SARS-CoV-2 menetralkan antibodi serum pada kucing: Investigasi Serologis

RINGKASAN

Penyakit Coronavirus 2019 (COVID-19) yang disebabkan oleh severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pertama kali dilaporkan di Wuhan, Cina, dan menyebar dengan cepat ke seluruh dunia. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa kucing bisa menjadi hewan yang rentan terhadap SARS-CoV-2. Di sini, kami menyelidiki infeksi SARS-CoV-2 pada kucing dengan mendeteksi antibodi serum spesifik. Dari suatu kohort sampel serum dikumpulkan dari kucing di Wuhan, termasuk 102 sampel setelah wabah COVID-19, dan 39 sebelum wabah. 15 dari 102 (14,7%) sera kucing yang dikumpulkan setelah wabah positif untuk domain pengikatan reseptor (RBD) dari SARS-CoV-2 dengan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) tidak langsung. Di antara sampel positif, 11 memiliki antibodi netralisasi SARS-CoV-2 dengan titer mulai dari 1/20 hingga 1/1080. Tidak ada reaktivitas silang serologis yang terdeteksi antara SARS-CoV-2 dan virus feline infectious peritonitis tipe I atau II (FIPV). Data kami menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 telah menginfeksi populasi kucing di Wuhan selama wabah.

Kata kunci: Penyakit Coronavirus 2019 (COVID-19), severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), penyelidikan serologis, netralisasi antibodi, kucing.

PENDAHULUAN

Pada bulan Desember, 2019, wabah pneumonia yang tidak diketahui penyebabnya terjadi di Wuhan, Cina. Patogen itu segera diidentifikasi sebagai severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), dan penyakit ini dinamai penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) oleh Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) (Chen et al., 2020; Zhou et al., 2020a). Gejala klinis COVID-19 terutama meliputi infeksi tanpa gejala, penyakit saluran pernapasan ringan hingga parah, dan bahkan kematian (Huang et al., 2020). Dibandingkan dengan SARS-CoV, SARS-CoV-2 memiliki angka reproduksi dasar yang lebih tinggi, mewakili lebih banyak keterusan (Liu et al., 2020a). Dalam waktu yang sangat singkat, COVID-19 dengan cepat menjadi ancaman yang sangat serius bagi perjalanan, perdagangan, dan kesehatan manusia di seluruh dunia (Bernard Stoecklin dkk., 2020; Ghinai dkk., 2020; Iacobucci, 2020; Shim et al., 2020; Tuite et al., 2020). Pada 28 Maret 2020, total 512.701 kasus yang dikonfirmasi, termasuk 23.495 kematian (4,58%), yang melibatkan 202 negara, wilayah atau wilayah, telah dilaporkan secara global oleh WHO (https://www.who.int/emergencies/diseases / novel-coronavirus-2019). Wabah COVID-19 pertama kali dikonfirmasi di Wuhan, Cina, kemungkinan terkait dengan pasar makanan laut. Namun, sejauh ini, tidak ada bukti bahwa pasar makanan laut adalah sumber asli dari SARS-CoV-2 (Guo et al., 2020). Sebelum SARS-CoV-2, 4 jenis beta coronavirus dapat menginfeksi manusia, termasuk SARS-CoV dan MERS-CoV yang sangat patogen dan keduanya berasal dari kelelawar (Li et al., 2020a; Liu et al., 2020b). Analisis genom menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 memiliki 96,2% keseluruhan identitas urutan genom dengan Bat CoV RaTG13, menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 juga dapat berasal dari kelelawar (Zhou et al., 2020b). Penularan SARS-CoV-2 dari kelelawar ke manusia diduga melalui kontak langsung antara manusia dan hewan inang perantara (Guo et al., 2020). Namun, masih belum jelas hewan mana yang merupakan inang perantara SARS-CoV-2. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 menggunakan reseptor entri sel yang sama, angiotensin converting enzyme II (ACE2), seperti SARS-CoV (Zhou et al., 2020b), menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 memiliki kisaran inang yang sama sebagai SARS-CoV. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa SARS-CoV dapat menginfeksi musang dan kucing (Martina et al., 2003), menyiratkan bahwa mereka mungkin juga rentan terhadap SARS-CoV-2. Sebagai salah satu hewan peliharaan paling populer, kucing memiliki kontak yang sangat dekat dengan manusia. Oleh karena itu, sangat penting untuk menyelidiki prevalensi SARS-CoV-2 pada kucing, terutama di daerah wabah. Namun, tidak ada survei tentang prevalensi SARS-CoV-2 pada kucing sejauh ini. Studi serologis cocok untuk skrining antibodi terhadap SARS-CoV-2 pada hewan (Reusken et al., 2013). Saat ini, beberapa metode telah diterapkan untuk uji antibodi SARS-CoV-2 pada manusia (Li et al., 2020b). Namun, tidak ada metode yang tersedia untuk mendeteksi antibodi kucing terhadap SARS-CoV-2. Di sini, kami menyelidiki prevalensi serologis SARS-CoV-2 pada kucing dengan ELISA tidak langsung dan tes netralisasi virus, memberikan bukti pertama infeksi SARS-CoV-2 pada kucing.

