Reaktivitas Silang SARS-CoV dan CoV Hewan Kelompok 1

Reaktivitas Silang Antigenik Dua Arah antara SARS-CoV dan CoV Hewan Kelompok 1 Dimediasi dengan Situs Antigenik Bagian N-Terminal Nucleoprotein SARS-CoV

ABSTRAK

Pada tahun 2002, terkait severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) muncul pada manusia, menyebabkan epidemi global. Dengan analisis filogenetik, SARS-CoV berbeda dari CoV yang diketahui dan paling terkait dengan kelompok 2 CoV. Namun, tidak ada reaktivitas silang antigenik antara SARS-CoV dan CoV yang diketahui secara meyakinkan dan konsisten ditunjukkan kecuali untuk CoV hewan kelompok 1. Kami menganalisis reaktivitas silang ini dengan uji enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) terkait dan analisis Western blot menggunakan antisera spesifik untuk CoV hewan dan SARS-CoV dan SARS fase penyembuhan atau negatif pasien SARS. Reaktivitas silang dua arah yang moderat antara SARS-CoV dan CoVs babi (Transmissible gastroenteritis coronavirus [TGEV] yang dapat ditransmisikan dan Porcine respiratory coronavirus [PRCV]) dimediasi melalui protein-N tetapi bukan protein Spike, sedangkan reaktivitas silang yang lebih lemah terjadi dengan Feline infectious peritonitis coronavirus (FCoV) pada kucing dan Canine coronavirus (CCoV) pada anjing. Dengan menggunakan protein dan fragmen rekombinan SARS-CoV N yang diekspresikan Escherichia coli, bagian reaktif silang terlokalisasi antara asam amino (aa) 120 hingga 208. Fragmen protei-Nn yang terdiri dari aa 360 hingga 412 dan aa 1 hingga 213 bereaksi secara khusus dengan SARS serum fase pemulihan tetapi tidak dengan serum manusia negatif di ELISA; fragmen yang terdiri dari aa 1 hingga 213 bereaksi silang dengan antisera terhadap CoV hewan, sedangkan fragmen yang terdiri dari aa 360 hingga 412 tidak bereaksi silang dan dapat menjadi kandidat potensial untuk diagnosis SARS. Sangat penting, substitusi tunggal pada protein-N PRCV 120 mengurangi reaktivitas silang. Kami juga menunjukkan bahwa reaktivitas silang tidak universal untuk semua CoV kelompok 1, karena HCoV-NL63 tidak bereaksi silang dengan SARS-CoV. Reaktivitas silang satu arah HCoV-NL63 dengan kelompok 1 CoV dilokalisasi aa ke 1 hingga 39 dan setidaknya satu situs antigenik pada terminal protein-N C, berbeda dari reaktif lintas reaktif yang diidentifikasi dalam protein-N SARS-CoV. Reaktivitas silang yang diamati bukan merupakan konsekuensi dari tingkat identitas asam amino yang lebih tinggi antara SARS-CoV dan nukleoprotein babi, karena perbandingan sekuens menunjukkan bahwa protein-N SARS-CoV memiliki identitas asam amino yang mirip dengan protein-N Infectious Bronchitis Virus dan berbagi tingkat identitas yang lebih tinggi dengan protein-N Bovine Coronavirus (BCoV) dalam bagian reaktif silang. Protein TGEV dan SARS-CoV N adalah pendamping RNA dengan bagian yang panjang yang tidak teratur. Kami berspekulasi bahwa selama infeksi alami, antibodi menargetkan situs antigenik pendek yang serupa dalam protein-N dari SARS-CoV dan kelompok babi 1 CoV yang terkena respons imun. Identifikasi daerah protein-N cross-reaktive dan non-cross-reaktive memungkinkan pengembangan tes antibodi spesifik SARS-CoV untuk skrening serum hewan dan manusia.

PENGANTAR

Coronavirus terkait severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV), yang menyebabkan epidemi global pada 2002-2003 diidentifikasi sebagai anggota kelompok 2b baru dari genus Coronavirus ( 6 , 21 , 34 ), yang paling dekat kaitannya dengan CoV hewan baru dari kucing, luwak ( 11 , 50 , 54 ) dan kelelawar ( 23 , 26 ). Karakterisasi yang luas dari SARS-CoV menunjukkan bahwa virus tersebut berbagi fitur umum struktur virion dan susunan genom dengan anggota lain dari genus CoV tetapi juga bahwa ia memiliki beberapa sifat unik dan berbeda dari CoV manusia yang dikenal (HCoVs). Isolasi CoV seperti SARS dari musang sawit Himalaya, anjing rakun ( 11 , 50 , 54 ), dan baru-baru ini kelelawar ( 23 , 26 ) mendukung gagasan bahwa SARS-CoV adalah zoonosis yang baru muncul ( 39 , 40 ). Kemajuan dalam memahami mekanisme molekuler replikasi SARS-CoV ( 27 ), transmisi eksperimental yang efisien dari virus ke sejumlah hewan ( 33 , 35 , 37 , 38 , 43 , 53 ), dan kecenderungan CoV yang diakui untuk mutasi / rekombinasi dengan rentang inang yang diperluas telah memberikan dukungan lebih lanjut untuk asal usul hewan yang diusulkan dari SARS-CoV ( 39 ). Analisis filogenetik mengungkapkan bahwa SARS-CoV tidak termasuk salah satu dari tiga kelompok filogenetik CoV yang sebelumnya dikenal dan membentuk kelompok baru (2b) dalam genus Coronavirus ( 20 ). Berdasarkan karakteristik antigeniknya yang berbeda, SARS-CoV juga tidak dapat diklasifikasikan dalam kelompok antigenik CoV yang ada. Meskipun banyak penelitian tentang karakterisasi genetik SARS-CoV mengungkapkan bahwa SARS-CoV paling erat kaitannya dengan kelompok 2 CoV ( 9 , 20 , 41 , 59 ), yang lain melaporkan bahwa SARS-CoV lebih dekat terkait dengan kelompok 1 atau 3 CoVs. ( 32 , 55 ) atau mewakili struktur genom mosaik ( 36 , 42 ). Selain itu, para peneliti menunjukkan reaktivitas silang antigenik antara SARS-CoV dan kelompok hewan 1 tetapi tidak pada kelompok 2a CoV ( 21 , 44 ). Namun, dasar untuk reaktivitas silang ini pada tingkat protein-N tidak diperiksa. Selain itu, beberapa data yang bertentangan pada SARS-CoV dan HCoV OC43 dan 229E satu arah reaktivitas silang telah dipublikasikan ( 1a , 3 ), tetapi data tersebut tidak konsisten untuk semua pasien, juga tidak jelas protein dan penentu antigenik apa yang terlibat, meskipun disarankan bahwa reaktivitas silang ini bukan karena protein nukleokapsid tetapi komponen virus lainnya ( 3 ). Berdasarkan perbedaan ini, asal yang tidak pasti dan posisi terpisah dari SARS-CoV di antara CoV lain, informasi tambahan diperlukan untuk menilai secara komprehensif baik hubungan antigenik dan genetik antara SARS-CoV dan CoV lain dan dengan demikian untuk memahami asal-usul dan evolusi SARS-CoV .

