Persiapan pembuatan vaksin H1N1 melalui studi epitop virus influenza H1N1

Infeksi mikroorganisme patogen dan virus dapat menimbulkan ancaman yang besar bagi kehidupan manusia di seluruh dunia.  Variasi, evolusi dan penyebaran virus dapat membuat sulit untuk mencegah dan mengendalikan infeksi. Variasi yang berkelanjutan dalam gen antigen virus hemagglutinin (HA) influenza merupakan penyebab utama wabah influenza ⁽³⁾. Ini menimbulkan tantangan untuk penelitian imunologi, virologi dan imunofarmakologi, dan untuk pengembangan vaksin influenza dan mikroorganisme patogen lainnya.

Epitop, juga dikenal sebagai penentu antigenik, mewakili bahan dasar antigenisitas imunogenik, dan merupakan bagian dari antigen yang dikenali oleh sistem kekebalan tubuh. Epitop dapat diklasifikasikan sebagai epitop konformasional atau epitop linier, berdasarkan struktur dan interaksinya dengan paratope ⁽⁴⁾. Epitop linier merupakan bagian dari urutan asam amino antigen yang kontinu, dan interaksinya dengan paratop sangat tergantung pada struktur primernya. Variasi dalam area epitop linier mana pun dapat menyebabkan perubahan struktural, berkurangnya kemampuan pengikatan antibodi, dan kemampuan untuk lepas dari pengenalan dengan antibodi dan vaksin yang ada ⁽⁵⁾.

Subtipe patogen yang berbeda mungkin memiliki beragam antigen; oleh karena itu, sulit untuk membedakan subtipe mikroorganisme patogen, untuk membangun teknologi deteksi imun, dan untuk mengklarifikasi mekanisme penyebaran penyakit.

Akibatnya, prediksi dan pemanfaatan epitop bernilai dalam diagnosis banding, prediksi tren variasi, menentukan mekanisme infeksi mikroorganisme patogen, dan dalam desain vaksin multi-epitop ⁽⁶⁾.

Baru-baru ini, beberapa metode prediksi epitop telah digunakan, yang sebagian besar terbatas pada satu antigen, meskipun mereka masih memberikan kapasitas prediksi yang memuaskan ^(7-9). Difraksi sinar X memerlukan lebih banyak waktu dan energi dalam identifikasi struktur epitop. Untuk menjelaskan profil biologis epitop, beberapa faktor harus dipertimbangkan, termasuk lokasinya di permukaan antigen, fleksibilitas, dan sensibilitas akses, meskipun menunjukkan peningkatan penerimaan di bidang ini ^(10-14). Selain heliks α dan lembaran berlipat β, situs glikosilasi juga penting untuk prediksi ⁽¹⁵⁾. Namun, akurasi prediksi dari metode ini hanya ~ 60% ⁽¹⁶⁾. Perpustakaan protein yang lebih besar diperlukan untuk teknologi tampilan fag, dan peptida tertentu memiliki hidrofobik yang kuat, yang memengaruhi strukturnya pada permukaan fag. Selanjutnya, prediksi yang diperoleh melalui metode ini masih memerlukan verifikasi lebih lanjut ⁽¹⁷⁾. Dengan demikian, diperlukan satu pendekatan optimal, yang mampu memprediksi sekuens epitop mikroorganisme secara komprehensif dan sekaligus, membentuk profil biologis dengan karakteristik dan fungsi epitop, dan memodelkan perilaku epitop ini selama perubahan antigenitas virus. . Ini akan memiliki peran penting dan langsung dalam desain obat aktif secara biologis, penelitian mekanisme patogen, dan prediksi variasi dalam mikroorganisme patogen tertentu.

Antibodi monoklonal (mAbs) adalah bagian dari antibodi yang dihasilkan oleh sel-sel imun yang identik dengan afinitas monovalen yang kuat, di mana mereka mengikat ke epitop yang sama, dengan spesifisitas dan sensitivitas yang tinggi, dan menentukan struktur dan karakter epitop ⁽¹⁸⁾. Kekhususan tersebut juga dapat digunakan sebagai alat untuk menganalisis epitop virus dan subtipe mereka, memberikan informasi tentang fungsi utama epitop dan variasi genetik yang terlibat dalam perubahan epitop, dan membantu penelitian variasi epitop dan perbaikan dalam desain vaksin ^(19-20).