HASIL

Sebanyak 143 serum kucing diskrening dengan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) tidak langsung untuk reaktivitas antibodi terhadap domain pengikatan reseptor rekombinan (RBD) protein lonjakan SARS-CoV-2. Dari 39 sera yang dikumpulkan sebelum wabah, yang OD-nya bervariasi dari 0,091 hingga 0,261, kami menetapkan cut-off sebagai 0,32. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan Gambar 1, 15 serum kucing (14,7%) yang dikumpulkan setelah wabah positif, dengan lima yang positif kuat dengan OD lebih dari 0,6. Sera hyperimmune virus peritonitis feline tipe I dan II kucing tidak menunjukkan reaktivitas silang dengan protein SARS-CoV-2 RBD. Untuk mengkonfirmasi keberadaan antibodi spesifik SARS-CoV-2 dalam serum kucing, ke-15 serum positif ELISA diuji dengan tes netralisasi virus atau Virus Netralization Test (VNT) untuk SARS-CoV-2. Dari jumlah tersebut, 11 sera kucing memiliki antibodi netralisasi terhadap SARS-CoV-2 dengan titer mulai dari 1/20 hingga 1/1080 (Tabel 1, Gambar 2A). Namun, 4 sera termasuk # 12, yang merupakan ELISA kuat positif dengan OD 0,85, tidak menunjukkan aktivitas netralisasi. Dan ELISA lain yang positif kuat, # 10, memiliki aktivitas menetralisir yang sangat lemah. Tetapi netralisasi yang kuat diamati untuk ketiga sera ELISA positif yang kuat lainnya, # 4, # 14 dan # 15, dengan titer penetralisasi 1/360 hingga 1/1080. Konsisten dengan titer penetral tinggi, pemilik Cat # 4, Cat # 14 dan Cat # 15 didiagnosis sebagai pasien COVID-19. Kucing # 1, Kucing # 5 ~ 9 berasal dari rumah sakit hewan peliharaan, sedangkan Kucing # 2, Kucing # 10 ~ 13 awalnya kucing liar dan disimpan di tempat perlindungan hewan setelah wabah. Sekali lagi, kedua tipe I dan II FIPV hiperimun serum negatif untuk VNT. Uji Western blot juga dilakukan untuk lebih memverifikasi keberadaan SARS-CoV-2 IgG spesifik dalam serum kucing. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2 B, # 4, # 14 dan # 15 sera mendeteksi protein S dan N dari SARS-CoV-2 yang dimurnikan, sebagai serum penyembuhan manusia. Sebaliknya, serum kucing ELISA negatif dan serum manusia sehat tidak menyelidiki pita protein. Diskusi Dalam penelitian ini, kami mendeteksi keberadaan antibodi SARS-CoV-2 pada kucing di Wuhan selama wabah COVID-19 dengan ELISA, VNT dan western blot. Sebanyak 102 kucing diuji, 15 (14,7%) positif untuk ELISA berbasis RBD dan 11 (10,8%) lebih positif dengan VNT. Hasil ini menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 telah menginfeksi populasi kucing di Wuhan, menyiratkan bahwa risiko ini juga dapat terjadi di daerah wabah lainnya. Investigasi retrospektif mengkonfirmasi bahwa semua serum positif ELISA adalah sampel setelah wabah, menunjukkan bahwa infeksi kucing bisa disebabkan oleh penularan virus dari manusia ke kucing. Tentu saja, masih perlu diverifikasi melalui penyelidikan infeksi SARS-CoV-2 sebelum wabah ini dalam berbagai sampel. Saat ini, tidak ada bukti penularan SARS-CoV-2 dari kucing ke manusia. Namun, sebuah laporan terbaru menunjukkan bahwa SARS-CoV-2 dapat mentransmisikan antar kucing melalui tetesan ekskresi pernapasan (Hualan Chen, 2020), jadi, peringatan dan regulasi yang kuat masih harus dikeluarkan untuk memblokir rute transmisi potensial ini. Tiga kucing yang dimiliki oleh pasien COVID-19 memiliki titer netralisasi tertinggi (masing-masing 1/360, 1/360, dan 1/1080). Sebaliknya, serum yang dikumpulkan dari kucing rumah sakit hewan peliharaan dan kucing liar memiliki aktivitas menetralkan 1/20 hingga 1/80, yang menunjukkan bahwa titer netralisasi yang tinggi bisa disebabkan oleh kontak erat antara kucing dan pasien COVID-19. Meskipun infeksi pada kucing liar belum sepenuhnya dipahami, masuk akal untuk berspekulasi bahwa infeksi ini mungkin disebabkan oleh kontak dengan lingkungan tercemar SARS-CoV-2, atau pasien COVID-19 yang memberi makan kucing. Selain itu, kami juga mengumpulkan swab nasofaring dan anal dari masing-masing kucing, dan melakukan qRT-PCR spesifik SARS-CoV-2 menggunakan kit komersial yang menargetkan gen ORF1ab dan N. Namun, tidak ada sampel positif gen ganda yang terdeteksi. Alasannya mungkin (1) bahwa viral load RNA terlalu rendah untuk dideteksi; (2) sebagai SARS-CoV (Martina et al., 2003), periode dimana kucing melepaskan SARS-CoV-2 mungkin sangat singkat, bersama dengan infeksi asimptomatik, kami tidak menangkap momen infeksi akut; (3) mungkin ada varian dalam urutan genom pada kucing, yang menyebabkan kegagalan dalam amplifikasi dalam sampel kucing. Sepengetahuan kami, ini adalah laporan pertama bahwa hewan menghasilkan antibodi netralisasi khusus terhadap SARS-CoV-2 dalam kondisi alami. Penelitian kami menunjukkan risiko kucing terlibat dalam transmisi SARS-CoV-2. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki rute transmisi SARS-CoV-2 dari manusia ke kucing. Yang penting, tindakan segera harus dilaksanakan untuk menjaga jarak yang sesuai antara manusia dan hewan pendamping seperti kucing dan anjing, dan tindakan kebersihan dan karantina yang ketat juga harus dilakukan untuk hewan-hewan ini.