Dalam penelitian ini, kami melakukan analisis komprehensif reaktivitas silang antigenik antara SARS-CoV dan CoV hewan lainnya (kelompok 1, 2, dan 3) dan kelompok 1 HCoV (NL63). Karena reaktivitas silang antara SARS-CoV dan antisera poliklonal ke antigenik kelompok 1 CoV hewan sebelumnya telah dikaitkan dengan protein nukleokapsid (protein N) oleh orang lain ( 44 ) dan dalam studi pendahuluan kami (HS Nagesha, MG Han, LJ Saif, TG Ksiazek, LJ Anderson, dan L. Haynes, dipresentasikan pada pertemuan tahunan ke-23 American Society for Virology, Universitas McGill, Montreal, Quebec, Kanada, 2004), fokus kami adalah untuk menggambarkan sifat reaktivitas silang ini, untuk menentukan bagian protein-N yang terlibat, dan untuk memetakan batas situs antigenik reaktif. Kami selanjutnya menunjukkan bahwa reaktivitas silang antigenik dua arah yang diamati dimediasi hanya oleh protein-N dan bukan protein lonjakan (S), dan kami melokalisasi potensi situs antigenik reaktif silang dalam protein-N. Analisis yang dilakukan memungkinkan kami untuk memastikan kisaran reaktif silang kelompok 1 (hewan dan manusia) dengan SARS-CoV dan untuk menunjukkan bahwa reaktivitas silang yang diamati tidak universal di antara CoV kelompok 1, karena HCoV-NL63 tidak lintas silang. bereaksi dengan SARS-CoV dalam penelitian kami. Tes serologi berbasis protein SARS-CoV N-protein lengkap dilaporkan menghasilkan hasil positif palsu dengan serum dari manusia sehat ( 29 , 30 , 51 ). Oleh karena itu, identifikasi dan karakterisasi fragmen non-reaktif silang dari protein-N SARS-CoV akan memungkinkan pengembangan tes serologis untuk skrining antibodi spesifik SARS-CoV pada pasien manusia dan di reservoir hewan untuk mengecualikan positif palsu karena reaktivitas silang dengan CoV manusia atau hewan kelompok 1.

MATERIAL DAN METODE

Virus referensi, antera, dan serum manusia digunakan dalam percobaan.Panel berikut dari CoV hewan, dipelihara di laboratorium LJ Saif, digunakan dalam penelitian ini: virus gastroenteritis yang dapat ditularkan (TGEVs; virulen Miller-M6 dan strain Purdue-P115 yang dilemahkan), CoV pernapasan pernafasan babi (PRCV; strain ISU1) yang mewakili mutan penghapusan S-gen dari TGEV, canine CoV (CCoV; strain UCD1), virus peritonitis infeksi feline (FIPV; tipe 2, strain 79-1146), CoV enterik sapi (BCoVs, strain Mebus dan DB2), dan CoV pernapasan pernapasan sapi) (saring 440). Virus bronkitis infeksi (IBV; strain Massachusetts) dan turkey CoV (TCoV; strain IN) disediakan oleh YM Saif. Strain HCoV-NL63 grup 1 dengan baik hati disediakan oleh Lia van der Hoek dan Ben Berkhout dari Academic Medical Center, Universitas Amsterdam, Amsterdam, Belanda ( 48 ). Strain SARS-CoV-Urbani (SPR786) yang diekstraksi deterjen, tidak aktif dan antigen Vero E6 yang tidak terinfeksi (SPR527) disediakan oleh Thomas Ksiazek (Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit [CDC], Atlanta, GA). Garis sel berikut yang digunakan untuk menumbuhkan virus ini adalah tiruan yang terinfeksi dan digunakan sebagai kontrol negatif: ST, CrFK, A72, LLCK12, dan HRT-18. Cairan alantoik dari embrio ayam tidak terinfeksi, spesifik-patogen bebas atau suspensi kalkun tidak terinfeksi digunakan sebagai kontrol negatif untuk kelompok 3 CoVs.

Antisera hiperimun terhadap CoV hewan dan unggas diproduksi pada babi gnotobiotik dan guinea dan digunakan dalam penelitian ini. Serum anti-TGEV-Miller (galur M6) (M2), anti-TGEV-Purdue (galur P115) (MM973), dan serum anti-PRCV (galur ISU1) (PP12) diproduksi pada babi gnotobiotik sebagai kombinasi pasca infeksi ( paparan oral / intranasal terhadap CoV hidup) dan hiperimun (empat injeksi parenteral dari CoV yang tidak aktif). Anti-CCoV (strain UCD1), anti-FIPV (strain 79-1146), anti-BCoV (strain enteric Mebus), anti-HCoV-NL63, dan serum anti-IBV (strain Massachusetts) diproduksi dengan hiperimunisasi parenteral dari marmot dengan CoV yang tidak aktif. Antiserum terakhir diberikan oleh YM Saif. Antiserum IBV-Massachusetts juga diproduksi pada ayam (dengan inokulasi intratrakeal dengan 10 pangkat 5 EID50 dari IBV-Mssachusetts, diikuti dengan inokulasi intravena dengan setidaknya 10 pangkat 5 dosis EID50  dari IBV-Massachusetts) dan disediakan oleh M. Jackwood (Universitas Georgia). Juga termasuk adalah antiserum untuk enterik BCoV (BO12722), yang diproduksi pada sapi gnotobiotik secara oral / terpapar galur BCoV-DB2 hidup, diikuti oleh empat suntikan intraperitoneal berikutnya dengan BCoV-Mebus yang diadaptasi dengan kultur sel yang tidak aktif. Sera dari babi gnotobiotik yang diinokulasi mock, sapi gnotobiotik, ayam, dan marmut digunakan sebagai kontrol negatif di semua uji. Mouse antiserum poliklonal SARS-CoV-Urbani diproduksi pada BALB / c mencit yang diimunisasi dengan lisat SARS-CoV yang inaktif (strain Urbani) dalam adjuvan Titermax, diikuti dengan penguat dengan 18 μg protein rekombinan SARS-CoV nukleokapsid protein dalam saline yang disangga dengan fosfat. PBS), dan disediakan oleh Lia M. Haynes (CDC, Atlanta, GA). Serum tikus normal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) digunakan sebagai serum kontrol negatif. Antiserum kelinci hiperimun untuk protein SARS-CoV S (dihasilkan oleh empat imunisasi DNA oleh senjata gen dengan vaksin DNA yang dioptimalkan dengan kodon yang mengekspresikan protein S penuh dari galur SARS-CoV-Urbani) dan serum kelinci negatif disediakan oleh Shan Lu (Medical School, University of Massachusetts, Worcester, MA).

Panel serum manusia digunakan untuk penilaian reaktivitas silang antigenik dengan analisis Western blot dan uji imunosorben terkait-enzim (ELISA). Panel tersebut menyertakan enam sampel serum fase-penyembuhan (sampel CoV 3 hingga 8) dari pasien SARS yang dikonfirmasi WHO (dikumpulkan 18 [sampel CoV 3 dan 4] dan 50 [sampel CoV 5 hingga 8] hari setelah onset penyakit) yang disediakan oleh Thomas Ksiazek (CDC, Atlanta, GA) dan 15 sampel serum (sampel CoV 10 hingga 24) diperoleh dari donor sehat dan disediakan oleh Matthias Niedrig (Robert Koch Institute, Berlin, Jerman), yang memenuhi syarat sebagai SARS negatif pada PCR pertama di uji jaminan kualitas eksternal. Sampel CoV 9 adalah sampel serum manusia yang diperoleh dari orang dewasa di Amerika Serikat yang kami tunjukkan negatif untuk Abs terhadap SARS-CoV yang teriradiasi dalam ELISA dan protein SARS-CoV N dan S dalam ELISA dan analisis Western blot. Semua sampel serum disimpan pada suhu -70 ° C sampai digunakan.

