rentan, embrio, atau ayam, dengan sepuluh replikasi per passage. Tidak ada bukti keberadaan virus hidup atau mikroorganisme yang terdeteksi.

 

iii) Sterilitas vaksin inaktif

Minyak yang digunakan dalam vaksin harus disterilisasi dengan pemanasan pada suhu 160°C selama 1 jam, atau dengan filtrasi, dan prosedur tersebut harus dibuktikan efektif. Uji yang sesuai untuk vaksin emulsi minyak dilakukan pada setiap batch vaksin akhir seperti yang dijelaskan, misalnya dalam European Pharmacopoeia (2014) atau dalam Title 9, Code of Federal Regulations (9-CFR), bagian 113.26.

 

2.2.4. Uji batch produk akhir

 

i) Identitas

Identitas vaksin IBD hidup dapat dikonfirmasi pada tingkat batch dengan menginkubasi pengenceran vaksin yang sesuai dengan antiserum monospecific anti-IBDV yang menetralkan serotipe 1 IBDV, kemudian menginokulasi campuran tersebut ke telur SAN atau SPF yang rentan atau kultur sel yang rentan. Vaksin yang dinetralkan tidak boleh menunjukkan infektivitas. Identitas vaksin IBD inaktif dapat dikonfirmasi pada tingkat batch dengan memberikan vaksin kepada ayam SAN atau SPF, dan membuktikan bahwa vaksin tersebut menghasilkan antibodi yang menetralkan serotipe 1 IBDV. Dalam beberapa kasus, uji ini dapat digabungkan dengan uji potensi untuk mengurangi jumlah hewan yang digunakan dalam percobaan.

 

ii) Sterilitas dan ketidakadaan agen asing

Uji untuk sterilitas dan kebebasan dari kontaminasi bahan biologis oleh bakteri, jamur, mikoplasma, dan agen asing dijelaskan dalam Chapter 2.3.4 Minimum requirements for the production and quality control of vaccines.

 

iii) Keamanan

 

a) Uji keamanan vaksin hidup

Sepuluh dosis lapangan vaksin diberikan dengan tetes mata kepada masing-masing 15 ayam SPF yang berusia minimum yang direkomendasikan untuk vaksinasi dan tidak lebih dari 2 minggu. Ayam-ayam tersebut diamati selama 21 hari. Jika lebih dari dua ayam mati karena penyebab yang tidak terkait dengan vaksin, uji harus diulang. Vaksin dianggap gagal jika ada ayam yang mati atau menunjukkan tanda-tanda penyakit yang disebabkan oleh vaksin. Uji ini dilakukan pada setiap batch vaksin akhir, kecuali jika kontrol pada tahap produksi sebelumnya yang dilengkapi dengan penerapan GMP mendukung keamanan proses secara keseluruhan. Uji keamanan alternatif dapat digunakan sebagaimana dijelaskan dalam 9-CFR 113.212(d)(1) dan 113.331(d)(2).

 

b) Agen asing pada vaksin inaktif

Sepuluh hingga dua puluh satu ayam SPF, berusia 14–28 hari, diinokulasi dengan rute yang direkomendasikan menggunakan dosis yang direkomendasikan atau dua kali dosis lapangan. Ayam-ayam tersebut diamati selama 3 minggu. Tidak boleh ada reaksi lokal atau sistemik yang abnormal. Tidak ada antibodi terhadap patogen unggas lain selain antigen vaksin yang boleh terbentuk. Uji ini dilakukan pada setiap batch vaksin akhir, kecuali jika kontrol pada tahap produksi sebelumnya yang dilengkapi dengan penerapan praktik manufaktur yang baik mendukung keamanan proses secara keseluruhan.

 

iv) Vaksin hidup sisa dalam vaksin inaktif

Proses yang dijelaskan dalam Section C.2.2.3 In process controls dapat dilakukan pada setiap batch produk akhir.