METODE

Pengumpulan sampel

Sebanyak 102 kucing diambil sampelnya dari tempat penampungan hewan atau rumah sakit hewan peliharaan di Wuhan antara Januari dan Maret 2020. Sampel darah dikumpulkan melalui venipuncture kaki dan serum dipisahkan dan disimpan pada suhu -20 ° C sampai diproses lebih lanjut. Penyeka nasofaring dan anal dikumpulkan dan dimasukkan ke dalam tabung yang mengandung media transportasi viral-penulis VTM (Copan Diagnostics, Brescia, Italia) (Haagmans et al., 2014).

Semua sampel dikumpulkan di bawah peralatan pelindung diri penuh, termasuk penutup kepala, kacamata, masker N95, sarung tangan, dan gaun sekali pakai. Serangkaian 39 sera kucing diambil dari bank serum di lab kami, yang dikumpulkan dari Wuhan antara Maret dan Mei, 2019. Sera hiperimun diperoleh dari Laboratorium Patogen Neuropati, Universitas Pertanian Huazhong, dengan titer netralisasi 1/640 dan 1/1280, masing-masing, terhadap virus infectious peritonitis feline tipe I dan II (FIPV). Serum konvensional pasien COVID-19 dikumpulkan dari rumah sakit Jiangxia Tongji dengan persetujuan pasien dan titer netralisasi 1/1280. Virus dan sel SARS-CoV-2 (IVCAS 6.7512) diisolasi dari pasien COVID-19 seperti yang dijelaskan sebelumnya. (Zhou et al., 2020b) Vero E6 dibeli dari ATCC (ATCC® CRL-1586 ™).

