Hydroxychloroquine efektif menghambat infeksi SARS-CoV-2 secara in vitro

Wabah penyakit coronavirus disease 2019 (COVID-19) disebabkan oleh virus severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) secara serius  mengancam kesehatan masyarakat global dan menimbulkan kerugian ekonomi secara nasional bagi negara-negara tertular.  Pada 3 Maret 2020 lebih dari 80.000 kasus telah dikonfirmasi di Tiongkok, termasuk 2946 kematian dan lebih dari 10.566 kasus yang dikonfirmasi di 72 negara di dunia.  Sejumlah besar orang yang terinfeksi membutuhkan pengobatan menggunakan obat yang berpotensi, aman, tersedia jumlahnya, dan terjangkau untuk pengendalian dan penurunan epidemi. Baru-baru ini telah dilaporkan bahwa dua obat, remdesivir (GS-5734) dan Chloroquine (CQ) fosfat dapat secara efisien menghambat infeksi SARS-CoV-2 in vitro. ^[1]  Remdesivir merupakan produk analog nukleosida yang dikembangkan oleh Gilead Sciences, Amerika serikat.

Tulisan ini merupakan laporan yang ditulis oleh Jia Liu et al. ^[13}Laporan kasus terbaru menunjukkan bahwa pengobatan dengan remdesivir meningkatkan kondisi klinis pasien pertama yang terinfeksi oleh SARS-CoV-2 di Amerika Serikat.^[2]  Uji klinis fase III remdesivir terhadap SARS-CoV-2 diluncurkan di Wuhan pada 4 Februari 2020. Namun, remdesivir sebagai obat percobaan yang diharapkan, tidak tersedia cukup untuk mengobati pasien yang jumlahnya sangat besar dengan tepat waktu. Oleh karena itu, dari dua obat yang betpotensi, CQ tampaknya menjadi obat pilihan untuk digunakan dalam skala besar karena tersedia, terbukti aman, dengan biaya relatif rendah. Mengingat data klinis awal, CQ telah ditambahkan ke daftar obat percobaan dalam Pedoman Diagnosis dan Pengobatan COVID-19 (Edisi Ke-enam) yang diterbitkan oleh Komisi Kesehatan Nasional Republik Rakyat Tiongkok. 

CQ (N4- (7-Chloro-4-quinolinyl)-N1, N1-diethyl-1,4- pentanediamine) telah lama digunakan untuk mengobati malaria dan amebiasis. Namun, resistensi terhadap Plasmodium falciparum menyebar  luas, dan terjadi pengembangan antimalaria baru yang menjadi obat pilihan profilaksis malaria. Selain itu, overdosis CQ bisa menimbulkan keracunan akut dan kematian.^[3] Dalam beberapa tahun terakhir, karena pemanfaatan CQ jarang dalam praktik klinis, maka produksinya menurun sehingga pasokan ke pasar di Tiongkok menjadi sangat berkurang. Pada tahun 1946 Hydroxychloroquine (HCQ) sulfate, turunan dari CQ, pertama kali disintesis dengan memperkenalkan gugus hidroksil menjadi CQ yang menunjukkan jauh lebih sedikit (~ 40%) beracun daripada CQ pada hewan.^[4] Lebi pentingnya HCQ masih banyak tersedia untuk mengobati penyakit autoimun, seperti systemic lupus erythematosus dan rheumatoid arthritis. Sejak CQ dan HCQ mempunyai struktur kimia yang sama dan juga mekanisme kerjanya sebagai basa lemah dan imunomodulator, mudah diusulkan secara cepat bahwa HCQ dapat menjadi kandidat obat yang berpotensi untuk mengobati infeksi virus SARS-CoV-2. Sebenarnya, pada 23 Februari, 2020, tujuh pendaftar uji klinis untuk Registrasi Uji Klinis dapat dilihat dalam bahasa Tiongkok (http://www.chictr.org.cn) HCQ akan digunakan mengobati COVID-19. Apakah HCQ atau CQ berkhasiat dalam mengobati infeksi SARS-CoV-2 bukti percobaannya  masih kurang. 

