Pembuatan dan Evaluasi Imunoglobulin Y (IgY) Anti-SARS-CoV dari ayam SPF yang Diimunisasi

Ringkasan

Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) adalah penyakit yang disebabkan oleh SARS-CoV ditandai dengan demam, batuk, pneumonia fibrinosa akut, dan infektivitas tinggi (Chang, 2005). Wabah SARS terjadi selama 2003 menyebabkan kekhawatiran di seluruh dunia sebagai ancaman serius bagi kesehatan masyarkat dunia.  Pencegahan komprehensif dan langkah-langkah pengobatan dilakukan dengan pendekatan One-Health, lintas sektor, lintas disiplin ilmu secara global.  Sementara pada saat yang sama penelitian tentang SARS-CoV dan pengembangan vaksin vaksin, obat-obatan terapeutik dan produk biologis harus segera dilakukan.  Penelitian telah berhasil dan banyak kemajuan telah dibuat dalam semua bidang tersebut (Chow et al., 2003). Chao-Yang Fua et al. melakukan penelitiannya dengan imunisasi ayam spesific pathogen free (SPF) dengan SARS-CoV yang inaktif dan telurnya dipanen secara berkala. Immunoglobulin Yolk (IgY) diekstraksi dari telur ayam-ayam tersebut menggunakan metode pengenceran air, diteruskan dengan pemurnian pada kolom Sephadex G-75.  Dilanjutkan uji menggunakan SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), hasil Western blot dan uji netralisasi menunjukkan bahwa IgY yang diperoleh memiliki kemurnian tinggi dan memiliki reaktifitas yang kuat dengan titer netralisasi 1:640. Pada uji stabilitas menunjukkan bahwa IgY anti-SARS-CoV yang sudah diliofilisasi memiliki sifat fisik yang menjanjikan, tanpa pengurangan yang signifikan dalam reaktifitas dan stabilitas termal yang baik. Dari datanya menunjukkan bahwa IgY anti-SARS-CoV bisa menjadi produk biologis yang bermanfaat untuk terapi antivirus spesifik terhadap SARS.

Imunisasi Pasif

Analisis urutan nukleotida dan asam amino menunjukkan bahwa urutan nukleotida dari SARS-CoV bukan termasuk ke dalam salah satu dari tiga subkelompok coronavirus yang dikenal dan karenanya pada saat itu telah diidentifikasi sebagai coronavirus jenis lain/baru (Wang dan Ding, 2003).

Kemajuan terbaru telah dibuat dalam produksi material biologis untuk menanggulangi SARS-CoV. Material tersebut adalah antiserum terhadap SARS-CoV manusia.  Setelah melalui beberapa percobaan telah terbukti mampu menghambat pembiakan virus SARS-CoV.  Mempunyai prospeknya yang menjanjikan layak setelah dikonfirmasi imunitas pasif terhadap pasien yang terinfeksi SARS-CoV dan orang yang tidak terinfeksi tetapi berisiko terinfeksi.

Imunisasi pasif dan perlindungan jangka pendek dengan titer antibodi tinggi secara historis merupakan cara yang efektif untuk memerangi penyakit menular yang mematikan. Selama wabah SARS di Tiongkok pada tahun 2003, beberapa hasil positif dicapai dengan imunisasi pasif ketika serum pasien SARS yang pulih digunakan. Hasil pengamatan tidak terdapat reaksi merugikan pada sukarelawan yang diimunisasi pertama.

Untuk memberikan imunisasi pasif baru dan efektif terhadap SARS, studi dasar tentang antibodi SARS-CoV harus dilakukan. Studi-studi ini harus termasuk mencari sumber antibodi yang lebih bermutu baik, meningkatkan output dan meningkatkan teknik produksi dan pemurnian. Dalam penelitiannya, Chao-Yang Fua et al. telah berhasil mengimunisasi ayam spesific pathogen free (SPF), dan kemudian memurnikan imunoglobulin kuning telurnya (SARY) coronavirus dengan titer antibodi tinggi yang bisa menetralkan SARS-CoV.

Pembuatan IgY SARS-CoV

Antigen SARS-CoV dibuat dengan menggunakan virus SARS BJ01 yang disediakan oleh Akademi Ilmu Kedokteran Militer Tiongkok, Beijing, Tiongkok. Kultur virus diinaktivasi dengan propiolactone dan dimurnikan pada sentrifugasi sucrosegradient seperti yang dijelaskan sebelumnya (Yin dan Liu, 1997). Tiga puluh ekor ayam Leghorn SPF umur 17 minggu disediakan oleh Pusat Hewan Eksperimental dari Institut Penelitian Veteriner Harbin, Akademi Ilmu Pengetahuan Pertanian Tiongkok, Harbin, Tiongkok. Ayam-ayam diimunisasi dengan menyuntikkan 0,18 mg antigen coronavirus SARS ke dalam otot dada. Suntikan booster kedua dan ketiga dari 0,30 mg antigen diberikan 2 dan 4 minggu kemudian. 