 

v) Potensi

 

a) Uji potensi vaksin hidup

Uji potensi (titrasi virus) pada telur atau kultur sel harus dilakukan pada setiap serial (batch) vaksin yang diproduksi. Selain itu, metode yang dijelaskan dalam Section C 2.1.3.i.a Immunogenicity harus digunakan dan memberikan hasil yang memadai pada satu batch yang representatif dari semua batch yang disiapkan dari lot benih yang sama.

 

b) Uji potensi vaksin inaktif

Sepuluh ayam SPF, berusia sekitar 4 minggu, masing-masing divaksinasi dengan satu dosis vaksin yang diberikan melalui rute yang direkomendasikan. Sepuluh ayam kontrol tambahan dari sumber dan usia yang sama dipelihara bersama dengan ayam yang divaksinasi. Respon antibodi masing-masing ayam ditentukan 4–6 minggu setelah vaksinasi dalam uji VN dengan merujuk pada antiserum standar. Rata-rata tingkat antibodi ayam yang divaksinasi tidak boleh lebih rendah secara signifikan daripada tingkat yang tercatat dalam uji perlindungan (lihat Section C.2.1.3.ii.a Immunogenicity). Tidak ada antibodi yang boleh terdeteksi pada ayam kontrol. Uji ini harus dilakukan pada setiap batch vaksin akhir. Sebagai alternatif, uji potensi vaksinasi tantangan dapat digunakan (9-CFR 113.212(d)(2)).

 

2.3. Persyaratan untuk otorisasi/pendaftaran/izin

 

2.3.1. Proses pembuatan

Untuk pendaftaran vaksin, semua rincian relevan mengenai pembuatan vaksin dan uji kontrol kualitas (lihat Section C.2.1 Characteristics of the seed dan C.2.2 Methods of manufacture) harus diserahkan kepada pihak berwenang. Informasi ini harus diberikan dari tiga batch vaksin berturut-turut dengan volume tidak kurang dari 1/3 dari volume batch industri yang khas.

 

2.3.2. Persyaratan keamanan

i) Keamanan hewan sasaran dan non-sasaran

Vaksin IBD yang dilemahkan hidup dengan kemampuan replikasi tertinggi dan potensi untuk menyebabkan defisiensi limfoid pada bursa biasanya diotorisasi untuk digunakan pada hewan dengan titer antibodi anti-IBDV yang berasal dari induk yang tinggi dan pada tempat yang memiliki tekanan infeksi tinggi dari virus patogenik. Informasi ini harus dicantumkan jika relevan dalam petunjuk penggunaan vaksin.

Tidak ada interaksi vaksin IBD hidup dengan spesies burung non-sasaran yang terdeteksi hingga saat ini. Setiap informasi terkait dampak negatif pada spesies hewan non-sasaran harus diberikan dalam petunjuk penggunaan vaksin.

 

ii) Reversi ke virulensi untuk vaksin dilemahkan/hidup dan pertimbangan lingkungan

Sangat penting bahwa potensi vaksin IBD yang dilemahkan hidup untuk kembali ke virulensi dievaluasi sebelum persetujuan regulasi (lihat Section C.2.1.2.ii di atas). Pertimbangan lingkungan yang perlu diperhitungkan dalam proses persetujuan regulasi meliputi pengetahuan tentang strain IBDV yang beredar di area tempat vaksin yang disetujui akan digunakan, karena pengetahuan ini dapat membantu i) dalam memilih vaksin yang sesuai untuk mengendalikan strain-strain tersebut dan ii) dalam memutuskan apakah diperbolehkan atau tidak memperkenalkan strain vaksin IBDV yang dilemahkan hidup yang mungkin sangat berbeda dengan strain IBDV lokal.

