Prinsip dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR)

Karakterisasi keanekaragaman spesies yang hidup dalam ekosistem merupakan kepentingan ilmiah utama untuk memahami fungsi ekosistem ini. Hal ini juga menjadi isu kemasyarakatan karena perlu dilakukan pelestarian atau bahkan pemulihan keanekaragaman hayati. Secara historis, spesies telah dideskripsikan dan dikarakterisasi berdasarkan kriteria morfologi, yang terkait erat dengan kondisi lingkungan atau yang menemukan batasnya terutama dalam kelompok yang sulit diakses, seperti halnya banyak spesies mikroorganisme. Kebutuhan untuk memahami mekanisme molekuler pada spesies telah menjadikan PCR alat yang sangat diperlukan untuk memahami fungsi sistem biologis ini. Sejumlah penanda sekarang tersedia untuk mendeteksi polimorfisme DNA inti. Dalam studi keragaman genetik, penanda yang paling sering digunakan adalah mikrosatelit. Studi tentang kompleksitas biologis adalah batas baru yang membutuhkan teknologi molekuler throughput tinggi, memori komputer berkecepatan tinggi, pendekatan baru untuk analisis data, dan integrasi keterampilan interdisipliner.

 

1. PENGENALAN

Polymerase chain reaction (PCR) ditemukan oleh Mullis pada tahun 1983 dan dipatenkan pada tahun 1985. Prinsipnya didasarkan pada penggunaan DNA polimerase yang merupakan replikasi in vitro dari sekuens DNA tertentu. Metode ini dapat menghasilkan puluhan miliar salinan fragmen DNA tertentu (urutan minat, DNA minat, atau DNA target) dari ekstrak DNA (templat DNA). Memang, jika urutan yang diinginkan ada dalam ekstrak DNA, dimungkinkan untuk mereplikasi secara selektif (kita berbicara tentang amplifikasi) dalam jumlah yang sangat besar. Kekuatan PCR didasarkan pada fakta bahwa jumlah DNA matriks, secara teori, bukanlah faktor pembatas. Oleh karena itu, kami dapat memperkuat urutan nukleotida dari ekstrak DNA dalam jumlah yang sangat kecil. Oleh karena itu, PCR merupakan teknik pemurnian atau kloning. DNA yang diekstraksi dari organisme atau sampel yang mengandung DNA dari berbagai asal tidak dapat dianalisis secara langsung. Ini mengandung banyak massa urutan nukleotida. Oleh karena itu perlu untuk mengisolasi dan memurnikan urutan atau urutan yang menarik, baik itu urutan gen atau urutan noncoding (intron, transposon, mini atau mikrosatelit). Dari massa sekuens yang menyusun DNA matriks, PCR karenanya dapat memilih satu atau lebih sekuens dan memperkuatnya dengan mereplikasi hingga puluhan miliar salinan. Setelah reaksi selesai, jumlah DNA matriks yang tidak berada di area yang diinginkan tidak akan bervariasi. Sebaliknya, jumlah sekuens yang diperkuat (DNA yang diinginkan) akan sangat besar. PCR memungkinkan untuk memperkuat sinyal dari kebisingan latar belakang, jadi ini adalah metode kloning molekuler, dan klon kembali ke kemurnian.

 

Ada banyak aplikasi PCR. Ini adalah teknik yang sekarang penting dalam biologi seluler dan molekuler. Ini memungkinkan, terutama dalam beberapa jam, "kloning aseluler" dari suatu fragmen DNA melalui sistem otomatis, yang biasanya membutuhkan waktu beberapa hari dengan teknik kloning molekuler standar. Di sisi lain, PCR banyak digunakan untuk tujuan diagnostik untuk mendeteksi keberadaan urutan DNA tertentu dari organisme ini atau itu dalam cairan biologis. Ini juga digunakan untuk membuat sidik jari genetik, apakah itu identifikasi genetik seseorang dalam konteks penyelidikan yudisial, atau identifikasi varietas hewan, tumbuhan, atau mikroba untuk pengujian kualitas makanan, diagnostik, atau pemilihan varietas. PCR masih penting untuk melakukan sekuensing atau mutagenesis yang diarahkan ke lokasi. Terakhir, ada varian PCR seperti PCR real-time, PCR kompetitif, PCR in situ, RT-PCR, dll.

 

Saat ini, evolusi revolusioner penelitian biologi molekuler didasarkan pada teknik PCR yang menghasilkan produk yang sesuai dan spesifik terutama di bidang karakterisasi dan konservasi keanekaragaman genetik. Beberapa aplikasi yang mungkin dilakukan di bagian hilir teknik PCR: (1) pembentukan urutan lengkap genom dari breed ternak yang paling penting; (2) pengembangan teknologi yang mengukur polimorfisme yang tersebar di lokus di seluruh genom (misalnya, metode deteksi SNP); dan (3) pengembangan teknologi microarray untuk mengukur transkripsi gen dalam skala besar. Studi tentang kompleksitas biologis adalah batas baru yang membutuhkan teknologi molekuler throughput tinggi, kecepatan tinggi dan memori komputer, pendekatan baru untuk analisis data, dan integrasi keterampilan interdisipliner.

 

2. PRINSIP PCR

PCR memungkinkan untuk memperoleh, dengan replikasi in vitro, banyak salinan dari suatu fragmen DNA dari suatu ekstrak. DNA matriks dapat berupa DNA genom serta DNA pelengkap yang diperoleh RT-PCR dari ekstrak RNA kurir (poly-A RNA), atau bahkan DNA mitokondria. Ini adalah teknik untuk mendapatkan jumlah yang besar urutan DNA tertentu dari sampel DNA. Amplifikasi ini didasarkan pada replikasi template DNA untai ganda. Ini dipecah menjadi tiga fase: fase denaturasi, fase hibridisasi dengan primer, dan fase perpanjangan. Produk dari setiap langkah sintesis berfungsi sebagai templat untuk langkah-langkah berikut, sehingga amplifikasi eksponensial tercapai [1].

 

Reaksi berantai polimerase dilakukan dalam campuran reaksi yang terdiri dari ekstrak DNA (DNA cetakan), Taq polimerase, primer, dan empat deoksiribonukleosida trifosfat (dNTP) berlebih dalam larutan buffer. Tabung yang berisi reaksi campuran mengalami siklus suhu berulang beberapa puluh kali dalam blok pemanas siklus termal (peralatan yang memiliki selungkup tempat tabung sampel disimpan dan suhu dapat bervariasi, sangat cepat dan tepat, dari 0 hingga 100 ° C oleh efek Peltier) [1, 2]. Peralatan memungkinkan pemrograman durasi dan suksesi siklus langkah suhu. Setiap siklus mencakup tiga periode beberapa puluh detik. Proses PCR dibagi menjadi tiga tahap sebagai berikut:

 

2.1 Denaturasi

Ini adalah pemisahan dua untai DNA, diperoleh dengan menaikkan suhu. Periode pertama dilakukan pada temperatur 94 ° C yang disebut temperatur denaturasi. Pada suhu ini, DNA matriks, yang berfungsi sebagai matriks selama replikasi, didenaturasi: ikatan hidrogen tidak dapat dipertahankan pada suhu yang lebih tinggi dari 80 ° C dan DNA untai ganda didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (untai tunggal DNA).