Maka dari itu telah dilakukan pembuktian dengan mengevaluasi efek antivirus HCQ terhadap infeksi SARS-CoV-2 dibandingkan dengan CQ secara in vitro. Sitotoksisitas HCQ dan CQ dalam sel African green monkey kidney Vero E 6 (ATCC-1586) diuji menggunakan uji CCK8 standar, dan hasilnya menunjukkan bahwa nilai 50% cytotoxic concentration (CC50) daripada CQ dan HCQ masing-masing adalah 273,20 dan 249,50 μM tidak berbeda nyata satu sama lain (Gambar 1a).

Keterangan Gambar

Gambar 1. Perbandingan aktivitas antivirus dan meknisme kerja CQ dan HCQ terhadap infeksi SARS-CoV-2 secara in vitro. 
a : sitotoksisitas dan aktifitas antivirus CQ dan HCQ. Sitotoksisitas dari dua obat dalam sel Vero E6 ditentukan oleh uji CCK-8. Sel Vero E6 diobati dengan dosis yang berbeda dari salah satu senyawa atau dengan PBS dalam kontrol selama 1 jam dan kemudian terinfeksi dengan SARS-CoV-2 pada MOI 0,01, 0,02, 0,2, dan 0,8. Virus hasil dalam supernatan sel dikuantifikasi oleh qRT-PCR pada 48 jam pasca infeksi. Sumbu Y mewakili rata-rata persen hambatan yang dinormalisasi ke kelompok PBS. Itu Percobaan diulang dua kali. 
b, c : Penelitiannya menberikan metodologi berbasis network untuk identifikasi cepat kandidat pengobatan SARS-CoV-2 menggunakan kombinasi obat lama yang berpotensi untuk dapat digunakan kembali.
CQ dan HCQ dalam menghambat masuknya virus. Sel-sel Vero E6 diobati dengan CQ atau HCQ (50 μM) selama 1 jam, diikuti oleh pengikatan virus (MOI = 10) pada 4 °C selama 1 jam. Kemudian virion yang tidak terikat dihilangkan, dan sel-sel selanjutnya ditambah dengan segar media yang mengandung obat pada suhu 37 °C selama 90 menit sebelum diperbaiki dan diwarnai dengan IFA menggunakan antibodi anti-NP untuk virion (merah) dan antibodi terhadap EEA1 untuk EE (hijau) atau LAMP1 untuk ELs (hijau). Nuklei (biru) diwarnai dengan pewarna Hoechst. Bagian virion yang co-localized dengan EE atau EL dalam setiap kelompok (n > 30 sel) dikuantifikasi dan ditunjukkan dalam b. Gambar mikroskopis konfokal representatif partikel virus (merah), EEA1 + EEs (hijau), atau LAMP1 + ELs (hijau) di setiap grup ditampilkan dalam c. Gambar yang diperbesar dalam kotak menunjukkan virion yang mengandung vesikel tunggal. Panah menunjukkan vesikel yang membesar secara tidak normal. Bar, 5 μm. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan analisis varian satu arah (ANOVA) dengan GraphPad Prism (F = 102.8, df = 5.182, *** P
Perlu dicatat bahwa bahwa nilai EC50 daripada CG tampaknya sedikit lebih tinggi dari pada yang dilaporkan sebelumnya (1,13 μM pada MOI 0,05) ^[1] yang kemungkinan karena adaptasi virus dalam kultur sel yang secara signifikan  meningkatkan infektifitas virus pada saat pasase virus terus menerus.  Akibatnya indeks selektivitas (SI = CC50 / EC50) dari CQ (100.81, 71.71, 38.26, dan 37.12) lebih tinggi dari HCQ (55,32, 61,45, 14,41, 19,25) pada MOI masing-masing 0,01, 0,02, 0,2, dan 0,8.
Analisis kuantifikasi menunjukkan bahwa, pada 90 menit pasca infeksi dalam sel yang tidak diobati, 16,2% virion yang diinternalisasi (anti-NP, red) diamati pada early endosome antigen 1 (EEA1)-EE positif (hijau), sementara lebih banyak virion (34,3%) dibawa ke late endosomal–lysosomal protein LAMP1 + ELs (hijau) (30 sel untuk setiap kelompok).  Sebaliknya terhadap CQ atau HCQ secara signifikan lebih banyak virion (35,3% untuk CQ dan 29,2% untuk HCQ, P < 0,001) terdeteksi dalam EE, sementara hanya hanya seidikit virio (2,4%  untuk CQ dan 0,03% untuk HCQ, P < 0,001) adalah ditemukan di lokalisasi dengan LAMP1 + ELs (30 sel) (Gambar 1b, 1 c). Hal ini menyarankan bahwa CQ dan HCQ memblokir transportasi SARS-CoV-2 dari EE ke EL, yang tampaknya menjadi persyaratan untuk melepaskan virus genom seperti dalam kasus SARS-CoV ^[7]. 