MABS.Dua set Abs monoklonal (MAb) digunakan untuk menganalisis reaktivitas silang antara SARS-CoV dan CoVs grup 1: anti-TGEV-M6 N-protein MAbs (25H7, 14E3, 14G9) yang sebelumnya diproduksi dan dikarakterisasi di laboratorium LJ Saif ( 52) ) dan MA-protein N-protein anti-SARS-CoV-Urbani (SA 46-4 dan SA 87-A1) disediakan oleh Ying Fang (Universitas Negeri Dakota Selatan, Brookings, SD) ( 7 ). TGEV-M6 N MAb mengenali tiga situs antigenik berbeda pada protein TGEV N: N1 (25H7), diapit oleh asam amino (aa) 1 hingga 120; N2 (14E3), tertanam di antara aa 255 dan 383; dan N3 (14G9), mulai dari aa 1 hingga aa 205 ( 52 ). MAb untuk lonjakan SARS-CoV-Urbani, 341C ( 46 ), disediakan oleh Lia M. Haynes (CDC, Atlanta, GA). Asites mouse negatif SP2 / 0 digunakan sebagai kontrol negatif dalam pengujian dengan MAb yang berbeda.

Ekstraksi RNA.RNA diekstraksi dari supernatan kultur sel CoVs, termasuk TGEV-M6, TGEV-P115, PRCV-ISU1, HCoV-NL63, dan irradiasi yang tidak diaktifkan, strain SARS-CoV-Urbani yang dikultur-sel yang dibiakkan, menggunakan gim mini SARS-CoV-Urbani yang dikulturkan dengan sel, menggunakan mini kit RNeasy sesuai dengan instruksi pabrik (Qiagen Inc., Valencia, CA).

Kloning gen N-protein (full-length dan fragmen).Dua belas situs enzim restriksi yang mengandung oligonukleotida, direkayasa (EcoRI dan SalI) untuk amplifikasi dan kloning dari delapan terpotong dan satu varian panjang penuh dari protein N SARS-CoV dirancang untuk memfasilitasi kloning dalam prokariotik (vektor-pET23b) (Novagen, EMD Biosciences, San Diego, CA) sistem ekspresi (Tabel 1 ). Dengan menggunakan primer ini, sembilan fragmen (termasuk fragmen full-length) diamplifikasi, dicerna dengan enzim restriksi EcoRI dan SalI, gel diekstraksi, dan di insert ke dalam vektor plasmid pET23b. Dua pasangan oligonukleotida lainnya dirancang untuk kloning penuh protein N dari grup 1 CoVs, termasuk dua strain TGEV (Miller-M6 dan Purdue-P115), strain PRCV ISU1, dan strain HCoV-NL63 (HCoV-NL63) ; tiga oligonukleotida tambahan dirancang untuk kloning fragmen protein-HCoV-NL63 (Tabel 1 ). Setelah transkripsi-PCR terbalik, fragmen yang diamplifikasi dengan primer ini dicerna dengan enzim restriksi EcoRI dan NotI, dimurnikan, dan diikat ke dalam plasmid pET23b. Setelah transformasi konstruksi menjadi strain Escherichia coli, Top Ten (Invitrogen, Carlsbad, CA), koloni terpilih ditanam dan kemudian diuji dengan PCR dan analisis restriksi. Klon positif membawa insersi yang benar dalam vektor plasmid pET23b diurutkan dan digunakan untuk ekspresi protein rekombinan dalam strain host E. coli untuk ekspresi, BL-21 (DE3) (Novagen, EMD Biosciences).

Tabel 1.

Oligonukleotida digunakan untuk ekspresi protein rekombinan, panjang urutan pengkodean, dan prediksi ukuran protein rekombinan

Ekspresi protein TGEV rekombinan, PRCV, HCoV-NL63, dan SARS-CoV N dalam sistem PET prokariotik (Novagen, EMD Biosciences).Plasmid pET23b rekombinan secara terpisah diubah menjadi E. coli strain BL-21 (DE3) (Novagen, EMD Biosciences) untuk ekspresi protein diinduksi. Kultur semalam dari E. coli BL-21 (DE3) yang baru ditransformasi diencerkan 1:25 (volume akhir untuk masing-masing adalah 50 ml) dan diinkubasi dengan agitasi pada 37 ° C sampai kepadatan optik pada 600 nm mencapai 0,6 hingga 0,8 (∼ 3 h). Sel-sel BL-21 (DE3) menghasilkan T7 polimerase, dan ekspresi protein target dipacu dengan promotor TNA RNA polimerase setelah penambahan 1 mM IPTG (isopropyl-β- d- thiogalactopyranoside) sesuai dengan protokol pabrikan (Novagen, Biosains EMD). Setelah induksi, sel diinkubasi selama 3 jam lagi, dan kemudian suspensi sel disentrifugasi pada 2.500 × g ke sel pelet, dicuci sekali dengan 1 × PBS dingin, dan disentrifugasi lagi (2.500 × g ) lagi. Pelet kemudian dibekukan pada suhu -20 ° C.

Pemurnian protein rekombinan.kloning dalam vektor pilihan (pET23b) memungkinkan ekspresi protein rekombinan menyatu dengan tag enam-Nya di ujung terminal-C. Gel afinitas nikel-HIS-Pilih (Sigma-Aldrich) digunakan untuk ekstraksi protein rekombinan, mengikuti dua protokol: satu untuk asli dan satu untuk kondisi denaturasi. Semua protein N rekombinan (rNs) yang diekspresikan dalam E. coli BL21 (DE3) terutama membentuk badan inklusi dan dapat dimurnikan dari fraksi yang larut dalam jumlah terbatas saja. Tidak ada perbedaan antigenik dari produk-produk rekombinan yang dimurnikan oleh salah satu kondisi yang dicatat; dengan demikian, untuk semua pemurnian setelah perbandingan awal, kami hanya menggunakan kondisi denaturasi karena mereka meningkatkan hasil protein yang lebih tinggi.

Kondisi denaturasi (metode pemurnian batch).Pelet sel E. coli BL-21 (DE3) ditangguhkan dalam 5 ml 6 M guanidine hidroklorida (Gu-HCl) buffer yang mengandung 5 mM dithiothreitol (DTT) dan dilisiskan dengan sonication dengan prosesor ultrasonik (sel Vibra; Sonics & Material , Inc., Newtown, CT). Lisat yang dihasilkan disentrifugasi pada 2.500 × g selama 10 menit pada suhu 4 ° C menggunakan centrifuge benchtop Allegra X-15R (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Setelah sentrifugasi, supernatan yang diklarifikasi diaplikasikan pada 1 ml (masing-masing) gel afinitas nikel-HIS-Select yang disetimbangkan dengan 5 volume (5 ml / ml) buffer kesetimbangan (0,1 M buffer natrium fosfat [Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 ], 6 M Gu-HCl, 5 mM DTT) (pH 8,0). Setelah pencampuran yang lembut selama 3 menit pada suhu kamar, suspensi disentrifugasi pada 250 × g selama 5 menit pada suhu 4 ° C. Supernatan dibuang, dan gel dengan protein terikat dicuci dua kali dengan 5 ml buffer cuci (0,1 M Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 , 6 M Gu-HCl, 5 mM DTT) (pH 6,3). Kemudian, protein enam-tag-nya dielusi dengan 2 ml buffer elusi (0,1 M Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4 , 6 M Gu-HCl, 5 mM DTT) (pH 4,5).