Serum darah ayam dikumpulkan sebelum dan setelah setiap imunisasi dan telur dipanen ketika baru keluar dari ayam percobaan. Pemisahan IgY dari telur individu ayam dilakukan dengan menggunakan protokol yang dijelaskan oleh Akita dan Nakai (1993). Secara singkat, putih telur dipisahkan dari kuning telur dan dibuang. Kuning telur dicampur dengan air steril dan dibiarkan semalam pada suhu 4^oC. Campuran kemudian disentrifugasi pada 1200×g pada suhu 4^oC selama 30 menit, dan supernatan dimurnikan dengan kromatografi. Protein konsentrasi dalam eluat yang dipanen diukur dengan menggunakan thin-layergel scan.  

Banyaknya perolehan protein kasar sebelum kromatografi ditemukan sebanyak 56% sedangkan kemurniannya adalah 92% setelah kromatografi. Eluat menjadi sasaran analisis dengan SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dan Westernblot. IgY yang dipisahkan memiliki kemurnian yang tinggi sebagaimana dikonfirmasikan dengan SDS-PAGE dan IgY yang dimurnikan memiliki aktivitas biologis yang baik sebagaimana dikonfirmasikan dengan Western Blot. Aktivitas IgY dalam serum dan kuning telur yang diencerkan pada 1: 200 dalam larutan buffer fosfat (PBS) dari hewan yang diimunisasi diuji menggunakan uji ELISA tidak langsung seperti yang dijelaskan sebelumnya (Huang et al., 2005). Setelah imunisasi ayam SPF dengan antigen SARS-CoV, terdapat antibodi yang dapat terdeteksi terhadap SARS-CoV dalam kuning telur yang dikeluarkan dari ayam dalam 3 minggu pertama setelah imunisasi pertama. Produksi antibodi anti-SARSV dalam kuning telur ditemukan 2 minggu setelah IgY diproduksi dalam serum ayam.

Uji Netralisasi Virus

Uji netralisasi virus dilakukan dalam laminar-flow safety cabinets. Secara singkat, sampel IgY yang diencerkan secara serial diinkubasi dengan 200 TCID₅₀ SARS-CoV pada 37^oC selama 1 jam, kemudian diinokulasikan ke sel VERO E6 dan diinkubasi dalam inkubator CO₂ pada suhu 37^oC. Sel VERO E6 yang tidak terinfeksi dan serum SARS-CoV positif atau serum ayam SPF digunakan sebagai kontrol untuk eksperimen ini. IgY tidak bereaksi dengan sel Vero jika diuji dengan teknik antibodi fluoresen tidak langsung. Dosis Infektivitas dihitung menggunakan uji TCID₅₀ standar. Pengenceran antibodi tertinggi yang menghambat cytopathogenic effect (CPE) pada 50% sel VERO E6 yang diinokulasi dengan pengenceran ini dianggap sebagai titer netralisasi 50%. Hasil uji netralisasi menunjukkan bahwa antibodi kuning telur sampai pengenceran 1:640 efektif dalam menetralkan SARS-CoV, dan konsisten dengan hasil ELISA ketika antibodi hasil ekstraksi kuning telur digunakan.

Hasil Stabilitas IgY setelah diliofilisasi

Untuk prosedur liofilisasi, kuning telur dipisahkan dan dicampur dengan larutan salin fosfat dengan perbandingan 1 : 9 (v / v), diikuti dengan sentrifugasi dan pembuangan lemak.  Aliquot dimasukkan ke dalam botol 4-ml yang ditambahkan kurang dari 0,01% (g / ml) meriolat. Setiap botol disedot dan diliofilisasi menurut metode standar. Sampel diuji titer antibodinya sebelum dan setelah liofilisasi.  IgY setelah pengeringan menunjukkan sifat fisik yang baik termasuk warna kuning pucat. Reaktivitas IgY dalam ELISA tidak berubah secara signifikan setelah liofilisasi. Hasil pengujian stabilitas IgY setelah diliofilisasi menunjukkan bahwa reaktivitas IgY tidak menurun secara signifikan sampai suhu mencapai 90^oC selama 15 menit dalam air panas, hal ini menunjukkan bahwa IgY memiliki stabilitas panas yang baik. Tidak ada perubahan reaktivitas IgY di bawah kondisi asam dari pH 7 ke pH 2 setelah pengobatan pada 37^oC selama 2 jam. Selanjutnya, dilakukan Uji ketahanan dalam penyimpanan IgY yang sudah diliopilisasi.  IgY tidak berubah setelah penyimpanan 5 bulan pada suhu - 20^oC, 4^oC atau◦suhu kamar.