 

2.2 Hibridisasi

Langkah kedua adalah hibridisasi. Itu dilakukan pada suhu yang umumnya antara 40 dan 70 ° C, yang disebut suhu hibridisasi primer. Penurunan suhu memungkinkan ikatan hidrogen terbentuk kembali dan dengan demikian untaian komplementer mengalami hibridisasi. Primer, urutan untai tunggal pendek melengkapi daerah yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, lebih mudah berhibridisasi daripada DNA matriks untai panjang. Semakin tinggi suhu hibridisasi, semakin selektif hibridisasi tersebut, semakin spesifik.

 

2.3 Perpanjangan

Periode ketiga dilakukan pada temperatur 72 ° C yang disebut temperatur elongasi. Ini adalah sintesis untai komplementer. Pada 72 ° C, Taq polimerase mengikat DNA untai tunggal prima dan mengkatalisis replikasi menggunakan deoksiribonukleosida trifosfat yang ada dalam campuran reaksi. Dengan demikian, daerah templat DNA di bagian hilir primer disintesis secara selektif. Pada siklus berikutnya, fragmen yang disintesis pada siklus sebelumnya pada gilirannya menjadi matriks dan setelah beberapa siklus, spesies dominan sesuai dengan urutan DNA antar daerah tempat primer hibridisasi. Dibutuhkan 20–40 siklus untuk mensintesis sejumlah DNA yang dapat dianalisis (sekitar 0,1 μg). Setiap siklus secara teoritis menggandakan jumlah DNA yang ada pada siklus sebelumnya. Direkomendasikan untuk menambahkan siklus terakhir pemanjangan pada 72 ° C, terutama jika urutan yang diinginkan besar (lebih dari 1 kilobase), dengan kecepatan 2 menit per kilobase [1, 2, 3]. PCR memungkinkan untuk memperkuat urutan yang ukurannya kurang dari 6 kilobase. Reaksi PCR sangat cepat, hanya berlangsung beberapa jam (2-3 jam untuk PCR 30 siklus).

 

2.4 Primer

Untuk mencapai amplifikasi selektif urutan nukleotida dari ekstrak DNA dengan PCR, penting untuk memiliki setidaknya satu pasang oligonukleotida. Oligonukleotida ini, yang akan berfungsi sebagai primer untuk replikasi, disintesis secara kimiawi dan harus menjadi komplementaritas terbaik dengan kedua ujung urutan kepentingan yang ingin diperkuat. Salah satu primer dirancang untuk mengenali secara komplementer urutan yang terletak di hulu fragmen DNA untai 5′-3 ′ yang diinginkan; yang lain mengenali, selalu dengan saling melengkapi, urutan yang terletak di untai komplementer hulu (3′ – 5 ′) dari fragmen DNA yang sama. Primer adalah DNA untai tunggal yang hibridisasinya pada sekuens yang mengapit sekuens yang diinginkan akan memungkinkan replikasinya begitu selektif. Ukuran primer biasanya antara 10 dan 30 nukleotida untuk menjamin hibridisasi yang cukup spesifik pada urutan yang diinginkan dari matriks DNA [1, 2, 3, 4, 5].

 

2.5 Taq polimerase

DNA polimerase memungkinkan replikasi. Kami menggunakan DNA polimerase yang dimurnikan atau diklon dari bakteri ekstremofilik, Thermus aquaticus, yang hidup di mata air panas dan tahan suhu di atas 100 ° C. Polimerase ini (Taq polimerase) memiliki karakteristik yang luar biasa untuk menahan suhu sekitar 100 ° C, yang biasanya cukup untuk mengubah sifat sebagian besar protein. Thermus aquaticus menemukan suhu kenyamanannya pada 72 ° C, suhu optimal untuk aktivitas polimerase nya [4].

 

3. KONDISI REAKSI

Volume media reaksi bervariasi antara 10 dan 100 μl. Ada banyak rumus media reaksi. Namun, dimungkinkan untuk menentukan formula standar yang sesuai untuk kebanyakan reaksi polimerisasi. Formula ini telah dipilih oleh sebagian besar produsen dan pemasok, yang, terlebih lagi, memberikan solusi buffer yang siap digunakan dengan Taq polimerase. Dipekatkan 10 kali, rumusnya kira-kira sebagai berikut: 100 mM Tris-HCl, pH 9.0; 15 mM MgCl2, 500 mM KCl [2, 4].

 

Dimungkinkan untuk menambahkan deterjen (Tween 20, Triton X-100) atau gliserol untuk meningkatkan kondisi kekakuan yang membuatnya lebih sulit dan oleh karena itu hibridisasi primer yang lebih selektif. Pendekatan ini umumnya digunakan untuk mengurangi tingkat amplifikasi nonspesifik akibat hibridisasi primer pada sekuens tanpa hubungan dengan sekuens yang diinginkan. Kita juga dapat menurunkan konsentrasi KCl hingga menghilangkan atau meningkatkan konsentrasi MgCl2 [1, 5]. Memang, beberapa pasang primer bekerja lebih baik dengan larutan yang diperkaya magnesium. Di sisi lain, dengan konsentrasi dNTP yang tinggi, konsentrasi magnesium harus ditingkatkan karena interaksi stoikiometri antara magnesium dan dNTP yang menurunkan jumlah magnesium bebas dalam media reaksi. dNTPs (deoksiribonukleosida trifosfat) menyediakan energi dan nukleotida yang dibutuhkan untuk sintesis DNA selama polimerisasi rantai. Mereka tergabung dalam media reaksi secara berlebihan, yaitu sekitar 200 μM akhir. Bergantung pada volume reaksi yang dipilih, konsentrasi primer dapat bervariasi antara 10 dan 50 pmol per sampel. DNA matriks dapat berasal dari organisme apa pun dan bahkan bahan biologis kompleks yang mencakup DNA dari berbagai organisme. Namun untuk menjamin keberhasilan suatu PCR, tetap diperlukan matriks DNA yang tidak terlalu terdegradasi. Kriteria ini jelas lebih penting karena ukuran urutan kepentingannya besar. Penting juga bahwa ekstrak DNA tidak terkontaminasi dengan inhibitor reaksi berantai polimerase (deterjen, EDTA, fenol, protein, dll.) [6, 7]. Jumlah cetakan DNA dalam media reaksi dimulai sehingga reaksi amplifikasi dapat direduksi menjadi satu salinan. Kuantitas maksimum tidak boleh melebihi 2 μg. Secara umum, jumlah yang digunakan berkisar antara 10-500 ng DNA cetakan. Jumlah Taq polimerase per sampel umumnya antara 1 dan 3 unit. Pilihan durasi siklus suhu dan jumlah siklus bergantung pada ukuran urutan yang diinginkan serta ukuran dan komplementaritas primer. Durasi harus dikurangi seminimal mungkin tidak hanya untuk menghemat waktu tetapi juga untuk mencegah risiko amplifikasi nonspesifik. Untuk denaturasi dan hibridisasi primer, biasanya 30 detik cukup. Untuk pemanjangan, dibutuhkan 1 menit per kilobase DNA yang diinginkan dan 2 menit per kilobase untuk siklus terakhir pemanjangan. Jumlah siklus, umumnya antara 20 dan 40, berbanding terbalik dengan kelimpahan matriks DNA [6, 7, 8].