Kemurnian protein yang dimurnikan dianalisis dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) dan dikonfirmasi oleh analisis Western blot. Konsentrasi protein rekombinan murni dinilai menggunakan kit uji protein Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) berdasarkan metode Bradford ( 1 ).

Ekspresi protein S dari SARS-CoV.Vektor ekspresi gen S-gen VRS 8304 manusia yang dioptimalkan dengan kodon disediakan oleh Gary Nabel (NIH / NIAID / VRC, Bethesda, MD) ( 17 ). Sel 293T limfosit manusia dipertahankan dalam medium Dulbecco yang dimodifikasi milik Eagle (DMEM; Gibco BRL) yang ditambah dengan 10% serum janin sapi. Untuk transfeksi sementara, sekitar 10 6 293 sel T diunggulkan ke dalam masing-masing sumur dari enam lubang sumur dan diinkubasi selama 24 hingga 48 jam pada suhu 37 ° C. Lima hingga sepuluh mikrogram (per sumur) dari VRC 8304 rekombinan murni ditransfeksi menggunakan pereaksi Cellfectin (Invitrogen). Secara singkat, 5 sampai 10 μg DNA dan 10 μl Cellfectin secara terpisah dicampur dengan 100 μl masing-masing DMEM yang tidak didukung. Kemudian, solusi yang mengandung DNA dan yang mengandung Cellfectin digabungkan dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Setelah itu, volume akhir campuran disesuaikan menjadi 2 ml dengan DMEM. Sel-sel 293T dicuci sebelum transfeksi dengan DMEM yang tidak didukung, dan kemudian campuran DNA-Cellfectin disalut ke dalam sel. Pada 48 jam setelah transfeksi, sel difiksasi menggunakan aseton 80% dan digunakan untuk uji kultur imunofluoresensi (CCIF) seperti dijelaskan sebelumnya ( 12 ). Untuk mendapatkan jumlah protein SARS-CoV S yang lebih besar, sel 293T ditanam dalam labu berukuran 175 cm 2 dan ditransfeksi dengan 50 μg VRC 8304. Pada 48 jam pasca infeksi, sel dipanen dan digunakan untuk analisis Western blot dan ELISA.

Analisis western blot.Analisis Western blot dilakukan untuk memverifikasi tingkat ekspresi protein rekombinan dan antigenisitas atau untuk menilai reaktivitas silang dengan menggunakan CoV yang tidak dimurnikan sebagai lisat sel yang terinfeksi. Protein rekombinan dan supernatan sel yang terinfeksi virus atau tiruan di-lysed dengan merebusnya selama 5 menit dalam 1 × buffer loading (Fermentas, Hanover, MD) di hadapan 200 mM DTT. Protein rekombinan yang dimurnikan atau tidak dimurnikan (20 atau 50 μg / jalur, masing-masing) dipisahkan oleh 12 hingga 15% SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (media transfer trans-blot; Bio-Rad, Hercules, CA). Membran kemudian diblokir (semalam pada suhu 4 ° C) dalam blocking buffer (PBS, pH 7,4, dan 10% susu kering tanpa lemak [NFDM]) dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dengan anti-SARS-CoV polyclonal Ab manusia, anti -six-His tag mouse MAb (Invitrogen), atau antisera CoV hewan yang dijelaskan di atas. Setelah inkubasi, selaput dibilas selama 20 menit di PBS-0,05% Tween 20, dan kemudian Abs yang terikat dideteksi dengan anti-babi, anti-ayam, anti-guinea pig, anti-tikus, anti-sapi, atau anti-manusia immunoglobulin G (IgG) terkonjugasi dengan peroksidase lobak pada pengenceran 1: 1.000, 1: 1.000, 1: 5.000, 1: 1.000, 1: 1.000, atau 1: 1.000, masing-masing. Pita immunoprecipitated, setelah dibilas selama 20 menit dalam PBS-0,05% Tween 20, dikembangkan menggunakan sistem substrat membran peroksidase TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Membran yang dikembangkan dicuci dengan air suling dan dikeringkan dengan udara.

ELISA menggunakan lisat sel kasar dan protein rekombinan murni.Piring ELISA 96-well (pelat ELISA berkekuatan protein tinggi Nunc MaxiSorp; Nunc, San Diego, CA) dilapisi (buffer lapisan [20 mM Na 2 CO 3 , 20 mM NaHCO 3 , pH 9.6]) semalam pada suhu 4 ° C dengan protein rekombinan (50 hingga 100 ng / well) atau lisat sel yang terinfeksi NL-63 pada hewan dan manusia dilarutkan 1:50 (diperoleh dengan dua siklus pembekuan-pencairan dan kemudian diklarifikasi dengan sentrifugasi) dan dimurnikan dengan SARS-CoV yang diencerkan 1: 2.000. Sumur dicuci dengan PBS-0,05% Tween 20 dan kemudian diblokir dengan 5% NFDM di PBS. Sera encer yang telah ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ° C. Pelat dicuci dengan PBS-0,05% Tween 20 dan diinkubasi selama 1 jam dengan anti-babi, anti-ayam, anti-guinea pig, anti-tikus, anti-sapi, atau anti-manusia lobak terkonjugasi peroxidase lobak anti-manusia pada pengenceran 1: 750, 1: 1.000, 1: 5.000, 1: 500, 1: 500, atau 1: 500, masing-masing. Pelat dicuci dan dikembangkan menggunakan sistem substrat peroksidase TMB Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Kemudian, reaksi dihentikan dengan 0,1 M HCl, dan hasilnya dibaca pada absorbansi 450 nm dengan menggunakan pembaca SpectraMax 340PC384 ELISA (perangkat Molekul, Union City, CA).

Semua ELISA yang dijelaskan dalam penelitian ini dilakukan di bawah kondisi yang ketat untuk menghindari reaksi spesifik: semua Abs diencerkan menggunakan 5% NFDM dan 1% Tween 20 di PBS; piring dicuci lima kali di setiap langkah. Kontrol negatif yang sesuai dimasukkan dalam semua percobaan: garis sel inang yang terinfeksi mock HRT-18, ST, Vero E6, CrFK, A72, LLCK12; sel 293T yang ditransfock mock; vektor pET23b E. coli BL-21 yang ditransformasi menjadi backbone (DE3); cairan allantoic dari embrio ayam bebas patogen spesifik yang tidak terinfeksi atau usus kalkun yang dihomogenisasi sebagai kontrol negatif untuk kelompok tiga CoV; dan babi gnotobiotik CoV-negatif, kelinci percobaan, kelinci, dan tikus dan serum manusia SARS-CoV-negatif.