Dalam suatu penelitian tentang Epitop virus influenza H1N1 diklasifikasikan menggunakan antibodi monoclonal yang dilakukan oleh Chunyang Guo et.al. 2018, ⁽³³⁾, mAb dari 40 vaksin influenza anti H1N1 yang dikembangkan sebelumnya telah dikembangkan dan dikarakterisasi ⁽²¹⁾, yang digunakan sebagai alat eksperimental untuk memprediksi epitop protein HA virus influenza, setelah distribusi dan ekspresinya diselidiki menggunakan peptida disintesis. Penelitiannya  ⁽³³⁾ bertujuan untuk menjelaskan hubungan antara variasi dalam virus influenza dan imunogenisitasnya, dan untuk mengembangkan metode yang berguna untuk memprediksi epitop variabel dari mikroorganisme patogen lainnya. Dalam penelitiannya, baru saja dilaporkan metode baru untuk memprediksi variabilitas epitop virus influenza. Selanjutnya, mereka melakukan studi fungsional biologis pada epitop berbeda yang diprediksi satu per satu, yang dapat membantu pengembangan vaksin epitop virus influenza, yang selanjutnya berkontribusi pada diagnosis dan pencegahan virus influenza.

Secara ringkas cara penelitiannya dijelaskan sebagai berikut.  Epitope berperan penting dalam infeksi influenza. Mungkin bermanfaat untuk menyaring vaksin virus influenza universal, menganalisis epitop dari beberapa subtipe protein hemagglutinin (HA). Sebanyak 40 antibodi monoklonal (mAbs) yang sebelumnya diperoleh dari antigen HA virus flu (pengembangan dan karakterisasi 40 mAb yang dihasilkan menggunakan vaksin split virus influenza H1N1 yang sebelumnya te;ah dipublijasikan) digunakan untuk mendeteksi dan mengklasifikasikan mAb ke dalam sub kategori virus flu yang berbeda menggunakan metode ELISA. Setelah ini, urutan asam amino kontinu yang umum diidentifikasi dengan analisis penyelarasan urutan ganda dengan basis data GenBank dan perangkat lunak DNAMAN, untuk digunakan dalam memprediksi epitop protein HA. Peptida tersintesis dari sekuens umum ini disiapkan, dan digunakan untuk memverifikasi dan menentukan epitop linier yang diprediksi melalui analisis lokalisasi dan distribusi. Dengan metode ini, sembilan epitop linier HA didistribusikan di antara berbagai jenis virus influenza diidentifikasi, termasuk tiga dari influenza A, empat dari 2009 H1N1 dan influenza musiman, dan dua dari H1. Penelitiannya menunjukkan bahwa dengan mempertimbangkan kombinasi spesifisitas reaksi antibodi antigen, variasi protein influenza HA protein dan epitop linier dapat menyajikan pendekatan yang berguna untuk merancang vaksin multi-epitop yang efektif. Penelitian tersebut bertujuan untuk mengklarifikasi penyebab dan mekanisme patogen virus influenza HA yang diinduksi flu, dan menyajikan ide baru untuk mengidentifikasi epitop mikroorganisme patogen lainnya.

Temuan utama yang telah didapat adalah sebagai berikut:

Pertama, dua peptida yang bereaksi dengan antibodi yang sama dekat dengan struktur 3D HA, dan membentuk epitop konformasi, meskipun mereka dipisahkan oleh urutan panjang dalam struktur primer.

Kedua, 40 mAb diperoleh dengan menggunakan vaksin virus influenza split, dan imunogen ini dapat menginduksi organisme untuk menghasilkan antibodi yang sama seperti yang diinduksi oleh patogen alami.  Peptida yang disintesis, yang desain dan pemanfaatannya didasarkan pada urutan utama protein, digunakan untuk prediksi dan identifikasi epitop linier.

Peptida pendek ini dapat juga digunakan sebagai imunogen yang baik untuk meneliti berbagai subtipe dari vaksin epitop virus influenza. Li et al ⁽³¹⁾ menerapkan imunisasi peptida pendek pada tikus secara langsung, dan menyaring mAb yang disiapkan.

Untuk meningkatkan imunogenisitas, koneksi polipeptida dan protein makromolekul juga dapat digunakan. Gong et al ⁽³²⁾ menggabungkan peptida pendek P1 ~ P6 dari urutan virus H3N2 yang disintesis secara kimia dengan protein pembawa Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) untuk meningkatkan imunogenisitas polipeptida, dan menginduksi respon imun humoral yang kuat.

Penelitian mereka sebelumnya telah menghubungkan 9 polipeptida berbeda dengan KLH satu per satu, memperoleh titer tinggi dan antibodi poliklonal afinitas tinggi setelah mengimunisasi tikus. Antibodi poliklonal kemudian diuji aktivitas netralisasi dan reaktivitas silangnya dengan jaringan manusia. Eksperimen ini sedang berlangsung.

