Serotyping C. trachomatis dengan PCR-RFLP

 

Serotyping Chlamydia trachomatis dengan Analisis PCR-RFLP

LATAR BELAKANG

Chlamydia trachomatis saat ini diklasifikasikan menjadi 15 serovar (A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L1, L2, L3) dan sejumlah besar serovarian. Pengetikan serovar C. trachomatis umumnya dilakukan dengan metode serotipe MOMP (major outer membrane protein), yang membutuhkan banyak antibodi poliklonal dan monoklonal. Baru-baru ini, PCR berhasil diterapkan untuk genotipe berbagai serovar C. trachomatis melalui analisis RFLP dan sekuensing langsung dari DNA omp1 yang telah diamplifikasi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengevaluasi serotipe C. trachomatis dengan PCR-RFLP dan menentukan serovar dari isolat urogenital C. trachomatis.

 

METODE

Lima belas strain referensi C. trachomatis dan 27 isolat klinis dianalisis dengan PCR-RFLP. Gen omp1 C. trachomatis diamplifikasi dengan PCR. Untuk serotipe dengan analisis RFLP, produk PCR omp1 dicerna dengan AluI dan dielektroforesis melalui gel poliakrilamida 7% dengan pewarnaan etidium bromida. Jika diperlukan, produk PCR dianalisis dengan HinfI, kombinasi EcoRI dan DdeI, atau CfoI.

 

HASIL

 

Dalam serotipe 15 strain referensi C. trachomatis, serovar A, B, Ba, E, F, G, K, dan L2 diidentifikasi dengan jelas setelah pencernaan AluI. Namun, serovar C, H, I, J, L3, dan serovar D, L1 menunjukkan pola yang identik setelah pencernaan AluI. Serovar C dan J serta serovar D dan L1 selanjutnya dibedakan dengan langkah kedua dari pencernaan enzim dengan HinfI. Serovar H, I, dan L3 dibedakan dengan pencernaan enzim menggunakan EcoRI dan DdeI. Pada serotipe C. trachomatis dari 27 isolat urogenital, 25 isolat dapat ditentukan dengan jelas. Sembilan di antaranya dikategorikan sebagai serovar E, 8 sebagai serovar D, 6 sebagai F, dan 2 sebagai serovar H. Dua isolat menunjukkan pola RFLP yang tidak dapat diidentifikasi dan tidak sesuai dengan prototipe C. trachomatis yang ada.

 

KESIMPULAN

 

Analisis PCR-RFLP adalah alat yang cepat, sederhana, dan kuat untuk membedakan serovar C. trachomatis. Oleh karena itu, pendekatan ini direkomendasikan untuk studi epidemiologi C. trachomatis di masa depan. Serovar E, D, dan F adalah jenis yang paling umum ditemukan pada spesimen urogenital, mewakili 92% dari sampel yang diteliti.

 

Kata Kunci: Chlamydia trachomatis, omp1, PCR-RFLP, Serotipe

 

SUMBER:

Yiel Hea Seo, M.D., Pil Whan Park, M.D., Wan Kim, M.D., Duck An Kim, M.D.,* dan Tae Yeal Choi, M.D. 2000. Serotipe Chlamydia trachomatis dengan Analisis Polimorfisme Panjang Fragmen Restriksi - Reaksi Berantai Polimerase (PCR-RFLP). Korean J Clin Pathol 2000; 20(5): 480-485.

Urutan Gen ompA C. psittaci Ungkap Genotipe Baru

 

Urutan gen ompA dari Chlamydophila psittaci mengungkapkan adanya

genotipe baru, E/B, dan kebutuhan akan metode genotipe diskriminatif

yang cepat

 

RINGKASAN

Dua puluh satu isolat Chlamydophila psittaci dari burung yang berasal dari berbagai negara di Eropa dianalisis menggunakan metode restriksi fragmen panjang polimorfisme ompA, pengurutan ompA, dan serotipe protein membran luar utama. Hasilnya menunjukkan keberadaan genotipe baru, E/B, di beberapa negara Eropa dan menekankan kebutuhan akan metode genotipe diskriminatif yang cepat.

 

ISI HASIL PENELITIAN

Chlamydophila psittaci diklasifikasikan menjadi 6 serovar, yaitu A hingga F. Serovar A endemik pada burung psittacine dan menyebabkan penyakit zoonosis pada manusia. Serovar B endemik pada merpati, pernah diisolasi dari kalkun, dan menyebabkan keguguran pada ternak sapi perah. Isolat serovar C (GD, MT1, dan 91/1264, 91/1301, CT1, dan Par1) diperoleh dari bebek di Jerman, Bulgaria, dan Belgia, angsa putih, kalkun dari California, dan burung puyuh. Serovar D umumnya diisolasi dari kalkun, namun juga ditemukan pada burung camar, burung kenari, dan manusia. Serovar C dan D dikenal sebagai risiko kerja bagi pekerja unggas. Isolat serovar E, yang dikenal sebagai Cal-10, MP, atau MN (meningopneumonitis), diisolasi selama wabah pneumonitis pada manusia pada akhir 1920-an dan awal 1930-an. Kemudian, isolat MN diperoleh dari berbagai burung di seluruh dunia, termasuk bebek, merpati, burung unta, dan rhea. Satu-satunya isolat serovar F, VS225, diperoleh dari burung parkit.

 

Serotyping dilakukan menggunakan panel antibodi monoklonal (MAbs) spesifik serovar dalam uji imunofluoresensi. Hibridoma penghasil MAb sebelumnya diuji menggunakan pewarnaan imunofluoresensi dengan organisme utuh dan, seperti Chlamydia trachomatis, diyakini mengenali protein membran luar utama (MOMP). Hanya MAb spesifik serovar A dan D yang telah dikarakterisasi menggunakan Western blotting dan uji radioimunopresipitasi (RIPA), dan memang MAb tersebut mengenali MOMP. Namun, MAb spesifik serovar lainnya masih perlu dikarakterisasi. Oleh karena itu, tujuan pertama dari studi ini adalah karakterisasi panel lengkap MAb spesifik serovar. Tujuan kedua adalah membandingkan serotipe MOMP, ompA RFLP, dan pengurutan ompA untuk mengkarakterisasi strain C. psittaci dari burung Psittaciformes, Columbiformes, Anseriformes, dan Galliformes.

 

