Inaktivasi Virus Penyakit Mulut dan Kuku

 

Inaktivasi Virus Penyakit Mulut dan Kuku oleh Asam Sitrat dan Natrium Karbonat dengan Deicers

 

RINGKASAN

 

Tiga dari lima wabah penyakit mulut dan kuku (PMK) sejak 2010 di Republik Korea terjadi pada musim dingin. Pada suhu beku, penyemprotan disinfektan tidak mungkin dilakukan pada permukaan kendaraan, jalan, dan bangunan pertanian karena disinfektan akan membeku segera setelah dibuang dan permukaan jalan atau mesin akan menjadi licin saat cuaca dingin.

 

Dalam penelitian ini, kami menambahkan bahan kimia penghilang es (etilen glikol, propilen glikol, natrium klorida, kalsium klorida, etil alkohol, dan cairan pencuci kaca depan komersial) untuk menjaga disinfektan (asam sitrat 0,2% dan natrium karbonat 4%) agar tidak membeku, dan kami menguji khasiat virucidal mereka di bawah simulasi suhu dingin dalam tabung.

 

Asam sitrat 0,2% dapat mengurangi log virus titer 4 pada suhu -20°C dengan semua deicer. Di sisi lain, natrium karbonat 4% menunjukkan sedikit aktivitas virucidal pada suhu -20°C dalam waktu 30 menit, meskipun tahan beku dengan fungsi deicers. Sebagai kesimpulan, untuk musim dingin, kami dapat merekomendasikan penggunaan asam sitrat (>0,2%) yang diencerkan dalam etil alkohol 30% atau pelarut natrium klorida 25%, tergantung tujuannya.

 

INTRODUKSI

 

Penyakit mulut dan kuku (PMK) adalah penyakit virus akut yang menyerang hewan berkuku belah, seperti sapi, babi, domba, kambing, dan rusa. Gejalanya meliputi peningkatan suhu tubuh, ketimpangan, dan lecet di mulut, lidah, atau puting susu atau di antara kuku; itu mempengaruhi pertumbuhan, laktasi, gerak, dan berkembang biak (1,–3). Virus penyakit mulut dan kuku (FMDV) milik genus Aphthovirus dari keluarga Picornaviridae, dan klasifikasinya memiliki tujuh serotipe (O, A, Asia 1, C, SAT 1, SAT 2, dan SAT 3) dan sekitar 80 subtipe (4, 5).

 

Sejak 2010, ada lima wabah PMK (tiga di antaranya berlangsung selama musim dingin) di Republik Korea (ROK). Selama periode tersebut, disinfektan cair tidak dapat digunakan secara memadai di luar ruangan karena takut akan membeku. Di ROK, Januari adalah bulan terdingin: suhu rata-ratanya berkisar dari −6°C hingga 7°C, dan suhu rendah harian sering turun hingga sekitar −20°C di beberapa daerah utara atau pegunungan.

 

Kegagalan desinfeksi kendaraan, gedung, dan jalan di wilayah yang terkontaminasi akibat cuaca dingin dimunculkan sebagai salah satu faktor tidak dihentikannya transmisi pada tahap awal wabah 2010-2011 (6). Mengenai keterbatasan disinfektan konvensional, penambahan deicers guna menurunkan titik beku penggunaannya pada musim dingin perlu diperhatikan.

 

Dalam kasus virus flu burung, etilen glikol atau metil alkohol berguna untuk menurunkan titik beku dan menjaga kemanjuran produk desinfektan berbasis fenol dan amonium kuaterner (7). Namun, uji reaksi tampaknya dilakukan pada atau di atas 4°C, yang bukan merupakan suhu sebenarnya di luar pada musim dingin, meskipun konsentrasi antibeku yang ditetapkan untuk campuran antibeku-disinfektan ternyata tidak dapat dibekukan pada suhu -15°C (7).

 

Untuk FMD, disinfektan asam atau alkali efektif dalam menonaktifkan virus, dan keberadaan bahan organik atau deterjen jarang memengaruhi efek tersebut selama nilai pH dipertahankan cukup asam atau basa (8). Asam sitrat adalah salah satu asam yang paling banyak digunakan untuk PMK, dan ternyata menjadi komponen utama disinfektan yang dipasok di ROK (9).

