Penggunaan Obat Poduk Rekayasa Genetika (PRG)

Banyak obat farmasi dalam bentuk protein kompleks memerlukan struktur 3D yang penting untuk fungsinya. Sel hewan memiliki mesin unik untuk membuat struktur khusus. Sel hewan / hewan yang direkayasa secara genetik (transgenik, transgenik) dibuat sehingga berfungsi sebagai "bioreaktor" untuk memproduksi obat-obatan pada skala industri.

Produk hewani seperti susu, putih telur, darah, urin, dan kepompong ulat sutera telah digunakan untuk menghasilkan obat kompleks yang tidak dapat dibuat dengan sintesis kimia.

Obat pertama yang diproduksi hewan transgenik, antitrombin III dari susu kambing transgenik, mencegah pembentukan gumpalan darah kecil yang bisa lepas dan menyumbat pembuluh (Gambar 1). Ini telah disetujui oleh FDA pada tahun 2009.

Sel hewan dan bakteri sederhana, bagaimanapun, telah digunakan untuk memproduksi obat protein jauh lebih awal dari itu. Misalnya, Activase® (r-tPA), yang diproduksi oleh sel dari hamster Cina, telah disetujui oleh FDA untuk mengobati stroke sejak 2001.

Obat yang pertama kali diproduksi oleh bakteri, Humulin (insulin manusia) dari Eli Lilly telah digunakan oleh jutaan orang jika tidak milyaran sejak 1982.

Saat ini, banyak obat kanker seperti terapi antibodi monoklonal diproduksi oleh kultur sel hewan setelah gen manusia diperkenalkan ke sel-sel ini.

Obat-obatan dari hewan transgenik / sel transgenik / bakteri transgenik akan terus dikembangkan untuk menyelamatkan nyawa.

APAKAH EFEK YANG MEMUNGKINKAN DARI PAKAN HEWAN YANG DIMODIFIKASI SECARA GENETIKA ?

 

1.   TANAMAN YANG DIMODIFIKASI SECARA UMUM SEBAGAI PAKAN HEWAN

Tanaman produk rekayasa genetika (PRG), produk turunannya dan enzim yang berasal dari mikroorganisme hasil rekayasa genetika banyak digunakan dalam pakan ternak. Pasar pakan ternak global diperkirakan mencapai sekitar 600 juta ton. Pakan majemuk pada prinsipnya digunakan untuk unggas, babi dan sapi perah dan diformulasikan dari berbagai bahan mentah, termasuk jagung dan sereal dan minyak sayur lainnya seperti kedelai dan kanola. Saat ini diperkirakan bahwa 51 persen dari area global kedelai, serta 12 persen kanola dan 9 persen jagung (digunakan sebagai jagung utuh dan produk sampingan seperti pakan gluten jagung) dimodifikasi secara genetik (James, 2002a).

 

Penilaian keamanan pakan ternak baru di Kanada, Amerika Serikat dan tempat lain melihat karakteristik molekuler, komposisi, toksikologi dan nutrisi dari pakan baru dibandingkan dengan pakan konvensional. Pertimbangan termasuk efek pada hewan yang memakan pakan dan konsumen yang memakan produk hewan yang dihasilkan, keselamatan pekerja dan aspek lingkungan lainnya dari penggunaan pakan. Selain itu, perbandingan komposisi nutrisi dan keutuhan antara pakan ternak yang mengandung komponen transgenik versus konvensional telah menjadi subyek banyak penelitian.

 

Perhatian utama yang terkait dengan penggunaan produk PRG dalam pakan ternak adalah apakah DNA yang dimodifikasi dari tanaman dapat ditransfer ke rantai makanan dengan konsekuensi berbahaya dan apakah gen penanda resistensi antibiotik yang digunakan dalam proses transformasi dapat ditransfer ke bakteri pada hewan dan karenanya berpotensi menjadi bakteri patogen manusia. Karena proses produksi enzim yang digunakan dalam pakan ternak berlangsung di bawah kondisi terkontrol dalam instalasi tangki fermentasi tertutup dan menghilangkan DNA yang dimodifikasi dari produk akhir, produk ini tidak menimbulkan risiko apa pun bagi hewan atau lingkungan. Fisik enzim memiliki manfaat khusus dalam memberi makan babi dan unggas, termasuk pengurangan signifikan jumlah fosfor yang dilepaskan ke lingkungan.

 

Para peneliti telah memeriksa efek pemrosesan pakan pada DNA untuk memastikan apakah DNA yang dimodifikasi tetap utuh dan bergerak ke dalam rantai makanan. Telah ditemukan bahwa DNA tidak banyak terfragmentasi dalam bahan mentah tanaman dan silase, tetapi tetap utuh sebagian atau seluruhnya. Ini berarti bahwa, jika tanaman PRG diberikan kepada hewan, hewan kemungkinan besar akan memakan DNA yang dimodifikasi. Untuk mempertimbangkan apakah DNA yang dimodifikasi atau protein turunan yang dikonsumsi oleh hewan berpotensi mempengaruhi kesehatan hewan atau untuk memasuki rantai makanan, perlu dipertimbangkan nasib molekul-molekul ini di dalam hewan. Pencernaan asam nukleat (DNA dan asam ribonukleat, RNA) terjadi melalui aksi nuklease yang ada di mulut, pankreas, dan sekresi usus. Pada ruminansia, terjadi degradasi mikroba dan fisik pakan tambahan. Bukti menunjukkan bahwa lebih dari 95 persen DNA dan RNA benar-benar rusak di dalam sistem pencernaan. Selain itu, penelitian yang dilakukan pada pencernaan protein transgenik dalam kultur in vitro telah menunjukkan pencernaan yang hampir sempurna terjadi dalam waktu lima menit dengan adanya enzim pepsin.

 

Perhatian lebih lanjut adalah apakah dapat terjadi transfer resistensi antibiotik dari gen penanda yang digunakan dalam produksi tanaman PRG ke mikro-organisme pada hewan dan kemudian ke bakteri patogen bagi manusia. Sebuah tinjauan yang dilakukan oleh FAO menyimpulkan bahwa hal ini sangat tidak mungkin terjadi (Chambers and Heritage, 2004). Namun demikian, makalah ini menyimpulkan bahwa penanda yang mengkode ketahanan terhadap antibiotik yang signifikan secara klinis, penting untuk mengobati penyakit menular pada manusia, tidak boleh digunakan dalam produksi tanaman transgenik.

 

MacKenzie dan McLean (2002) meninjau 15 studi pemberian pakan pada sapi perah, sapi potong, babi dan ayam yang diterbitkan antara 1995 dan 2001. Pakan yang dipelajari adalah jagung dan kedelai tahan serangga dan / atau herbisida. Hewan diberi makan produk transgenik atau konvensional untuk jangka waktu mulai dari 35 hari untuk unggas hingga dua tahun untuk sapi potong. Tak satu pun dari studi ini menemukan efek merugikan pada hewan yang diberi makan produk transgenik untuk salah satu parameter yang diukur, yang meliputi komposisi nutrisi, berat badan, asupan pakan, konversi pakan, produksi susu, komposisi susu, fermentasi rumen, kinerja pertumbuhan atau karakteristik karkas. . Dua dari studi menemukan sedikit perbaikan dalam tingkat konversi pakan untuk hewan yang diberi makan jagung tahan serangga, mungkin karena konsentrasi aflatoksin yang lebih rendah, antinutrien yang dihasilkan dari kerusakan serangga.

 

Singkatnya, dapat disimpulkan bahwa risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan dari penggunaan tanaman PRG dan enzim yang berasal dari mikro-organisme hasil rekayasa genetika sebagai pakan ternak dapat diabaikan. Namun demikian, beberapa negara memang memerlukan pelabelan untuk menunjukkan pengertian bahan PRG dalam impor dan produk turunannya.

 

2.   MASALAH LINGKUNGAN TENTANG HEWAN YANG DIMODIFIKASI SECARA GENETIKA

Saat ini tidak ada hewan PRG yang digunakan dalam peternakan komersial di mana pun di dunia, tetapi beberapa hewan ternak dan spesies air sedang diteliti terkait berbagai sifat transgenik. Studi masalah lingkungan potensial yang terkait dengan hewan PRG telah dilakukan baru-baru ini oleh Dewan Riset Nasional Amerika Serikat (NRC, 2002), Komisi Bioteknologi Pertanian dan Lingkungan Inggris (AEBC, 2002) dan Pew Initiative on Food and Biotechnology (Pew Initiative, 2003). Studi-studi ini menyimpulkan bahwa hewan PRG mungkin memiliki efek positif atau negatif terhadap lingkungan tergantung pada hewan tertentu, sifat dan lingkungan produksi tempat ia diperkenalkan. Masalah lingkungan utama yang terkait dengan hewan meliputi: (a) kemungkinan bahwa hewan transgenik dapat melarikan diri dengan efek negatif yang dihasilkan pada kerabat atau ekosistem liar, dan (b) potensi perubahan dalam praktik produksi yang dapat menyebabkan berbagai tingkat tekanan lingkungan. Laporan-laporan ini merekomendasikan bahwa hewan PRG harus dievaluasi dalam hubungannya dengan rekan konvensionalnya.