Serotipe MOMP dan ompA RFLP sebelumnya telah dibandingkan dan terkadang memberikan hasil yang tidak konsisten. Oleh karena itu, pengurutan ompA dimasukkan sebagai metode pengetikan referensi. Dua puluh satu isolat C. psittaci dari Belgia (n=7), Jerman (n=6), Italia (n=7), dan Belanda (n=1) dikarakterisasi. Selain itu, strain referensi serovar A hingga F, VS1, CP3, GD, NJ1, MN, dan VS225, juga digunakan. Bakteri ditumbuhkan dalam sel Buffalo Green Monkey (BGM) seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. MAbs spesifik serovar VS1/7A7/E8, CP3/4C6/G2, GD/2H9, NJ1/2GB/C2, MN/4A10/A4, dan VS225/D6/36 dikarakterisasi menggunakan imunoblotting dan RIPA. Isotipe ditentukan menggunakan kit Hbt Mouse Monoclonal Isotyping (Sanbio, Uden, Belanda). Imunoblotting dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Antibodi monoklonal tidak relevan dengan isotipe yang sama serta larutan buffer fosfat (PBS) digunakan sebagai kontrol negatif, sedangkan MAb spesifik keluarga (7B6III) digunakan sebagai kontrol positif. Lisat sel RIPA disiapkan menggunakan modifikasi metode yang dijelaskan oleh Caldwell dan Perry. Singkatnya, strain referensi dikultur dalam sel BGM yang diobati dengan sikloheksimid menggunakan media esensial minimum tanpa metionin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) yang dilengkapi dengan 25 Ci (35S) L-metionin (TRAN35S-LABEL; MP Biomedicals, Irvine, CA) per ml. Tiga hari pasca-inokulasi (PI), monolayer terinfeksi dan tidak terinfeksi dicuci dengan PBS (pH 7,4) dan dihancurkan dengan larutan lisis RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Trizma base, 1 mM EDTA, 0,2 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 0,1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 0,1% NaN3, 1% Triton X-100, dan 10% sodium deoxycholate) pada suhu 37°C selama 30 menit. Suspensi klamidia berlabel disentrifugasi (10.000 g, 10 menit, 4°C). Supernatan dipulihkan dan digunakan sebagai antigen uji untuk imunopresipitasi. Imunopresipitasi dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Sambrook et al. menggunakan kontrol yang sama seperti pada imunoblotting. Sampel dianalisis secara elektroforetik pada gel slab vertikal SDS-poliakrilamida 12% (Mini Protean 3; Bio-Rad, Hercules, CA). Setelah itu, gel dicuci dalam larutan asam asetat 7% (5 menit), air suling ganda (15 menit), dan akhirnya Amplify (30 menit) (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Setelah itu, gel dikeringkan dalam pengering gel slab (Hoefer; Amersham Biosciences) dan dianalisis 24 jam kemudian menggunakan phosphoimager Typhoon 9200 (Amersham Biosciences).

DNA genomik untuk sekuensing ompA dipersiapkan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Wilson et al. (25). ompA diperbanyak menggunakan PCR seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (22), menghasilkan fragmen sepanjang 1.065 hingga 1.098 bp tergantung pada strainnya. Produk PCR dimurnikan menggunakan kolom spin QIAGEN (Westburg, Leusden, Belanda) dan diklon ke dalam pGemT (Promega, Madison, WI) sesuai dengan protokol pabrikan. Sel kompeten JM109 yang ditransformasi dengan heat shock (30 s, 42°C) (Promega) dikembangkan pada lempeng Luria-Bertani (LB) dengan tambahan karbenisilin (30 g/ml; Duchefa, Haarlem, Belanda). Lima klon dipilih dan kemudian dikembangkan dalam medium LB cair untuk pemurnian plasmid (QIAGEN Tip 100 Westburg). Analisis sekuens ompA dilakukan oleh VIB Genetic Service Facility (Universitas Antwerpen, Belgia) dan Laboratorium Fisiologi dan Imunologi Hewan Domestik (KULeuven, Belgia) menggunakan situs priming T7 dan SP6 yang terkait dengan vektor. Sekuens ompA yang diperoleh diserahkan ke GenBank, diselaraskan dengan sekuens ompA yang telah dipublikasikan sebelumnya menggunakan perangkat lunak ClustalX (16), dan kemudian diimpor ke TreeconW (17) menggunakan algoritma Jukes dan Cantor serta metode Neighbor-Joining (12) untuk membuat pohon filogenetik ompA (Gambar 1). Dua ribu bootstrap dihitung (9). Pohon tersebut di-root dengan sekuens ompA Chlamydophila caviae (GPIC) (26) (GenBank AF269282).

 

Analisis RFLP berbasis AluI dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (21). Fragmen dipisahkan pada gel agarosa LSI MP 2% (Life Science International, Zellik, Belgia). Sebagai kontrol, sekuens strain referensi dimasukkan ke Webcutter 2.0 (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html), dan pita yang diperoleh secara in silico dibandingkan dengan hasil perhitungan berbasis gel (Perangkat Lunak Demo Magelan; Incogen, Williamsburg, VA). Serotipe dilakukan dengan menggunakan pewarnaan imunofluoresensi tidak langsung pada monolayer BGM yang terinfeksi C. psittaci yang ditumbuhkan pada coverslip berdiameter 13 mm di bagian bawah Chlamydia Trac Bottles (CTB; International Medical, Brussels, Belgia). Setiap isolat diinokulasi ke dalam 8 CTB, dan 72 jam pasca infeksi (hpi), monolayer diperbaiki dengan metanol (10 menit, 20°C), setelah itu situs pengikatan non-spesifik diblokir dengan PBS (pH 7.3) plus 5% FCS (1 jam, suhu kamar). Semua pengenceran disiapkan dalam PBS plus 1% albumin serum sapi (BSA), dan semua inkubasi dilakukan di ruang lembap pada suhu 37°C selama 1 jam. Setelah pemblokiran, 25 μl PBS, kontrol spesifik keluarga MAb 7B6III, atau pengenceran pembeda dari enam MAb spesifik serovar A hingga F ditambahkan. Pengenceran pembeda dari MAb spesifik serovar ditentukan sebagai pengenceran di mana MAb spesifik serovar hanya bereaksi dengan strain referensi yang sesuai. Pengenceran pembeda adalah 1/5.000 untuk semua MAb, kecuali untuk MAb spesifik serovar D, di mana pengenceran 1/500 harus digunakan. Monolayer diinkubasi dan dicuci tiga kali (5 menit) dalam PBS plus 1% BSA, dan kemudian 25 μl imunoglobulin (IgG HL) anti-tikus yang terkonjugasi dengan isothiocyanate fluorescein kelinci (DakoCytomation; diencerkan 1/200) ditambahkan. CTB diinkubasi dan dicuci dua kali (5 menit) dalam PBS diikuti oleh dua kali (30 detik) dalam air destilasi ganda. Coverslip diambil, dipasang pada slide kaca mikroskop, dan diperiksa dengan mikroskop pemindai laser konfokal (600; Radiance 2000; Bio-Rad). Tidak ada MAb, kecuali kontrol spesifik keluarga MAb 7B6III, yang mengenali MOMP dalam imunoblotting, baik dalam kondisi reduksi atau nonreduksi. Namun, semua MAb mengenali MOMP dalam RIPA, yang menunjukkan bahwa mereka mengenali epitop konformasi, yang masuk akal karena 90% epitop antigen diperkirakan diskontinu dan sangat konformasi (19). Epitop sel B dianggap mengandung 15 hingga 20 residu yang berasal dari dua hingga lima segmen peptida, menempati permukaan seluas 70 hingga 90 nm (7). Anehnya, MAb spesifik serovar A dan D mengenali MOMP dalam imunoblotting dan RIPA sebelumnya tetapi sekarang gagal bereaksi dalam imunoblotting (22). Mencari penjelasan, ditemukan bahwa MAb spesifik serovar A dan D yang digunakan sekarang dan sebelumnya berasal dari klon yang berbeda (A. A. Andersen, komunikasi pribadi). Pengenalan oleh MAb yang digunakan sebelumnya mungkin kurang bergantung pada konformasi tinggi, atau MAb menunjukkan afinitas yang lebih tinggi terhadap epitop spesifik serovar. Namun, mungkin MOMP C. psittaci, seperti pada C. trachomatis, dapat membawa lebih dari satu epitop spesifik serovar (4), dan MAb yang digunakan sekarang dan sebelumnya diarahkan pada epitop spesifik serovar yang berbeda pada MOMP. Pemetaan epitop dapat memberikan jawaban. Isotiping mengungkapkan hasil berikut: IgG1 (7B6III), IgG2b (VS1/7A7/E8, MN/4A10/A4, VS225/D6/36), dan IgG3 (CP3/4C6/G2, GD/2H9, NJ1/2GB/C2). Sekuensing ompA dari 21 isolat mengungkapkan delapan genotipe A, lima genotipe B, dua genotipe D, dan satu genotipe E dan F (Tabel 2).