HASIL-HASIL

Penilaian reaktivitas silang antara SARS-CoV dan kelompok CoV lainnya (menggunakan kelompok 1, 2, dan 3 CoV yang tidak dimurnikan) oleh ELISA.Untuk menilai reaktivitas silang antigenik dua arah antara SARS-CoV dan hewan atau HCoV, 12 CoV dari tiga kelompok digunakan dalam ELISA dengan antisera hiperimun yang sangat spesifik. Karena reaktivitas silang sebelumnya terbukti ada antara SARS-CoV dan kelompok 1 CoV, kami termasuk dalam penelitian ini dua strain CoV TGEV babi (Purdue-P115 dan Miller-M6) dan PRCV-ISU1, CCoV-UCD1, FIPV-79- 1146, dan HCoV-NL63. BCoV-Mebus, BCoV-DB2, dan BRCoV-440 digunakan sebagai grup 2a dan IBV-Massachusetts dan TCoV-IN sebagai strain referensi grup 3. Pertama, kami menilai SARS-CoV dan reaktivitas CoV lainnya dengan antiserum hiperimun CoV, termasuk antiserum hiperimun SARS-CoV yang diproduksi pada tikus (Tabel 2 ), dan kemudian kami menilai reaktivitas CoV grup 1 hingga 3 dengan manusia fase konvalensi SARS-CoV. sera (data tidak ditampilkan). Reaktivitas silang terbukti dalam ELISA antara antigen SARS-CoV dan antisera grup 1, termasuk TGEV-P115, TGEV-M6, PRCV-ISU1, CCoV-UCD1, dan FIPV-79-1146 antisera (Tabel 2 ). Yang menarik, tingkat reaktivitas silang antara antigen SARS-CoV dan antisera babi Porvine bervariasi: antisera TGEV-P115 dan TGEV-M6 menunjukkan tingkat reaktivitas yang lebih tinggi dengan SARS-CoV, sedangkan tingkat reaktivitas yang lebih rendah diamati antara SARS-CoV dan PRCV -ISU1, FIPV-79-1146, dan CCoV-UCD1 antisera.

Tabel 2.

Hasil ELISA untuk menguji reaktivitas silang antar kelompok CoV dengan menggunakan kelompok 1 sampai 3 CoV yang tidak dimurnikan (sebagai lisat sel kasar yang terinfeksi CoV) dan antisera hiperimun spesifik

Selanjutnya, CoV dari ketiga kelompok dinilai dengan ELISA dengan sera fase-fase pemulihan SARS (sampel CoV 3 hingga 8) dan serum manusia negatif (sampel CoV 9 hingga 24). SARS-CoV bereaksi dengan sera fase fase pemulihan SARS, dengan titer mulai dari 3.200 hingga 25.600, tetapi tidak bereaksi dengan serum manusia negatif (data tidak ditampilkan). Semua serum manusia negatif menunjukkan reaktivitas yang lemah (titer 100 hingga 800) dengan kelompok 1 dan 2a CoV hewan yang digunakan dalam percobaan, menunjukkan adanya Abs terhadap kelompok 1 dan 2a HCoV dalam serum ini, sedangkan reaktivitas dari CoV ini dengan serum fase pulih SARS sedikit (1,4- 2,5 kali lipat) tetapi tidak lebih tinggi secara signifikan, dengan titer mulai dari 200 hingga 1.600 (data tidak ditampilkan). Semua serum manusia (fase pemulihan SARS dan negatif) bereaksi kuat dengan HCoV-NL63 tanpa perbedaan titer yang signifikan, kemungkinan karena kehadiran dalam semua serum HCoV-NL63 khusus Abs atau kelompok reaktif silang 1 HCoV-229E Abs. Tidak ada reaktivitas yang diamati antara kelompok 3 CoV, IBV-Massachusetts dan TCoV-IN, dan serum manusia (data tidak ditampilkan).

Kami tidak dapat mengonfirmasi reaktivitas silang dengan hanya menggunakan sera manusia fase konvalensien SARS, karena hasilnya akan dikompromikan oleh kehadiran Abs terhadap HCoV lain. Oleh karena itu, SARS-CoV mouse hyperimmune antiserum digunakan untuk mengkonfirmasi keberadaan reaktivitas silang dua arah antara SARS-CoV dan grup 1 CoVs. Hasilnya jelas menunjukkan adanya situs antigenik reaktif silang untuk TGEV-P115 dan TGEV-M6, sedangkan PRCV-ISU1 bereaksi silang lebih lemah, berdasarkan nilai keterkaitan ( R %) seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2 . Meskipun CoV yang tidak dimurnikan digunakan dalam percobaan ini pada titer infeksius yang sama, antigen masih dapat hadir dalam konsentrasi yang berbeda dan bertanggung jawab untuk variasi ini. Namun, tidak ada reaktivitas yang ditunjukkan untuk FIPV, CCoV, HCoV-NL63, dan kelompok 2a atau 3 CoV dengan menggunakan antiserum hyperimmune mouse SARS-CoV.

Untuk menunjukkan protein struktural utama SARS-CoV mana yang bertanggung jawab atas reaktivitas silang yang diamati, protein SARS-CoV S dan N dan TGEV (M6 dan P115), protein PRCV-ISU1, dan HCoV-NL63 N diekspresikan dan dinilai oleh ELISA dan Tes Western Blot.

Penilaian reaktivitas silang menggunakan protein SARS-CoV S yang diekspresikan dalam sel 293T.Untuk menguji apakah ada reaktivitas silang yang dimediasi melalui protein SARS-CoV S, vektor ekspresi gen SARS-CoV S dioptimalkan kodon manusia VRC 8304 digunakan untuk ekspresi transien protein-S SARS-CoV dalam sel 293T. Ekspresi yang sukses dari protein S dikonfirmasi oleh analisis Western blot, CCIF, dan ELISA dengan MAbs atau Abs poliklonal untuk protein SARS-CoV S. Sel 293T yang ditransfeksi dan diperbaiki dinilai oleh CCIF. Lisat yang mengandung protein kasar sel S digunakan dalam analisis ELISA dan Western blot dengan panel fase konvalesen SARS (sampel CoV 3 hingga 8) dan serum manusia negatif (sampel CoV 9 hingga 24). Protein S rekombinan menunjukkan imunoreaktivitas yang kuat dengan semua serum fase konvalesen SARS tetapi tidak bereaksi dengan serum negatif SARS mana pun (Tabel 3 ). Hyperimmune tikus, antiserum SARS-CoV juga bereaksi dengan protein S pada titer tinggi (1: 3.200). Selain itu, protein S rekombinan bereaksi hanya dengan antisera SARS-CoV homolog dan tidak ada CoV lain atau protein CoV rekombinan yang diuji bereaksi dengan SARS-CoV monoklonal atau poliklonal Abs untuk protein S (Tabel 3 ). Dengan demikian, tidak ada reaktivitas silang antara SARS-CoV dan CoV lain yang dimediasi oleh protein S ditunjukkan dalam setiap tes.