Untuk menadapatkan hasil yang lebih baik maka aktivitas antivirus CQ dibandingkan dengan aktivitas HCQ, kurva dosis-respons dari dua senyawa terhadap SARS-CoV-2 ditentukan menggunakan empat multiplicities of infection (MOI) dengan kuantifikasi virus RNA yang diperoleh dari supernatan sel pada 48 jam pasca infeksi (p.i). Data diringkas dalam Gambar 1a dan Tabel S1 tambahan menunjukkan bahwa, pada semua MOI (0,01, 0,02, 0,2, dan 0,8), konsentrasi efektif maksimal 50% (EC50) untuk CQ (2,71, 3,81, 7,14, dan 7,36 μM) adalah lebih rendah dari HCQ (4,51, 4,06, 17,31, dan 12,96 μM). Perbedaan nilai EC50 secara statistik signifikan pada MOI  0,01 (P < 0,05) dan MOI 0,02 (P <; 0,001) (Tambahan Tabel S 1). 

Hasil ini dikuatkan dengan imunofluoresensi mikroskop yang dibuktikan dengan tingkat ekspresi yang berbeda dari nucleoprotein (NP) virus pada konsentrasi obat yang ditunjukkan pada 48 jam pasca infeksi. (Gambar Tambahan. S1). Diambil bersama-sama, data menunjukkan bahwa anti-SARS-CoV-2 aktivitas HCQ tampaknya kurang kuat dibandingkan dengan CQ, setidaknya pada MOI tertentu. 

Baik CQ dan HCQ adalah basa lemah yang diketahui meningkatkan pH organel intraseluler asam, seperti endosom / lisosom, penting untuk fusi membran. ^[5] Di Selain itu, CQ dapat menghambat masuknya SARS-CoV mengubah glikosilasi reseptor dan Spike ACE2 protein.^[6] Eksperimen penambahan waktu mengkonfirmasi hal itu HCQ secara efektif menghambat tahap masuk, serta tahap pasca masuknya SARS-CoV-2, yang juga ditemukan setelah perawatan CQ (Tambahan Gambar. S2). Lebih jauh mengeksplorasi mekanisme kerja CQ dan HCQ secara terperinci dalam menghambat masuknya virus, co-lokalisasi virion dengan early endosome (EE) atau endolysosome (EL) dianalisis dengan immunofluorescence analysis (IFA) dan confocal mikroskopi. 

Menariknya, ditemukan bahwa pengobatan CQ dan HCQ menyebabkan perubahan nyata dalam jumlah dan ukuran / morfologi EE dan EL (Gambar 1c). Pada sel yang tidak diobati, kebanyakan EE jauh lebih kecil daripada EL (Gambar 1c). Dalam sel yang diobati dengan CQ dan HCQ, vesikel EE yang membesar secara tidak normal diamati (Gambar 1c, panah di panel atas), banyak di antaranya bahkan lebih besar dari ELs pada sel yang tidak diobati.  Ini sesuai dengan laporan pengobatan sebelumnya dengan CQ menginduksi pembentukan sitoplasma diperluas vesikel.^[8] Di dalam vesikel EE, virion (merah) terlokalisasi di sekitar membran (hijau) vesikel. CQ pengobatan tidak menyebabkan perubahan yang jelas pada jumlahnya dan ukuran ELs; Namun, struktur vesikel teratur tampaknya terganggu, setidaknya sebagian. Sebaliknya, dalam Sel yang diobati dengan HCQ, ukuran dan jumlah EL meningkat secara signifikan (Gambar 1c, panah di panel bawah).

Karena pengasaman sangat penting untuk pematangan endosom dan fungsinya, diduga bahwa pendewasaan endosome mungkin tersumbat pada tahap menengah endositosis, mengakibatkan kegagalan pengangkutan virion lebih lanjut ke situs pelepasan ultimat. CQ dilaporkan meningkatkan pH dari lisosom dari sekitar 4,5 hingga 6,5 pada 100 μM9. Untuk pengetahuan, ada kekurangan studi tentang dampak HCQ pada nilai morfologi dan pH endosom / lisosom. Hasil pengamatan menyarankan bahwa cara kerja CQ dan HCQ tampaknya berbeda dalam aspek-aspek tertentu. 