 

Serotipe tidak selalu dapat dilakukan langsung pada sampel klinis, karena mungkin terdapat antigen yang tidak cukup, sehingga memerlukan kultur. Namun, kultur memerlukan biaya tinggi dan tenaga kerja yang intensif, membutuhkan tingkat biosafety khusus, serta menunda serotipe setidaknya selama 3 hingga 6 hari. Interpretasi pewarnaan imunofluoresensi memakan waktu dan memerlukan ketelitian dari interpretator. Saat ini, serotipe belum dapat secara konklusif mendeteksi genotipe E/B. Secara teori, analisis RFLP ompA lebih sensitif dan spesifik, lebih murah, dan jauh lebih cepat. Namun, amplifikasi gen ompA utuh langsung dari sampel klinis kadang-kadang tidak mungkin dilakukan tanpa kultur sebelumnya. RFLP menghasilkan pola restriksi yang jelas, memberikan hasil pengetikan yang konklusif ketika melihat keberadaan pita spesifik yang sudah dikenal kecuali untuk genotipe E/B baru, yang menghasilkan pola E. Seperti analisis RFLP, sekuensing ompA kadang-kadang memerlukan kultur sebelumnya untuk mendapatkan produk PCR utuh untuk kloning selanjutnya. Sekuensing lebih mahal dan memakan waktu lebih lama daripada RFLP. Namun, saat ini, sekuensing ompA adalah satu-satunya metode pengetikan yang mampu mengidentifikasi semua genotipe yang diketahui, termasuk genotipe E/B. Sebagaimana diamati sebelumnya, genotipe tertentu cenderung, meskipun tidak secara ketat, dikaitkan dengan spesies burung tertentu (21). Genotipe A terjadi pada semua psittacina, genotipe B ditemukan pada tiga dari lima merpati, dan genotipe E/B hadir pada semua bebek. Menariknya, sejauh ini, genotipe F hanya ditemukan pada parkit Amerika (VS225) dan burung beo Jerman (84/2334) (2, 18). Saat ini, kami mengisolasi strain genotipe F tambahan di peternakan kalkun Belgia yang mengalami penyakit pernapasan. Serotipe dulunya sangat penting tetapi kini telah digantikan oleh RFLP ompA. Namun, RFLP tidak dapat membedakan genotipe E dari genotipe E/B yang baru ditemukan. Sekuensing ompA saat ini adalah satu-satunya cara untuk menemukan semua genotipe ompA unggas yang diketahui dan genotipe baru lainnya. Kami dengan jelas menunjukkan bahwa genotipe baru tidak selalu dapat ditemukan dengan RFLP maupun serotipe, karena polimorfisme nukleotida tunggal tidak menghasilkan pola restriksi lain (kecuali muncul pada situs restriksi) dan mutasi basa tidak mempengaruhi konformasi epitop spesifik serovar. Studi ini menekankan perlunya teknik pengetikan yang lebih diskriminatif dan cepat untuk memeriksa baik burung maupun manusia mengingat risiko zoonosis dari infeksi C. psittaci. Untuk tujuan ini, real-time PCR spesifik spesies dan genotipe kombinasi saat ini sedang dievaluasi. Nomor akses sekuens nukleotida. Sekuens gen ompA untuk genotipe A, B, D, E, F, dan E/B telah diserahkan ke GenBank dan diberi nomor akses AY762608, AY762609, AY762610, AY762611, AY762612, dan AY762613. Institut Penelitian Ilmiah Flemish (Grant S2/5DPE174) diakui atas dukungan finansial. Universitas Ghent diakui karena menyediakan hibah (Grant 01113401) untuk T. Geens.

 

REFERENSI

1. Andersen, A. A. 1991. Serotyping of Chlamydia psittaci isolates using serovarspecific monoclonal antibodies with the microimmunofluorescence test. J. Clin. Microbiol. 29:707–711.

2. Andersen, A. A. 1997. Two new serovars of Chlamydia psittaci from North American birds. J. Vet. Diagn. Investig. 9:159–164.

3. Andersen, A. A., and R. A. Van Deusen. 1988. Production and partial characterization of monoclonal antibodies to four Chlamydia psittaci isolates. Infect. Immun. 56:2075–2079.

4. Batteiger, B. E. 1996. The major outer membrane protein of a single Chlamydia trachomatis serovar can possess more than one serovar-specific epitope. Infect. Immun. 64:542–547.

5. Bush, R. M., and K. D. Everett. 2001. Molecular evolution of the Chlamydiaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:203–220.

6. Caldwell, H. D., and L. J. Perry. 1982. Neutralization of Chlamydia trachomatis infectivity with antibodies to the major outer membrane protein. Infect. Immun. 38:745–754.

7. Chakrabarti, P., and J. Janin. 2002. Dissecting protein-protein recognition sites. Proteins 47:334–343.

8. Everett, K. D., R. M. Bush, and A. A. Andersen. 1999. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:415–440.

9. Felsenstein, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39:783–791.

10. Francis, T., Jr., and T. P. Magill. 1938. An unidentified virus producing acute meningitis and pneumonitis in experimental animals. J. Exp. Med. 68:147–163.

11. Illner, V. F. 1960. Zur Frage der Ubertragung des Ornithosevirus durch das Ei. Monatsh Veterina¨rmed. 17:116–117.

12. Saitou, N., and M. Nei. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4:406–425.

13. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Detection and analysis of proteins expressed from cloned genes, p. 19–75. In N. Ford, C. F. M. Nolan, and M. Ockler (ed.), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

14. Sayada, C., A. A. Andersen, C. Storey, A. Milon, F. Eb, N. Hashimoto, K. Hirai, J. Elion, and E. Denamur. 1995. Usefulness of omp1 restriction mapping for avian Chlamydia psittaci isolate differentiation. Res. Microbiol. 146:155–165.

15. Sudler, C., L. E. Hoelzle, I. Schiller, and R. K. Hoop. 2004. Molecular characterisation of chlamydial isolates from birds. Vet. Microbiol. 98:235– 241.

16. Thompson, J. D., T. J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, and D. G. Higgins. 1997. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25:4876–4882.

17. Van de Peer, Y., and R. De Wachter. 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Appl. Biosci. 10:569–570.

18. Van Loock, M., D. Vanrompay, B. Herrmann, S. J. Vander, G. Volckaert, B. M. Goddeeris, and K. D. Everett. 2003. Missing links in the divergence of Chlamydophila abortus from Chlamydophila psittaci. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53:761–770.

19. Van Regenmortel, M. H. V. 1996. Mapping epitope structure and activity: from one-dimensional prediction to four-dimensional description of antigenic specificity. Methods 9:465–472.

20. Vanrompay, D., A. A. Andersen, R. Ducatelle, and F. Haesebrouck. 1993. Serotyping of European isolates of Chlamydia psittaci from poultry and other birds. J. Clin. Microbiol. 31:134–137.

21. Vanrompay, D., P. Butaye, C. Sayada, R. Ducatelle, and F. Haesebrouck. 1997. Characterization of avian Chlamydia psittaci strains using omp1 restriction mapping and serovar-specific monoclonal antibodies. Res. Microbiol. 148:327–333.

22. Vanrompay, D., E. Cox, J. Mast, B. Goddeeris, and G. Volckaert. 1998. High-level expression of Chlamydia psittaci major outer membrane protein in COS cells and in skeletal muscles of turkeys. Infect. Immun. 66:5494–5500.

23. Vanrompay, D., R. Ducatelle, and F. Haesebrouck. 1992. Diagnosis of avian chlamydiosis: specificity of the modified Gimenez staining on smears and comparison of the sensitivity of isolation in eggs and three different cell cultures. J. Vet. Med. 39:105–112.