 

Tiga studi sepakat bahwa hewan transgenik harus dievaluasi kemampuannya untuk lepas dan menjadi mapan di lingkungan yang berbeda. NRC dan AEBC setuju bahwa dampak lingkungan yang merugikan lebih kecil kemungkinannya untuk bibit ternak dibandingkan ikan, karena sebagian besar spesies hewan ternak tidak memiliki kerabat liar yang tersisa dan reproduksi hewan ternak terbatas pada kelompok-kelompok ternak yang dikelola. Bahaya menjadi liar rendah pada sapi, domba, dan ayam peliharaan, yang kurang bergerak dan sangat dijinakkan, tetapi lebih tinggi pada kuda, unta, kelinci, anjing, dan hewan laboratorium (mencit dan tikus).

 

Kambing, babi dan kucing domestik non-transgenik telah diketahui menjadi satwa liar, menyebabkan kerusakan ekstensif pada komunitas ekologi (NRC, 2002). Hewan ternak transgenik akan sangat berharga dan karenanya akan dipelihara di lingkungan yang diawasi dengan cermat. Sebaliknya, ikan yang dibudidayakan secara alami bergerak dan berkembang biak dengan mudah bersama spesies liar. Laporan AEBC merekomendasikan bahwa ikan transgenik tidak boleh dibesarkan di kandang lepas pantai karena kemungkinan lepas tinggi. Studi Pew Initiative menunjukkan bahwa dampak ikan budidaya yang lolos, baik yang diternakkan secara transgenik atau konvensional, bergantung pada “kesesuaian jaring” mereka dibandingkan dengan spesies liar. Ia berpendapat bahwa sifat-sifat transgenik dapat meningkatkan atau menurunkan kesesuaian bersih spesies yang dibudidayakan, dan merekomendasikan bahwa ikan transgenik dievaluasi dan diatur secara hati-hati dengan cara yang terintegrasi dan transparan.

 

Hewan transgenik juga dapat menimbulkan dampak lingkungan melalui perubahan pada hewan itu sendiri atau dalam praktik pengelolaan yang terkait dengannya. Modifikasi transgenik dapat mengurangi jumlah kotoran dan emisi metana yang dihasilkan oleh spesies ternak dan akuakultur (AEBC, 2002; Pew Initiative, 2003) atau meningkatkan ketahanan mereka terhadap penyakit (mendorong penggunaan antibiotik yang lebih rendah). Di sisi lain, beberapa modifikasi genetik dapat mengarah pada produksi ternak yang lebih intensif dengan peningkatan pencemar lingkungan yang terkait. Oleh karena itu, pertanyaan tentang kerusakan lingkungan bukanlah masalah teknologi itu sendiri daripada kapasitas untuk mengelolanya.

 

Faktor tambahan yang perlu dipertimbangkan dengan bioteknologi ternak adalah kemungkinan efeknya pada kesejahteraan hewan. Efek kesejahteraan ini mungkin positif atau negatif dan harus dievaluasi terhadap praktik pengelolaan ternak konvensional (AEBC, 2002). Saat ini, produksi hewan transgenik dan kloning sangat tidak efisien, dengan angka kematian yang tinggi selama perkembangan awal embrio dan tingkat keberhasilan hanya 1-3 persen. Dari hewan transgenik yang lahir, gen yang disisipkan mungkin tidak berfungsi seperti yang diharapkan, seringkali mengakibatkan kelainan anatomis, fisiologis dan perilaku (NRC, 2002). Sapi yang dihasilkan dengan metode kloning cenderung memiliki masa gestasi yang lebih lama dan bobot lahir lebih tinggi, sehingga angka kelahiran caesar lebih tinggi (NRC, 2002; AEBC, 2002). Masalah tersebut juga dapat terjadi pada hewan yang diproduksi dengan menggunakan AI / MOET, dan harus dievaluasi dalam konteks teknologi reproduksi lain yang digunakan dalam produksi ternak (AEBC, 2002). Laporan AEBC selanjutnya merekomendasikan bahwa potensi efek kesejahteraan dari semua teknologi yang digunakan dalam peternakan hewan harus dipertimbangkan dengan pertimbangan ekonomi dan lingkungan.

Sumber:

1Pharmaceutical Use of GMOs.  https://gmo.uconn.edu/topics/pharmaceutical-use-of-gmos/#:~:text=Genetically%20engineered%20(transgenic%2C%20GMO),be%20made%20by%20chemical%20synthesis.

2Green Fact.  What are the implications of GM-technologies for animals? https://www.greenfacts.org/en/gmo/3-genetically-engineered-food/6-genetically-modified-animal.htm

Estimasi Efektivitas Vaksin Ina SARS-CoV-2 terhadap Infeksi COVID-19

Estimasi Efektivitas Vaksin Inactivated SARS-CoV-2 (Coronavac) terhadap Infeksi COVID-19 Bergejala pada Tenaga Kesehatan di DKI Jakarta (13 januari-18 maret 2021)

Metode Penelitian

Studi menggunakan desain kohort retrospektif menggunakan data sekunder vaksinasi, PCR, dan data perawatan RS selama periode 13 Januari – 18 Maret 2021 pada tenaga kesehatan di DKI Jakarta. Total 128.290 orang, berusia ³ 18 tahun dan tidak memiliki riwayat COVID -19 diamati . Estimasi efektivitas vaksin berdasarkan Cox proportional hazards model, mengkontrol faktor usia dan jenis kelamin.

A. Pajanan Ketika Belum Divaksinasi

Observasi Luaran:

1.     Terinfeksi (PCR positif ); - Dirawat di RS; – Meninggal

2.     Tidak terinfeksi ( PCR negatif ); - Tidak dirawat di RS;  - Tidak meninggal

 

B.  Pajanan Sudah divaksinasi

Observasi Luaran:

1.     Terinfeksi (PCR positif );  - Dirawat di RS;  – Meninggal

2.     Tidak terinfeksi ( PCR negatif ); - Tidak dirawat di RS; - Tidak meninggal

Ada keterbatasan studi akibat :

Inakurasi waktu terjadinya ‘event’ sakit sesungguhnya (tanggal onset gejala).

Analisis mengacu pada tanggal pelaporan dan periode pengamatan yang ditentukan.

Kemungkinan terjadi under-testing dan testing hanya dilakukan pada mereka yang bergejala .

 

Estimasi Efektivitas Vaksin dalam Mencegah COVID-19 Bergejala

Vaksinasi efektif dalam mencegah 94% COVID-19 bergejala pada hari ke-28 hingga 63 hari setelah dosis kedua.

 

Estimasi Efektivitas Vaksin dalam Mencegah Perawatan karena COVID-19

 

 

Estimasi Efektivitas Vaksin dalam Mencegah Kematian karena COVID-19

Vaksinasi efektif dalam mencegah 98% kematian karena COVID-19 pada hari ke-28 hingga 63 hari setelah dosis kedua.

*Efektivitas vaksin diestimasi dengan Cox proportional Hazard model setelah dikontrol umur dan usia

** Angka di dalam kurung adalah interval kepercayaan 95%

 

 

 

*Studi dilakukan pada 128.290 tenaga Kesehatan di DKI Jakarta selama periode 13 Januari – 18 Maret 2021.

** Angka di dalam kurung adalah interval kepercayaan 95% Efektivitas vaksin diestimasi dengan Cox proportional Hazard model setelah dikontrol umur dan usia

 

Sumber:

Estimasi efektivitas vaksin inactivated sars-cov-2 (Coronavacò) terhadap infeksi covid-19 bergejala pada tenaga kesehatan di DKI Jakarta (13 januari-18 maret 2021).  Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI.