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Antibodi diuji oleh ELISA tidak langsung dengan protein SARS-CoV-2 RBD (Sino Biological Inc., China) dan IgG anti-kucing terkonjugasi peroksidase IgG (Sigma-Aldrich, USA). Secara singkat, pelat ELISA dilapisi semalam pada suhu 4 dengan protein RBD (1 μg / ml, 100μl per sumur). Setelah diblokir dengan PBS yang mengandung susu skim 5% selama 2 jam pada suhu 37, pelat ditambahkan dengan serum pada pengenceran 1: 40. Setelah inkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ° C, piring dicuci 5 kali dengan pencuci pencuci (PBS). mengandung 0,05% Tween-20). IgG anti-kucing encer 1: 20000 ditambahkan dan diinkubasi selama 30 menit tambahan. Setelah 5 kali pencucian lainnya, Substrat TMB (Sigma-Aldrich, USA) ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit. Kemudian reaksi dihentikan, dan kepadatan optik (OD) diukur pada 450 nm. Sera tersebut dianggap positif jika nilai OD dua kali lebih tinggi dari rata-rata OD dari 39 sera yang dikumpulkan antara Maret dan Mei, 2019. Tes netralisasi virus (VNT) Untuk tes netralisasi virus, sampel serum dilemahkan oleh inkubasi pada suhu 56 °. C selama 30 menit. Setiap sampel serum diencerkan secara serial dengan Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sebagai dua kali lipat atau tiga kali lipat sesuai dengan nilai OD dan kualitas sampel, dicampur dengan volume yang sama dari virus yang diencerkan dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 1 jam. Sel-sel Vero E6 dalam plat 24-sumur diinokulasi dengan campuran sera-virus pada suhu 37 ° C; 1 jam kemudian, campuran digantikan dengan DMEM yang mengandung 2,5% FBS dan 0,8% karboksimetilselulosa. Pelat difiksasi dengan paraformaldehyde 8% dan diwarnai dengan kristal violet 0,5% 3 hari kemudian. Semua sampel diuji dalam duplikat dan titer netralisasi didefinisikan sebagai pengenceran serum yang menghasilkan pengurangan plak setidaknya 50% (Davies et al., 2005).

Uji Western blotting

Konsentrasi total protein dari SARS-CoV-2 yang dimurnikan dan tidak aktif ditentukan dengan uji protein Bradford (Su et al., 2018). Protein 4 μg mengalami elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) 8% dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Kemudian protein virus dihilangkan dengan serum kucing atau serum pemulihan manusia. Pita protein divisualisasikan dengan inkubasi dengan IgG anti-kucing kambing atau IgG anti-manusia tikus dan kemudian dideteksi menggunakan Sistem ECL (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL, USA).

Referensi

Bernard Stoecklin, S., Rolland, P., Silue, Y., Mailles, A., Campese, C., Simondon, A., Mechain, M., Meurice, L., Nguyen, M., Bassi, C., et al. (2020). First cases of coronavirus disease 2019 (COVID-19) in France: surveillance, investigations and control measures, January 2020. Euro surveillance : bulletin Europeen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin 25.

Chen, N., Zhou, M., Dong, X., Qu, J., Gong, F., Han, Y., Qiu, Y., Wang, J., Liu, Y., Wei, Y., et al. (2020). Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. Lancet 395, 507-513.

Davies, D.H., McCausland, M.M., Valdez, C., Huynh, D., Hernandez, J.E., Mu, Y., Hirst, S., Villarreal, L., Felgner, P.L., and Crotty, S. (2005). Vaccinia virus H3L envelope protein is a major target of neutralizing antibodies in humans and elicits protection against lethal challenge in mice. Journal of virology 79, 11724-11733.

Ghinai, I., McPherson, T.D., Hunter, J.C., Kirking, H.L., Christiansen, D., Joshi, K., Rubin, R., Morales-Estrada, S., Black, S.R., Pacilli, M., et al. (2020). First known person-to-person transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in the USA. Lancet.

Guo, Y.R., Cao, Q.D., Hong, Z.S., Tan, Y.Y., Chen, S.D., Jin, H.J., Tan, K.S., Wang, D.Y., and Yan, Y. (2020). The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research 7, 11.