 

4. DETEKSI DAN ANALISIS PRODUK PCR

Produk PCR terdiri dari satu atau lebih fragmen DNA (urutan atau urutan yang diinginkan). Deteksi dan analisis produk dapat dilakukan dengan sangat cepat dengan elektroforesis gel agarosa (atau akrilamida). DNA terungkap dengan pewarnaan etidium bromida [2, 3, 5]. Dengan demikian, produk langsung terlihat oleh transiluminasi ultraviolet (280–320 nm). Produk yang sangat kecil sering terlihat sangat dekat dengan garis depan migrasi dalam bentuk pita yang lebih atau kurang tersebar. Mereka berhubungan dengan dimer primer dan terkadang dengan primer itu sendiri. Bergantung pada kondisi reaksi, fragmen DNA nonspesifik dapat diperkuat ke tingkat yang lebih besar atau lebih kecil, membentuk pita bersih atau "smear" [6, 7, 8, 9]. Pada sistem otomatis, penganalisis fragmen sekarang digunakan. Alat ini menggunakan prinsip elektroforesis kapiler. Deteksi fragmen dilakukan oleh dioda laser. Ini hanya mungkin jika PCR dilakukan dengan primer yang digabungkan dengan fluorokrom [10].

 

5. TINJAUAN TEKNIK MOLEKULER BERDASARKAN TEKNOLOGI PCR 

Mikrosatelit bersifat hipervariabel; pada lokus, mereka sering menunjukkan lusinan alel yang berbeda satu sama lain dalam jumlah pengulangan. Mereka masih menjadi penanda pilihan untuk studi tentang keragaman, analisis paternitas dan pemetaan lokus efek kuantitatif atau quantative effect loci (QTL), meskipun hal ini dapat berubah, dalam waktu dekat, melalui elaborasi metode uji SNP yang murah. Minisatelit memiliki karakteristik yang sama dengan mikrosatelit, tetapi pengulangannya berkisar dari sepuluh hingga beberapa ratus pasang basa. Mikro dan minisatelit juga dikenal sebagai polimorfisme pengulangan tandem variabel atau variable number of tandem repeat (VNTR). Polimorfisme panjang fragmen yang diperkuat.

 

5.1 Mikrosatelit

Mikrosatelit sekarang menjadi penanda yang paling banyak digunakan dalam studi karakterisasi genetik hewan ternak [11]. Tingkat mutasi yang tinggi dan sifat kodominan mendukung perkiraan keragaman intra dan antar ras, dan percampuran genetik antar ras, bahkan jika keduanya sangat dekat. Berbagai tantangan melingkupi pilihan model mutasi — model mutasi alel tak terbatas atau progresif [12] untuk analisis data mikrosatelit. Namun, studi simulasi telah menunjukkan bahwa model mutasi alel tak terbatas umumnya berlaku untuk evaluasi keanekaragaman intrarasial [13]. Jumlah alel yang rendah per populasi dan heterozigositas yang diamati dan diharapkan adalah parameter yang paling umum digunakan untuk menilai keragaman intrarasial. Parameter paling sederhana untuk mengevaluasi keragaman antar ras adalah diferensiasi genetik atau indeks fiksasi. Beberapa penduga telah diusulkan (misalnya, FST-indeks fiksasi dan GST-glutathione S transferase), dan yang paling banyak digunakan adalah FST [14], yang mengukur derajat diferensiasi genetik subpopulasi dengan menghitung varian standar frekuensi alel populasi. Signifikansi statistik dihitung untuk nilai FST antara pasangan populasi untuk menguji hipotesis nol dari kurangnya diferensiasi genetik antara populasi dan, akibatnya, pembagian keragaman genetik [15]. Data mikrosatelit juga biasa digunakan untuk menilai hubungan genetik antara populasi dan subjek melalui estimasi jarak genetik [16, 17, 18, 19]. Ukuran jarak genetik yang paling sering digunakan adalah jarak genetik standar Nei [20]. Dalam kasus lain, jarak Cavalli-Sforza yang dimodifikasi direkomendasikan [21] untuk populasi terdekat, di mana pergeseran genetik merupakan faktor utama diferensiasi genetik. Hubungan genetik antar breed sering divisualisasikan dengan rekonstruksi suatu filogeni, paling sering menggunakan metode “tetangga-bergabung” [22]. Akan tetapi, masalah utama dalam rekonstruksi pohon filogenetik adalah bahwa evolusi garis dianggap tidak terkait, artinya garis dapat menyimpang, tetapi tidak pernah dapat berasal dari kawin silang. Asumsi ini jarang berlaku untuk hewan ternak, karena breed baru seringkali diturunkan dari persilangan antara dua atau lebih breed leluhur. Visualisasi evolusi breed dengan rekonstruksi filogenetik karenanya harus diinterpretasikan dengan sangat hati-hati.