Sebagai kesimpulan, penelitiannya mengidentifikasi 9 linear epitop protein influenza HA melalui analisis interaksi mAb dan antigen tradisional, dan memverifikasi ini menggunakan ELISA dan analisis lokasi struktur 3D dengan peptida yang disintesis.

Hasilnya memberikan metode baru, efektif dan andal untuk menginvestigasi mekanisme yang mendasari penyebaran dan variasi virus influenza dan mikroorganisme patogen lainnya, selain meningkatkan pengembangan vaksin yang berfokus pada epitop.

DAFTAR PUSTAKA

1. Cao L, Zhu F and Zeng CL: To explore the clinical value of the Hepatitis B virus mutation detection by the gene chip technology testing. Chin J Lab Diagn 19: 1301‑1303, 2015.

2. Tedbury PR, Mercredi PY, Gaines CR, Summers MF and Freed EO: Elucidating the mechanism by which compensatory mutations rescue an HIV‑1 matrix mutant defective for gag membrane targeting and envelope glycoprotein incorporation. J Mol Biol 427: 1413‑1427, 2015.

3. Nishioka R, Satomura A, Yamada J, Kuroda K and Ueda M: Rapid preparation of mutated influenza Hemagglutinins for Influenza virus pandemic prevention. AMB Express 6: 8, 2016.

4. Huang J and Honda W: CED: A conformational epitope data‑ base. BMC Immunol 7: 7, 2016. 5. Huang X, Lu D, Ji G, Sun Y, Ma L, Chen Z, Zhang L, Huang J and Yu L: Hepatitis B virus (HBV) vaccine‑induced escape mutants of HBV S gene among children from Qidong area, China. Virus Res 99: 63‑68, 2004. 6. Zerbe K, Moehle K and Robinson JA: Protein epitope mimetics: From new antibiotics to supramolecular synthetic vaccines. Acc Chem Res 50: 1323‑1331, 2017.

7. Khairy WOA, Wang L, Tian X, Ye J, Qian K, Shao H and Qin A: Identification of a novel linear B‑cell epitope in the p27 of Avian leukosis virus. Virus Res 238: 253‑257, 2017.

8. Nezafat N, Eslami M, Negahdaripour M, Rahbar MR and Ghasemi Y: Designing an efficient multi‑epitope oral vaccine against Helicobacter pylori using immunoinformatics and structural vaccinology approaches. Mol Biosyst 13: 699‑713, 2017.

9. Wang H, Liu R, Zhang W, Sun L, Ning Z, Ji F, Cui J and Zhang G: Identification of epitopes on nonstructural protein 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome viru tecohnlogy. s recognized by monoclonal antibodies using phage‑display. Virus Genes 53: 623‑635, 2017.

10. De Groot AS, Sbai H, Aubin CS, McMurry J and Martin W: Immuno‑informatics: Mining Genomes for vaccine components. Immunol Cell Biol 80: 255‑269, 2002.

11. El‑Manzalawy Y and Honavar V: Recent advances in B‑cell epitope prediction methods. Immunome Res 6 (Suppl 2): S2, 2010.

12. Liang L, Huang P, Wen M, Ni H, Tan S, Zhang Y and Chen Q: Epitope peptides of influenza H3N2 virus neuraminidase gene designed by immunoinformatics. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 44: 113‑118, 2012.

13. Igarashi M, Ito K, Yoshida R, Tomabechi D, Kida H and Takada A: Predicting the antigenic structure of the pandemic (H1N1) 2009 influenza virus hemagglutinin. PLos One 5: e8553, 2010.

14. Pan W, Chen DS, Lu YJ, Sun FF, Xu HW, Zhang YW, Yan C, Fu LL, Zheng KY and Tang RX: Bioinformatic prediction of the epitopes of Echinococcus granulosus antigen 5. Biomed Rep 6: 181‑187, 2017.

15. Chen W, Zhong Y, Qin Y, Sun S and Li Z: The evolutionary pattern of glycosylation sites in influenza virus (H5N1) hemagglutinin and neuraminidase. PLoS One 7: e49224, 2012.

16. Huang YX, Bao YL and Li YX: Advances in immunological information methods for prediction of antigenic epitopes. Chin J Immunol 24: 857‑860, 2008.

17. Xiao C, Liu Y, Jiang Y, Magoffin DE, Guo H, Xuan H, Wang G, Wang LF and Tu C: Monoclonal antibodies against the nucleocapsid proteins of henipaviruses: Production, epitope mapping and application in immunohistochemistry. Arch Virol 153: 273‑281, 2008.

18. O'Brien CM, Chy HS, Zhou Q, Blumenfeld S, Lambshead JW, Liu X, Kie J, Capaldo BD, Chung TL, Adams TE, et al: New monoclonal antibodies to defined cell surface proteins on human pluripotent stem cells. Stem Cells 35: 626‑640, 2017.