 

iii) Langkah-langkah pencegahan (bahaya)

Vaksin emulsi minyak dapat menyebabkan cedera serius pada pemberi vaksin jika secara tidak sengaja disuntikkan ke tangan atau jaringan lainnya. Jika terjadi kecelakaan seperti itu, orang tersebut harus segera pergi ke rumah sakit dengan membawa paket vaksin. Setiap botol dan kemasan vaksin harus diberi tanda yang jelas mengenai akibat serius dari cedera diri secara tidak sengaja. Luka tersebut harus ditangani oleh dokter yang menangani kecelakaan sebagai ‘cedera senapan pelumas’.

 

2.3.3. Persyaratan Efikasi

 Uji coba, model tantangan, dan kriteria yang digunakan untuk menilai efikasi vaksin IBD dijelaskan pada Bagian C.2.1.3.i Vaksin hidup dan C.2.1.3.ii Vaksin inaktif. Ketika menilai efikasi dalam model tantangan IBDV, disarankan agar virus tantangan yang dipilih mewakili strain IBDV kontemporer yang beredar di wilayah tempat vaksin yang diotorisasi akan digunakan.

 

2.3.4. Vaksin dengan Strategi DIVA

Di antara vaksin yang tersedia secara komersial saat ini, vaksin rekombinan hidup berbasis vektor yang mengekspresikan protein VP2 IBDV, serta vaksin subunit yang mengandung protein VP2 sebagai satu-satunya antigen IBDV, memiliki potensi untuk digunakan dalam strategi DIVA. Ayam yang divaksinasi dengan vaksin semacam itu hanya akan mengembangkan antibodi anti-VP2, sedangkan ayam yang terinfeksi IBDV akan menunjukkan respons antibodi yang lebih luas terhadap semua antigen IBDV, termasuk protein VP3 (ribonukleoprotein IBDV). Berdasarkan keberadaan hanya antibodi anti-VP2, atau keberadaan baik antibodi anti-VP2 maupun anti-VP3, secara teori dimungkinkan untuk membedakan ayam yang hanya menerima vaksin tersebut dari ayam yang terinfeksi. Namun, implementasi strategi DIVA memerlukan ELISA yang memungkinkan studi diferensial dari kedua jenis respons antibodi ini. Meskipun ELISA komersial dapat menunjukkan sensitivitas yang berbeda terhadap jenis antibodi ini, validasi uji komersial untuk tujuan tersebut belum dilaporkan dalam literatur ilmiah.

 

2.3.5. Durasi Kekebalan

Sebagaimana dijelaskan di atas (lihat Bagian C.2.1.3.ii Vaksin inaktif), pengulangan evaluasi efikasi vaksin inaktif pada ayam petelur, baik di awal masa bertelur maupun di akhir periode bertelur, dapat membantu menilai apakah perlindungan yang diperpanjang untuk keturunan memerlukan pelaksanaan vaksinasi booster selama periode bertelur.

 

2.3.6. Stabilitas

Bukti harus disediakan dari tiga batch vaksin yang menunjukkan bahwa vaksin tersebut lulus uji potensi batch pada umur simpan yang diminta atau, sebagai alternatif, hingga 3 bulan setelahnya.

 

REFERENSI

1.       ALFONSO-MORALES A., RIOS L., MARTÍNEZ-PÉREZ O., DOLZ R.,VALLE R., PERERA C.L., BERTRAN K., FRÍAS M.T., GANGES L., DÍAZ DE ARCE H., MAJÓ N., NÚÑEZ J.I. & PÉREZ L.J. (2015). Evaluation of a Phylogenetic Marker Based on Genomic Segment B of Infectious Bursal Disease Virus: Facilitating a Feasible Incorporation of this Segment to the Molecular Epidemiology Studies for this Viral Agent. PLoS One, 10(5):e0125853.

2.       AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATHOLOGISTS (2008). Chapter 43. In: Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fifth Edition. AAAP, University of Pennsylvania, New Bolton Center, Kenneth Square, PA 19348-1692, USA.