 

5.2 Single necluotide polymorphism (SNP)

SNP digunakan sebagai alternatif mikrosatelit dalam studi keragaman genetik. Beberapa teknologi tersedia untuk mendeteksi jenis penanda SNP [23]. Sebagai penanda biallelic, SNP memiliki jumlah informasi yang relatif rendah, dan untuk mencapai level informasi panel standar dari 30 lokus mikrosatelit, jumlah yang lebih besar harus digunakan. Namun, teknologi molekuler yang terus berkembang meningkatkan otomatisasi dan mengurangi biaya pengetikan SNP, yang kemungkinan akan memungkinkan, dalam waktu dekat, analisis paralel dari sejumlah besar penanda dengan biaya yang lebih rendah. Dalam perspektif ini, proyek skala besar sedang dilaksanakan untuk beberapa spesies ternak untuk mengidentifikasi jutaan SNP [24] dan memvalidasi beberapa ribu dan mengidentifikasi haplotipe dalam genom. Seperti informasi urutan, SNP memungkinkan perbandingan langsung dan analisis gabungan dari berbagai eksperimen. SNP cenderung menjadi penanda yang menarik untuk digunakan di masa depan dalam studi keanekaragaman genetik karena mereka dapat dengan mudah digunakan dalam penilaian variasi fungsional atau netral. Namun, tahap awal dari penemuan atau pemilihan SNP dari database sangatlah penting. SNP dapat dihasilkan melalui berbagai protokol eksperimental, seperti sekuensing, polimorfisme koformasional untai tunggal (SSCP) atau denaturasi kromatografi cair kinerja tinggi (DHPLC) atau dalam silico, menyelaraskan dan membandingkan beberapa sekuens dari wilayah yang sama dari database publik pada genom dan tag ekspresi sekuensial (EST). Jika data diperoleh secara acak, penduga parameter genetik populasi standar tidak dapat diterapkan. Contoh umum adalah ketika SNP yang awalnya diidentifikasi dalam sampel kecil (panel) individu kemudian diketik menjadi sampel kromosom yang lebih besar. Dengan lebih disukai melakukan pengambilan sampel SNP pada frekuensi menengah, protokol seperti itu akan mempengaruhi distribusi frekuensi alel sehubungan dengan nilai kemungkinan untuk sampel acak. SNP menyajikan alat modern dalam konteks analisis genetik populasi; Namun, perlu untuk mengembangkan metode statistik yang akan memperhitungkan setiap metode operasi SNP dan lokasinya [25, 26].

 

5.3 Amplification Fragment Length Polymorphism (AFLP)

AFLPs adalah penanda biallelic dominan [27]. Variasi pada banyak lokus dapat diatur secara bersamaan untuk mendeteksi variasi nukleotida tunggal dari daerah genom yang tidak diketahui, di mana mutasi tertentu mungkin sering muncul pada gen fungsional yang tidak dapat ditentukan. Kerugiannya adalah mereka menunjukkan mode pewarisan yang dominan, yang mengurangi kekuatan mereka selama analisis genetik populasi pada keragaman dan kerabat antar ras. Namun, profil AFLP sangat informatif dalam evaluasi hubungan ras [28, 29, 30, 31, 32] dan spesies terkait [33].

 

5.4 Batasan polimorfisme panjang fragmen (RFLP)

Polimorfisme panjang fragmen restriksi atau Restriction fragment length polymorphism (RFLP) diidentifikasi menggunakan enzim restriksi yang memotong DNA hanya di "lokasi restriksi" tertentu (misalnya, pemotongan EcoRI di lokasi yang ditentukan oleh sekuens GAATTC palindrom). Saat ini, penggunaan RFLP yang paling umum adalah PCR hilir (PCR-RFLP) untuk mendeteksi alel yang berbeda urutannya di lokasi pembatasan tertentu. Fragmen gen pertama-tama diamplifikasi menggunakan PCR dan kemudian diekspos ke enzim restriksi spesifik yang hanya memotong salah satu bentuk alel. Amplikon yang dicerna biasanya diatasi dengan elektroforesis. Mikrosatelit atau SSR (pengulangan urutan sederhana) atau STR (pengulangan tandem pendek) terdiri dari beberapa nukleotida — 2–6 urutan DNA pasangan basa — diulang beberapa kali secara bersamaan (misalnya, CACACACACACACACA). Mereka tersebar pada genom eukariotik. Mikrosatelit berukuran relatif kecil dan, oleh karena itu, mudah diperkuat menggunakan DNA PCR yang diekstraksi dari berbagai sumber, seperti darah, rambut, kulit, atau bahkan feses. Polimorfisme dapat divisualisasikan pada gel sekuensing, dan ketersediaan sekuensing DNA otomatis memungkinkan analisis throughput tinggi dari sejumlah besar sampel [34, 35].

 

5.5 Penanda DNA mitokondria

Polimorfisme DNA mitokondria (mtDNA) telah banyak digunakan dalam analisis keragaman filogenetik dan genetik. MtDNA haploid yang diangkut oleh mitokondria dari sitoplasma seluler memiliki cara pewarisan keibuan (hewan mewarisi mtDNA dari ibunya dan bukan dari ayahnya) dan tingkat mutasi yang tinggi; itu tidak bergabung kembali. Fitur-fitur ini memungkinkan ahli biologi untuk merekonstruksi hubungan evolusi intra dan antar ras dengan mengevaluasi pola mutasi mtDNA. Tag mtDNA juga dapat memberikan cara cepat untuk mendeteksi hibridisasi antara spesies yang dibudidayakan dan subspesies [36]. Polimorfisme di wilayah hipervariabel lingkaran-D atau wilayah kontrol mtDNA sebagian besar telah berkontribusi pada identifikasi keturunan liar spesies domestik dan pembentukan model geografis keanekaragaman genetik.

 