 

Karakterisasi Virus LPAI H7N7 di Shanghai, Cina

Virus avian influenza (AIV) H7N7 dapat dibagi menjadi AIV patogen rendah (LPAI) dan AIV patogen tinggi (HPAI).  Ini telah terbukti menginfeksi manusia dan hewan. Status prevalensinya pada burung liar di Cina sebagian besar masih belum jelas. Dalam studi ini, strain baru H7N7 AIV, bernama CM1216, diisolasi dari burung liar di Shanghai, Cina, dikarakterisasi.  Analisis urutan filogenetik dan nukleotida CM1216 mengungkapkan bahwa gen HA, NA, PB1, NP, dan M memiliki identitas nukleotida tertinggi dengan subtipe H7 Jepang AIV yang beredar pada tahun 2019; gen PB2 dan PA memiliki identitas nukleotida tertinggi dengan subtipe Korea H7 AIV yang beredar pada burung liar tahun 2018, sedangkan gen NS CM1216 adalah 98,93% identik dengan itik AIV yang beredar di Bangladesh, dan semuanya tergolong dalam garis keturunan Eurasia. Rekonstruksi filogenetik Bayesian dari 2 gen permukaan CM1216 menunjukkan bahwa beberapa reassortment mungkin telah terjadi pada tahun 2015. Mutasi ditemukan di HA (A135 T, T136S, dan T160 A [penomoran H3]), M1 (N30D dan T215 A), NS1 (P42S dan D97 E), PB2 (R389 K), dan protein PA (N383D); mutasi ini telah terbukti terkait dengan adaptasi mamalia dan perubahan virulensi AIV. Studi infeksi menunjukkan bahwa CM1216 dapat menginfeksi tikus dan menyebabkan gejala khas infeksi virus influenza dan berkembang biak di paru-paru tanpa adaptasi sebelumnya. Studi ini menunjukkan perlunya pengawasan rutin AIV pada burung liar dan deteksi evolusinya menjadi virus dengan patogenisitas tinggi dan kemampuan menginfeksi manusia.

 

I.   LATAR BELAKANG

Avian influenza virus (AIV) memiliki genom RNA beruntai tunggal, beruntai tunggal, dan berindra negatif. Burung liar adalah inang alami mereka. Enam belas subtipe hemagglutinin (HA) dan 9 neuraminidase (NA) dari AIV telah ditemukan, dan strain dari hampir semua kemungkinan kombinasi subtipe HA dan NA telah terdeteksi (Yoon et al., 1992; Fouchier et al., 2005). AIV dibagi menjadi kelompok virus flu burung patogen rendah (LPAIV) dan virus flu burung patogen tinggi (HPAIV). Hanya subtipe H5 dan H7 yang dikaitkan dengan wabah HPAIV (Swayne, 2012). Beberapa LPAIV berpotensi untuk berkembang menjadi HPAIV melalui serangkaian mutasi dan rekombinasi (Alexander, 2000). Subtipe H7 dari AIVs telah menyebabkan wabah pada unggas selama beberapa dekade dan menjadi ancaman besar bagi manusia (Belser et al., 2009; Swayne, 2012). AIV H7N9 pertama kali ditemukan menyebabkan infeksi fatal pada manusia pada tahun 2013 di Tiongkok Timur (Gao et al., 2013; Zeng et al., 2013). Analisis asal dan sumber AIV H7N9 ini mengungkapkan bahwa ia berasal dari unggas liar dan telah menginfeksi itik peliharaan, yang menyebabkan wabah H7N9 AIV 2013 di China (Lam et al., 2013). Pada tahun yang sama, strain H7N9 AIV lainnya diisolasi dari burung pipit pohon yang tampaknya sehat di Shanghai. Seluruh komposisi gen virus ini ditemukan mirip dengan isolat dari manusia (Zhao et al., 2014). Pengamatan ini menjamin kebutuhan untuk memantau virus influenza subtipe H7 pada burung liar.

 

AIV H7N7 pertama kali terdeteksi pada ayam di Italia pada tahun 1902 (Horimoto dan Kawaoka, 2001) dan telah banyak ditemukan pada burung liar dan unggas peliharaan di seluruh dunia (Campitelli et al., 2008; Smietanka et al., 2011). Pada tahun 2003, satu kasus sindrom gangguan pernapasan akut yang fatal dilaporkan pada pasien dengan infeksi AIV H7N7 selama wabah di Belanda (Fouchier et al., 2004). Dalam wabah ini, 86 individu yang terlibat dalam operasi pemusnahan hewan ternak dan 3 anggota keluarganya yang tidak bersentuhan langsung dengan unggas yang tertular dipastikan terinfeksi AIV H7N7 ini, menunjukkan bahwa telah terjadi penularan dari manusia ke manusia yang terbatas. (Koopmans et al., 2004). Selanjutnya, strain AIV H7N7 lainnya ditemukan di peternakan unggas di beberapa negara Eropa. Strain AIV H7N7 yang sangat patogen juga terdeteksi di peternakan unggas di Inggris pada tahun 2008. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa HPAIV H7N7 ini berasal dari LPAIV H7N7 (Seekings et al., 2018).

 

Di China, AIV H7N7 pertama kali terdeteksi di pasar unggas hidup di Provinsi Zhejiang pada tahun 2013. AIV ini terbukti dapat menginfeksi dan menyebabkan pneumonia parah pada musang, yang menunjukkan kemampuannya untuk melewati penghalang antarspesies. Selain itu, ditemukan 2 strain AIV H7N7 pada burung migran di China pada tahun 2013 (Liu et al., 2018). Beberapa gen dari 2 galur H7N7 ini ditemukan berkerabat dekat dengan gen H7N7 AIV yang bersirkulasi pada unggas peliharaan, yang menunjukkan adanya pertukaran gen antara burung migran dan unggas. Namun informasi H7N7 AIV pada unggas liar di China sangat terbatas. Dalam database Global Initiative on Sharing All Influenza Data, hingga saat ini hanya ditemukan 14 AIV H7N7 dari burung liar di China. AIV ini didistribusikan di Hubei, Hunan, Jiangxi, dan Hong Kong dari 2009 hingga 2014. Shanghai terletak di Delta Sungai Yangtze dan merupakan tempat persinggahan penting bagi banyak burung migran di jalur terbang migrasi Asia Timur-Australia. Untuk mengetahui prevalensi H7N7 AIV di Shanghai, kami melakukan surveilans pada burung liar di pulau Chongming pada tahun 2018. Satu novel H7N7 AIV dengan reassortment multi genom diisolasi dari burung liar. Filogenetik dan patogenisitas virus ini diselidiki.

 

II.          METODE ANALISIS

Sampel

Dari April 2017 hingga Desember 2018, 751 sampel usap trakea dan kloaka dikumpulkan dari burung liar di pulau Chongming, Shanghai, Cina. Masing-masing sampel ini ditempatkan dalam tabung Eppendorf 5 mL yang berisi 2 mL media transpor virus dan kemudian disimpan pada suhu -80 ° C sampai digunakan. Burung liar ditangkap dan diambil sampelnya dengan izin dan pengawasan dari Kantor Manajemen dan Konservasi Kehidupan Liar Shanghai.

 

Identifikasi dan Isolasi Virus

Setelah sentrifugasi tabung yang berisi swab, supernatan dikumpulkan. RNA virus diekstraksi dari setiap supernatan menggunakan MagMAX Patogen RNA / Kit DNA (Applied Biosystems, Waltham, MA) sesuai dengan protokol pabrik. AIV diidentifikasi dengan PCR transkripsi balik waktu nyata dengan primer gen matriks (M) dan set probe (WHO, 2002). Subtipe AIV ditentukan dengan sekuensing nukleotida menggunakan primer universal yang dijelaskan dalam WHO (2002). Untuk menyebarkan virus, sampel positif AIV yang dipilih diinokulasi ke dalam embrio ayam bebas patogen spesifik berumur 9 sampai 10 hari. Embrio ayam yang diinokulasi diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37 ° C dalam kondisi lembab dan kemudian didinginkan pada suhu 4 ° C selama 6 sampai 8 jam. Cairan allantoic dari embrio ayam yang diinokulasi diperiksa untuk keberhasilan pertumbuhan AIV menggunakan tes HA dengan 1% sel darah merah ayam seperti yang dijelaskan sebelumnya (WHO, 2002). Cairan allantoic HA-positif dikumpulkan dan disimpan pada -80 ° C sampai digunakan.