 

Natrium karbonat, yang dikenal sebagai soda pencuci, juga merupakan alkali yang terkenal untuk menonaktifkan FMDV. Dalam penelitian ini, kami menggunakan enam bahan kimia penghilang es (garam anorganik untuk jalan atau antibeku untuk penggunaan lain) untuk menurunkan titik beku asam sitrat 0,2% dan natrium karbonat 4% dan menentukan efek virucidal dari campurannya untuk FMDV.

 

BAHAN DAN METODE

 

Virus dan sel.

Virus penyakit mulut dan kuku serotipe O dan A, yang dikumpulkan dari ROK pada tahun 2010, dibiakkan dalam bovine kidney cell line (LFBK) yang ditumbuhkan dalam medium Dulbecco modified Eagle (DMEM) dengan glukosa tinggi (Cellgro, USA) yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS; Cellgro). (Garis sel ini dengan baik hati disediakan oleh Luis Rodriguez dari ARS, USDA.).

 

Disinfektan dan bahan kimia deicing.

Bahan kimia dan produk berikut digunakan sebagai disinfektan atau penghilang es: asam sitrat (C6H8O7; Sigma-Aldrich), natrium karbonat (Na2CO3; Sigma-Aldrich), etilen glikol (HOCH2CH2OH; Sigma-Aldrich), propilen glikol [CH3CH(OH)CH2OH ; Sigma-Aldrich], natrium klorida (NaCl; Sigma-Aldrich), kalsium klorida (CaCl2; Sigma-Aldrich), etil alkohol (CH3CH2OH; Sigma-Aldrich), dan cairan pencuci kaca depan (SK Networks, ROK) yang mengandung 38 hingga ∼39 % (vol/vol) metil alkohol (CH3OH).

Disinfektan diencerkan dalam air keras WHO steril yang mengandung kalsium klorida (0,305 g; Sigma-Aldrich) dan magnesium klorida (MgCl2•6H2O; 0,139 g; Sigma-Aldrich) dalam 1 liter air deionisasi. Untuk mengotori campuran desinfektan dan deicer, 5% FBS (Cellgro) digunakan sebagai pelarut.

 

Uji fisikokimia dan khasiat campuran deicer dan disinfektan.

Pada awalnya, setiap jenis deicers kimia diencerkan dalam air sadah dan dikenakan suhu beku (−20°C) selama 24 jam untuk menemukan kisaran konsentrasinya di mana larutan tersebut tidak membeku (data tidak ditampilkan). Setelah itu, asam sitrat 0,2% dan natrium karbonat 4% diencerkan dalam larutan tersebut dan kemudian diperiksa perubahan nilai pH, keadaan fisik, dan sedimentasinya setelah disimpan pada suhu 37°C, −20°C, dan −40°C selama 24 jam (Tabel 1). Dari hasil ini, ditentukan konsentrasi optimal dari masing-masing deicer, dan pada level ini, campuran deicer dan disinfektan diuji efek virucidalnya terhadap virus PMK, serotipe O, pada berbagai suhu (37°C, 4 °C, dan −20°C) untuk berbagai periode (5 menit dan 30 menit).

 

TABEL 1 Kondisi fisikokimia dan nilai pH campuran deicer-disinfektan yang disimpan selama 24 jam pada berbagai temperatur

 

^aL, cair; F, beku. Jumlah tanda plus sesuai dengan tingkat sedimentasi. −, tidak ada sedimentasi.

 

Sepuluh mikroliter supernatan virus yang didinginkan dari serotipe O atau A dengan titer> 10⁷ 50% dosis infektif kultur jaringan (TCID₅₀)/ml ditambahkan dengan hati-hati ke 10 μl larutan deicer-disinfektan dalam tabung mikro di thermorack (Eppendorf, Jerman) , yang telah diseimbangkan dengan suhu yang ditentukan (37°C, 4°C, dan −20°C) selama 24 jam di dalam inkubator atau freezer. Campuran tersebut dicampur dengan cepat dan hati-hati dengan memipet ke atas dan ke bawah sehingga virus tidak akan menyentuh dinding tabung dengan sendirinya. Setelah itu, campuran ditempatkan kembali ke dalam inkubator atau freezer selama periode yang diinginkan, dan kemudian ditambahkan 980 μl media penetral (5% FBS) untuk menonaktifkan efek virucidal dari disinfektan (1:50).