6. APLIKASI

6.1 Kloning aseluler

Ini adalah salah satu aplikasi PCR yang paling luar biasa. Ini memungkinkan untuk mengisolasi, yaitu, untuk memurnikan gen tanpa menggunakan metode kloning molekuler tradisional yang terdiri dari memasukkan perpustakaan DNA dalam vektor plasmid yang kemudian digunakan untuk mengubah strain bakteri yang klonnya setelah seleksi disaring. Realisasinya jauh lebih cepat dan lebih tidak acak menggunakan PCR. Kloning aseluler digunakan saat menggunakan PCR karena tidak ada gunanya menggunakan sistem seluler (bakteri, ragi, dan sel hewan atau tumbuhan) untuk memperkuat klon. Realisasi kloning molekuler dengan PCR bergantung pada dua kriteria utama: pilihan ekstrak DNA (DNA matriks) dan primer. Memang penting untuk memiliki data yang kurang lebih dapat diandalkan tentang urutan gen yang akan dikloning dan / atau urutan mengapit untuk mensintesis set primer yang diperlukan untuk amplifikasinya secara keseluruhan atau sebagian. Di sisi lain, apakah masih perlu untuk melakukan PCR pada matriks DNA yang sesuai [37, 38]. Kita dapat memilih DNA genom yang mencakup sekuens total genom dan karenanya semua gen spesies. Dalam hal ini, gen termasuk ekson dan intron dan hasil amplifikasinya dalam kloning urutan gen lengkap dan bahkan, tergantung pada primer yang telah dipilih, daerah pengaturan. Tetapi kita juga dapat memilih untuk mengekstrak messenger RNA (mRNA), artinya satu-satunya urutan pengkodean gen — transkrip. Karena RNA tidak stabil, messenger RNA diubah menjadi DNA komplementer (cDNA) oleh RT-PCR (lihat di bawah), varian PCR yang menggunakan reverse transcriptase dan memungkinkan perubahan urutan RNA menjadi DNA. Di pustaka cDNA inilah PCR kemudian dilakukan untuk mengkloning gen yang diinginkan. Dalam kasus ini, kesepakatannya lebih kompleks. Adanya transkrip gen dalam ekstrak bergantung pada jenis sel, jaringan, atau organ tempat ekstraksi mRNA dilakukan. Memang, transkripsi dikhususkan untuk jenis sel. Lebih serius lagi, ekspresi suatu gen sering kali diatur oleh faktor fisiologis, lingkungan, dalam hal ini gen yang diinginkan belum tentu ditranskripsikan dan pustaka cDNA mungkin tidak mengandungnya. Akhirnya, harus dikatakan bahwa transkripsi diatur dengan sendirinya dan sering kali disertai dengan penyambungan alternatif. Fenomena ini menyebabkan eliminasi ekson pada saat eksisi intron dan mengarah pada ekspresi protein yang berbeda dari gen yang sama. Oleh karena itu, bergantung pada jenis sel dan profil pengatur, kita mungkin tidak berurusan dengan transkrip yang sama. Meskipun demikian, sangat menarik untuk mengkloning transkrip karena urutan nukleotidanya sesuai dengan urutan asam amino yang dihasilkan dari translasi. Di sisi lain, dengan cDNA, lebih mudah untuk melakukan ekspresi gen dan evaluasi protein fungsional atau protein yang sesuai dalam model ekspresi seluler. Sangat sering, kloning PCR dipraktekkan secara paralel pada DNA genom (perpustakaan genom) dan perpustakaan cDNA yang berbeda untuk menentukan urutan lengkap gen, profil ekspresinya, modalitas regulasi sambungan [8, 39], dll.

 

6.2 Membalik transkriptase PCR (RT-PCR)

Seperti dibahas di bab sebelumnya, mungkin relevan untuk mengekstrak mRNA untuk kemudian menghasilkan salinan cDNA. Reaksi ini dikatalisis oleh retrovirus reverse transcriptase (reverse transcriptase) yang mensintesis rantai DNA dari template RNA. Pada awalnya, total RNA diekstraksi. MRNA diisolasi dari RNA total dengan kromatografi afinitas menggunakan oligodT (poligon oligonukleotida) karena RNA kurir dicirikan oleh urutan 3'polyA. Kemudian, mRNA mengalami reverse transcriptase yang akan menghasilkan salinan DNA (cDNA) dari setiap mRNA. Setelah transkripsi balik, mRNA dihidrolisis (perlakuan basa, RNase, atau suhu). Langkah-langkah berikut dilakukan di dalam penutup pengendara sepeda termal. CDNA untai tunggal kemudian direplikasi oleh DNA polimerase selama siklus suhu pertama [40, 41]. Siklus lain diulangi untuk memperkuat cDNA untai ganda dalam jumlah besar. Dalam fenotipe sel tertentu, diperkirakan 10–15.000 gen diekspresikan pada manusia dan kebanyakan mamalia. Beberapa transkrip sel diekspresikan dalam beberapa ratus atau bahkan beberapa ribu salinan per sel, tetapi sebagian besar transkrip menunjukkan jumlah salinan yang rendah. Profil ekspresi transkrip mengalami variasi kualitatif atau kuantitatif yang mencerminkan dinamika biologis sel. Oleh karena itu, identifikasi variasi ekspresi gen dalam konteks fisiologis atau patologis tertentu dapat memberikan informasi berharga mengenai fungsi gen dan pengaruh faktor modulasi pada ekspresinya, baik secara fisiologis maupun lingkungan. Analisis variasi ekspresi gen yang terlibat dalam patologi dapat mengarah pada target terapeutik atau diagnostik baru. Akhirnya, dari sudut pandang fundamental, mempelajari profil ekspresi gen memungkinkan untuk maju dalam memahami mekanisme fisiologi seluler [40, 41, 42].

 

6.3 PCR kuantitatif dalam waktu nyata (PCR waktu nyata kuantitatif)

Dikembangkan pada pertengahan 1980-an, PCR kuantitatif dapat menentukan tingkat DNA atau RNA spesifik dalam sampel biologis. Metode ini didasarkan pada deteksi sinyal fluoresen yang dihasilkan secara proporsional dengan amplifikasi produk PCR, siklus demi siklus. Ini membutuhkan sepeda termal yang digabungkan ke sistem pembacaan optik yang mengukur emisi fluoresensi. Probe nukleotida disintesis sehingga dapat menghibridisasi secara selektif ke DNA yang diinginkan antara sekuens tempat primer hibridisasi. Probe diberi label di ujung 5 'dengan sinyal fluorochrome (misalnya, 6-carboxyfluorescein), dan di ujung 3' dengan quencher (misalnya, 6-carboxy-tetramethyl rhodamine). Probe ini harus menunjukkan hibridisasi suhu (Tm) lebih besar dari primer sehingga hibridisasi 100% selama fase perpanjangan (parameter kritis) [43, 44, 45].

 

Selama dua fluorokrom tetap ada di probe, alat pemadam mencegah fluoresensi sinyal. Pada langkah ini, kedekatan quencher dan sinyal menyebabkan kurangnya emisi fluoresensi. Selama fase perpanjangan ini, polimerase Taq, yang memiliki aktivitas nuklease 5′ – 3 'intrinsik, menurunkan probe dan melepaskan sinyal fluorochrome. Tingkat fluoresensi kemudian dilepaskan sebanding dengan jumlah produk PCR yang dihasilkan di setiap siklus. Penggerak termal dirancang sedemikian rupa sehingga setiap sampel (PCR umumnya dilakukan di pelat 96-sumur) terhubung ke sistem optik. Ini termasuk pemancar laser yang terhubung ke serat optik. Laser, melalui serat optik, merangsang fluorokrom dalam campuran reaksi PCR. Fluoresensi yang dipancarkan dipancarkan ulang, selalu melalui serat optik, ke kamera digital yang terhubung ke komputer. Perangkat lunak kemudian menganalisis dan menyimpan data. PCR kuantitatif adalah metode spesifisitas dan sensitivitas tinggi. Ini sangat tepat waktu untuk aplikasi yang tak terhitung jumlahnya. PCR konvensional hanya menyediakan data kualitatif (ada atau tidak adanya DNA yang diinginkan, pemurnian DNA ini). PCR kuantitatif, seperti namanya, memungkinkan untuk mengetahui lebih tepat jumlah DNA yang diinginkan (atau RNA, karena dimungkinkan untuk melakukan RT-PCR kuantitatif dengan peralatan yang sama) [45, 46, 47]. Memang sangat sering digunakan untuk tujuan ini, misalnya untuk menentukan viral load, khususnya pada kasus hepatitis C atau AIDS. Salah satu aplikasi yang paling luar biasa dan berguna adalah analisis ekspresi gen melalui pengukuran transkrip kuantitatif.