24. Vanrompay, D., T. Geens, A. Desplanques, T. Q. Hoang, L. D. Vos, M. V. Loock, E. Huyck, C. Mirry, and E. Cox. 2004. Immunoblotting, ELISA and culture evidence for Chlamydiaceae in sows on 258 Belgian farms. Vet. Microbiol. 99:59–66.

25. Wilson, P. A., J. Phipps, D. Samuel, and N. A. Saunders. 1996. Development of a simplified polymerase chain reaction-enzyme immunoassay for the detection of Chlamydia pneumoniae. J. Appl. Bacteriol. 80:431–438.

26. Zhang, Y. X., S. G. Morrison, H. D. Caldwell, and W. Baehr. 1989. Cloning and sequence analysis of the major outer membrane protein genes of two Chlamydia psittaci strains. Infect. Immun. 57:1621–1625.

 

SUMBER:

Tom Geens, Ann Desplanques, Marnix Van Loock, Brigitte M. Bo¨nner, Erhard F. Kaleta, Simone Magnino, Arthur A. Andersen, Karin D. E. Everett, and Daisy Vanrompay. 2005. Sequencing of the Chlamydophila psittaci ompA Gene Reveals a New Genotype, E/B, and the Need for a Rapid Discriminatory Genotyping Method. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2005, p. 2456–2461

Karakterisasi Chlamydia pada Peternakan Unggas

Karakterisasi Molekuler Spesies Chlamydia pada Peternakan Unggas Komersial dan Rumah Tangga di Kosta Rika

ABSTRAK

Wabah yang disebabkan oleh Chlamydia psittaci dan spesies chlamydia lainnya baru-baru ini dilaporkan di peternakan unggas di seluruh dunia, menyebabkan kerugian ekonomi yang signifikan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan keberadaan spesies chlamydia pada unggas di Kosta Rika. Sebanyak 150 kumpulan sampel jaringan paru-paru dari unggas industri dengan masalah pernapasan dan 112 kumpulan swab trakea dari unggas rumah tangga tanpa gejala dianalisis menggunakan real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), end-point PCR, dan sekuensing. Sebanyak 16,8% (44/262) sampel positif untuk Chlamydia spp., sebagian besar terdeteksi pada unggas rumah tangga tanpa gejala (28,6%, 32/112) dan lebih sedikit pada unggas industri (8%, 12/150). Dari sampel positif tersebut, 45,5% (20/44) diidentifikasi sebagai C. psittaci. Untuk pertama kalinya, genotipe C. psittaci A dilaporkan pada unggas di Amerika Latin. Selain itu, keberadaan Chlamydia gallinacea pada unggas rumah tangga dan Chlamydia muridarum pada unggas industri dan rumah tangga dilaporkan untuk pertama kalinya di Amerika Tengah. Pada 40,9% (18/44) sampel positif, spesies chlamydia penyebab infeksi tidak dapat diidentifikasi. Temuan ini mengungkapkan adanya risiko zoonosis, terutama bagi pekerja peternakan unggas dan rumah potong hewan yang memiliki kontak langsung dengan unggas tersebut.

 

PENDAHULUAN

 

Klamidiosis pada unggas atau psitakosis adalah penyakit zoonosis yang disebabkan oleh bakteri intraseluler Chlamydia psittaci, yang tersebar luas di seluruh dunia [1]. Bakteri ini dapat menginfeksi lebih dari 467 spesies burung dan beberapa spesies mamalia, termasuk manusia [2]. Patogenisitasnya pada burung yang terinfeksi tergantung pada spesies yang terkena dan strain C. psittaci yang menginfeksi.

 

Strain C. psittaci saat ini dibagi menjadi 15 genotipe berdasarkan urutan gen ompA, yang mengkode protein membran luar utama [3, 4]. Sebagian besar genotipe unggas juga telah diidentifikasi secara sporadis pada manusia, terutama genotipe A, B, dan EB [5, 6]. Penularan ke manusia terutama terjadi melalui aerosol dari feses atau sekresi pernapasan burung. Di seluruh dunia, psitakosis adalah penyakit yang wajib dilaporkan pada manusia dan burung peliharaan, dan baru-baru ini juga pada unggas [7]. Meskipun ayam dan kalkun awalnya tampak kurang rentan terhadap infeksi klamidia dan menjadi sumber infeksi manusia yang sporadis [8], penelitian sering melaporkan C. psittaci pada jenis unggas ini dan penularannya ke manusia [9, 10]. Namun, sejak penemuan Chlamydia gallinacea, spesies ini tampaknya dominan, baik secara eksklusif atau bersamaan dengan C. psittaci pada kawanan ayam [7, 11–13]. Spesies chlamydia lainnya juga telah dilaporkan pada unggas, termasuk Chlamydia abortus, Chlamydia pecorum, Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis, dan Chlamydia muridarum [14]. Penelitian terbaru mengemukakan hipotesis bahwa C. gallinacea endemik pada ayam dan menyebabkan tanda klinis ringan serta penurunan kenaikan berat badan pada ayam pedaging [14]. Potensi zoonosis C. gallinacea telah disarankan, tetapi belum ada bukti konklusif yang disajikan hingga saat ini [7].

 

Penelitian yang dilakukan di Kosta Rika mengidentifikasi keberadaan C. psittaci pada burung paruh bengkok dan merpati yang hidup berdampingan dengan warga Kosta Rika di rumah dan tempat umum, masing-masing [15, 16]. Namun, keberadaan C. psittaci dan spesies Chlamydia lainnya pada burung galinaceous belum diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan keberadaan spesies chlamydia pada unggas industri dan rumah tangga di Kosta Rika, yang berpotensi ditularkan ke manusia selama penanganan dan pemotongan unggas.

 

BAHAN DAN METODE

 

Populasi Referensi dan Jenis Penelitian

 

Di Kosta Rika, peternakan komersial industri adalah tempat dengan sertifikat operasi veteriner yang dikeluarkan oleh Layanan Kesehatan Hewan Nasional (Servicio Nacional de Salud Animal – SENASA) dan ditandai dengan memiliki lebih dari 100 ekor unggas. Peternakan rumah tangga adalah fasilitas dengan maksimal 100 ekor unggas yang dipelihara dalam kandang atau bebas, digunakan untuk keperluan subsisten secara tidak terorganisir atau teknis. Garis genetik utama ayam pedaging yang digunakan di negara ini adalah Cobb 500, Ross 308, dan Hubbart, sedangkan ayam petelur utamanya adalah Isa Brown, Hy-line Brown, dan Lohman (R. Chaves, Koordinator Program Kesehatan Unggas Nasional – SENASA, komunikasi pribadi).