 

RT-PCR dan Pengurutan Genom

Viral RNA diekstraksi dari cairan allantoic menggunakan kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Jerman) dan ditranskripsikan menjadi cDNA menggunakan primer Uni12 (5′-AGC AAA AGC AGG-3 ′) dan PrimScript II first Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Jepang). 8 segmen RNA genomik H7 subtipe AIV diamplifikasi menggunakan primer universal. Setiap reaksi PCR mengandung 1 μL cDNA, 1 μL masing-masing primer maju dan mundur, 12,5 μL Campuran Sempurna Taq HS (Takara, Mountain View, CA), dan 10,5 μL air bebas Rnase dalam volume akhir 25 μL. Produk PCR diurutkan menggunakan kit terminasi BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA) pada penganalisis urutan ABI 3730.

 

Analisis Urutan dan Pohon Filogenetik

Urutan nukleotida dianalisis dan diselaraskan menggunakan program DNAMAN (versi 6.0). Pohon filogenetik dihasilkan dengan menggunakan algoritma penggabungan-tetangga dan model 2-parameter dengan analisis bootstrap (1.000 ulangan) dalam perangkat lunak MEGA-X (https://www.megasoftware.net/). Urutan lain yang digunakan untuk analisis filogenetik diperoleh dari GenBank dan database Global Initiative on Sharing All Influenza Data EpiFlu.

 

Analisis Filodinamik

Menurut alur kerja yang diterbitkan dari analisis evolusi Bayesian (Wei et al., 2017), tingkat evolusi dari 2 gen permukaan dianalisis. TempEst (versi 1.5.3; http://tree.bio.ed.ac.uk/) digunakan untuk melakukan analisis regresi jarak genetik dan tanggal pengambilan sampel dalam penelitian ini. Bayesian Evolutionary Analysis Sampling Trees (BEAST) v1.10.4 digunakan untuk memperkirakan waktu dari nenek moyang yang paling baru (tMRCA) dan laju substitusi nukleotida. Kami menggunakan model substitusi nukleotida Hasegawa-Kishino-Yano dengan variasi kecepatan antar situs terdistribusi gamma dan jam santai tidak berkorelasi. Semua rantai dijalankan dalam 50.000.000 generasi, dan nilai ukuran sampel efektif (ESS) dalam hasil lebih besar dari 200. Selain itu, Tracer v1.6 (http://tree.bio.ed.ac.uk/) digunakan untuk mengkonfirmasi keandalan hasil. Semua pohon diberi anotasi oleh Tree Annotator dengan 10% burn-in cutoffs, dan kredibilitas klade maksimum pohon divisualisasikan dan didekorasi oleh FigTree v1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ ).

 

Hewan

Sebanyak 42 mencit betina BALB / c bebas patogen berumur enam sampai delapan minggu, yang dibeli dari Shanghai Jiesijie Experimental Animal Co., Ltd. (Shanghai, China), digunakan dalam penelitian ini. Tikus diberi makanan dan air ad libitum dan dipelihara dalam siklus terang 12 jam dan gelap 12 jam.

 

Studi Infeksi pada Tikus

Untuk mengetahui infeksi AIV pada hewan, 26 mencit dibagi secara acak menjadi 2 kelompok dengan 20 pada kelompok eksperimen dan 6 pada kelompok kontrol. Setelah dianestesi dengan eter, mencit pada kelompok eksperimen diinokulasi secara intranasal dengan H7N7 AIV (50 μL dari 106 EID50 / 100 μL), dan tikus pada kelompok kontrol diinokulasi secara intranasal dengan jumlah cairan allantoic noninfeksi yang sama. Untuk mengevaluasi replikasi virus di paru-paru, masing-masing 3 tikus dari kelompok eksperimen disuntik mati pada 3, 5, dan 7 hari pasca infeksi (d.p.i.), dan paru-paru mereka dikumpulkan. Berat setiap paru ditentukan, dan indeks paru dihitung dengan rumus berikut: indeks paru (%) = total massa paru / rata-rata massa tubuh kontrol (hari 0) x 100%. Sebagian dari setiap paru difiksasi dengan formalin dan diproses untuk pemeriksaan histologi dan imunohistokimia (IHC). Singkatnya, sampel paru-paru difiksasi dalam 10% buffered formalin, diproses, dan diwarnai dengan hematoksilin dan eosin. Antibodi anti-influenza H7N7 (CM1216) melawan nukleoprotein (NP) digunakan untuk IHC. Jaringan paru-paru yang tersisa digunakan untuk penentuan titer virus berikutnya pada sel ginjal anjing Madin-Darby seperti yang dijelaskan sebelumnya (Price et al., 2000). Tikus yang tersisa dipantau setiap hari untuk gejala klinis, berat badan, dan waktu kelangsungan hidup selama 14 hari setelah infeksi.

 

Analisis statistik

Data dinyatakan sebagai mean ± SD. Perbedaan antar kelompok dianalisis dengan ANOVA satu arah. Perbedaan antara 2 kelompok dianalisis dengan uji t Student menggunakan SPSS 19 (SPSS Inc., Chicago, IL). Grafik dibuat menggunakan GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

 

Nomor Aksesi di GenBank

Urutan nukleotida diarsipkan di GenBank dengan nomor aksesi MK554564 - MK55571.

 

Keamanan Hayati dan Penanganan Hewan

Semua percobaan dilakukan dalam kondisi biosafety level-2. Hewan dipelihara sesuai dengan pedoman National Institutes of Health untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Eksperimental. Semua protokol eksperimental telah ditinjau dan disetujui oleh Komite Investigasi Hewan (no. BRDW-XBS-19-02).

 

III.      HASIL-HASIL

Urutan Nukleotida dan Analisis Filogenetik CM1216

Pada tanggal 16 Desember 2018 diperoleh 2 isolat AIV H7N7 dari tanaman teals (Anas crecca) di Pulau Chongming, Shanghai. Urutan nukleotida dari 2 isolat ini ternyata identik. Virus itu dinamai A / common teal / Shanghai / CM1216 / 2018, selanjutnya disebut CM1216.

 

Analisis urutan genom menunjukkan bahwa gen HA dan NA CM1216 masing-masing adalah 99,57 dan 99,63%, homolog dengan burung liar Jepang H7N7 AIV (A / mallard / Tottori / 31 C / 2019) pada tahun 2019. Ketiga gen internal, polimerase gen dasar 1, NP, dan matriks, juga berbagi 99,78 hingga 99,90% identitas nukleotida dengan burung liar Jepang H7N7 AIV. Gen polimerase basa 2 (PB2) dan polimerase asam (PA) berbagi 99,82 dan 99,76% identitas nukleotida dengan yang ada pada angsa H7N7 AIV yang beredar di Korea Selatan, sedangkan gen nonstruktural (NS) dari CM1216 adalah 98,93% identik dengan gen bebek AIV yang beredar di Bangladesh (Tabel 1).

 

Tabel 1. Analisis homologi CM1216 dengan isolat di NCBI.

Gen	Segment-ID	Virus	Homologi (%)
PB2	MN483236.1	A/White-fronted Goose/South Korea/KNU18-119/2018(H7N7)	99.82
PB1	LC496342.1	A/mallard/Tottori/31 C/2019(H7N7)	99.78
PA	MN602509.1	A/White-fronted Goose/South Korea/KNU18-119/2018(H7N7)	99.76
HA	LC496344.1	A/mallard/Tottori/31 C/2019(H7N7)	99.57
NP	LC496345.1	A/mallard/Tottori/31 C/2019(H7N7)	99.87
NA	LC496346.1	A/mallard/Tottori/31 C/2019(H7N7)	99.63
M	LC496347.1	A/mallard/Tottori/31 C/2019(H7N7)	99.90
NS	MT090541.1	A/duck/Bangladesh/38292/2019(H2N2)	98.93

 

Topologi gen CM1216 8 pada pohon filogenetik serupa, dan semuanya termasuk dalam garis keturunan Eurasia (Gambar 1 dan 2). Gen HA, NA (Gambar 1), PB2, PB1, PA, NS, dan M (Gambar 2) dari CM1216 digabungkan dengan subtipe H7 Jepang dan Korea ke dalam subtipe kecil dan kemudian dikelompokkan dengan subtipe AIV berbeda yang beredar pada unggas dan burung liar di Mongolia dan Bangladesh, sedangkan gen NS (Gambar 2) terpisah dalam sub-garis keturunan kecil, yang dekat dengan Georgia AIVs.

Gambar 1. Pohon filogenetik gen HA dan NA CM1216. Pohon tetangga-bergabung dibangun menggunakan model 2-parameter Kimura di perangkat lunak MEGA-X (http://www.megasoftware.net/). Nilai bootstrap dihitung untuk 1.000 ulangan; nilai kurang dari 75% tidak ditampilkan. Angka menunjukkan nilai bootstrap yang bergabung dengan tetangga. Virus (CM1216) yang dicirikan pada penelitian ini ditandai dengan segitiga terisi, virus H7N7 Korea ditandai dengan lingkaran terisi.