 

6.4 PCR semi-kuantitatif atau kompetitif

Ini dalam banyak kasus RT-PCR. Dalam kasus kuantitatif PCR, tingkat RNA atau DNA yang diinginkan diukur sebagai jumlah absolut. Dalam kasus PCR semi-kuantitatif atau PCR kompetitif, ini adalah masalah mengukur kuantitas relatif dengan menggunakan standar yang sesuai dengan RNA atau lebih jarang dengan DNA. Ini dalam banyak kasus RT-PCR. Standar ini bisa internal atau eksternal. Standar eksternal mungkin homolog atau heterolog. Standar adalah RNA (lebih jarang DNA) yang ada dalam ekstrak RNA (standar internal) atau yang ditambahkan dalam jumlah yang diketahui dalam campuran reaksi (standar eksternal). Standar diperkuat pada saat yang sama dengan RNA yang diinginkan. Oleh karena itu, ada persaingan antara amplifikasi standar dan DNA yang diinginkan. Semakin tinggi kuantitas standar, semakin sedikit RNA yang diinginkan akan diperkuat dan oleh karena itu jumlahnya akan kecil. Tentu saja, metode analisis sampel PCR harus memungkinkan untuk membedakan standar sehubungan dengan RNA yang diinginkan di satu sisi dan di sisi lain untuk mengevaluasi jumlah relatif DNA yang diinginkan dengan membandingkan dengan jumlah standar yang diketahui [48]. Standar internal adalah RNA endogen, sesuai dengan gen RNA yang ekspresinya dianggap konstan (aktin, beta2-mikroglobulin, dll.) Dan yang ada dalam populasi matriks RNA selama transkripsi balik. Standar ini memiliki kelemahan utama: mereka membutuhkan penggunaan primer yang berbeda dari yang digunakan untuk RNA yang diinginkan. Karenanya, kinetika amplifikasi sangat berbeda, dan sangat sulit atau tidak mungkin untuk menjamin ekspresi konstan antara sampel yang berbeda. Standar RNA eksternal homolog adalah RNA sintetis yang berbagi situs hibridisasi priming yang sama dengan RNA yang diinginkan dan yang memiliki urutan keseluruhan yang sama, dengan sedikit mutasi, penghapusan, atau penyisipan yang akan memungkinkan identifikasi dan kuantifikasinya sehubungan dengan sinyal. diberikan oleh RNA yang diinginkan. Standar ini memungkinkan di satu sisi untuk menghargai variabilitas yang diperkenalkan pada level RT dan, di sisi lain, umumnya memiliki efisiensi amplifikasi yang sama dengan RNA yang diinginkan apakah itu pada level RT atau PCR [48, 49].

 

Standar RNA eksternal yang heterolog adalah RNA eksogen dan oleh karena itu laju mereka dapat dikontrol. Namun, tidak seperti standar eksternal homolog, mereka memiliki efisiensi amplifikasi yang berbeda dibandingkan dengan RNA yang diinginkan. Dalam kasus RT-PCR kuantitatif (PCR semi-kuantitatif), standar terdiri dari larutan DNA yang dititrasi dengan urutan yang identik dengan DNA yang ingin dikuantifikasi. Serangkaian pengenceran dilakukan, masing-masing digunakan untuk amplifikasi. Ini kemudian menjadi pertanyaan untuk menentukan jumlah siklus ideal yang akan ditempatkan dalam fase eksponensial reaksi sambil memastikan amplifikasi yang efektif. Kemudian, setiap pengenceran DNA standar serta DNA yang diekstraksi dari sampel yang akan dikuantifikasi dikirim secara paralel ke reaksi PCR. Kurva standar dibuat dengan pengenceran standar [sinyal = f (konsentrasi)]. Mengetahui nilai sinyal yang diukur pada sampel yang akan dikuantifikasi, jumlah salinan yang sesuai dapat diekstrapolasi dari kurva. Dalam kasus PCR kompetitif, serangkaian pengenceran RNA standar sintetis eksternal homolog diperkuat bersama dengan jumlah yang setara dari total RNA (dan dengan demikian jumlah yang setara dari gen asli) [50, 51]. Standar tersebut bersaing dengan RNA yang diinginkan untuk polimerase dan primer. Ketika konsentrasi standar meningkat, sinyal dari gen yang diinginkan akan menurun. Di sini, PCR tidak perlu dilakukan dalam fase eksponensial dan hasilnya menunjukkan reproduktifitas yang benar. Namun, metode ini rumit dan tidak memungkinkan untuk mengelola banyak sampel secara bersamaan [52].

 

6.5 PCR diterapkan untuk diagnosis

PCR adalah alat diagnostik yang luar biasa. Ini sudah banyak digunakan dalam mendeteksi penyakit genetik. Amplifikasi semua atau sebagian gen yang bertanggung jawab atas penyakit genetik memungkinkan terungkapnya mutasi yang merusak, posisi, ukuran, dan sifatnya. Dengan demikian dimungkinkan untuk mendeteksi penghapusan, inversi, penyisipan, dan bahkan mutasi titik, baik dengan analisis langsung produk PCR dengan elektroforesis atau dengan menggabungkan PCR dengan teknik lain [53]. Tetapi PCR masih dapat digunakan untuk mendeteksi penyakit menular (virus, bakteri, parasit, dll.), Seperti halnya pada kasus AIDS, hepatitis C, atau infeksi klamidia. Meskipun alat diagnostik lain efektif dalam mendeteksi penyakit ini, PCR memiliki keuntungan besar dalam menghasilkan hasil yang sangat andal dan cepat dari sampel biologis kecil di mana keberadaan patogen tidak selalu dapat dideteksi dengan teknik lain [53, 54].