Tabel 3

Penilaian oleh ELISA reaktivitas homolog dan reaktivitas silang dari protein N rekombinan murni yang diproduksi dalam E. coli (fragmen protein SARS-CoV N, protein HCoV-NL63 N, dan protein TGEV-M6, TGEV-P115, dan PRCV N) dan protein SARS-CoV S yang tidak dihasilkan yang diproduksi dalam sel 293T manusia

Penilaian reaktivitas silang dengan menggunakan protein CoV N rekombinan full-length yang dinyatakan dalam E. coli BL-21 (DE3).Untuk mengkonfirmasi keterlibatan N-protein dalam reaktivitas silang, tiga pasang oligonukleotida yang mengandung situs enzim restriksi dirancang (Tabel 1 ) dan digunakan untuk kloning penuh protein N dari SARS-CoV-Urbani, dua strain TGEV (Miller-M6 dan Purdue-P115), strain PRCV-ISU1, dan HCoV-NL63. Setelah transkripsi-PCR terbalik, gen N selanjutnya dikloning dalam plasmid pET23b dan ekspresi diinduksi dilakukan.

ANALISIS WEATERN

Penilaian oleh ELISA reaktivitas homolog dan reaktivitas silang dari protein N rekombinan murni yang diproduksi dalam E. coli (fragmen protein SARS-CoV N, protein HCoV-NL63 N, dan protein TGEV-M6, TGEV-P115, dan PRCV N) dan protein SARS-CoV S yang tidak dihasilkan yang diproduksi dalam sel 293T manusia

Penilaian reaktivitas silang dengan menggunakan protein CoV N rekombinan full-length yang dinyatakan dalam E. coli BL-21 (DE3).Untuk mengkonfirmasi keterlibatan N-protein dalam reaktivitas silang, tiga pasang oligonukleotida yang mengandung situs enzim restriksi dirancang (Tabel 1 ) dan digunakan untuk kloning penuh protein N dari SARS-CoV-Urbani, dua strain TGEV (Miller-M6 dan Purdue-P115), strain PRCV-ISU1, dan HCoV-NL63. Setelah transkripsi-PCR terbalik, gen N selanjutnya dikloning dalam plasmid pET23b dan ekspresi diinduksi dilakukan. Analisis Western blot menggunakan antisera spesifik (untuk SARS-CoV, HCoV-NL63, TGEV, dan PRCV) atau anti-histidin MAb mengungkapkan tingkat ekspresi yang tinggi dari rN dengan prediksi massa molekul, yang ditentukan sebagai berikut: 49 kDa untuk SARS -CoV dan 43 hingga 44 kDa untuk TGEV, PRCV, dan HCoV-NL63. Untuk digunakan dalam ELISA, protein rekombinan dimurnikan menggunakan gel afinitas nikel HIS-Select (Sigma-Aldrich).

Reaktivitas semua rN dianalisis dengan ELISA dengan panel antisera hewan terhadap CoV (Tabel 3 ). Hasil mengkonfirmasi temuan sebelumnya untuk antisera CoV babi: reaktivitas silang yang terkuat ditunjukkan antara antiserum SARS-CoV dan TGEV-P115 dan TGEV-M6, dengan reaktivitas silang yang lebih lemah dengan antiserum PRCV-ISU1. Sera anti-CCoV dan anti-FIPV bereaksi secara luas dengan semua kelompok 1 rN, termasuk HCoV-NL63 rN, tetapi dengan rN SARS-CoV, tingkat reaktivitas silang berada di bawah ambang batas deteksi di ELISA, meskipun bereaksi dengan sera ini. dalam analisis Western blot (data tidak ditampilkan). Tidak ada reaktivitas silang yang diamati antara kelompok 1 CoV atau SARS-CoV rNs dan kelompok 2a BCoV-Mebus dan antisera grup 3 IBV-Massachusetts. Meskipun semua antisera CoV grup 1 mengenali HCoV-NL63 rN, antiserum HCoV-NL63 tidak bereaksi silang dengan apa pun kecuali rN homolog.

Hasil ELISA yang diperoleh dengan menggunakan CoV rNs dan fase konvalensien SARS dan serum manusia negatif serupa dengan yang diperoleh dengan lisat sel yang terinfeksi CoV (Tabel 3 ), menunjukkan adanya Ab spesifik protein SARS-CoV N serta lintas silang. Abs-reaktif untuk mengelompokkan 1 CoV N protein dalam serum ini. The SARS-CoV rN membedakan serum manusia positif dan negatif. TGEV-M6 dan TGEV-P115 rN bereaksi dengan sebagian besar serum fase pemulihan SARS pada titer rendah, tetapi tidak seperti CoVs yang tidak dimurnikan, mereka tidak bereaksi dengan serum manusia negatif. Tingkat reaktivitas PRCV rN dengan antisera fase pemulihan SARS lebih rendah; PRCV rN bereaksi dengan titer rendah dengan setengah dari serum fase pemulihan SARS yang diuji tetapi juga tidak terdeteksi dengan serum manusia negatif. HCoV-NL63 rN bereaksi pada titer tinggi dengan fase manusia dan fase manusia yang negatif, tetapi dengan beberapa fase fase fase-SAR SAR (sampel CoV 3, 4, dan 6), titer dua kali lebih tinggi daripada negatif (Tabel 3). ). Selain itu, rN dari TGEV dan PRCV bereaksi secara khusus dengan antiserum hiperimun SARS-CoV yang diturunkan dari tikus pada titer rendah (100 hingga 400), sedangkan untuk rN SARS-CoV, titernya adalah 3.200 (Tabel 3 ).

Hasil dari percobaan ini membuktikan bahwa reaktivitas silang antara SARS dan kelompok hewan 1 CoV tampaknya dua arah. Namun, tidak ada reaktivitas silang antara SARS dan CoV babi yang ditunjukkan dalam analisis ELISA atau Western blot menggunakan SARS-CoV atau TGEV-M6 anti-N MAb. SARS-CoV anti-N MAb hanya bereaksi dengan SARS-CoV rN, dan TGEV-M6 anti-N MAbs bereaksi dengan rNs dari grup 1 CoVs, TGEV-M6, TGEV-P115, PRCV-ISU1, dan HCoV-NL63 (data tidak ditampilkan).

Identifikasi daerah reaktif silang dengan menggunakan fragmen rekombinan protein SARS-CoV N yang diekspresikan dalam E. coli BL-21 (DE3).Selain gen full-length, delapan fragmen terpotong dari gen N-protein dari SARS-CoV (Gbr. 1 ) diamplifikasi dengan pasangan primer yang dirancang. Fragmen ini diprediksi (oleh Pepscan) untuk membawa situs antigenik imunodominan dan ditunjukkan untuk membawa situs imunogenik dalam penelitian sebelumnya ( 15 ) atau digunakan dalam sistem deteksi AB SARS-CoV komersial (Genesis Biotech Inc., Taiwan). Salah satu fragmen pendek terminal-N, aa 120 hingga 208, dirancang untuk mengecualikan kemungkinan bahwa reaktivitas silang dimediasi melalui motif FYYLGTGP yang sangat kekal (aa 111 hingga 118), yang terdapat dalam protein N dari semua CoV. Fragmen C-terminal terpendek (360 sampai 412) dimasukkan dalam penelitian ini sebagai wilayah paling spesifik dari protein SARS-CoV N, dengan peregangan asam amino kaya lisin yang unik, KTFPPTEPKKDKKKKTDEAQ (a 362 hingga 381).

Gambar 1

Diagram skematik dari delapan fragmen N-protein SARS-CoV (mencakup seluruh urutan N-protein) dan protein N panjang penuh.