3.       ASHRAF S., ABDEL-ALIM G. & SAIF Y.M. (2006). Detection of antibodies against serotypes 1 and 2 infectious bursal disease virus by commercial ELISA kits. Avian Dis.,50, 104–109.

4.       BLOCK H., MEYER-BLOCK K., REBESKI D.E., SCHARR H., DE WIT S., ROHN K. & RAUTENSCHLEIN S. (2007). A field study on the significance of vaccination against infectious bursal disease virus (IBDV) at the optimal time point in broiler flocks with maternally derived IBDV antibodies. Avian Pathol., 36, 401–409.

5.       BROWN M.D., GREEN P. & SKINNER M.A. (1994). VP2 sequences of recent European ‘very virulent’ isolates of infectious bursal disease virus are closely related to each other but are distinct from those of ‘classical strains’. J. Gen. Virol., 75, 675–680.

6.       BOOT H.J., TER HUURNE A.A., HOEKMAN A.J., PEETERS B.P., & GIELKENS A.L. (2000). Rescue of very virulent and mosaic infectious bursal disease virus from cloned cDNA: VP2 is not the sole determinant of the very virulent phenotype. J. Virol., 74, 6701–6711.

7.       COULIBALY F., CHEVALIER C., GUTSCHE I., POUS J., NAVAZA J. BRESSANELLI S., DELMAS B. & REY F.A. (2005) The birnavirus crystal structure reveals structural relationships among icosahedral viruses. Cell, 120, 761–772.

8.       CULLEN G.A. & WYETH P.J. (1975). Quantitation of antibodies to infectious bursal disease. Vet. Rec., 97, 315.

9.       DE WIT J.J., VAN DE SANDE H.W., COUNOTTE G.H. & WELLENBERG G.J. (2007) Analyses of the results of different test systems in the 2005 global proficiency testing schemes for infectious bursal disease virus and Newcastle disease virus antibody detection in chicken serum. Avian Pathol., 36, 177–183.

10.  ESCAFFRE O., LE NOUËN C., AMELOT M., AMBROGGIO X., OGDEN K.M., GUIONIE O., TOQUIN D., MÜLLER H., ISLAM M.R. & ETERRADOSSI N. (2013). Both genome segments contribute to the pathogenicity of very virulent infectious bursal disease virus. J. Virol., 87, 2767–2780.

11.  ETERRADOSSI N., ARNAULD C., TEKAIA F., TOQUIN D., LE COQ H., RIVALLAN G., GUITTET M., DOMENECH J., VAN DEN BERG T.P. & SKINNER M.A. (1999). Antigenic and genetic relationships between European very virulent infectious bursal disease viruses and an early West African isolate. Avian Pathol., 28, 36–46.

12.  ETERRADOSSI N., ARNAULD C., TOQUIN D. & RIVALLAN G. (1998). Critical amino acid changes in VP2 variable domain are associated with typical and atypical antigenicity in very virulent infectious bursal disease viruses. Arch. Virol., 143, 1627–1636.

13.  ETERRADOSSI N. & SAIF Y.M. (2013 2020). Chapter 7: Infectious bursal disease. In: Diseases of Poultry, 13th 14th Edition, Editor in chief D.E. Swayne, John Wiley & Sons Inc., Ames, Iowa Hoboken, NJ, USA, pp 219–246 257–283.

14.  EUROPEAN PHARMACOPOEIA 8.2. (2014). European Directorate for the Quality of Medicines and Health Care (EDQM), Council of Europe, Strasbourg, France. Available online at http://online.edqm.eu/.

15.  HADDAD E.E., WHITFILL C.E., AVAKIAN A.P., RICKS C.A., ANDREWS P.D., THOMA J.A. & WAKENELL P.S. (1997). Efficacy of a novel infectious bursal disease virus immune complex vaccine in broiler chickens. Avian Dis., 41, 882–889.