 

6.6 Deteksi penyakit genetik

Dalam konteks penyakit genetik, ini adalah pertanyaan untuk mendeteksi mutasi pada urutan suatu gen. Beberapa situasi muncul.  Yang paling sederhana menyangkut penyisipan dan penghapusan. Dalam kasus ini, mutasi dimanifestasikan oleh perubahan ukuran gen atau bagian dari gen tersebut. Sejauh mutasi diketahui dan dijelaskan, mutasi sudah cukup untuk memperkuat semua atau sebagian gen. Dalam kasus penyisipan, produk PCR dari DNA pasien lebih panjang daripada produk dari orang sehat. Penghapusan memberikan hasil yang berlawanan [55]. Analisis produk PCR dengan elektroforesis, dan oleh karena itu evaluasi ukurannya, mengarah langsung ke diagnosis. Deteksi inversi dan mutasi titik lebih rumit. Perbedaan ukuran antara DNA yang sehat dan yang sakit adalah nol dalam kasus inversi dan hampir nol dalam kasus mutasi titik. Oleh karena itu, kami tidak dapat mempertahankan kriteria ukuran produk PCR untuk mencapai hasil. Oleh karena itu, perlu menggunakan teknik yang melengkapi PCR. Tiga pendekatan dapat dipilih, noda selatan, polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP), atau deteksi ketidakcocokan. South blot terdiri dari hibridisasi pada produk PCR sebuah probe oligonukleotida yang ditandai, berkat isotop radioaktif atau fluorochrome, yang urutannya saling melengkapi dan oleh karena itu spesifik untuk yang sesuai dengan mutasi. Strategi ini cocok untuk kasus inversi [56, 57].

 

RFLP dapat mendeteksi inversi seperti mutasi titik. Ini melibatkan enzim restriksi yang mampu menghidrolisis produk PCR pada urutan yang mengatur mutasi. Pendekatan ini hanya mungkin jika situs restriksi memang ada pada urutan ini, apakah itu alel yang bermutasi atau alel tipe liar. Enzim restriksi dengan demikian menghidrolisis produk PCR yang berasal dari DNA yang sehat atau yang berasal dari DNA yang sakit. Dari produk PCR ini, satu atau dua fragmen DNA diperoleh yang kemudian diungkapkan dengan elektroforesis. Deteksi ketidakcocokan, seperti RFLP, disesuaikan dengan inversi dan mutasi titik [57, 58, 59]. Produk PCR dari DNA pasien (DNA sampel) dicampur dengan produk PCR dari DNA orang sehat (DNA referensi). Campuran ini kemudian didenaturasi oleh suhu dan kemudian dihibridisasi kembali. Ya, sampel DNA bermutasi; pasangan antara DNA sampel dan DNA referensi tidak akan lengkap pada tingkat mutasi. Ketidaksesuaian menyangkut pasangan basa tunggal dalam kasus mutasi titik dan beberapa pasangan basa dalam kasus inversi. Ketidaksesuaian ini kemudian didegradasi oleh nuklease S1, enzim yang hanya mendegradasi DNA untai tunggal. Solusi lain adalah dengan memecah ketidaksesuaian secara kimiawi (osmium tetroksida, kemudian piperidin), tetapi lebih cocok untuk mutasi titik. Singkatnya, mutasi menyebabkan ketidaksesuaian pada tingkat pembelahan enzimatis atau kimiawi yang mengarah pada pembentukan dua fragmen dari satu produk PCR. Fragmen ini dianalisis dengan elektroforesis.

 

6.7 Deteksi penyakit menular

Kontaminasi dengan virus atau mikroorganisme (bakteri, parasit, dll.) Selalu menyebabkan adanya materi genetik di semua atau sebagian organisme yang terinfeksi. Oleh karena itu, PCR merupakan alat yang lebih efektif dalam mendeteksi keberadaan patogen dalam sampel biologis yang sensitivitas dan spesifisitasnya sangat besar. Kinerja diagnosis PCR pada dasarnya didasarkan pada kriteria: pilihan primer yang mampu secara selektif memperkuat urutan DNA virus atau mikroorganisme [57, 58, 59]. DNA matriks, di sisi lain, harus diekstraksi dari jaringan di mana mikroorganisme ada. Oleh karena itu, cukup memperkuat urutan patogen tertentu dari sampel yang diambil pada pasien dan menganalisis produk PCR dengan elektroforesis. Ukuran fragmen DNA yang diperkuat, yang harus sesuai dengan ukuran yang diharapkan, menjamin keandalan hasil dan juga diagnosisnya. Dalam kasus pengujian AIDS (HIV), misalnya, pengujian rutin didasarkan pada metode ELISA untuk mendeteksi antibodi HIV atau antigen virus dalam serum pasien dengan teknik immunoassay. Metode ini, cukup andal dan murah, namun memiliki beberapa kekurangan. Positif palsu cukup umum karena reaktivitas silang. Sampel positif karena itu diuji untuk kontrol dengan teknik rutin lain, Western blot. Masih ada masalah orang HIV positif yang tidak membawa virus, seperti anak yang ibunya mengidap AIDS. Darah bayi baru lahir ini biasanya mengandung antibodi anti-HIV yang berasal dari ibu dan oleh karena itu seropositif. Di sisi lain, mereka belum tentu membawa virus. Dalam kasus jenis ini, diagnosis PCR relevan [57, 58, 59, 60]. Metode ini melibatkan penguatan urutan tertentu provirus dari ekstrak limfosit. Prinsip yang sama digunakan untuk mendeteksi toksoplasma pada bayi baru lahir yang ibunya adalah karier. Tentu saja memungkinkan untuk mendiagnosis AIDS dengan RT-PCR dengan mencari RNA virus dalam serum pasien.  Metode Kuantitatif atau semi-kuantitatif telah dikembangkan yang juga memungkinkan untuk mengevaluasi viral load.

 