Telah dilaporkan bahwa penyerapan oral CQ dan HCQ pada manusia sangat efisien. Pada hewan, kedua obat berbagi pola distribusi jaringan yang sama, dengan konsentrasi tinggi di hati, limpa, ginjal, dan jangkauan paru-paru tingkat 200-700 kali lebih tinggi daripada yang ada di plasma ^[10].  Dilaporkan bahwa dosis aman (6-6,5 mg / kg per hari) daripada HCQ sulfat dapat menghasilkan kadar serum 1,4-1,5 μM dalam manusia ^[11].  Oleh karena itu, dengan dosis yang aman, konsentrasi HCQ dalam jaringan di atas kemungkinan akan tercapai menghambat infeksi SARS-CoV-2. 

Investigasi klinis ditemukan bahwa konsentrasi tinggi sitokin terdeteksi dalam plasma sakit kritis  pasien yang terinfeksi SARS-CoV-2.  Terjadinya peningkatan drastis sitokin diduga berkaitkan dengan tingkat keparahan penyakit.^[12]  Selain aktivitas antivirus langsungnya, HCQ adalah aman dan merupakan agen anti-inflamasi yang aman telah berhasil dengan baik digunakan secara luas pada penyakit autoimun dan dapat secara signifikan mengurangi produksi sitokin dan khususnya faktor proinflamasi. Oleh karena itu, dalam pasien COVID-19, HCQ juga dapat berkontribusi untuk melemahkan respon inflamasi.

Kesimpulannya, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa HCQ secara efisien dapat menghambat infeksi SARS-CoV-2 in vitro. Dalam kombinasi dengan fungsi anti-inflamasinya, diperkirakan bahwa obat tersebut memiliki potensi yang baik untuk memerangi penyakit ini. Kemungkinan menunggu konfirmasi dengan uji klinis, perlu ditunjukkan, meskipun HCQ kurang beracun daripada CQ, penggunaan jangka panjang dan overdosis masih bisa menyebabkan keracunan. Dan SI yang relatif rendah daripada HCQ membutuhkan perancangan dan pelaksanaan uji klinis yang cermat untuk mencapai pengendalian infeksi SARS-CoV-2 yang efisien dan aman.

Daftar Pustaka

1.   Wang, M. et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res. 30, 269–271 (2020).

2.   Holshue, M. L. et al. First case of 2019 novel coronavirus in the United States. N. Engl. J. Med. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2001191 (2020).

3.   Weniger, H. Review of side effects and toxicity of chloroquine. Bull. World Health 79, 906 (1979).

4.  McChesney, E. W. Animal toxicity and pharmacokinetics of hydroxychloroquine sulfate. Am. J. Med. 75, 11–18 (1983).

5.  Mauthe, M. et al. Chloroquine inhibits autophagic flux by decreasing autophagosome-lysosome fusion. Autophagy 14, 1435–1455 (2018).

6.  Savarino, A. et al. New insights into the antiviral effects of chloroquine. Lancet Infect. Dis. 6, 67–69 (2006).

7.  Mingo, R. M. et al. Ebola virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus display late cell entry kinetics: evidence that transport to NPC1+ endolysosomes is a rate-defining step. J. Virol. 89, 2931–2943 (2015).

8. Zheng, N., Zhang, X. & Rosania, G. R. Effect of phospholipidosis on the cellular pharmacokinetics of chloroquine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 336, 661–671 (2011).

9.   Ohkuma, S. & Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 3327–3331 (1978).

10. Popert, A. J. Choloroquine: a review. Rheumatology 15, 235–238 (1976).

11. Laaksonen, A. L., Koskiahde, V. & Juva, K. Dosage of antimalarial drugs for children with juvenile rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. A clinical study with determination of serum concentrations of chloroquine and hydroxychloroquine. Scand. J. rheumatol. 3, 103–108 (1974).

12. Huang, C. et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet 395, 497–506 (2020).

13. Hengrui Hu, Yufeng Li, Zhihong Hu, Wu Zhong and Manli Wang.  2020.  Hydroxychloroquine, a less toxic derivative of chloroquine, is effective in inhibiting SARS-CoV-2 infection in vitro.  Cell Discovery 6:16. (2020).