 

Penelitian dengan pengambilan sampel non-probabilistik secara kebetulan dilakukan untuk menentukan keberadaan spesies Chlamydia pada unggas galinaceous dengan dan tanpa gejala pernapasan. Dua kelompok sampel dianalisis, yang dikumpulkan pada tahun 2014 dan 2015 oleh SENASA. Kelompok pertama (kelompok 1) terdiri dari jaringan paru-paru yang dikumpulkan dari ayam pedaging (Gallus gallus domesticus) dengan masalah pernapasan, dari sistem industri-komersial di wilayah tengah (Alajuela, Cartago, Heredia, dan San José) serta Puntarenas. Sebanyak 150 kumpulan sampel jaringan paru-paru dari unggas di 77 tempat produksi industri-komersial dianalisis. Setiap kumpulan sampel terdiri dari jaringan paru-paru dari satu hingga lima ayam dengan gejala pernapasan dari peternakan produksi yang sama. Kelompok kedua (kelompok 2) terdiri dari swab trakea yang diambil dari ayam dan kalkun (Meleagris gallopavo) tanpa gejala pernapasan, dari peternakan rumah tangga di berbagai wilayah geografis negara (Alajuela, Cartago, Guanacaste, Heredia, dan Puntarenas). Pada kelompok ini, sebanyak 112 kumpulan sampel swab trakea dari unggas tanpa gejala klinis dari 25 tempat peternakan rumah tangga dianalisis; 111 kumpulan sampel merupakan swab dari satu hingga lima ayam, dan satu kumpulan sampel merupakan swab dari tiga kalkun. Sampel-sampel tersebut disimpan dalam keadaan dingin di dalam kotak es maksimal selama 24 jam hingga dikirim ke laboratorium, di mana sampel tersebut langsung diawetkan pada suhu −80 °C.

 

Ekstraksi DNA dari Sampel Unggas

 

Untuk ekstraksi asam nukleat, digunakan MagMAX™ Pathogen RNA/DNA Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dan MagMAX™ Express-96 Magnetic Particle Processor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sesuai dengan petunjuk produsen. Pada jaringan paru-paru, metode bead-beating digunakan sebagai langkah persiapan sebelum ekstraksi DNA. Spektrofotometer NanoDrop® ND-1000 digunakan untuk mengukur dan memverifikasi kualitas ekstrak.

 

Reaksi rantai polimerase kuantitatif (qPCR) untuk mendeteksi Chlamydia spp.

 

qPCR dilakukan mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Everett et al. [17] untuk mendeteksi gen 23S rRNA dari keluarga Chlamydiaceae, dengan modifikasi sebagai berikut: primer yang digunakan adalah TQF 5′-GAAAAGAACCCTTGTTAAGGGAG-3′ dan TQR 5′-CTTAACTCCCTGGCTCATCATG-3′, serta probe-nya adalah FAM-CAAAAGGCACGCCGTCAAC-TAMRA. Volume reaksi (25 μl) terdiri dari 12,5 μl Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix – 2× (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 1,0 μl dari masing-masing primer pada 10 pmol/μl, 0,5 μl dari probe pada konsentrasi 10 pmol/μl, 5 μl DNA, dan 5 μl air grade biologi molekuler (Thermo Scientific). Langkah-langkah amplifikasi adalah 95 °C selama 10 menit diikuti oleh 40 siklus 95 °C selama 15 detik dan 60 °C selama 1 menit. Sampel unggas dianalisis dalam tiga kali pengulangan. Ekstrak DNA dari C. muridarum (ATCC VR-123), yang disumbangkan oleh Laboratorium Chlamydias dan Human Papillomavirus, Institut Virologi, Fakultas Ilmu Kedokteran, Universitas Nasional Córdoba, Argentina, digunakan sebagai kontrol positif, dan air grade biologi molekuler sebagai kontrol negatif. Semua sampel dengan amplifikasi segmen 130-bp dan kurva pertumbuhan yang melebihi ambang batas siklus (dihitung secara otomatis) hingga siklus ke-35 dianggap positif [17].

 

qPCR untuk mendeteksi C. psittaci pada sampel yang qPCR-positif untuk Chlamydia spp.

 

Protokol amplifikasi gen ompA C. psittaci yang dijelaskan oleh Pantchev et al. [18] diterapkan dengan modifikasi sebagai berikut: primer yang digunakan adalah CppsOMP1-F (5′-CACTATGTGGGAAGGTGCTTCA-3′) dan CppsOMP1-R (5′-CTGCGCGGATGCTAATGG-3′), serta probe-nya adalah CppsOMP1-S (5′-FAM-CGCTACTTGGTGTGAC-TAMRA-3′). Volume reagen dan kondisi amplifikasi sama seperti yang dijelaskan di atas. Kontrol positif adalah ekstrak DNA C. psittaci yang disumbangkan oleh Laboratorium Chlamydias dan Human Papillomavirus, Argentina. Semua sampel dengan amplifikasi segmen 77-bp hingga siklus ke-36 dianggap positif [18].

 

Karakterisasi Molekuler dan Analisis Filogenetik Komparatif dari Sampel Positif Chlamydia spp.

Sampel yang positif pada qPCR untuk Chlamydia spp. dianalisis menggunakan PCR konvensional untuk mengamplifikasi urutan parsial dari domain variabel gen 23S rRNA Chlamydia spp. [14]. Campuran reaksi (25 μl) terdiri dari 12,5 μl DreamTaq™ PCR Master Mix – 2× (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 2,0 μl dari masing-masing primer (23S-UP: 5′-GAGTCCGGGAGATAGACAGC-3′; 23S-DN: 5′-CATGGATCTTCACTAGTATCCGC-3′) pada 10 pmol/μl, 5 μl DNA, dan 3,5 μl air grade biologi molekuler (Thermo Scientific). Langkah-langkah amplifikasi terdiri dari 95 °C selama 3 menit; 40 siklus 95 °C selama 30 detik, 50 °C selama 30 detik, dan 72 °C selama 45 detik; serta ekstensi akhir pada 72 °C selama 5 menit. Kontrol positif yang digunakan adalah ekstrak DNA C. psittaci yang telah disebutkan sebelumnya. Sampel dengan amplicon 329 bp dianggap positif. Produk PCR dimurnikan dengan kit QIAquick® (QIAGEN, Venlo, Belanda) sesuai petunjuk produsen, dan dikirim ke Macrogen (Seoul, Korea) untuk sekuensing. Urutan parsial disejajarkan menggunakan program BioEdit Sequence Alignment Editor® [19] dan dibandingkan menggunakan algoritma BLASTn terhadap database NCBI. Kemudian, urutan tersebut diimpor ke MEGA X, di mana algoritma Jukes dan Cantor [20] serta metode neighbour-joining [21] digunakan untuk menggambar pohon filogenetik. Urutan strain referensi dari berbagai spesies Chlamydia (C. gallinacea 08-1274/3 (AWUS01000004), Chlamydia avium 10DC88 NR121988, C. abortus S26/3 (NR077001), C. psittaci 6BC (NR102574), Chlamydia felis Fe/C-56 (NR076260), Chlamydia caviae GPIC (NR076195), Chlamydia pneumoniae CWL029 (NR076161), C. pecorum E58 (NR103180), C. suis R22 (U68420), C. trachomatis 434/BU (NR103960) dan C. muridarum Nigg3 (CP009760)) dimasukkan dalam analisis filogenetik.

 

Genotiping dan Analisis Filogenetik dari Sampel Positif C. psittaci
Pada sampel yang positif qPCR untuk C. psittaci, dilakukan nested PCR untuk mengamplifikasi domain variabel IV dari gen ompA dan menentukan genotip yang ada. Protokol yang dijelaskan oleh Sachse dan Hotzel [22] diikuti. Primer 191CHOMP (5′-GCIYTITGGGARTGYGGITGYGCIAC-3′) dan 371CHOMP (5′-TTAGAAICKGAATTGIGCRTTIAYGTGIGCIGC-3′) digunakan pada putaran amplifikasi pertama, dan pasangan 218PSITT (5′-GTAATTTCIAGCCCAGCACAATTYGTG-3′) dan 336CHOMP (5′-CCRCAAGMTTTTCTRGAYTTCAWYTTGTTRAT-3′) pada putaran kedua. Pada kedua putaran PCR, volume reaksi (25 μl) terdiri dari 12,5 μl DreamTaq™ PCR Master Mix – 2× (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 1,0 μl dari masing-masing primer pada 20 pmol/μl, 5 μl DNA, dan 5,5 μl air grade biologi molekuler (Thermo Scientific). Langkah-langkah amplifikasi adalah 95 °C selama 3 menit; 35 siklus 95 °C selama 30 detik, 55 °C selama 30 detik, dan 72 °C selama 45 detik; serta ekstensi akhir pada 72 °C selama 5 menit. Sampel dengan amplifikasi segmen 389 bp dianggap positif. Amplicon divisualisasikan dengan elektroforesis, dimurnikan, dan dikirim untuk sekuensing ke Macrogen (Korea).