Analisis Western blot dengan MAbs anti-histidin dan lisat sel kasar dari fragmen SARS-CoV rN mengungkapkan adanya delapan produk dari perkiraan berat molekul. Pewarnaan dengan antisera fase pemulihan SARS (sampel CoV 3 hingga 8) dan dua MABS SARS-CoV (SA 46-4 dan SA 87-A1) menunjukkan tingkat antigenisitas yang berbeda untuk semua fragmen. Tingkat aktivitas pengikatan terendah ditunjukkan untuk fragmen aa-1-ke-72 dari protein SARS-CoV N, yang tidak bereaksi silang dengan serum atau MAb apa pun, dan tingkat aktivitas pengikatan tertinggi ditunjukkan untuk aa 1 ke 213 (Gbr. 2 ). Semua serum fase pemulihan SARS menunjukkan pola reaktivitas yang sama dengan fragmen dalam analisis Western blot, tetapi tingkat reaktivitas dengan fragmen dalam pengikatan serum bervariasi sesuai dengan titer Ab yang berbeda. Menariknya, fragmen yang terdiri dari aa 120 hingga 208 tidak bereaksi dalam analisis Western blot dengan serum fase pemulihan SARS (Gbr. 2a ), tetapi bereaksi dengan SARS-CoV N MAb SA87-A1 (Gbr. 2b ) dan kemudian dengan hiperimun antisera babi TGEV / PRCV (Gbr. 2d ). Juga, reaktivitas tingkat rendah diamati dalam analisis Western blot dengan beberapa serum manusia negatif untuk fragmen yang terdiri dari a hingga 213 dan 212 hingga 422 dan protein N panjang penuh (aa 1 hingga 422).

Gambar 2

Reaktifitas silang dari fragmen protein N-SARS-CoV E.-coli yang tidak mengandung serat yang dinilai dengan analisis Western blot dengan serum fase-konvalesen-SARS (a), SARS-CoV N MAb (b, c), atau babi gnotobiotik anti- TGEV serum (d).

Pada langkah berikutnya, fragmen rN yang dimurnikan dari SARS-CoV digunakan dalam ELISA (50 hingga 100 ng per sumur) dengan fase fase pemulihan SARS (sampel CoV 3 hingga 8) dan serum manusia negatif (sampel CoV 9 hingga 24) ( Tabel 3 ). Fragmen rN tidak bereaksi dengan serum manusia negatif. Fragmen yang terdiri dari a hingga 72 tidak bereaksi dengan serum manusia negatif dan bereaksi pada level rendah (titer 100) hanya dengan sampel serum fase-konveksi-fase CoV SARS 5 dan 6. Reaktivitas level rendah hingga sedang dengan SARS-CoV-convalescent- serum fase diperlihatkan untuk fragmen-fragmen yang terdiri dari a 120 sampai 208, 212 sampai 349, 70 hingga 213, 337 hingga 422, 212 hingga 422, dan 1 hingga 422, sedangkan tingkat reaktivitas tertinggi diamati untuk fragmen-fragmen yang terdiri dari a hingga 213. dan 360 hingga 412 (Tabel 3 ). Namun, pola reaktivitas berbeda untuk dua fragmen terakhir (Tabel 3 ). Antiserum hyperimmune tikus untuk SARS-CoV juga digunakan untuk menilai aktivitas imun dari fragmen N-protein. Yang mengejutkan, antiserum ini gagal mengenali fragmen pendek dari bagian terminal-C (a 212 hingga 349, 360 hingga 412, dan 337 hingga 422), bereaksi lemah dengan a 212 hingga 422, dan menunjukkan imunoreaktivitas yang kuat dengan semua fragmen dari N -terminal bagian dari protein N (kecuali untuk a sampai 72) (Tabel 3 ). Dengan demikian, dengan menggunakan panel SARS fase fase pemulihan dan negatif manusia serta dua SARS anti-N MAb, kami menilai antigenik semua fragmen yang diekspresikan dan menunjukkan bahwa a 1 hingga 213 dan 360 hingga 412 adalah fragmen yang paling antigenik; namun, kedua MAb menargetkan situs antigenik di bagian terminal N dari protein N (Gbr. 2b dan c ).

Kami kemudian menilai reaktivitas silang dari semua fragmen N-protein SARS-CoV dalam analisis Western blot dan ELISA menggunakan kelompok 1 hyperimmune anti-TGEV (anti-P115 [MM973] [Gambar. 2d ] dan anti-Miller M6 [M2] ) dan serum anti-PRCV (PP12) diproduksi pada babi gnotobiotik dan antimera hiperimun ke FIPV-79-1146, CCoV-UCD1, HCoV-NL63 (grup 1), BCoV-Mebus (grup 2), dan IBV-Massachusetts (grup 3) ), semua diproduksi di marmut, dan ke IBV-Massachusetts diproduksi di ayam. Reaktivitas yang kuat terdeteksi antara fragmen yang terdiri dari a 120 hingga 208, 70 hingga 213 (keduanya terkuat), dan 1 hingga 213 dan antisera babi CoV dalam analisis Western blot (Gbr. 2d ). Untuk protein N full-length (1 hingga 422), pewarnaan lebih lemah tetapi terdeteksi (Gbr. 2d ) dengan semua antisera babi. Selain itu, reaktivitas tingkat rendah terdeteksi antara fragmen yang terdiri dari a hingga 213 dan antipera FIPV dan CCoV. Hasil ELISA dengan fragmen N-protein SARS-CoV murni dan antera kelompok hewan 1 sebagian besar konsisten dengan analisis Western blot; Namun, fragmen yang terdiri dari a hingga 213 menunjukkan reaktivitas silang yang terkuat dengan semua antisera kelompok hewan 1 CoV dan tidak ada reaktivitas silang yang diamati untuk fragmen dari bagian terminal C dari protein N (Tabel 3 ). Tidak ada reaktivitas yang terbukti untuk setiap fragmen dengan HCoV-NL63, BCoV-Mebus, atau antisera IBV-Massachusetts baik dalam analisis Western blot atau ELISA.

