RSS Feed (xml)
Deteksi virus Influenza zoonosis dan influenza hewan yang resistan terhadap oseltamivir menggunakan tes resistensi antiviral influenza cepat.
RINGKASAN
Mutasi pada neuraminidase (NA) virus influenza yang menyebabkan berkurangnya kerentanan terhadap NAI inhibitor (NAI) oseltamivir dapat terjadi secara alami atau setelah pengobatan antivirus. Saat ini, deteksi menggunakan uji penghambatan NA tradisional atau pengurutan gen untuk mengidentifikasi penanda yang diketahui terkait dengan pengurangan penghambatan oleh oseltamivir. Kedua metode itu melelahkan dan membutuhkan personel terlatih. Influenza antiviral resistance test (iART), sistem prototipe yang dikembangkan oleh Becton, Dickinson and Company hanya untuk penggunaan penelitian, menawarkan metode cepat dan sederhana untuk mengidentifikasi virus semacam itu. Studi ini menyelidiki penerapan iART pada virus influenza A yang diisolasi dari inang non-manusia dengan berbagai subtipe NA (N1-N9).
1. INTRODUKSI
Virus zoonosis dan influenza hewan A merupakan ancaman yang signifikan bagi kesehatan masyarakat; mereka dapat menyebabkan penyakit parah pada manusia dengan sedikit perlindungan yang diberikan oleh vaksinasi musiman karena perbedaan antigenik.[1] NAI secara rutin digunakan untuk mengobati individu yang terinfeksi virus influenza, terlepas dari subtipenya, dan oseltamivir adalah terapi anti-influenza yang paling sering diresepkan. Resistensi antivirus dapat muncul di alam atau setelah pengobatan dengan NAI melalui perubahan permukaan antigen NA yang mempengaruhi pengikatan neuraminidase inhibitor (NAI). Perubahan tersebut dapat menyebabkan resistensi terhadap satu atau lebih NAI.[2]
Sementara analisis urutan gen NA sering digunakan untuk menyaring virus untuk penanda resistensi yang sudah ada, analisis genetik tidak dapat mengidentifikasi virus yang membawa penanda molekuler baru, atau menilai tingkat kerentanan yang berkurang. Dengan demikian, uji NAI fenotipik biasanya digunakan untuk menilai kerentanan virus terhadap NAI.[3] Dalam uji ini, virus diencerkan ke tingkat aktivitas NA yang ditargetkan dan diuji terhadap NAI yang diencerkan secara serial untuk menentukan IC50, konsentrasi obat yang diperlukan untuk menghambat 50% dari aktivitas NA.
Untuk melaporkan hasil virus influenza A musiman, perubahan lipatan virus uji dihitung dengan membandingkan nilai IC50 referensi, baik median spesifik subtipe atau IC50 virus kontrol yang tidak memiliki perubahan NA.[4] Namun, pendekatan ini tidak dapat dengan mudah diterapkan untuk pengujian dan pelaporan kerentanan virus influenza non-musiman terhadap NAI karena kesulitan memperoleh dan menguji sejumlah besar dari setiap subtipe yang berbeda dan berbagai garis keturunan genetik dalam setiap subtipe. Selain itu, hasil NAI memerlukan interpretasi yang hati-hati, karena korelasi laboratorium dari resistensi yang relevan secara klinis belum ditetapkan, kecuali untuk virus yang membawa N1 NA dengan substitusi H275Y.[5] Infeksi yang disebabkan oleh virus yang menunjukkan fenotipe penghambatan berkurang (RI) atau fenotipe penghambatan sangat berkurang (HRI) mungkin lebih sulit dikendalikan dengan intervensi terapeutik, yang dapat menyebabkan penyakit berkepanjangan dan pelepasan virus.[6]
Tes sederhana dan cepat yang dapat digunakan oleh laboratorium surveilans, dan dalam pengaturan klinis diperlukan untuk mendeteksi virus dengan kerentanan yang berkurang terhadap NAI. Seperti dilaporkan sebelumnya, prototipe tes resistensi antiviral influenza (iART), yang dikembangkan oleh BD Technologies (BARDA Contract HHSO100201300008C), mampu mendeteksi secara fenotip virus influenza musiman yang menampilkan RI/HRI oleh oseltamivir.[7] Pengujian ini membandingkan aktivitas sialidase spesifik influenza (NA) dengan dan tanpa konsentrasi obat tunggal, hanya membutuhkan 1 jam, dan tidak memerlukan pelatihan ekstensif untuk melakukannya. Di sini, kami menyajikan temuan serupa untuk virus influenza manusia zoonosis dan influenza hewan.