 

Analisis filogenetik dilakukan menggunakan urutan referensi genotipe A (AY762608), B (AF269265), C (L25436), D (AF269266), E (X12647), F (AF269259), E/B (AY762613), M56 (AF269268), dan WC (AF269269) [23]. Pohon filogenetik dibuat berdasarkan perbandingan dengan urutan ompA C. caviae sebagai kelompok eksternal (GPIC, GenBank AF269282) [24].

 

HASIL

 

Sebanyak 44 (16,8%) dari 262 sampel positif untuk Chlamydia spp. berdasarkan qPCR spesifik keluarga, dengan 12 (8,0%) di kelompok 1 dan 32 (28,6%) di kelompok 2 (Tabel 1). Analisis dari 44 sampel positif menggunakan PCR konvensional untuk Chlamydia spp. berhasil mengidentifikasi spesies Chlamydia pada delapan sampel (Tabel 1). qPCR untuk C. psittaci mengidentifikasi 20 sampel positif: empat (4/44, 9,1%) di kelompok 1 dan 16 (16/44, 36,3%) di kelompok 2. Dari 20 sampel positif tersebut, tiga sampel dikonfirmasi sebagai C. psittaci menggunakan nested PCR spesifik (Tabel 1). Tidak memungkinkan untuk mengidentifikasi spesies Chlamydia pada 18 sampel lainnya dengan end-point PCR.

 

Tabel 1. Jumlah sampel positif yang diamplifikasi dengan teknik PCR yang berbeda berdasarkan sistem produksi

Dari 12 sampel positif di kelompok 1, empat sampel terdeteksi sebagai C. psittaci melalui qPCR. Dari empat sampel tersebut, dua sampel (P1 dan P30) juga dikonfirmasi melalui PCR spesifik spesies dan proses sekuensing (Tabel 2, Gambar 1). Salah satu sampel tersebut (P1) juga positif pada PCR untuk Chlamydia spp. dan diidentifikasi melalui sekuensing sebagai C. psittaci (Tabel 3, Gambar 2), sedangkan sampel lain (P53) diidentifikasi melalui sekuensing sebagai C. muridarum (Tabel 3, Gambar 2). Tidak memungkinkan untuk menetapkan spesies Chlamydia yang menginfeksi pada tujuh sampel lainnya (Tabel 1).

 

TABEL 2. Sampel yang positif untuk gen ompA dari C. psittaci berdasarkan spesies burung, sistem produksi, lokasi, dan identitas nukleotida dengan sekuens GenBank

Gambar 1. Dendrogram yang diperoleh dari fragmen 330 nukleotida dari domain variabel IV gen ompA C. psittaci, dibangun menggunakan metode neighbour-joining dan model Jukes dan Cantor. Sekuens C. caviae GPIC disertakan sebagai kelompok eksternal. Nilai bootstrap (10.000 pseudoreplikasi) ditunjukkan pada titik percabangan.

 

Tabel 3. Sampel positif untuk Chlamydia spp. berdasarkan spesies burung, sistem produksi, lokasi, dan identitas nukleotida dari gen 23S rRNA yang diamplifikasi dengan PCR dibandingkan dengan sekuens di GenBank.

Gambar 2. Dendrogram yang diperoleh dari fragmen sepanjang 317 nukleotida dari domain variabel gen 23S rRNA Chlamydia spp., dibangun menggunakan metode neighbour-joining dan model Jukes dan Cantor. Sebelas strain referensi Chlamydia spp. dan spesies klamidia yang ditemukan dalam penelitian ini (ditandai dengan poin tebal) ditampilkan. Nilai bootstrap (10.000 pseudoreplikasi) ditunjukkan pada titik cabang.\

 

Dari 32 sampel yang positif untuk Chlamydia spp. di kelompok 2, 16 sampel dinyatakan positif C. psittaci melalui qPCR dan salah satu sampel tersebut (H27) dikonfirmasi oleh dua uji PCR end-point dan sekuensing (Tabel 2 dan 3, Gambar 1 dan 2). Dengan menggunakan PCR konvensional untuk Chlamydia spp., tiga sampel (H102, H105, dan H112) dinyatakan positif C. gallinacea (Tabel 3, Gambar 2), dan dua sampel (H58 dan H59) dinyatakan positif C. muridarum (Tabel 3, Gambar 2). Tidak memungkinkan untuk menentukan spesies klamidia pada 11 sampel (Tabel 1).

 

Ketiga sampel yang positif untuk C. psittaci dikonfirmasi sebagai genotipe A dan mendapatkan nomor akses GenBank yang tercantum dalam Tabel 2. Analisis filogenetik berdasarkan gen 23S rRNA menunjukkan bahwa sekuens dari tiga spesies yang diidentifikasi dalam penelitian ini (C. psittaci, C. muridarum, dan C. gallinacea) memiliki kemiripan (99,4–100%) dengan sekuens spesies klamidia yang disimpan di GenBank (Tabel 3) dan memperoleh nomor akses yang tercantum dalam Tabel 3.

 

Jumlah sampel Chlamydia positif terbesar ditemukan pada kelompok burung peliharaan di halaman belakang tanpa tanda klinis (kelompok 2). Sebanyak 28,6% (32/112) dari sampel ini positif. Sampel positif ditemukan di 60,0% (15/25) dari tempat pemeliharaan halaman belakang yang dianalisis (Tabel 4). Sebaliknya, dalam kelompok sampel dari burung di tempat industri-komersial, hanya 8,0% (12/150) yang positif, dan burung positif ditemukan di 12,9% (10/77) dari tempat yang dianalisis. Sampel yang positif untuk Chlamydia spp. terutama ditemukan di Alajuela (33/44, 75,0%), meskipun jumlah sampel terbesar juga dikumpulkan di provinsi ini (195/262, 74,4%). Semua sampel positif untuk Chlamydia spp. dari kelompok 1 (burung industri-komersial) ditemukan di provinsi Alajuela (Tabel 4), sedangkan sampel positif dari kelompok 2 (burung peliharaan di halaman belakang) terutama ditemukan di Alajuela tetapi juga di Puntarenas, Cartago, dan Guanacaste (Tabel 4).

 

Tabel 4. Distribusi sampel positif untuk Chlamydia spp. berdasarkan sistem produksi dan lokasi

Kehadiran C. psittaci terdeteksi di tiga tempat usaha komersial di provinsi Alajuela, empat tempat usaha belakang rumah di Alajuela, dan satu tempat usaha belakang rumah di Puntarenas (C. psittaci, qPCR) (Tabel 2), sementara C. gallinacea terdeteksi di dua tempat usaha belakang rumah di Puntarenas dan satu di Cartago (Tabel 3). Kehadiran C. muridarum terdeteksi di satu tempat usaha komersial dan satu tempat usaha belakang rumah di Alajuela (Tabel 3).