Gambar 2. Pohon filogenetik dari 6 gen internal CM1216 lainnya

 

Karakterisasi Molekuler dan Analisis Genetik CM1216

CM1216 ditemukan memiliki situs pembelahan monobasik (PEKLPKGR) yang terletak di antara gen HA1 dan HA2, menyiratkan bahwa itu adalah patogen rendah pada ayam (Tabel 2). Motif pengikatan reseptor CM1216 ditemukan sebagai QRG, terletak pada asam amino 226-228 (penomoran H3), menunjukkan bahwa CM1216 secara istimewa mengikat reseptor unggas (asam sialat alpha-2,3-galaktosa, SA α-2, 3 Gal) (Chutinimitkul et al., 2010). Protein HA CM1216 ditemukan memiliki mutasi T160 A, yang telah terbukti meningkatkan afinitas pengikatan AIV ke reseptor mirip manusia (SA α-2, 6 Gal) (Stevens et al., 2008). Analisis urutan asam amino CM1216 HA mengungkapkan 5 kemungkinan motif glikosilasi (30GNT, 46NAT, 423NWT, 495NNT, 249NDT). Tidak ada penghapusan asam amino di daerah batang NA (posisi 69-73) diamati, dan urutan asam amino NA CM1216 ditemukan memiliki 9 lokasi glikosilasi potensial (32NVS, 87NKS, 401NWS, 67NNTT, 145NGT, 200NAT, 234NGT, 47NLT, 56NNTT). Mutasi yang terlibat dalam resistensi obat (penghambat NA dan penghambat M2) tidak ditemukan pada CM1216, menunjukkan bahwa hal itu mungkin sensitif terhadap penghambat NA dan penghambat saluran ion M2. Substitusi N30D dan T215 A, yang telah terbukti meningkatkan patogenisitas mamalia, pada protein M1 ditemukan (Tabel 2). Adanya E627 dan D701 pada PB2 menunjukkan bahwa isolat tersebut bukan AIV yang beradaptasi dengan mamalia, tetapi keberadaan K389 dalam PB2 menunjukkan adanya adaptasi mamalia. Residu E97 dan S42 pada gen NS dan residu D383 pada gen PA juga ditemukan; residu ini telah terbukti terkait dengan peningkatan patogenisitas AIV pada tikus (Song et al., 2015).

 

Tabel 2. Substitusi asam amino dalam berbagai protein CM1216.

Protein	Situs Mutasi (aa)	Residu Asam Amino pada CM1216	Fungsi yang memungkinkan
HA		PEKLPKGR	Situs pembelahan HA
	Q226 L	Q	Pergeseran pengikat reseptor (RBS) posisi (penomoran H3), spesifisitas reseptor yang diubah
	G228S	G	Peningkatan afinitas untuk asam sialic terkait α-2, 6 manusiareceptors
	V186 N	G	Preferensi pengikatan reseptor manusia dari subtipe H13
	T160 A	A	Afinitas pengikatan dengan reseptor mirip manusia (α2-6-SA) dapat meningkat (Gao et al., 2018)
	A135 T	T	Kekhususan pengikatan reseptor
	T136S	S
	E190D	E	Preferensi pengikatan reseptor manusia (H5)
		30GNT, 46NAT, 423NWT, 495NNT, 249NDT	Motif glikosilasi
NA	69-73	No deletion	Stalk
	R292 K	R	Resistensi antivirus R292 K (oseltamivir) (Song et al., 2015)
	E119 V	P	Mutasi resistensi inhibitor neuraminidase (Song et al., 2015)
	R152 W	T
	H274Y	H
	D293 N	D
	E276D	E
		32NVS, 87NKS, 401NWS, 67NNTT, 145NGT, 200NAT, 234NGT, 47NLT, 56NNTT	Motif glikosilasi
M1	N30D	D	Peningkatan patogenisitas H5N1 pada tikus
	T215 A	A	Peningkatan patogenisitas
	V15I	V	Peningkatan patogenisitas
M2	S31 N	S	Mutasi resistensi Adamantine / Resistensi antivirus S31 N (amantadine)
NS	218-230	No deletion
	P42S	S	Meningkatnya virulensi pada tikus
	D97 E	E	Peningkatan patogenisitas pada tikus
	L89 V	Y	Peningkatan aktivitas polimerase dan peningkatan  virulensi pada tikus
PB1	13	P
	H99Y	H	Penularan virus H5 di antara musang
	198	K
	I368 V	I	Penularan virus H5 di antara musang
	R118I	R
PB2	E627 K	E	Peningkatan aktivitas polimerase dan peningkatan virulensi pada tikus. Mutasi adaptasi mamalia (Jong et al., 2013; Li et al., 2017)
	T271 A	T
	D701 N	D	Meningkatkan replikasi, patogenisitas, dan penularan virus H1N1 (Zhou et al., 2013)
	R389 K	K	Mutasi adaptasi mamalia
	T271 A	T	Peningkatan adaptasi pada mamalia
	S224P	S	Meningkatnya patogenisitas H5N1 pada itik
PA	N383D	D	Meningkatnya patogenisitas H5N1 pada itik
	V100 A	V
	K356 R	K
	S409 N	S
	L550 M	L

 

Estimasi Laju Evolusi Gen CM1216

Analisis gabungan filogenetik dan Bayesian dilakukan untuk memperkirakan tingkat evolusi dan tMRCA dari 2 gen permukaan strain CM1216. Terdapat hubungan yang kuat antara jarak genetik dan lokasi pengambilan sampel pada gen HA (n = 78; koefisien korelasi = 0.9257; R2 = 0.8568) dan NA (n = 97; koefisien korelasi = 0.9857; R2 = 0.97), yang menunjukkan bahwa data set tersedia untuk melakukan analisis jam molekul filogenetik di BEAST. Tingkat substitusi (dalam unit substitusi nukleotida per situs per tahun) dari gen HA dan NA diperkirakan 5.9766E-3 (95% HPD: 4.724E-3-7.2532E-3) dan 4.4501E-3 (95 % HPD: 3.4735E-3-5.3627E-3), masing-masing (Tabel 3). Dengan menggunakan model jam molekuler santai, kami melakukan estimasi independen rantai Bayesian Markov Monte Carlo untuk 2 gen permukaan. TMRCA dari 2 gen ditemukan berkerumun pada tahun 2015. 6257 dan 2015. 8924 (Tabel 3). Dengan demikian, reassortment genom CM1216 mungkin telah terjadi pada tahun 2015.

 

Tabel 3. Laju evolusi dan nenek moyang terbaru (tMRCA) dari gen HA dan NA strain CM1216

Gen	Tingkat substitusi (subs / situs / tahun))		tMRCA (tahun kalender)
	Rata-rata	Interval HPD 95%	tMRCA	95% HPD
HA	5.9766E-3	[4.7247E-3, 7.2532E-3]	2015.6257	[2015.2334, 2016.7161]
NA	4.4501E-3	[3.4735E-3, 5.3627E-3]	2015.8924	[2013.8419, 2018.1656]

Singkatan: Interval HPD (highest posterior density interval) 95% kepadatan posterior tertinggi

 

Patogenisitas CM1216 pada Tikus

Untuk mengevaluasi patogenisitas CM1216, 26 mencit BALB / c dibagi secara acak menjadi kelompok eksperimen dan kontrol. Semua tikus yang terinfeksi CM1216 bertahan selama 2 minggu periode pengamatan, tetapi mereka mulai menunjukkan tanda-tanda klinis 1 hari setelah infeksi, termasuk tidak adanya aktivitas, tidak aktif, dan bulu yang kusut (data tidak ditampilkan). Tidak ada satupun tikus pada kelompok kontrol yang menunjukkan tanda-tanda klinis atau mati selama periode observasi. Pada 2 d.p.i., berat badan rata-rata mencit yang terinfeksi turun ke level terendah (83%) dan kemudian berangsur pulih (Gambar 3A). Pada 3 dan 5 d.p.i., indeks paru mencit yang terinfeksi meningkat secara signifikan dibandingkan dengan tikus kontrol (Gambar 3B). Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam indeks paru antara 2 kelompok pada 7 d.p.i., yang menunjukkan bahwa mencit yang terinfeksi telah pulih pada waktu tersebut. Titer virus yang tinggi di paru-paru tikus yang terinfeksi diamati pada 3 dan 5 hari, dan tidak ada titer virus yang terdeteksi pada 7 hari. (Gambar 3C). Pneumonia difus yang parah, ditandai dengan infiltrasi neutrofil, kerusakan epitel alveolar, deskuamasi sel epitel bronkial, kongesti, dan perdarahan, diamati pada tikus yang terinfeksi pada 3 dan 5 hari. (Gambar 4A dan 4B, panah padat). Tidak ada perubahan histopatologi pada paru mencit yang terinfeksi pada 7 hari i dan tikus kontrol (Gambar 4C dan 4D). Data ini menunjukkan bahwa CM1216 dapat berkembang biak secara efektif dan menyebabkan edema paru pada tikus. Hasil ini diperkuat oleh IHC (Gambar 5). Antigen NP diamati melalui pewarnaan IHC pada bagian paru mencit setelah infeksi (Gambar 5A dan 5B), menunjukkan bahwa virus CM1216 bereplikasi di paru-paru tikus.