2. PERBANDINGAN iART DENGAN NAI ASSAY
Untuk memverifikasi kemampuan iART untuk secara efisien mendeteksi aktivitas enzimatik NA dan penghambatan oleh oseltamivir dari berbagai subtipe (N1 hingga N9), telah dilakukan pengujian terhadap berbagai virus influenza manusia zoonosis dan influenza hewan. Pengujian ini dilakukan termasuk terhaap virus (n = 45) yang diisolasi dari burung liar, unggas, kucing domestik, dan infeksi manusia zoonosis yang disebarkan dalam sel MDCK atau telur ayam yang dibuahi (Tabel 1). Analisis sekuens NA tidak mengidentifikasi penanda resistansi terhadap oseltamivir yang diketahui atau dicurigai (Tabel S1). Virus diuji menggunakan uji NAI dan iART berbasis fluoresensi, seperti yang dijelaskan sebelumnya.[4] Semua isolat virus ditemukan rentan terhadap penghambatan oleh oseltamivir dalam uji iART (faktor-R ≤0,70). Dalam uji NAI, semua nilai IC50 yang dihitung berada dalam rentang nanomolar/subnanomolar; beberapa perbedaan antara subtipe diamati, seperti yang diharapkan, dengan nilai IC50 terbesar diamati untuk virus N8 dan terendah untuk virus N2 (Tabel 1). Median IC50 untuk semua subtipe (dihitung menggunakan IC50 rata-rata untuk setiap subtipe) ditentukan menjadi 0,48 nmol/L (Tabel S2).
Menggunakan median IC50, perubahan kelipatan dihitung untuk setiap isolat. Seperti yang diharapkan, semua virus yang diuji ditentukan secara normal dihambat (NI) oleh oseltamivir, dan, oleh karena itu, rentan terhadap obat ini, sesuai dengan kriteria yang diterapkan oleh Kelompok Kerja Ahli tentang Kerentanan Antiviral untuk Sistem Pengawasan dan Respon Influenza Global WHO [5] (peningkatan <10 kali lipat dibandingkan dengan median IC50). Data dari uji standar emas NAI menunjukkan korelasi yang baik dengan hasil yang diperoleh dengan menggunakan iART, memverifikasi kemampuan tes untuk mendeteksi aktivitas enzim NA dan penghambatan oleh oseltamivir untuk virus influenza non-musiman.
Tabel 1. Virus Influenza zoonosis dan Avian Influenza subtipe N1-N9 neuraminidase (NA) dan aktivitas NA inhibitor (NAI)
a. Posisi substitusi asam amino NA ditunjukkan menggunakan penomoran lurus dan penomoran subtipe N2.
b. Diuji menggunakan uji NAI berbasis fluoresensi standar Pusat Pengendalian dan Pencegahan AS. Rata-rata dan standar deviasi (SD) dari setidaknya tiga percobaan independen ditampilkan; perubahan kelipatan menunjukkan peningkatan kelipatan nilai IC50 dari uji protein NA rekombinan dibandingkan dengan nilai IC50 protein NA A/Shanghai/2/2013.
c. Kriteria untuk menginterpretasikan hasil uji NAI berdasarkan peningkatan kelipatan nilai IC50 dari uji NA dibandingkan dengan protein NA tipe liar A/Shanghai/2/2013 Nilai IC50: inhibisi normal (NI) <10 kali lipat, inhibisi berkurang ( RI) 10 hingga 100 kali lipat, dan penghambatan sangat berkurang (HRI) >100 kali lipat.
d. Faktor-R: rasio intensitas sinyal chemiluminescent yang dihasilkan oleh aktivitas NA virus pada substrat dengan dan tanpa inhibitor (yaitu, oseltamivir karboksilat). Rata-rata dan standar deviasi faktor-R dari tiga percobaan independen. Interpretasi faktor-R berdasarkan cutoff yang telah ditentukan sebelumnya untuk influenza A (resistensi ≥0,70).