 

DISKUSI DAN KESIMPULAN

 

Penelitian ini melaporkan deteksi pertama berbagai spesies Chlamydia pada burung berkokok dari peternakan komersial dan belakang rumah di Kosta Rika dan di Amerika Tengah. Persentase positif yang diamati pada sampel campuran yang dikumpulkan dari peternakan komersial (8,0%) lebih tinggi dibandingkan yang dilaporkan di Meksiko (3,4% (20/526 sampel individu)) dan Slovakia (6,9% (19/276 sampel individu)) [9, 13], tetapi lebih rendah dibandingkan yang ditemukan di peternakan unggas komersial di Polandia (23% (26/113 sampel campuran)), Belanda (49% (74/151 sampel campuran)), dan Argentina (40,3% (27/67 sampel individu)) [7, 25, 26]. Demikian juga, persentase positif yang terdeteksi di peternakan belakang rumah di Kosta Rika (28,6%) lebih tinggi dibandingkan di negara lain, seperti Amerika Serikat (13,6% (64/472 sampel campuran)), Italia (15% (24/160 sampel individu)), dan Cina (24,7% (442/1791 sampel individu)) [11, 12, 14], tetapi mirip dengan yang baru-baru ini dilaporkan di Meksiko (28,6% (83/293 sampel individu)) [13].

 

Empat kali lebih banyak sampel positif untuk spesies Chlamydia ditemukan pada sampel dari burung belakang rumah dibandingkan dengan burung industri, meskipun yang terakhir menunjukkan tanda-tanda pernapasan. Temuan ini mungkin disebabkan oleh kurangnya langkah-langkah biosekuriti di tempat usaha belakang rumah dan kemungkinan kontak yang lebih tinggi dengan hewan lain, terutama burung liar yang dapat menularkan agen tersebut [27]. Faktor-faktor seperti langkah-langkah biosekuriti yang ketat, praktik pembersihan dan disinfeksi yang baik, penggunaan obat pencegahan (antibiotik), dan manajemen nutrisi yang baik telah terbukti mengurangi risiko penularan patogen [28]. Deteksi C. psittaci pada burung dengan tanda-tanda pernapasan di peternakan komersial adalah hal yang patut dicatat. Namun, persentase positif dalam kedua kelompok mungkin terunderestimasi karena, di satu sisi, bakteri ini dikeluarkan secara intermiten pada hewan asimptomatik [29], dan di sisi lain, burung umumnya mengeluarkan bakteri melalui faring atau kloaka, bukan dari kedua tempat tersebut [9]. Potensi zoonosis harus dianggap mungkin pada pembawa asimptomatik C. psittaci bahkan tanpa adanya tanda-tanda klinis [30].

 

Penelitian ini adalah yang pertama mendeteksi di Kosta Rika dan di Amerika Tengah kehadiran C. psittaci pada burung berkokok komersial dan belakang rumah. Kehadirannya harus menjadi peringatan bagi pekerja peternakan unggas dan rumah pemotongan hewan serta orang lain yang memiliki kontak langsung dengan burung-burung ini bahwa mereka mungkin berisiko terinfeksi oleh bakteri tersebut dan penyakit yang dapat ditimbulkannya. C. psittaci telah terdeteksi pada ayam di Australia, Jerman, Belgia, Prancis, Slovakia, Italia, dan Cina [9, 14], menyebabkan kerugian ekonomi bagi industri unggas karena pelaporannya yang wajib [9]. Persentase infeksi di semua negara tersebut tidak melebihi 6,9% (Slovakia), berbeda dengan persentase yang diperoleh dalam penelitian ini (45,5%). Namun, studi serologis (enzim-linked immunoassay yang spesifik untuk C. psittaci) di peternakan pembesaran di Belgia menemukan seropositivitas sebesar 95%, sehingga persentase yang diperoleh melalui PCR bisa jadi terunderestimasi karena pengeluaran bakteri yang bersifat intermiten [31]. Deteksi genotipe C. psittaci A pada unggas di negara kami sejalan dengan laporan dari Belgia [8] dan merupakan risiko bagi orang yang memiliki kontak dengan burung-burung ini, karena genotipe ini dianggap sangat virulen [32]. Di berbagai tempat usaha, terutama yang positif untuk C. psittaci, langkah-langkah perlindungan pribadi harus ditinjau dan diterapkan, yang harus mencakup protokol kebersihan tangan dan pakaian pelindung, termasuk sarung tangan dan masker udara dengan filter penuh. Selain itu, harus ada ruang transisi di mana pakaian pelindung dapat disimpan, serta pembersihan yang memadai dan ventilasi alami atau mekanis untuk menghindari kontaminasi silang antara berbagai ruang [33].

 

Diagnosis agen infeksi yang menyebabkan masalah pernapasan pada unggas di Kosta Rika dilakukan secara aktif oleh SENASA, yang mencakup usaha untuk penyakit Newcastle, influenza avian, laringotrakeitis infeksius avian, bronkitis infeksius avian, dan infeksi oleh spesies Mycoplasma. Penelitian terbaru oleh De Boek et al. [34] menemukan masalah konjungtivitis, penyakit saluran pernapasan atas, dan dispnea pada broiler, dan menetapkan bahwa C. psittaci selalu mendahului infeksi Ornithobacterium rhinotracheale, memberikan bukti bahwa C. psittaci dapat terjadi pada usia dini pada broiler tanpa infeksi pernapasan predisposisi. Juga dilaporkan peningkatan kematian virus influenza avian H9N2 dengan menekan respons imun inang akibat infeksi dengan strain C. psittaci yang patogen [35]. Oleh karena itu, disarankan untuk memasukkan klamidiosis avian dalam diagnosis banding penyakit pernapasan unggas [8, 31].

 

Kehadiran C. muridarum pada ayam komersial dan belakang rumah juga dilaporkan di sini untuk pertama kalinya di Kosta Rika dan di Amerika Tengah. Temuan ini dianggap sebagai kejadian yang kebetulan dan sporadis, kemungkinan disebabkan oleh kontak dekat burung-burung dengan inang alaminya (rodensia) [14].

 

Akhirnya, kehadiran C. gallinacea pada ayam belakang rumah dilaporkan untuk pertama kalinya di Kosta Rika dan di Amerika Tengah. Agen klamidia ini baru-baru ini terdeteksi di seluruh dunia, sehingga informasi tentangnya masih terbatas. Di Amerika, keberadaannya dilaporkan di Argentina, Meksiko, dan Amerika Serikat [11, 13, 26]. Studi eksperimental dengan C. gallinacea telah menunjukkan penurunan berat badan yang signifikan (6,5–11,4%) pada hewan tanpa tanda klinis [14].

 

Teknik qPCR yang digunakan dalam penelitian ini lebih sensitif dibandingkan dengan teknik PCR titik akhir, seperti yang banyak didokumentasikan dalam literatur [1]. Dari sampel yang terdeteksi positif dalam qPCR untuk Chlamydia spp., 45,4% (20/44) dikonfirmasi sebagai C. psittaci melalui qPCR yang spesifik untuk spesies ini, mengonfirmasi kehadiran signifikan agen tersebut di lingkungan kami [15, 16]. Sebaliknya, uji PCR titik akhir untuk Chlamydia spp. dan C. psittaci hanya mampu mendeteksi masing-masing 18,2% (8/44) dan 15,0% (3/20) dari sampel positif yang terdeteksi oleh qPCR. Pada 40,9% (18/44) kasus positif, tidak mungkin untuk mengidentifikasi spesies klamidia yang menginfeksi. Kemungkinan penggunaan qPCR untuk spesies Chlamydia lainnya (misalnya C. gallinacea) dapat membantu kami mengidentifikasi spesies klamidia yang belum ditentukan. Studi terbaru [9, 14] telah menetapkan bahwa sebagian besar klamidia yang tidak teridentifikasi termasuk dalam C. gallinacea (terdeteksi melalui qPCR), yang dianggap endemik dan dominan pada ayam.