Gambar 3. Penurunan berat badan, indeks paru, dan titer virus pada tikus.

(A) Penurunan berat badan tikus yang terinfeksi (lingkaran penuh) dan tikus kontrol (kotak penuh).

(B) Indeks paru mencit yang terinfeksi (lingkaran terisi) dan mencit kontrol (kotak terisi).

(C) Titer replikasi virus di paru-paru pada 3, 5, dan 7 d.p.i. dari tikus yang terinfeksi (batang hitam) dan tikus kontrol (batang abu-abu). Mencit diinfeksi secara intranasal dengan virus H7N7 (50 μL dari 10⁶ EID50 / 100 μL). Sampel dikumpulkan pada hari yang sesuai setelah infeksi, dan titer virus ditentukan dengan TCID₅₀. ∗ P <0,05, ∗∗ P <0,01.

Gambar 4. Analisis histopatologi jaringan paru dari mencit yang terinfeksi CM1216. Histologi bagian paru diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (H&E) dari tikus yang diinokulasi pada tikus 3 (A), 5 (B), 7 (C) d.p.i., dan tikus kontrol (D). Panah hitam menunjukkan area representatif dengan infiltrasi sel inflamasi, edema, dan detasemen ringan sel epitel bronkial.

Gambar 5. Analisis imunohistokimia (IHC) jaringan paru dari mencit yang terinfeksi CM1216. Pewarnaan IHC dilakukan pada bagian paru-paru 3 (A), 5 (B), 7 (C) d.p.i., dan tikus kontrol (D). Panah hitam menunjukkan area virus.

 

IV.      DISKUSI ANALISIS

Subtipe H7 dari AIV dapat menginfeksi berbagai spesies, termasuk burung liar, unggas, babi, anjing laut, dan manusia (Naeve dan Webster, 1983; Capua dan Alexander, 2004; Lewis et al., 2013; Zhou et al., 2014). Baru-baru ini, peningkatan yang signifikan dalam prevalensi subtipe H7 dari AIV dan evolusi H7 LPAIV menjadi HPAIV diamati (Abdelwhab et al., 2013).

 

Infeksi ayam buras di Inggris oleh HPAIV H7N7 yang berasal dari burung liar LPAIV juga terlihat (Seekings et al., 2018). Oleh karena itu, perlu dilakukan pemantauan virus influenza subtipe H7 pada unggas liar.

 

Dalam studi ini, strain AIV H7N7 baru, disebut CM1216, diisolasi dari teals umum di Pulau Chongming, yang dikenal sebagai "Pintu Gerbang ke Sungai Yangtze" dan merupakan pulau terbesar ketiga di Cina. Berdasarkan data surveilans tahunan kami (tidak dipublikasikan), kami menemukan bahwa subtipe H7 dari AIV pertama kali diidentifikasi dari burung liar, mengindikasikan subtipe H7 mungkin merupakan strain AIV yang langka di daerah ini.

 

Burung teal (bebek air tawar kecil, biasanya dengan pita kehijauan di sayap yang paling menonjol saat terbang) adalah salah satu unggas air yang paling banyak bermigrasi di wilayah ini dan dapat membawa banyak subtipe virus influenza yang berbeda, yang memberikan kondisi potensial untuk reassortment genom di antara virus influenza yang berbeda. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa CM1216 memiliki beberapa reassortment yang membawa gen dari virus H7N7, H3N6, H6N2, dan H3N8 yang telah diisolasi sebelumnya dari unggas dan itik liar di negara-negara Asia, Eropa, dan Amerika (Tabel 1). Pengamatan ini menunjukkan bahwa H7N7 AIV yang ditemukan pada bebek air tawar kecil ini di Shanghai mungkin telah mengalami reassortment genom dengan virus influenza lainnya.

 

Analisis filogenetik menunjukkan bahwa CM1216 berkerabat dekat dengan virus yang beredar di subtipe H7 Jepang dan Korea, dan semuanya berkelompok menjadi sub-garis keturunan kecil. Kami juga menemukan bahwa subtipe virus H7 ini telah bertahan pada burung liar sejak 2018, menunjukkan bahwa mereka mungkin telah beradaptasi dengan inang burung liar di negara-negara ini. Seperti kita ketahui, Jepang, Korea, dan Shanghai semuanya terletak di sepanjang jalur terbang migrasi Asia Timur-Australia, jadi unggas air yang bermigrasi dalam penyebaran virus subtipe H7 di sepanjang jalur terbang migrasi memainkan peran penting. Dapat disimpulkan bahwa terdapat interaksi yang kompleks di antara berbagai burung migran yang mengakibatkan perubahan pada gen pool AIV.

 

Analisis filogenetik dan filodinamik CM1216 mengungkapkan bahwa tingkat substitusi nukleotida dari gen HA dan NA lebih tinggi daripada gen internal yang dilaporkan sebelumnya (Xu et al., 2011); Protein HA dan NA diketahui mengalami pergeseran antigen, dan fragmen genom yang membawa 2 gen ini menyusun ulang lebih sering daripada segmen lainnya (Rabadan et al., 2008), yang mengarah pada evolusi dan variasi virus yang berkelanjutan. Protein PB2 berperan penting dalam patogenisitas virus influenza pada mamalia. Telah menunjukkan bahwa beberapa mutasi pada protein PB2 dapat mendorong replikasi atau meningkatkan patogenisitas virus (Jong et al., 2013; Zhou et al., 2013; Li et al., 2017). Estimasi tMRCA untuk CM1216 dilakukan pada tahun 2015, yaitu 3 tahun sebelum CM1216 diisolasi dalam penelitian ini. Karena kurangnya informasi tentang infeksi CM1216 pada burung liar di China selama periode ini, kami tidak dapat mengidentifikasi pendahulunya.

 

Virus influenza biasanya menyebabkan manifestasi saluran pernapasan bagian atas dan bawah pada manusia. Dalam kondisi laboratorium, banyak AIV termasuk subtipe H5N1 dan H7N9 juga menyebabkan infeksi pada saluran pernapasan atas dan bawah pada tikus (Dybing et al., 2000; Szretter et al., 2007; Belser et al., 2013). Oleh karena itu, tikus telah digunakan untuk mempelajari patogenesis AIVs (Kawaoka, 1991; Kumar et al., 2015). Dalam studi ini, kami menemukan bahwa CM1216 dapat bereplikasi secara efisien pada tikus tanpa adaptasi sebelumnya (Gambar 2 dan 3); kemampuan replikasi CM126 ini mirip dengan isolat H7 Korea (Kang et al., 2014).

 

Namun, patogenisitas CM1216 pada tikus berbeda dari 2 AIV H7N7 yang beragam secara genetik (HH179 / H7N7 dan CH1288 / H7N7) yang lazim di China tengah karena 2 AIV ini avirulen pada tikus dan tidak dapat bereplikasi di organ mana pun dari tikus yang terinfeksi (Liu et al., 2018). Virulensi terhadap inang yang berbeda telah didalilkan (dipercaya) akibat mutasi pada beberapa protein AIV termasuk HA, PB2, dan NS1 (Jiao et al., 2008; Gao et al., 2009; Maines et al., 2011).

 

Dalam studi ini, tidak ada mutasi asam amino utama yang ditemukan pada PB2, terutama mutasi E627 K dan D701 N, yang telah terbukti meningkatkan adaptasi AIV lain terhadap mamalia (Vines et al., 1998; Shinya et al., 2004).  