16.  IVAN J., VELHNER M., URSU K., GERMAN P., MATÓ T., DRÉN C.N. & MÉSZÁROS J. (2005). Delayed vaccine virus replication in chickens vaccinated subcutaneously with an immune complex infectious bursal disease vaccine: quantification of vaccine virus by real-time polymerase chain reaction. Can. J. Vet. Res., 69, 135–142.

17.  JACKWOOD D.H. & SAIF Y.M. (1987). Antigenic diversity of infectious bursal disease viruses. Avian Dis., 31, 766–770.

18.  JACKWOOD D.J., SOMMER-WAGNER S.E.,CROSSLEY B.M., STOUTE S.T.,WOOLCOCK P.R. & CHARLTON B.R. (2011). Identification and pathogenicity of a natural reassortant between a very virulent serotype 1 infectious bursal disease virus (IBDV) and a serotype 2 IBDV. Virology, 420, 98–105.

19.  KREIDER D.L., SKEELES J.K., PARSLEY M., NEWBERRY L.A. & STORY J.D. (1991). Variability in a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay system. II Laboratory variability. Avian Dis., 35, 288–293.

20.  LE GROS F.X., DANCER A., GIACOMINI C., PIZZONI L., BUBLOT M., GRAZIANI M. & PRANDINI F. (2009) Field efficacy trial of a novel HVT-IBD vector vaccine for 1-day-old broilers. Vaccine, 27, 592–596.

21.  LE NOUEN C., RIVALLAN G., TOQUIN D., DARLU P., MORIN Y., BEVEN V., DE BOISSESON C., CAZABAN C., COMTE S., GARDIN Y. & ETERRADOSSI N.(2006). Very virulent infectious bursal disease virus: reduced pathogenicity in a rare natural segment B-reassorted isolate. J. Gen. Virol., 87, 209–216.

22.  LEMIERE S., WONG S.Y., SAINT-GERAND A.L., GOUTEBROZE S. & LE GROS F.X. (2011). Compatibility of turkey herpesvirusinfectious bursal disease vector vaccine with Marek’s disease rispens vaccine injected into day-old pullets. Avian Dis., 55, 113–118.

23.  LIN Z., KATO A., OTAKI Y., NAKAMURA T., SASMAZ E. & UEDA S. (1993). Sequence comparisons of a highly virulent infectious bursal disease virus prevalent in Japan. Avian Dis., 37, 315–323.

24.  MAAS R., VENEMA S., KANT A., OEI H. & CLAASSEN I. (2004). Quantification of infectious bursal disease viral proteins 2 and 3 in inactivated vaccines as an indicator of serological response and measure of potency. Avian Pathol., 33, 126–132.

25.  MARQUARDT W.W., JOHNSON R.B., ODENWALD W.F. & SCHLOTTHOBER B.A. (1980). An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring antibodies in chickens infected with infectious bursal disease virus. Avian Dis., 24, 375–385.

26.  MEULEMANS G., ANTOINE O. & HALEN P. (1977). Application de l’immunofluorescence au diagnostic de la Maladie de Gumboro. OIE Bull., 88, 225–229.

27.  MULLER H., MUNDT E., ETERRADOSSI N. & ISLAM M.R. (2012) Review: current status of vaccines against infectious bursal disease. Avian Pathol., 41, 133–139.

28.  MUNDT E. (1999). Tissue culture infectivity of different strains of infectious bursal disease virus is determined by distinct amino acids in VP2. J. Gen. Virol., 80, 2067–2076.

29.  MUSKETT J.C., HOPKINS I.G., EDWARDS K.R. & THORNTON D.H. (1979). Comparison of two infectious bursal disease vaccine strains: Efficacy and potential hazards in susceptible and maternally immune birds. Vet. Rec., 104, 332– 334.