 

Sitotoksisitas desinfektan dan deicers pada sel ditemukan dinetralkan dalam proses ini. Infektivitas virus sebelum dan sesudah pengobatan diukur dengan titrasi dalam sel LFBK pada pelat mikrotiter 96 lubang, di mana efek sitopatik yang diinduksi virus (CPE) diperiksa selama 48 jam dan TCID₅₀ ditentukan berdasarkan metode tersebut. dari Reed dan Muench (10).  Untuk deicer terpilih (natrium klorida dan etil alkohol), kami melakukan uji desinfeksi terhadap dua virus serotipe O dan A yang berbeda dengan kondisi mengotori campuran deicer-disinfektan dengan FBS 5%.

 

HASIL

 

Efek deicers pada sifat fisiokimia disinfektan.

Kisaran konsentrasi masing-masing deicer di mana campurannya dengan disinfektan tahan beku pada suhu -20°C telah ditentukan (Tabel 1). Untuk asam sitrat 0,2%, nilai pH berkisar antara 0,9 hingga 3,4, bergantung pada berbagai suhu dan kombinasi dengan deicer; kalsium klorida paling banyak mempengaruhi pH larutan dengan menurunkannya menjadi 0,9 hingga ∼0,99, dan natrium klorida juga menurunkan pH larutan, menjadi sekitar 1,73 hingga ∼2,23 (Tabel 1).

 

Pada suhu -40°C, dalam kasus konsentrasi deicer yang lebih rendah, asam sitrat 0,2% dibekukan sedikit. Untuk natrium karbonat 4%, nilai pH berkisar dari 9,70 hingga 11,94 tergantung pada berbagai suhu dan kombinasi dengan deicer, kecuali untuk kalsium klorida, yang mengendap dengan natrium karbonat dan menurunkan pH larutan menjadi 5,01 hingga ∼5,06 (Tabel 1 ). Campuran penghilang es natrium karbonat ini tampaknya lebih mudah dibekukan pada suhu -40°C daripada asam sitrat, meskipun keadaan bekunya tidak begitu padat.

 

Dalam konsentrasi yang lebih tinggi dari cairan pencuci kaca depan dan etil alkohol pada suhu yang lebih rendah, natrium karbonat 4% menghasilkan beberapa sedimen (Tabel 1). Dari hasil ini, kami memilih konsentrasi deicers yang optimal untuk menguji kemanjuran virucidal pada berbagai suhu: untuk etilen glikol, 40% (vol/vol); untuk propilen glikol, 40% (vol/vol); untuk natrium klorida, 25% (berat/vol); untuk kalsium klorida, 30% (berat/vol); untuk etil alkohol, 30% (vol/vol); dan untuk cairan washer kaca depan, 80% (vol/vol).

 

Khasiat campuran desinfektan-deicer untuk menonaktifkan virus.

Campuran asam sitrat 0,2% dan semua deicer dapat menurunkan titer virus setidaknya 4 log10 dalam 5 menit pada suhu 37°C, 4°C, dan −20°C (Gambar 1). Tetapi natrium karbonat 4% tampaknya tidak menetralkan infektivitas virus apa pun dalam 30 menit pada suhu -20°C, bahkan dengan deicer. Pada suhu 4°C, natrium karbonat 4% yang dicampur dengan cairan pencuci kaca depan, etilen glikol, natrium klorida, dan kalsium klorida kurang efektif dalam menetralkan virus dibandingkan natrium karbonat 4%. Campuran natrium karbonat-kalsium klorida, yang pHnya mendekati 6,0, tampaknya kehilangan kemanjurannya hampir sepenuhnya terlepas dari kondisi suhu (Gambar 1).