 

Mutasi lain termasuk A135 T, T136S, dan T160 A di HA; N30D dan T215 A di M1; P42S dan D97 E di NS1; R389 K di PB2; dan N383D di PA ditemukan di CM1216.

 

Substitusi T160 A di HA telah terbukti mempengaruhi tidak hanya properti pengikat reseptor tetapi juga penularan H5N1 AIV clade 2.3.4 pada kelinci percobaan (Gao et al., 2018). Protein HA dari H7N9 AIV yang diisolasi dari manusia di Cina memiliki substitusi T160 A dan Q226 L (penomoran H3), yang dapat meningkatkan pengikatan virus ke reseptor SA α-2, 6 Gal, memungkinkan penularan dari burung.

1. Apakah patogenisitas CM1216 pada tikus terkait dengan mutasi ini masih harus diselidiki.

   Karena CM1216 diisolasi dari burung liar, ada kemungkinan bahwa CM1216 dapat menyebar ke daerah lain dengan cara bermigrasi burung atau mengangkut unggas.

3. Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan perlunya memantau evolusi AIV H7N7 dengan fokus khusus pada potensi patogenisitasnya terhadap mamalia.

 

DAFTAR PUSTAKA

1.  Abdelwhab et al., 2013.  E.S.M. Abdelwhab, J. Veits, T.C. Mettenleiter.  Genetic changes that accompanied shifts of low pathogenic avian influenza viruses toward higher pathogenicity in poultry.  Virulence, 4 (2013), pp. 441-452.  CrossRefGoogle Scholar

2. Alexander, 2000. D.J. Alexander. A review of avian influenza in different bird species. Vet. Microbiol., 74 (2000), pp. 3-13.  ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

4.  Belser et al., 2009.  J.A. Belser, C.B. Bridges, J.M. Katz, T.M. Tumpey.  Past, present, and possible future human infection with influenza virus A subtype H7. Emerg. Infect Dis., 15 (2009), pp. 859-865. CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

5.  Belser et al., 2013.  J.A. Belser, K.M. Gustin, M.B. Pearce, T.R. Maines, H. Zeng, C. Pappas, X. Sun, P.J. Carney, J.M. Villanueva, J. Stevens. Pathogenesis and transmission of avian influenza A (H7N9) virus in ferrets and mice. Nature, 501 (2013), pp. 556-559.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

6.   Campitelli et al., 2008.  L. Campitelli, A. Di Martino, D. Spagnolo, G.J. Smith, L. Di Trani, M. Facchini, M.A. De Marco, E. Foni, C. Chiapponi, A.M. Martin, H. Chen, Y. Guan, M. Delogu, I. Donatelli.  Molecular analysis of avian H7 influenza viruses circulating in Eurasia in 1999-2005: detection of multiple reassortant virus genotypes. J. Gen. Virol., 89 (2008), pp. 48-59. CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

8. Capua and Alexander, 2004. I. Capua, D.J. Alexander. Avian influenza: recent developments. Avian Pathol., 33 (2004), pp. 393-404.  View Record in ScopusGoogle Scholar

9.   Chutinimitkul et al., 2010.  S. Chutinimitkul, D. van Riel, V.J. Munster, J.M. van den Brand, G.F. Rimmelzwaan, T. Kuiken, A.D. Osterhaus, R.A. Fouchier, E. de Wit.  In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J. Virol., 84 (2010), pp. 6825-6833. View Record in ScopusGoogle Scholar

10.Dybing et al., 2000. J.K. Dybing, S. Schultz-Cherry, D.E. Swayne, D.L. Suarez, M.L. Perdue. Distinct pathogenesis of Hong Kong-origin H5N1 viruses in mice compared to that of other highly pathogenic H5 avian influenza viruses. J. Virol., 74 (2000), p. 1443. View Record in ScopusGoogle Scholar.

11. Fouchier et al., 2005. R.A.M. Fouchier, V. Munster, A. Wallensten, T.M. Bestebroer, S. Herfst, D. Smith, G.F. Rimmelzwaan, B. Olsen, A.D. Osterhaus. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J. Virol., 79 (2005), pp. 2814-2822. View Record in ScopusGoogle Scholar

12. Fouchier et al., 2004.  R.A.M. Fouchier, P.M. Schneeberger, F.W. Rozendaal, J.M. Broekman, S.A.G. Kemink, V. Munster, T. Kuiken, G.F. Rimmelzwaan, M. Schutten, G.J.J.V. Doornum.  Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. P Natl. Acad. Sci. USA, 101 (2004), pp. 1356-1361.  View Record in ScopusGoogle Scholar.

13. Gao et al., 2013.  R. Gao, B. Cao, Y. Hu, Z. Feng, D. Wang, W. Hu, J. Chen, Z. Jie, H. Qiu, K. Xu, X. Xu, H. Lu, W. Zhu, Z. Gao, N. Xiang, Y. Shen, Z. He, Y. Gu, Z. Zhang, Y. Yang, X. Zhao, L. Zhou, X. Li, S. Zou, Y. Zhang, X. Li, L. Yang, J. Guo, J. Dong, Q. Li, L. Dong, Y. Zhu, T. Bai, S. Wang, P. Hao, W. Yang, Y. Zhang, J. Han, H. Yu, D. Li, G.F. Gao, G. Wu, Y. Wang, Z. Yuan, Y. Shu.  Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus.  N. Engl. J. Med., 368 (2013), pp. 1888-18897.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar’

14. Gao et al., 2018.  R. Gao, M. Gu, K. Liu, Q. Li, J. Li, L. Shi, X. Li, X. Wang, J. Hu, X. Liu.  T160A mutation-induced deglycosylation at site 158 in hemagglutinin is a critical determinant of the dual receptor binding properties of clade 2.3.4.4 H5NX subtype avian influenza viruses.  Vet. Microbiol., 217 (2018), pp. 158-166.  ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar.

15. Gao et al., 2009.  Y. Gao, Y. Zhang, K. Shinya, G. Deng, Y. Jiang, Z. Li, Y. Guan, G. Tian, Y. Li, J. Shi, L. Liu, X. Zeng, Z. Bu, X. Xia, Y. Kawaoka, H. Chen.  Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host.  PLoS Pathog., 5 (2009), p. e1000709. CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

16.Horimoto and Kawaoka, 2001.  T. Horimoto, Y. Kawaoka.  Pandemic threat posed by avian influenza A viruses.  Clin. Microbiol. Rev., 14 (2001), pp. 129-149.  View Record in ScopusGoogle Scholar

17. Jiao et al., 2008.  P. Jiao, G. Tian, Y. Li, G. Deng, Y. Jiang, C. Liu, W. Liu, Z. Bu, Y. Kawaoka, H. Chen.  A single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice.  J. Virol., 82 (2008), pp. 1146-1154.  View Record in ScopusGoogle Scholar

18.Jong et al., 2013.  R.M.D. Jong, N. Stockhofe-Zurwieden, E.S. Verheij, E.A.D. Boer-Luijtze, L.A. Cornelissen.  Rapid emergence of a virulent PB2 E627K variant during adaptation of highly pathogenic avian influenza H7N7 virus to mice.  Virol. J., 10 (2013), p. 276.  Google Scholar

19.Kang et al., 2014.  H.M. Kang, H.Y. Park, K.J. Lee, J.G. Choi, E.K. Lee, B.M. Song, H.S. Lee, Y.J. Lee.  Characterization of H7 influenza A virus in wild and domestic birds in Korea.  PloS One, 9 (2014), p. e91887.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

20.Kawaoka, 1991. Y. Kawaoka.  Equine H7N7 influenza A viruses are highly pathogenic in mice without adaptation: potential use as an animal model.  J. Virol., 65 (1991), pp. 3891-3894. CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

21.Koopmans et al., 2004.  M. Koopmans, B. Wilbrink, M. Conyn, G. Natrop, H.v. d. Nat, H. Vennema, A. Meijer, J.V. Steenbergen, R. Fouchier, A. Osterhaus, A. Bosman.  Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human beings during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherland.  Lancet, 363 (2004), pp. 587-593.  ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

22.Kumar et al., 2015. S.R. Kumar, M. Prabakaran, K.V. Ashok Raj, F. He, J. Kwang.  Amino acid substitutions improve the immunogenicity of H7N7 HA protein and protect mice against lethal H7N7 viral challenge.  PLoS One, 10 (2015), p. e0128940.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

23.Lam et al., 2013.  T.T. Lam, J. Wang, Y. Shen, B. Zhou, L. Duan, C.L. Cheung, C. Ma, S.J. Lycett, C.Y. Leung, X. Chen, L. Li, W. Hong, Y. Chai, L. Zhou, H. Liang, Z. Ou, Y. Liu, A. Farooqui, D.J. Kelvin, L.L. Poon, D.K. Smith, O.G. Pybus, G.M. Leung, Y. Shu, R.G. Webster, R.J. Webby, J.S. Peiris, A. Rambaut, H. Zhu, Y. Guan.  The genesis and source of the H7N9 influenza viruses causing human infections in China. Nature, 502 (2013), pp. 241-244.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

24.Lewis et al., 2013.  N.S. Lewis, J. Zurab, C.A. Russell, M. Ann, L. Pascal, J.H. Verhagen, V. Oanh, O. Tinatin, D. Marina, D.J. Smith.  Avian influenza virus surveillance in wild birds in Georgia: 2009-2011.  PLoS One, 8 (2013), p. e58534.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar.