30.  PITCOVSKI J., GUTTER B., GALLILI G., GOLDWAY M., PERELMAN B., GROSS G., KRISPEL S., BARBAKOV M. & MICHAEL A. (2003). Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine, 21, 4736–4743.

31.  ROSENBERGER J.K. & CLOUD S.S (1986). Isolation and characterization of variant infectious bursal disease viruses. J. Am. Vet. Med. Assoc., 189, 357.

32.  ROSENBERGER J.K., KLOPP S., ECKROADE R.J. & KRAUSS W.C. (1975). The role of the infectious bursal agent and several adenoviruses in the hemorrhagic-aplastic-anaemia syndrome and gangrenous dermatitis. Avian Dis., 19, 717–729.

33.  SCHNITZLER D., BERNSTEIN F., MÜLLER H. & BECHT H. (1993). The genetic basis for the antigenicity of the VP2 protein of the infectious bursal disease virus. J. Gen. Virol., 74, 1563–1571.

34.  SKEELES J.K., LUKERT P.D., FLETCHER O.J. & LEONARD J.D. (1979). Immunisation studies with a cell-culture-adapted infectious bursal virus. Avian Dis., 23, 456–465.

35.  SMILEY J.R., SOMMER S.E. & JACKWOOD D.J. (1999). Development of an ssRNA internal control reagent for an infectious bursal disease virus reverse transcription/polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism diagnostic assay. J. Vet. Diagn. Invest., 11, 497–504.

36.  SNYDER D.B., LANA D.P., SAVAGE P.K., YANCEY F.S., MENGEL S.A. & MARQUARDT W.W. (1988). Differentiation of infectious bursal disease viruses directly from infected tissues with neutralizing monoclonal antibodies: Evidence for a major antigenic shift in recent field isolates. Avian Dis., 32, 535–539.

37.  SNYDER D.B., VAKHARIA V.N. & SAVAGE P.K. (1992). Naturally occurring neutralizing monoclonal antibody escape variants define the epidemiology of infectious bursal disease viruses in the United States. Arch. Virol., 127, 89–101.

38.  UNITED STATES CODE OF FEDERAL REGULATIONS, TITLE 9, PART 113 (available on line: https://www.govinfo.gov/app/details/CFR-2000-title9-vol1/CFR-2000-title9-vol1-part113).

39.  VAKHARIA V.N., HE J., AHAMED B. & SNYDER D.B. (1994). Molecular basis of antigenic variation in infectious bursal disease virus. Virus Res., 31, 265–273.

40.  VAN DEN BERG T.P., GONZE M., MORALES D. & MEULEMANS G. (1996). Acute infectious bursal disease in poultry: immunological and molecular basis of antigenicity of a highly virulent strain. Avian Pathol., 25, 751–768.

41.  VAN DEN BERG T.P. & MEULEMANS G. (1991). Acute infectious bursal disease in poultry: protection afforded by maternally derived antibodies and interference with live vaccination. Avian Pathol., 20, 409–421.

42.  WEI Y.,YU X.,ZHENG J.,CHU W.,XU H.,YU X.&YU L.(2008). Reassortant infectious bursal disease virus isolated in China. Virus Res., 131, 279–282.

43.  WU C.C., LIN T.L., ZHANG H.G., DAVIS V.S. & BOYLE J.A. (1992). Molecular detection of infectious bursal disease virus by polymerase chain reaction. Avian Dis., 36, 221–226.

44.  WU C.C., RUBINELLI P. & LIN T.L. (2007). Molecular detection and differentiation of infectious bursal disease virus. Avian Dis., 51, 515–526.

45.  WYETH P.J. & CULLEN G.A. (1979). The use of an inactivated infectious bursal disease oil emulsion vaccine in commercial broiler parent chickens. Vet. Rec., 104, 188–193.

 

SUMBER:

WOAH Terrestrial Code Chapter 3.3.12. INFECTIOUS BURSAL DISEASE (GUMBORO DISEASE)