6.8 PCR diterapkan untuk identifikasi

PCR sangat efektif dalam mengidentifikasi spesies, varietas, atau individu dengan sidik jari genetik. Aplikasi ini didasarkan pada pengetahuan yang diperoleh tentang struktur genom. Ini hanya untuk memperkuat urutan nukleotida yang spesifik untuk spesies, varietas, atau individu. Khususnya pada eukariota, urutan ini sangat banyak dan menawarkan palet luas yang memungkinkan identifikasi dengan cara yang sangat tepat dan sangat selektif. Memang, genom organisme eukariotik memiliki, tidak seperti prokariota, urutan pengkodean dan urutan nonkode. Urutan pengkodean sesuai dengan gen dan karena itu diterjemahkan menjadi protein. Urutan noncoding, yang karenanya tidak diterjemahkan, mewakili sebagian besar DNA genom eukariotik (hingga 98%). Urutan pengkodean sangat homolog pada individu dari spesies yang sama. Memang, spesies dicirikan oleh karakter dan ciri umum yang dijamin oleh gennya. Perbedaan fenotipik antara individu yang menyusunnya didasarkan pada variasi alel dan perbedaan alel dari gen yang sama menunjukkan perbedaan urutan yang sangat kecil (dari urutan 1 pasangan basa per 1000) [61, 62]. Dari satu spesies ke spesies lainnya, bergantung pada jarak filogenetik yang memisahkan mereka, urutan gen yang mengkode fungsi yang sama memiliki homologi yang sangat kuat, terlebih lagi sehingga fungsi gen tersebut penting untuk embriogenesis atau metabolisme. Akibatnya, urutan pengkodean memiliki sedikit relevansi dalam hal identifikasi. Di sisi lain, urutan noncoding sangat polimorfis antara spesies seperti antara individu dari spesies yang sama. Dengan demikian, mereka menyajikan banyak pilihan penanda genetik yang memungkinkan dilakukannya uji identifikasi yang sangat diskriminatif. Di antara penanda ini adalah minisatelit (atau jumlah variabel pengulangan tandem) dan mikrosatelit (atau STR, pengulangan tandem pendek) [61, 62, 63]. VNTR dan STR adalah polimorfisme berulang yang terdiri dari urutan yang diulang bersama-sama. Urutan berulang ini mengukur dari 10 hingga 40 pasangan basa untuk VNTR dan dari 1 hingga 5 pasangan basa untuk STR. Dari satu individu ke individu lainnya, urutan berulang dari VNTR atau STR identik tetapi jumlah pengulangan dan oleh karena itu ukuran VNTR atau STR bisa sangat bervariasi (kita berbicara tentang alel). Di sisi lain, ada banyak variasi VNTR dan STR pada genom eukariotik. Deteksi polimorfisme STR atau VNTR dilakukan dengan PCR menggunakan primer yang dihibridisasi menjadi rangkaian mengapit nonpolimorfik. Produk amplifikasi kemudian dianalisis dengan elektroforesis atau menjalani analisis fragmen menggunakan sekuenser kapiler. Sekarang dimungkinkan untuk memperkuat beberapa STR atau VNTR secara bersamaan dengan menggunakan beberapa pasang primer. Variasi produk amplifikasi yang diperoleh mengarah ke footprint yang merupakan individu tertentu. Di sisi lain, kekuatan PCR memungkinkan untuk memperkuat mikro dan minisatelit dari DNA yang sangat sedikit. Sidik jari DNA telah menjadi lebih umum dalam beberapa tahun terakhir dalam konteks investigasi yudisial. Tetapi teknik ini sama efektifnya pada spesies lain seperti manusia dan memungkinkan tidak hanya mengidentifikasi individu tetapi juga varietas atau spesies. Jenis identifikasi hanya bergantung pada pilihan penanda. Demikian pula, untuk tujuan identifikasi varietas, seseorang biasanya dapat melanjutkan sesuai dengan protokol yang diturunkan dari PCR [64, 65, 66].

 

Dua teknik yang relevan adalah amplifikasi acak DNA polimorfik (RAPD) dan amplifikasi polimorfisme panjang fragmen (AFLP). (Amplifikasi acak DNA polimorfik (RAPD) adalah PCR untuk identifikasi varietas yang menggunakan pasangan primer acak dengan ukuran yang diperkecil (sekitar 10 pasangan basa). Primer ini akan berhibridisasi secara acak, tetapi PCR biasanya menghasilkan profil amplifikasi elektroforesis yang khusus untuk variasi dari mana DNA matriks diturunkan. Amplifikasi polimorfisme panjang fragmen (AFLP) adalah metode yang jauh lebih efisien. Metode pertama terdiri dari hidrolisis DNA genom dengan satu atau dua restriksi endonuklease yang lebih baik. Kemudian, kami melanjutkan dengan ligasi adaptor ( urutan DNA yang ditentukan sekitar 15 nukleotida) pada tingkat ujung kohesif yang dihasilkan oleh enzim restriksi. Akhirnya, produk ligasi diperkuat oleh PCR dengan sepasang primer yang berhibridisasi pada tingkat adaptor. AFLP memberikan a Hasil yang sebanding dengan RAPD. Namun, AFLP menunjukkan hasil yang lebih bersih dan lebih dapat direproduksi. Ini adalah metode yang paling berhasil hingga saat ini diterapkan pada identifikasi varietas.

 

7. KESIMPULAN

Perluasan pendekatan genotipe untuk semua organisme hidup telah membuat kemajuan signifikan dalam rekonstruksi sejarah kehidupan. Pada tingkat populasi, distribusi dan frekuensi polimorfisme genetik yang diketahui dalam suatu spesies dapat menyoroti kekuatan yang berkembang yang berperan, mengungkap efek seleksi alam, dan menyimpulkan perubahan demografis.  Selain itu, perbandingan urutan gen yang sama antara spesies yang berbeda dan seluruh genom adalah pada asal mula filogeni molekuler yang saat ini berlaku dalam klasifikasi. Mereka memungkinkan untuk melacak hubungan antar spesies berdasarkan perbedaan urutan DNA mereka. Dengan demikian, PCR merupakan tahapan kunci di dua tingkat. Yang pertama menyangkut isolasi gen homolog pada beberapa spesies dan karakterisasinya. Yang kedua adalah produksi DNA genom total yang diamplifikasi untuk sekuensing genom dan analisis komparatif. Tetapi PCR juga digunakan untuk mengidentifikasi warisan genetik dari organisme yang hilang. DNA rusak oleh fragmentasi setelah kematian tubuh. Jika kita dapat memulihkan fragmen-fragmen ini dan memperkuatnya, itu menjadi mungkin, terlepas dari statusnya, untuk menyimpulkan semua atau sebagian dari genom awal individu tersebut. PCR dengan demikian telah menjadi alat utama di bidang paleogenetika, yang terdiri dari pemulihan dan analisis urutan DNA dari organisme yang kurang lebih tua, dan ini juga dari sisa-sisa yang diawetkan dalam koleksi museum, dari situs bersejarah di mana sisa-sisa kerangka atau mumi organisme punah selama ratusan ribu atau bahkan ratusan ribu tahun. Penggunaan PCR dengan demikian segera berhenti terbatas pada studi biologi, untuk mendapatkan disiplin ilmu atau bidang kegiatan lain.

 

Sumber:

Karim Kadri (June 7th 2019). Polymerase Chain Reaction (PCR): Principle and Applications, Synthetic Biology - New Interdisciplinary Science, Madan L. Nagpal, Oana-Maria Boldura, Cornel Baltă and Shymaa Enany, IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen.86491. Available from: https://www.intechopen.com/books/synthetic-biology-new-interdisciplinary-science/polymerase-chain-reaction-pcr-principle-and-applications