 

Gambar 1.  Inaktivasi FMDV dari serotipe O dengan campuran desinfektan-deicer pada berbagai suhu. Virus dititrasi setelah pengobatan selama 5 menit dan 30 menit pada suhu 37°C (A), 4°C (B), dan −20°C (C). Setiap reaksi diuji lebih dari dua kali, dan semua nilai dirata-ratakan; titer terukur terendah adalah 2,5 log10 TCID₅₀/0,1 ml.

 

Tes desinfeksi lebih lanjut dilakukan dengan dua virus serotipe O dan A yang berbeda dengan menggunakan pengotoran, khusus untuk natrium klorida dan etil alkohol karena kegunaannya sebagai aditif untuk disinfektan (Gambar 2). Tampaknya tidak ada perbedaan pola penurunan titer virus setelah perlakuan antara dua virus yang berbeda, dan pengotoran dengan bahan organik tampaknya tidak mempengaruhi hasil. Dua zat, natrium klorida dan etil alkohol, sendiri tidak menonaktifkan virus (Gambar 2).

 

Gambar 2

Inaktivasi FMDV serotipe O dan A dengan campuran desinfektan-deicer yang dikotori dengan FBS 5% pada suhu -20°C. Virus dititrasi setelah pengobatan selama 5 menit dan 30 menit pada suhu -20°C untuk serotipe O (A) dan serotipe A (B). Setiap reaksi diuji dalam rangkap lebih dari dua kali, dan semua nilai dirata-ratakan; titer terukur terendah adalah 2,5 log10 TCID₅₀/0,1 ml.

 

DISKUSI

 

Kemanjuran asam sitrat 0,2% dalam menonaktifkan FMDV tampaknya bertahan dengan penambahan deicers bahkan pada berbagai suhu: 37°C, 4°C, dan −20°C. Dalam semua kasus, setidaknya 4 log penurunan titer virus ditemukan dalam 5 menit. Karena volume reaksi dalam skala mikro dan harus diencerkan 1:50, kisaran yang dapat dilihat untuk mengukur pengurangan titer virus terbatas dalam membandingkan efek berbagai suhu secara lebih menyeluruh dalam penelitian ini (Gambar 1 dan2). Namun, untuk menetralkan sitotoksisitas deicers dan untuk menangani reaksi desinfeksi pada kondisi isotermal pada suhu -20°C secara lebih efektif, volume reaksi harus kecil.

 

Kotoran dengan FBS 5% tampaknya tidak mempengaruhi efek virucidal dari campuran deicer asam sitrat 0,2%. Kekokohan khasiat asam untuk desinfektan FMDV telah terbukti (1, 8); selama penambahan serum sapi, feses, atau penambahan suspensi tanah tidak mempengaruhi pH, penurunan titer virus dalam suasana asam atau basa hampir sama pada suhu 4°C (8).

 

Di sisi lain, natrium karbonat 4% tidak begitu efektif untuk menonaktifkan virus pada suhu beku (Gambar 1 dan 2). Meskipun campuran deicer-natrium karbonat tahan beku pada suhu -20°C, hal ini tidak meningkatkan efek virucidal dari disinfektan pada suhu tersebut. Dua deicers (natrium klorida dan kalsium klorida) menurunkan kemanjuran desinfeksi natrium karbonat dengan reaksi kimia di antaranya yang menurunkan pH disinfektan (Gambar 1).

 

Dilaporkan, mengenai laju inaktivasi virus menggunakan natrium karbonat (4%, pH 11.0), diperlukan waktu 3 menit dan 30 menit untuk mencapai pengurangan titer virus sebanyak 5 log masing-masing pada suhu 20°C dan 4°C (8). Demikian pula, dalam penelitian ini, hanya membutuhkan waktu paling lama 5 menit untuk mendapatkan pengurangan titer virus tipe O sebanyak 4 log dengan natrium karbonat 4% pada suhu 4°C (Gambar 1).