Untuk memverifikasi bahwa iART dapat mendeteksi penurunan kerentanan terhadap oseltamivir dari virus unggas dan zoonosis, sembilan isolat virus dengan substitusi asam amino NA yang diketahui memengaruhi kerentanan oseltamivir diuji dengan uji NAI dan iART (Tabel 2). Nilai IC50 yang dihitung dibandingkan dengan virus kontrol yang tidak memiliki substitusi NA, serta nilai median IC50 yang dihitung di atas. Perhitungan perubahan lipatan IC50 median diperlukan ketika virus tipe liar yang cocok tidak tersedia atau virus dengan urutan NA yang tidak diketahui diuji. Metode perubahan kelipatan tidak mengubah interpretasi delapan dari sembilan virus (Tabel 2).
Satu isolat (Tabel 2, klon 1 A/Vietnam/HN30408/2005) diinterpretasikan memiliki RI menggunakan perubahan kelipatan yang ditentukan dengan virus kontrol IC50, penghambatan normal (NI) menggunakan perubahan lipatan yang ditentukan dengan median IC50, dan R -faktor yang berada di bawah ambang batas yang ditetapkan sebelumnya sebesar 0,70 (0,57). Dua virus (Tabel 2, A/Ohio/88/2012 dan A/Taiwan/1/2013 clone 3) diuji sebagai RI oleh NAI dengan faktor R di iART mendekati ambang batas (0,62, 0,66). Enam virus lain yang memiliki fenotipe RI atau HRI dengan uji NAI menunjukkan faktor-R di atas ambang batas ≥0,70 dalam uji iART.
Tabel 2. Virus zoonosis dan flu burung A dengan substitusi neuraminidase (NA) memberikan (sangat) pengurangan penghambatan oleh oseltamivir
a. Posisi substitusi asam amino NA ditunjukkan menggunakan penomoran lurus dan penomoran subtipe N2.
b. Diuji menggunakan uji NAI berbasis fluoresensi standar Pusat Pengendalian dan Pencegahan AS. Rata-rata dan standar deviasi (SD) dari setidaknya tiga percobaan independen ditampilkan; perubahan lipatan menunjukkan peningkatan lipat nilai IC50 dari virus uji dibandingkan dengan nilai IC50 virus kontrol (untuk virus yang tidak memiliki substitusi asam amino) dan menggunakan median IC50 dari semua subtipe.
c. Kriteria untuk menginterpretasikan hasil uji NAI berdasarkan peningkatan IC50 kali lipat dibandingkan dengan virus kontrol/nilai median IC50: penghambatan normal (NI) <10 kali lipat, penghambatan berkurang (RI) 10 hingga 100 kali lipat, dan penghambatan sangat berkurang (HRI) >100 kali lipat.
d. Faktor-R: rasio intensitas sinyal chemiluminescent yang dihasilkan oleh aktivitas NA virus dengan dan tanpa inhibitor (yaitu, oseltamivir karboksilat). Interpretasi faktor-R berdasarkan cutoff yang telah ditentukan sebelumnya untuk influenza A (resistensi ≥0,70).