19. Jia XY, Yu JT, Hu SY, Li JN, Wang M, Wang C, Chen M, Cui Z and Zhao MH: Antibodies against linear epitopes on Goodpasture autoantigen in patients with anti‑neutrophil cyto‑ plasmic antibody‑associated vasculitis. Clin Rheumatol 26, 2017.

20. Jones ML, Legge FS, Lebani K, Mahler SM, Young PR, Watterson D, Treutlein HR and Zeng J: Computational identi‑ fication of antibody epitopes on the dengue virus NS1 protein. Molecules 22: E607, 2017.

21. Guo CY, Tang YG, Qi ZL, Liu Y, Zhao XR, Huo XP, Li Y, Feng Q, Zhao PH, Wang X, et al: Development and characteriza‑ tion of a panel of cross‑reactive monoclonal antibodies generated using H1N1 influenza virus. Immunobiology 8: 941‑946, 2015.

22. Jegaskanda S, Vanderven HA, Wheatley AK and Kent SJ: Fc or not Fc; that is the question: Antibody Fc‑receptor interactions are key to universal influenza vaccine design. Hum Vaccin Immunother 13: 1‑9, 2017.

23. Correia BE, Bates JT, Loomis RJ, Baneyx G, Carrico C, Jardine JG, Rupert P, Correnti C, Kalyuzhniy O, Vittal V, et al: Proof of principle for epitope‑focused vaccine design. Nature 507: 201‑206, 2014.

24. McBurney SP, Sunshine JE, Gabriel S, Huynh JP, Sutton WF, Fuller DH, Haigwood NL and Messer WB: Evaluation of protec‑ tion induced by a dengue virus serotype 2 envelope domain III protein scaffold/DNA vaccine in non‑human primates. Vaccine 34: 3500‑3507, 2016.

25. Cao Y, Li D, Fu Y, Bai Q, Chen Y, Bai X, Jing Z, Sun P, Bao H, Li P, et al: Rational design and efficacy of a multi‑epitope recom‑ binant protein vaccine against foot‑and‑mouth disease virus serotype A in pigs. Antiviral Res 140: 133‑141, 2017.

26. Baratelli M, Pedersen LE, Trebbien R, Larsen LE, Jungersen G, Blanco E, Nielsen J and Montoya M: Identification of cross‑reacting T‑cell epitopes in structural and non‑structural proteins of swine and pandemic H1N1 influenza A virus strains in pigs. J Gen Virol 98: 895‑899, 2017.

27. Li H, Ding J and Chen YH: Recombinant protein comprising multi‑neutralizing epitopes induced high titer of antibodies against influenza A virus. Immunobiology 207: 305‑313, 2003.

28. Myers CA, Kasper MR, Yasuda CY, Savuth C, Spiro DJ, Halpin R, Faix DJ, Coon R, Putnam SD, Wierzba TF and Blair PJ: Dual infec‑ tion of novel influenza viruses A/H1N1 and A/H3N2 in a cluster of Cambodian patients. Am J Trop Med Hyg 85: 961‑963, 2011.

29. Kilbourne ED: Influenza pandemics of the 20th century. Emerg Infect Dis 12: 9‑14, 2006.

30. Han T and Marasco WA: Structural basis of influenza virus neutralization. Ann N Y Acad Sci 1217: 178‑190, 2011.

31. Li Y, Hu HY, Qi ZL, Sun LJ, Li Y, Feng Q, Guo CY, Wang HF, Zhao PH, Liu Y, et al: Identification and characterization of epit‑ opes from influenza A virus hemagglutinin that induce broadly cross‑reactive antibodies. Int J Mol Med 3: 1673‑1682, 2018.

32. Gong X, Yin H, Shi YH, Guan SS, He XQ, Yang L, Yu YJ, Kuai ZY, Jiang CL, Kong W, et al: Conserved stem fragment from H3 influenza hemagglutinin elicits cross‑clade neutralizing antibodies through stalk‑targeted blocking of conformational change during membrane fusion. Immunol Lett 172: 11‑20, 2016.

33. Chunyan Guo, Haixiang Zhang, Xin Xie, Yang Liu, Lijun Sun, Huijin Li, Pengbo Yu, Hanyu Hu, Jingying Sun, Yuan Li, Qing Feng, Xiangrong Zhao, Daoyan Liang, Zhen Wang and Jun Hu. 2018. H1N1 influenza virus epitopes classified by monoclonal antibodies.  Experimental and Therapeutic Medicine.  DOI: 10.3892/etm.2018.6429