 

Singkatnya, kami dapat merekomendasikan penggunaan natrium klorida dan etil alkohol sebagai zat antibeku untuk ditambahkan ke asam sitrat untuk mendisinfeksi FMDV. Karena natrium klorida digunakan secara luas sebagai penghilang es di musim dingin, ini mungkin lebih tepat untuk mendisinfeksi jalan dan roda kendaraan di daerah yang terkena dampak. Karena etil alkohol digunakan secara luas di laboratorium dan asam sitrat kurang berbahaya bagi manusia dan hewan daripada asam lainnya, campurannya dapat diterapkan pada pakaian, kendaraan, dan bangunan di tempat yang terkena dampak.

 

Untuk meningkatkan efek asam sitrat, penggunaan detergen dan/atau peningkatan konsentrasi asam sitrat dapat dipertimbangkan. Namun, komponen klorida menimbulkan korosi pada logam, yang dapat menimbulkan masalah bila diterapkan pada mobil dan bahan logam lainnya. Selain itu, penguapan alkohol juga perlu diperhatikan penggunaannya. Jadi beberapa tindakan pencegahan perlu diambil untuk penggunaannya di lapangan dengan asam sitrat.

 

Mengenai deicers lain yang efektif untuk asam sitrat, propilen glikol lebih ramah lingkungan daripada etilen glikol dalam hal toksisitas pada manusia, tetapi keduanya tampaknya tidak hemat biaya dibandingkan dengan natrium klorida dan etil alkohol; meskipun cairan pencuci kaca depan bisa hemat biaya dan ramah pengguna, potensi bahayanya bagi manusia sangat besar.

 

Sebagai kesimpulan, mengingat keterbatasan deicers atau zat antibeku yang diuji untuk mendisinfeksi FMDV dalam penelitian ini atau virus flu burung (7), kita mungkin perlu menguji lebih banyak kandidat bahan kimia atau bahan untuk mengaktifkan disinfektan agar lebih manjur di musim dingin.

 

DAFTAR PUSTAKA

 

1.    Bachrach HL. 1968. Foot-and-mouth disease. Annu Rev Microbiol 22:201–244.

2.   Burrows R, Mann J, Garland A, Greig A, Goodridge D. 1981. The pathogenesis of natural and simulated natural foot-and-mouth disease infection in cattle. J Comp Pathol 91:599–609.

3.  Thomson G, Vosloo W, Bastos AD. 2003. Foot and mouth disease in wildlife. Virus Res 91:145–161.

4.   Pereira H. 1981. Foot-and-mouth disease, p 333–363. In Gibbs EPG. (ed), Virus diseases of food animals, vol 2 Academic Press, New York, NY.

5.  Sellers RF. 1969. The nature and the control of foot-and-mouth disease. Int J Dairy Technol 22:90–93.

6.  Yoon H, Yoon SS, Kim YJ, Moon OK, Wee SH, Joo YS, Kim B. 2015. Epidemiology of the foot-and-mouth disease serotype O epidemic of November 2010 to April 2011 in the Republic of Korea. Transbound Emerg Dis 62:252–263.

7.  Davison S, Benson CE, Ziegler AF, Eckroade RJ. 1999. Evaluation of disinfectants with the addition of antifreezing compounds against nonpathogenic H7N2 avian influenza virus. Avian Dis 43:533–537.

8.  Sellers RF. 1968. The inactivation of foot-and mouth disease virus by chemicals and disinfectants. Vet Rec 83:504–506.

9.    Kim H-M, Shim I-S, Baek Y-W, Han H-J, Kim P-J, Choi K. 2013. Investigation of disinfectants for foot-and-mouth disease in the Republic of Korea. J Infect Public Health 6:331–338.

10. Reed LJ, Muench H. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 27:493–497.

 

SUMBER:

Jang-Kwan Hong, Kwang-Nyeong Lee, Su-Hwa You, Su-Mi Kim, Dangseob Tark, Hyung-Sim Lee, Young-Joon Ko, Min-Goo Seo, Jong-Hyeon Park, and Byounghan Kim. 2015. Inactivation of Foot-and-Mouth Disease Virus by Citric Acid and Sodium Carbonate with Deicers. Appl. Environ Microbiol. 2015 Nov; 81(21): 7610–7614.