Berbagai faktor-R diamati, yang berkorelasi dengan rentang perbedaan lipatan yang ditentukan oleh uji NAI (Gambar S1). Virus dengan faktor R tertinggi (yaitu >4,0) juga diidentifikasi memiliki HRI dengan uji NAI. Virus dengan RI atau nilai perubahan lipat mendekati batas 10 kali lipat memiliki faktor R mendekati ambang 0,70. Hasil ini menunjukkan bahwa setiap virus yang dilaporkan resisten dengan iART akan memiliki RI/HRI dengan NAI. Virus yang tidak resisten, terutama yang memiliki faktor R tinggi, juga menunjukkan beberapa penghambatan yang berkurang oleh oseltamivir. Dengan pengujian lebih lanjut dan penyempurnaan ambang faktor R, iART mungkin dapat membedakan antara virus RI dan HRI di masa mendatang. Sebagai alternatif, setiap spesimen dengan faktor R di atas 0,50 dapat ditandai untuk analisis urutan dan pengujian tambahan dalam pengujian NAI. Tak satu pun dari virus tipe liar yang ditunjukkan pada Tabel 1 atau virus musiman yang dilaporkan sebelumnya akan ditandai sebagai berpotensi mengurangi kerentanan menggunakan ambang batas yang lebih rendah untuk virus tipe A.[7]
3. PROTEIN N9 REKOMBINAN DENGAN PENANDA RI/HRI YANG DIKETAHUI OLEH OSELTAMIVIR
Substitusi asam amino yang diketahui mengurangi kerentanan terhadap oseltamivir E119V, I222K/R, H274Y, R292K, dan R371K (penomoran N2) telah terdeteksi pada virus NA A(H7N9) yang diisolasi dari manusia.8 Selain itu, I222T terdeteksi pada Virus A(H7N9) diisolasi dari primata non-manusia setelah pengobatan oseltamivir.9 Untuk menentukan apakah iART mampu mengidentifikasi NA dengan perubahan ini sebagai resisten terhadap oseltamivir, masing-masing protein rekombinan N9 (rN9) dihasilkan menggunakan A/Shanghai/ 2/2013 NA sebagai tulang punggung, seperti yang dijelaskan sebelumnya.10 Penggunaan protein rekombinan memungkinkan pengujian perubahan asam amino yang mengurangi aktivitas enzimatik selain mengurangi kerentanan terhadap NAI, termasuk R292K (R289K dalam penomoran lurus N9), yang paling sering diidentifikasi Perubahan NA terdeteksi pada kasus manusia H7N9. Faktor-R dari protein rN9 yang membawa substitusi E119V, I222K/R, H274Y, R292K, atau R371K mengkategorikannya sebagai resisten terhadap oseltamivir dan berkorelasi dengan hasil uji NAI (Tabel 3).
Kisaran faktor-R juga berkorelasi dengan kisaran nilai IC50 (Gambar S1); semua rN9 dengan faktor-R di atas 2,0 diidentifikasi memiliki HRI dengan uji NAI. Protein rN9 dengan I222T diidentifikasi sebagai tidak resisten oleh iART. Dalam uji NAI, perubahan lipatan yang diberikan oleh substitusi ini berada di bawah ambang batas 10, yang selanjutnya menegaskan korelasi antara kedua uji tersebut.
Tabel 3. Protein neuraminidase (NA) rekombinan A/Shanghai/2/2013 (H7N9) dengan substitusi yang memberikan penghambatan (sangat) berkurang oleh oseltamivir
a. Posisi substitusi asam amino NA ditunjukkan menggunakan penomoran lurus dan penomoran subtipe N2.
b. Diuji menggunakan uji NAI berbasis fluoresensi standar Pusat Pengendalian dan Pencegahan AS. Rata-rata dan standar deviasi (SD) dari setidaknya tiga percobaan independen ditampilkan; perubahan lipatan menunjukkan peningkatan lipat nilai IC50 dari uji protein NA rekombinan dibandingkan dengan nilai IC50 protein NA A/Shanghai/2/2013.
c. Kriteria untuk menginterpretasikan hasil uji NAI berdasarkan peningkatan lipat nilai IC50 dari uji NA dibandingkan dengan protein NA tipe liar A/Shanghai/2/2013 Nilai IC50: inhibisi normal (NI) <10 kali lipat, inhibisi tereduksi (RI ) 10 hingga 100 kali lipat, dan penghambatan sangat berkurang (HRI) >100 kali lipat.
d. R-faktor: rasio intensitas sinyal chemiluminescent yang dihasilkan oleh aktivitas NA virus pada substrat dengan dan tanpa inhibitor (yaitu, karboksilat oseltamivir). Rata-rata dan standar deviasi faktor-R dari tiga percobaan independen. Interpretasi faktor-R berdasarkan cutoff yang telah ditentukan sebelumnya untuk influenza A (resistensi ≥0,70).