25. Li et al., 2017. W. Li, H.H.Y. Lee, R.F. Li, H.M. Zhu, G. Yi, J.S.M. Peiris, Z.F. Yang, C.K.P. Mok.  The PB2 mutation with lysine at 627 enhances the pathogenicity of avian influenza (H7N9) virus which belongs to a non-zoonotic lineage.  Sci. Rep., 7 (2017), p. 2352.  View Record in ScopusGoogle Scholar

26.Liu et al., 2018.  H. Liu, C. Xiong, J. Chen, G. Chen, J. Zhang, Y. Li, Y. Xiong, R. Wang, Y. Cao, Q. Chen, D. Liu, H. Wang, J. Chen.  Two genetically diverse H7N7 avian influenza viruses isolated from migratory birds in central China.  Emerg. Microbes Infect, 7 (2018), p. 62.  ArticleDownload PDFCrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

27.Maines et al., 2011.  T.R. Maines, L.M. Chen, J.A. Belser, N. Van Hoeven, E. Smith, R.O. Donis, T.M. Tumpey, J.M. Katz.  Multiple genes contribute to the virulent phenotype observed in ferrets of an H5N1 influenza virus isolated from Thailand in 2004.  Virology, 413 (2011), pp. 226-2230.  View Record in ScopusGoogle Scholar.

28.Naeve and Webster, 1983. C.W. Naeve, R.G. Webster.  Sequence of the hemagglutinin gene from influenza virus A/Seal/Mass/1/80.  Virology, 129 (1983), pp. 298-308.  ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar. 

29.Price et al., 2000. G.E. Price, A. Gaszewska-Mastarlarz, D. Moskophidis.  The role of alpha/beta and gamma interferons in development of immunity to influenza A virus in mice.  J. Virol., 74 (2000), pp. 3996-4003.  View Record in ScopusGoogle Scholar.

30.Rabadan et al., 2008. R. Rabadan, A.J. Levine, M. Krasnitz. Non-random reassortment in human influenza A viruses.  Influenza Other Resp, 2 (2008), pp. 9-22.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar

31.Seegs et al., 2018.  A.H. Seekings, M.J. Slomka, C. Russell, W.A. Howard, B. Choudhury, A. Nunez, B.Z. Londt, W. Cox, V. Ceeraz, P. Thoren, R.M. Irvine, R.J. Manvell, J. Banks, I.H. Brown.  Direct evidence of H7N7 avian influenza virus mutation from low to high virulence on a single poultry premises during an outbreak in free range chickens in the UK, 2008. Infect Genet. Evol., 64 (2018), pp. 13-31. ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar

32.Shinya et al., 2004.  K. Shinya, S. Hamm, M. Hatta, H. Ito, T. Ito, Y. Kawaoka.  PB2 amino acid at position 627 affects replicative efficiency, but not cell tropism, of Hong Kong H5N1 influenza A viruses in mice.  Virology, 320 (2004), pp. 258-266.  ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar. 

33.Smietanka et al., 2011.  K. Smietanka, A. Pikula, Z. Minta, W. Meissner.  Evidence of persistence and multiple genetic modifications of H7N7 low-pathogenic avian influenza virus in wild mallards in Poland provided by phylogenetic studies.  Avian Pathol., 40 (2011), pp. 131-138.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar. 

34.Song et al., 2015.  M.S. Song, B.M. Marathe, G. Kumar, S.S. Wong, A. Rubrum, M. Zanin, Y.K. Choi, R.G. Webster, E.A. Govorkova, R.J. Webby.  Unique determinants of neuraminidase inhibitor resistance among N3, N7, and N9 avian influenza viruses.  J. Virol., 89 (2015), pp. 10891-10900.  View Record in ScopusGoogle Scholar

35.Stevens et al., 2008.  J. Stevens, O. Blixt, L.M. Chen, R.O. Donis, J.C. Paulson, I.A. Wilson.  Recent avian H5N1 viruses exhibit increased propensity for acquiring human receptor specificity.  J. Mol. Biol., 381 (2008), pp. 1382-1394.  ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar.

36.Swayne, 2012.  D.E. Swayne.  Impact of vaccines and vaccination on global control of avian influenza.  Avian Dis., 56 (2012), pp. 818-828.  CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar.

37.Szretter et al., 2007.  K.J. Szretter, S. Gangappa, X. Lu, C. Smith, W.-J. Shieh, S.R. Zaki, S. Sambhara, T.M. Tumpey, J.M. Katz. Role of host cytokine responses in the pathogenesis of avian H5N1 influenza viruses in mice. J. Virol., 81 (2007), pp. 2736-2744. View Record in ScopusGoogle Scholar.

38.Vines et al., 1998. A. Vines, K. Wells, M. Matrosovich, M.R. Castrucci, T. Ito, Y. Kawaoka. The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction. J. Virol., 72 (1998), pp. 7626-7631. CrossRefView Record in ScopusGoogle Scholar.

39.Wei et al., 2017. X. Wei, M. Chen, J. Cui.  Bayesian evolutionary analysis for emerging infectious disease: an exemplified application for H7N9 avian influenza viruses.Sci. China Life Sci., 60 (2017), pp. 1392-1395. View Record in ScopusGoogle Scholar

40.WHO, 2002. WHO.  WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance (2002).  Accessed May 2002. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/68026/WHO_CDS_CSR_NCS_2002.5.pdf?sequence=1&isAllowed=y.  Google Scholar.

41.Xu et al., 2011. J. Xu, M.C. Christman, R.O. Donis, G. Lu. Evolutionary dynamics of influenza A nucleoprotein (NP) lineages revealed by large-scale sequence analyses. Infect Genet. Evol., 11 (2011), pp. 2125-2132. ArticleDownload PDFView Record in ScopusGoogle Scholar.

42.Yoon et al., 1992. S.-W. Yoon, R.J. Webby, R.G. Webster. Evolution and ecology of influenza A viruses.  Curr. Top Microbiol. Immunol., 56 (1992), pp. 359-375.  Google Scholar

43.Zeng et al., 2013. M. Zeng, S. Lu, X. Wu, L. Shao, Y. Hui, W. Jiali, L. Tao, Z. Haixia, W. Xiaohong, Y. Feifei. Avian influenza A(H7N9) virus infections, Shanghai, China. Emerg. Infect Dis., 19 (2013), pp. 1179-1181.  Google Scholar

44.Zhao et al., 2014. B. Zhao, X. Zhang, W. Zhu, T. Zheng, X. Yu, Y. Gao, D. Wu, E. Pei, Z. Yuan, L. Yang. Novel avian influenza A(H7N9) virus in tree sparrow, Shanghai, China, 2013.  Emerg. Infect Dis., 20 (2014), pp. 850-853. CrossRefGoogle Scholar.

45.Zhou et al., 2014. P. Zhou, M. Hong, M.M. Merrill, H. He, L. Sun, G. Zhang. Serological report of influenza a (H7N9) infections among pigs in Southern China. BMC Vet. Res., 10 (2014), p. 203.  View Record in ScopusGoogle Scholar.

46.Zhou et al., 2013. B. Zhou, M.B. Pearce, L. Yan, W. Jieru, R.J. Mason, T.M. Tumpey, D.E. Wentworth. Asparagine substitution at PB2 residue 701 enhances the replication, pathogenicity, and transmission of the 2009 pandemic H1N1 influenza A virus. PLoS One, 8 (2013), p. e0067616. Google Scholar

Sumber:

Wangjun Tang, Xuyong Li, Ling Tang, Tianhau Wang, Guimei He.  2021. Characterization of the low-pathogenic H7N7 avian influenza virus in Shanghai, China.  Poultry Science.  Volume 100, Issue 2, February 2021, Pages 565-574