 

Hasil penelitian ini menunjukkan kompleksitas epidemiologi klamidiosis avian dan mengonfirmasi bahwa infeksi klamidia pada burung tidak hanya disebabkan oleh C. psittaci. Hasil tersebut dilaporkan kepada direktur dan pejabat SENASA, kepada para profesional dan mahasiswa kedokteran hewan, melalui siaran pers dan kongres. Kami merekomendasikan untuk memperingatkan individu yang bekerja di peternakan unggas komersial atau memiliki kontak dengan burung tentang risiko penularan agen klamidia sehingga mereka dapat mengambil langkah-langkah biosekuriti yang diperlukan. Selain itu, perlu meningkatkan kesadaran di kalangan profesional kedokteran hewan dan mengingatkan mereka untuk mempertimbangkan klamidia dalam diagnosis banding agen penyebab masalah pernapasan pada unggas. Terakhir, SENASA harus memasukkan diagnosis klamidiosis avian dalam pengendalian aktif penyakit pernapasan pada unggas untuk menghindari penyebaran infeksi. Metode diagnostik molekuler, terutama qPCR, berkat sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi, harus menjadi pilihan utama untuk menentukan keberadaan spesies Chlamydia pada unggas. Penelitian mendatang harus menyelidiki patogenitas, pengaruh terhadap produksi, dan kemungkinan potensi zoonotik C. psittaci dan C. gallinacea pada unggas di Kosta Rika.

 

REFERENSI

1.   OIE (2018) Avian chlamydiosis. In Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. Office International des epizooties. Terrestrial Manual. Chapter 2.3.1 Paris, France, pp. 1–13.

2.   Kaleta EF and Taday EMA (2003) Avian host range of Chlamydophila spp. based on isolation, antigen detection and serology. Avian Pathology 32, 435–462.

3.   Sachse K, Laroucau K and Vanrompay D (2015) Avian Chlamydiosis. Current Clinical Microbiology Reports 2, 10–21.

4.   Sachse K and Ruettger A (2014) Rapid microarray-based genotyping of Chlamydia spp. strains from clinical tissue samples. Methods in Molecular Biology 1247, 391–400.

5.   Heddema ER et al. (2006) Genotyping of Chlamydophila psittaci in human samples. Emerging Infectious Diseases 12, 1989–1990.

6.   Vanrompay D et al. (2007) Chlamydophila psittaci transmission from pet birds to humans. Emerging Infectious Diseases 13, 1108–1110.

7.   Heijne M et al. (2018) A cross sectional study on Dutch layer farms to investigate the prevalence and potential risk factors for different Chlamydia species. PLoS ONE 13, e0190774.

8.   Lagae S et al. (2014) Emerging Chlamydia psittaci infections in chickens and examination of transmission to humans. Journal of Medical Microbiology 63, 399–407.

9.   Čechová L et al. (2018) Chlamydiosis in farmed chickens in Slovakia and zoonotic risk for humans. Annals of Agricultural and Environmental Medicine 25, 320–325.

10. CDC (2018) Multistate Psittacosis Outbreak among Poultry Plant Workers.

11. Li L et al. (2017) Chlamydia gallinacea: a widespread emerging Chlamydia agent with zoonotic potential in backyard poultry. Epidemiology and Infection 145, 2701–2703.

12. Donati M et al. (2018) Chlamydiosis in backyard chickens (Gallus gallus) in Italy. Vector-Borne and Zoonotic Diseases 18, 222–225.

13  Ornelas-Eusebio E et al. (2020) Cross-sectional study on Chlamydiaceae prevalence and associated risk factors on commercial and backyard poultry farms in Mexico. Preventive Veterinary Medicine 176, 104922.

14. Guo W et al. (2016) Chlamydia gallinacea, not C. psittaci, is the endemic chlamydial species in chicken (Gallus gallus). Scientific Reports 6, 1–10.

15. Sheleby-Elías J et al. (2013) Molecular detection and genotyping of Chlamydia psittaci in captive psittacines from Costa Rica. Veterinary Medicine International 142962, 1–6.

16. Dolz G et al. (2013) Chlamydia psittaci genotype B in a pigeon (Columba livia) inhabiting a public place in San José, Costa Rica. Open Veterinary Journal 3, 135–139.

17. Everett KDE, Hornung LJ and Andersen AA (1999) Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests. Journal of Clinical Microbiology 37, 575–80.

18. Pantchev A et al. (2009) New real-time PCR tests for species-specific detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus from tissue samples. Veterinary Journal 181, 145–150.

19. Hall TA (1999) BIOEDIT: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/ NT. Nucleic Acids Symposium Series 41, 95–98.

20. Jukes TH and Cantor CR (1969) Evolution of protein molecules BT – mammalian protein metabolism. In Munro, H.N., (Ed.), Mammalian Protein Metabolism. Academic Press, New York, pp. 21–132.

21. Saitou N and Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4, 406–425. doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454.

22. Sachse K and Hotzel H (2003) Detection and differentiation of Chlamydiae by nested PCR. Methods in Molecular Biology 216, 123–136.

23. Sachse K et al. (2008) Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes. BMC Microbiology 8, 63.

24. Zhang YX et al. (1989) Cloning and sequence analysis of the major outer membrane protein genes of two Chlamydia psittaci strains. Infection and Immunity 57, 1621–1625.

25. Szymańska-Czerwińska M et al. (2017) Poultry in Poland as Chlamydiaceae carrier. Journal of Veterinary Research 61, 411–419.

26. Origlia J, Cadario M and Arias N (2016) Detección molecular de Chlamydia gallinacea en aves comerciales de Argentina. XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología'At: Rosario, Argentina.

27. Vorimore F et al. (2015) Chlamydia psittaci in ducks: a hidden health risk for poultry workers. Pathogens and Disease 73, 1–9.

28. Sims LD (2006) Risks associated with poultry production systems. Poultry in the 21st Century, Asia Pacific Veterinary Information Services, Palm Cove, Australia, pp. 1–23.

29. Andersen AA and Vanrompay D (2003) Avian chlamydiosis (psittacosis, ornithosis). In Saif Y. M., Barnes H. J., Fadly A. M., Glisson J. R., McDougald L. R., and Swayne D. E. (Eds.), Diseases of poultry. Iowa State University Press, Ames, IA. pp. 863–879.

30. Zaręba-Marchewka K et al. (2020) Chlamydiae – what's new? Journal of Veterinary Research 64(4), 461–467.

31. Dickx V et al. (2010) Chlamydophila psittaci in homing and feral pigeons and zoonotic transmission. Journal of Medical Microbiology 59, 1348–1353.

32. Beeckman DSA and Vanrompay DCG (2009) Zoonotic Chlamydophila psittaci infections from a clinical perspective. Clinical Microbiology and Infection 15, 11–17.

33. Deschuyffeleer TPG et al. (2012) Risk assessment and management of Chlamydia psittaci in poultry processing plants. Annals of Occupational Hygiene 56, 340–349.

34. De Boeck C et al. (2015) Longitudinal monitoring for respiratory pathogens in broiler chickens reveals co-infection of Chlamydia psittaci and Ornithobacterium rhinotracheale. Journal of Medical Microbiology 64, 565–574.

35. Chu J et al. (2016) Chlamydia psittaci infection increases mortality of avian influenza virus H9N2 by suppressing host immune response. Scientific Reports 6, 29421.

 

SUMBER:

Antony Solorzano-Morales, Goby Dolz. 2022. Molecular characterization of Chlamydia species in commercial and backyard poultry farms in Costa Rica. Epidemiol Infect. 2022 Feb 24;150:e67.