4. UJI IART VS NAI DI BAWAH KONDISI PH RENDAH (PH 5.3 VS 6.8)
Seperti disebutkan di atas, R292K adalah penanda NA yang paling sering dilaporkan pada pasien yang diobati dengan oseltamivir yang terinfeksi virus A(H7N9). Selain itu, perubahan ini juga dikenal untuk mengurangi aktivitas enzimatik, membuat deteksi resistensi obat menjadi sulit menggunakan uji NAI standar karena aktivitas yang tidak mencukupi untuk pengujian atau aktivitas masking resistensi tipe liar.11 Sebelumnya dilaporkan bahwa deteksi virus R292K dapat dilakukan ditingkatkan dengan pengujian NAI pada pH asam.12 Untuk mengkonfirmasi temuan ini, pengujian dilakukan pada isolat A(H7N9) flu burung yang sangat patogen, A/Taiwan/1/2017, yang mengandung substitusi R292K.
Pada pH standar 6,8, uji NAI tidak dapat menguji isolat virus ini karena aktivitas NA di bawah ambang batas yang diperlukan untuk pengujian (Tabel 4). Namun, pada pH 5,3, virus ini memiliki aktivitas NA yang cukup dan menampilkan fenotipe HRI. Khususnya, iART mampu mendeteksi resistansi yang disebabkan oleh R292K, tanpa mengubah kondisi pH pengujian. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa spesimen klinis dapat diuji secara langsung oleh iART, bahkan ketika aktivitas NA tidak cukup untuk pengujian oleh NAI. Hasil ini mengkonfirmasi dan memperluas temuan tersebut dan menyarankan sensitivitas iART yang lebih besar untuk mendeteksi resistensi pada virus NA aktivitas rendah.
Tabel 4. Hasil uji resistensi antiviral influenza (IART) vs uji uji NAI pada pH rendah (pH 5,3)
a. N/A: Tidak tersedia karena tingkat aktivitas enzim NA tidak mencukupi untuk pengujian.
b. Kriteria pelaporan hasil uji NAI berdasarkan peningkatan kelipatan nilai IC50 virus uji dibandingkan dengan nilai IC50 virus kontrol tanpa substitusi R292K: inhibisi normal (NI) <10 kali lipat, inhibisi tereduksi (RI) 10 hingga 100 kali lipat, dan penghambatan sangat berkurang (HRI) >100 kali lipat.
c. Faktor-R: rasio intensitas sinyal chemiluminescent yang dihasilkan oleh aktivitas NA virus pada substrat dengan dan tanpa inhibitor (yaitu, oseltamivir karboksilat). Rata-rata dan standar deviasi faktor-R dari tiga percobaan independen. Interpretasi faktor-R berdasarkan cutoff yang telah ditentukan sebelumnya untuk influenza A (resistensi ≥0,70).
Tes resistensi antivirus influenza adalah uji fenotipik yang cepat dan sensitif untuk mendeteksi virus influenza dengan penghambatan yang dikurangi oleh oseltamivir. Tidak seperti metode berbasis urutan, iART memberikan data fenotipik yang berharga untuk identifikasi virus yang membawa penanda molekuler yang diketahui dan tidak diketahui terkait dengan penurunan kerentanan.