Keuntungan dari IgY ayam SPF

IgY dari ayam SPF menyediakan sumber antibodi yang kaya yang mudah diperoleh dan hemat biaya. Keuntungan dari IgY ayam SPF dibandingkan antibodi dari mamalia lain termasuk konsentrasi tinggi dan bebas dari patogen spesifik, membuat penggunaan IgY mempunyai prospek yang lebih luas untuk dikembangkan (Schade et al., 1992; Tini et al., 2002). IgY yang diperoleh dari telur ayam SPF dalam studi ini mempertahankan aktivitas biologis dan netralisasi yang baik pada kondisi lingkungan panas dan asam. Tingkat perolehan IgY setelah pemurnian dengan pengenceran air dan tingkat kemurnian IgY setelah pemurnian lebih lanjut menjanjikan, pengikatan IgY tetap tidak berubah setelah diliofilisasi, juga membuatnya layak untuk produk yang telah disiapkan dengan metode ini bisa digunakan untuk imunisasi pasif dan perlindungan jangka pendek.

Pengendalian Wabah SARS-CoV

Wabah pertama penularan SARS-CoV telah bisa dikendalikan dan potensi epidemi telah diatasi dengan isolasi pasien yang dicurigai dikombinasi dengan terapi obat, berdasarkan karakteristik klinis dan epidemiologis dari SARS. Namun, pengendalian jangka panjang SARS akan membutuhkan kombinasi imunisasi aktif dan pasif, terapi obat, dan tindakan komprehensif lainnya.

Oleh karena itu sangat penting untuk dapat menghasilkan vaksin dan produk imunisasi pasif untuk pengendalian SARS yang efektif.

Potensi diproduksi secara komersial

Pengembangan IgY anti-SARS-CoV tingkat tinggi yang dijelaskan dalam penelitian ini tampaknya berpotensi sebagai produk biologis anti-SARS baru untuk imunisasi pasif, karena secara efektif bisa menetralkan SARS-CoV. Dalam penelitian yang dilakukan oleh Chao-Yang Fua et al. ini bahwa IgY anti-SARS sudah disiapkan sebagai produk kasar dan murni, sedangkan uji ELISA tidak langsung digunakan untuk kontrol kualitas produksi IgY. Untuk memfasilitasi proses produksi massal IgY yang dimurnikan, teknik pembuangan lemak dan pemurnian akan menjadi kunci penting untuk studi berikutnya. Setelah evaluasi menggunakan model hewan yang terinfeksi secara eksperimental, IgY anti-SARS yang diproduksi dalam penelitiannya memiliki potensi untuk diproduksi secara komersial. Efisiensi kapsul yang dihasilkan dari IgY kasar atau bubuk semprot dan larutan intra-vena yang diproduksi dari IgY yang lebih tinggi akan perlu ditentukan sebagai langkah selanjutnya dalam pengembangan produk IgY.

DAFTAR PUSTAKA

1. Akita, E.M., Nakai, S., 1993. Comparison of four purification methods for theproduction  of  immunoglobulins  from  eggs  laid  by  hens  immunized  withan  enterotoxigenicE. coli2  strain.  J.  Immunol.  Methods  160,  207–214.

2. Chang,  S.C.,  2005.  Clinical  findings,  treatment  and  prognosis  in  patientswith  severe  acute  respiratory  syndrome  (SARS).  Chin.  Med.  Assoc.  68,106–107.

3. Chao-Yang Fua, He Huangb, Xiao-Mei Wanga, Yong-Gang Liua, Zhi-Guo Wanga,Shang-Jin Cuia, Hong-Lei Gaoa, Zan Lia, Jing-Peng Lib, Xian-Gang Konga. 2006. Preparation and evaluation of anti-SARS coronavirus IgY fromyolks of immunized SPF chickens. Journal of Virological Methods 133 (2006) 112–115.

4.  Chow, K.Y., Hon, C.C., Hui, R.K., Wong, R.T., Yip, C.W., Zeng, K., Leung,E.C.,  2003.  Molecular  advances  in  severe  acute  respiratory  syndrome-associated  coronavirus  (SARS-CoV).  Genomics  Proteomics  Bioinf.  1,247–262. 

5.     Huang,  H.,  Fu,  C.,  Wang,  Z.,  Cui,  S.,  Gao,  H.,  Wang,  X.,  Li,  Z.,  Li,  J.,Kong,  X.,  2005.  Establishment  of  the  detection  method  of  anti  SARSyolk antibody and serum antibody. Heilongjiang Ani. Sci. Vet. Med. 282,51–52.

6. Schade,  R.,  Schniering,  A.,  Hlinak,  A.,  1992.  Polyclonal  avian  antibodiesextracted from egg yolk as an alternative to the production of antibodiesin  mammals—a  review.  ALTEX  9,  43–56.

7.  Tini, M., Jewell, U.R., Camenisch, G., Chilov, D., Gassmann, M., 2002. Gen-eration and application of chicken egg-yolk antibodies. Comp. Biochem.Physiol.  A  Mol.  Integr.  Physiol.  131,  569–574.

8.   Wang,  H.,  Ding,  Q.,  2003.  SARS  coronaviruses.  Chin.  Virol.  18,  303–306.Yin,  Z.,  Liu,  J.,  1997.  Animal  Virology,  second  ed.  Science  Press,  Beijing,pp.  303–323.