Haagmans, B.L., Al Dhahiry, S.H., Reusken, C.B., Raj, V.S., Galiano, M., Myers, R., Godeke, G.J., Jonges, M., Farag, E., Diab, A., et al. (2014). Middle East respiratory syndrome coronavirus in dromedary camels: an outbreak investigation. The Lancet infectious diseases 14, 140-145.

Hualan Chen. Susceptibility of ferrets, cats, dogs, and different domestic animals to SARS-coronavirus-2. doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.30.015347.

Huang, C., Wang, Y., Li, X., Ren, L., Zhao, J., Hu, Y., Zhang, L., Fan, G., Xu, J., Gu, X., et al. (2020). Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 395, 497-506.

Iacobucci, G. (2020). Covid-19: all non-urgent elective surgery is suspended for at least three months in England. Bmj 368, m1106. Li, B., Si, H.R., Zhu, Y., Yang, X.L., Anderson, D.E., Shi, Z.L., Wang, L.F., and Zhou, P. (2020a). Discovery of Bat Coronaviruses through Surveillance and Probe Capture-Based Next-Generation Sequencing. mSphere 5.

Li, Z., Yi, Y., Luo, X., Xiong, N., Liu, Y., Li, S., Sun, R., Wang, Y., Hu, B., Chen, W., et al. (2020b). Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis. Journal of medical virology.

Liu, Y., Gayle, A.A., Wilder-Smith, A., and Rocklov, J. (2020a). The reproductive number of COVID-19 is higher compared to SARS coronavirus. Journal of travel medicine 27.

Liu, Z., Xiao, X., Wei, X., Li, J., Yang, J., Tan, H., Zhu, J., Zhang, Q., Wu, J., and Liu, L. (2020b). Composition and divergence of coronavirus spike proteins and host ACE2 receptors predict potential intermediate hosts of SARS-CoV-2. Journal of medical virology.

Martina, B.E., Haagmans, B.L., Kuiken, T., Fouchier, R.A., Rimmelzwaan, G.F., Van Amerongen, G., Peiris, J.S., Lim, W., and Osterhaus, A.D. (2003). Virology: SARS virus infection of cats and ferrets. Nature 425, 915.

author/funder. It is made available under a CC-BY-NC-ND 4.0 International license. bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.01.021196. The copyright holder for this preprint (which was not peer-reviewed) is the Reusken, C.B., Haagmans, B.L., Muller, M.A., Gutierrez, C., Godeke, G.J., Meyer, B., Muth, D., Raj, V.S., Smits-De Vries, L., Corman, V.M., et al. (2013). Middle East respiratory syndrome coronavirus neutralising serum antibodies in dromedary camels: a comparative serological study. The Lancet infectious diseases 13, 859-866.

Shim, E., Tariq, A., Choi, W., Lee, Y., and Chowell, G. (2020). Transmission potential and severity of COVID-19 in South Korea. International journal of infectious diseases : IJID : official publication of the International Society for Infectious Diseases.

Su, X., Tian, Y., Zhou, H., Li, Y., Zhang, Z., Jiang, B., Yang, B., Zhang, J., and Fang, J. (2018). Inactivation Efficacy of Nonthermal Plasma-Activated Solutions against Newcastle Disease Virus. Applied and environmental microbiology 84.

Tuite, A.R., Ng, V., Rees, E., and Fisman, D. (2020). Estimation of COVID-19 outbreak size in Italy. The Lancet infectious diseases.

Zhou, F., Yu, T., Du, R., Fan, G., Liu, Y., Liu, Z., Xiang, J., Wang, Y., Song, B., Gu, X., et al. (2020a). Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet.

Zhou, P., Yang, X.L., Wang, X.G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., Si, H.R., Zhu, Y., Li, B., Huang, C.L., et al. (2020b). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270-273.

Sumber:

Qiang Zhang, Huajun Zhang, Kun Huang, Yong Yang, Xianfeng Hui, Jindong Gao, Xinglin He, Chengfei Li, Wenxiao Gong, Yufei Zhang, Cheng Peng, Xiaoxiao Gao, Huanchun Chen, Zhong Zou1, Zhengli Shi, and Meilin Jin.  2020.  SARS-CoV-2 neutralizing serum antibodies in cats: a serological investigation. 

https://doi.org/10.1101/2020.04.01.021196.

file:///C:/Users/User/Downloads/2020.04.01.021196v1.full.pdf       

diunduh 6 April 2020 jam 13:00.