Ketika virus subtipe hewan dan zoonosis baru muncul, sangat penting untuk menentukan fenotipe obatnya dengan cepat sehingga otoritas kesehatan masyarakat dan dokter dapat menilai pilihan pengobatan dengan lebih baik. iART saat ini tidak tersedia secara komersial, meskipun pengujian spesifik influenza lainnya (QFlu Combo Test oleh Cellex) menggunakan prinsip deteksi resistansi oseltamivir yang serupa. Ketersediaan iART di masa depan bergantung pada permintaan tes perawatan untuk mendeteksi resistensi antivirus.
Meskipun uji NAI merupakan standar emas terus menjadi uji pilihan untuk laboratorium surveilans, uji ini tidak praktis dan membutuhkan personel yang sangat terlatih. iART menyediakan alternatif, metode sederhana untuk mendeteksi virus yang resistan terhadap oseltamivir menggunakan perangkat kecil dan portabel dengan perangkat lunak bawaan untuk interpretasi data. Virus yang terdeteksi oleh iART dengan faktor R yang tinggi dapat ditandai untuk analisis genetik dan evaluasi fenotipik yang komprehensif. Desain dan kemudahan penggunaan ini memungkinkan pengujian kerentanan oseltamivir di lokasi yang saat ini tidak dapat melakukan pengujian NAI.
DAFTAR PUSTAKA
1. Blanton L, Wentworth DE, Alab N, et al. Update: influenza activity—United States and Worldwide, May 21–September 23, 2017. Morb Mortal Wkly Rep. 2017; 6: 1043-1051.
2. Marjuki H, Mishin VP, Chesnokov AP, et al. Characterization of drug-resistant influenza A(H7N9) variants isolated from an oseltamivir-treated patient in Taiwan. J Infect Dis. 2015; 211(2): 249-257.
3. Okomo-Adhiambo M, Mishin VP, Sleeman K, et al. Standardizing the influenza neuraminidase inhibition assay among United States public health laboratories conducting virological surveillance. Antiviral Res. 2016; 128: 28-35.
4. Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility – Geneva, November 2011 and June 2012. Wkly Epidemiol Rec. 2012; 87(39): 369-374.
5. Nguyen HT, Trujillo AA, Sheu TG, et al. Analysis of influenza viruses from patients clinically suspected of infection with an oseltamivir resistant virus during the 2009 pandemic in the United States. Antiviral Res. 2012; 93(3): 381-386.
6. Li TC, Chan MC, Lee N. Clinical implications of antiviral resistance in influenza. Viruses. 2015; 7(9): 4929-4944.
7. Gubareva LV, Fallows E, Mishin VP, et al. Monitoring influenza virus susceptibility to oseltamivir using a new rapid assay, iART. Eurosurveillance. 2017; 22(18): 30529.
8. Marjuki H, Mishin VP, Chesnokov AP, et al. Neuraminidase mutations conferring resistance to oseltamivir in influenza A(H7N9) viruses. J Virol. 2015; 89(10): 5419-5426.
9. Itoh Y, Shichinohe S, Nakayama M, et al. Emergence of H7N9 influenza A virus resistant to neuraminidase inhibitors in nonhuman primates. Antimicrob Agents Chemother. 2015; 59(8): 4962-4973.
10 Gubareva LV, Sleeman K, Guo Z, et al. Drug susceptibility evaluation of an influenza A(H7N9) virus by analyzing recombinant neuraminidase proteins. J Infect Dis. 2017; 216 (suppl_4): S566-S574.
11Gubareva LV, Robinson MJ, Bethell RC, Webster RG. Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en. J Virol. 1997; 71(5): 3385.
12.Sleeman K, Guo Z, Barnes J, Shaw M, Stevens J, Gubareva LV. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses. Emerg Infect Dis. 2013; 19(9): 1521-1524.
SUMBER:
Erin N. Hodges, Vasiliy P. Mishin, Juan De la Cruz, Zhu Guo, Ha T. Nguyen, Eric Fallows, James Stevens, David E. Wentworth, Charles Todd Davis, Larisa V. Gubareva. 2019. Detection of oseltamivir-resistant zoonotic and animal influenza A viruses using the rapid influenza antiviral resistance test. https;//doi.org/10.1111/irv.12661.
No comments:
Post a Comment