Penilaian antigenisitas bagian reaktif silang putatif dengan menggunakan fragmen rekombinan dari protein HCoV-NL63 N yang diekspresikan dalam E. coli BL-21 (DE3).Untuk menentukan daerah N-protein HCoV-NL63 yang berkontribusi terhadap reaktivitas silang dengan CoV kelompok 1 lainnya dan untuk menguji apakah bagian protein NL63 N yang terdiri dari 39 hingga 183, sesuai dengan bagian reaktif silang SARS-CoV N-protein (berdasarkan keselarasan asam amino), memiliki antigenisitas tinggi, tiga fragmen protein HCoV-NL63 diekspresikan dalam E. coli : setengah terminal N (aa 1 hingga 183), setengah terminal C (aa 182 hingga 378), dan wilayah yang terdiri dari aa 39 hingga 183, yang sesuai dengan fragmen N-protein reaktif silang SARS-CoV yang lebih panjang (aa 70 hingga 213). Setelah ekspresi berhasil dikonfirmasi, antigenicities dari protein rekombinan dinilai dengan seperangkat fase fase konvalesen hiperimun dan SARS dalam analisis Western blot dan ELISA. Analisis Western blot dengan antiserum hiperimun marmut untuk HCoV-NL63 menunjukkan keberadaan situs antigenik yang kuat di bagian terminal C dari protein N (aa 182 hingga 378), sedangkan untuk bagian terminal N (a 1 hingga 183), antigenisitas yang jauh lebih rendah ditunjukkan dan tidak ada reaktivitas yang diamati untuk fragmen aa-39-ke-183 (Gambar 3). Antisera hiperimun terhadap TGEV-P115 dan -M6 dan TGEV-M6 anti-N MAbs 14G9 dan 25H7 bereaksi dengan setengah terminal N dari protein HCoV-NL63 N tetapi tidak dengan aa-39-ke-183 atau fragmen aa-182- ke-378, sedangkan TGEV-M6 anti-N MAb 14E3 dan antiserum hiperimun PRCV-ISU1 bereaksi dengan fragmen aa-182-ke-378 (Gambar 3 ). Menariknya, MAbs 25H7 dan 14E3 mengenali situs antigenik berbeda pada protein TGEV N,  masing-masing terhadap N1 (aa 1 hingga 120), dan N2 (aa 255 hingga 383), sedangkan MAb 14G9 mengenali situs antigenik ketiga yang berbeda, N3 (a 1 hingga 205) ) ( 52 ). Sera fase-konvalesen SARS manusia bereaksi kuat dengan setengah terminal-N; reaktivitas yang lebih lemah diamati untuk setengah terminal-C, dan tidak ada reaktivitas yang ditunjukkan untuk fragmen aa-39-ke-183 (data tidak ditampilkan). Hasil ELISA untuk fragmen protein HCoV-NL63 N murni (50 hingga 100 ng / well) (Tabel 4 ) mengkonfirmasikan analisis Western blot dengan menunjukkan keberadaan situs antigenik yang kuat di terminal C bagian terminal dari protein N ketika diuji dengan antiserum NL63 homolog dan tidak ada reaktivitas untuk bagian reaktif silang putatif (aa 39 hingga 183) dengan Abs heterolog. Namun, berbeda dengan hasil analisis Western blot, antiserum terhadap HCoV-NL63 bereaksi dengan fragmen aa-39-ke-183 pada ELISA pada titer rendah (Tabel 4). Meskipun reaktivitas silang yang serupa dengan bagian terminal N diamati untuk ketiga antiserum terhadap CoV babi, reaktivitas dengan separuh terminal C dari protein N berbeda secara signifikan antara ketiga antera, dengan level tertinggi yang terdeteksi untuk antiserum PRCV-ISU1 (Tabel 4 ). Selain itu, tidak ada reaktivitas yang diamati antara antiserum hiperimun tikus terhadap SARS-CoV dan salah satu dari tiga fragmen yang diuji dalam ELISA atau analisis Western blot.

Gambar 3

Reaktivitas silang dari fragmen protein-N HCoV-NL63 yang dimurnikan dari E coli yang dinilai dengan analisis Western blot dengan HCoV-NL63 hyperimmune antiserum marmot (a), babi gnotobiotik PRCV-ISU1 antiserum (b), atau babi gnotobiotik TGEV-P115 antiserum (c).

Tabel 4

Penilaian dengan ELISA reaktivitas homolog dan reaktivitas silang dari fragmen protein-N HC-VL-NL63 rekombinan

Analisis asam amino polimorfik dan tingkat identitas protein-N SARS-CoV dengan protein-N CoVs lainnya. Untuk memperkuat perbedaan tingkat reaktivitas silang yang diamati antara SARS-CoV dan CoV babi, TGEV (P115 dan M6) dan PRCV-ISU1, analisis rinci dari empat sekuens protein-N dilakukan. Dua belas posisi polimorfik terdeteksi antara tiga protein babi CoV N ( 58 ), dan hanya satu dari mereka, alanin (A) pada posisi 120, yang umum antara SARS-CoV dan TGEV (P115 dan M6), sedangkan valin (V) adalah terdeteksi pada posisi ini untuk PRCV-ISU1, yang mungkin berkontribusi terhadap penurunan reaktivitas silang dengan protein-N SARS-CoV, meskipun ini perlu dikonfirmasi oleh analisis mutagenesis. Identitas urutan asam amino yang dihitung dari SARS-CoV dan tiga protein-N CoV babi adalah 25,8% (109a), 25,8% (109a), dan 25,1% (106a) untuk TGEV-P115, TGEV-M6, dan PRCV-ISU1, masing-masing (Tabel 5). Selain itu, sekuens protein-N HCoV-NL63, CCoV, FIPV, BCoV, dan IBV dianalisis dan identitas asam amino dengan protein-N SARS-CoV ditunjukkan pada Tabel 5 . Strain HCoV-NL63 adalah satu-satunya kelompok 1 CoV yang diuji yang tidak bereaksi silang dengan SARS-CoV. Namun demikian, kami gagal menunjukkan identitas urutan yang lebih rendah (dibandingkan dengan yang dari CoV kelompok 1 lainnya) dengan protein-N SARS-CoV atau untuk mengidentifikasi mutasi titik kritis yang dapat mengurangi reaktivitas silang. Secara total, kami mengidentifikasi 10 posisi polimorfik dalam wilayah reaktif silang yang umum untuk SARS-CoV dan rN HCoV-NL63 yang berbeda dalam rN TGEV dan rN PRCV, tetapi kami juga mengidentifikasi 10 posisi polimorfik yang umum untuk SARS-CoV dan kelompok babi 1 CoV yang berbeda dalam rN HCoV-NL63. Salah satu dari posisi terakhir dapat mempengaruhi situs antigenik reaktif silang.

Tabel 5

Identifikasi asam amino antara protein-N SARS-CoV-Urbani dan protein-N CoV lainnya

DISKUSI

Pada tahun 2002, satu CoV baru muncul di provinsi Guandong, Republik Rakyat Tiongkok, dan dalam beberapa bulan, CoV menyebar secara global dan menyebabkan lebih dari 800 kematian manusia. Infeksi dikaitkan dengan kegagalan pernafasan yang serius, dan patogen ditunjuk sebagai SARS-CoV ( 6 , 21 , 22 , 34 ). SARS-CoV sekarang diakui berasal dari zoonosis, dengan spesies kelelawar sebagai reservoir hewan liar ( 23 , 26 ) dan musang kelapa Himalaya ( Paguma larvata ) dan anjing rakun ( Nyctereutes procyonoides ) sebagai sumber infeksi langsung ( 11 , 19 , 50 ). Transmisi antarspesies dan reservoir hewan liar yang dilaporkan sebelumnya untuk CoV hewan yang berbeda ( 18 , 31 , 39 , 40 , 47 ), perkembangan terbaru dalam memahami mekanisme replikasi molekuler SARS-CoV, dan percobaan yang berhasil untuk transmisi SARS-CoV ke jumlah hewan ( 27 , 33 , 35 , 37 , 38 , 43 , 53 ) mendukung kemungkinan munculnya SARS-CoV dari hewan liar. Selain itu, transmisi SARS-CoV dari manusia ke babi telah dilaporkan ( 4 ). Temuan kontradiktif mengenai keterkaitan SARS-CoV dengan CoV lain ( 9 , 20 , 32 , 36 , 41 , 42 , 55 , 59 ), bersama dengan posisi segregasinya dalam genus CoV, menunjukkan bahwa virus tersebut telah mengalami peristiwa evolusi yang lebih rumit daripada hanya sekadar pemisahan awal dari kelompok CoV 2a atau peristiwa evolusi konvergen terjadi, yang mengarah ke hasil yang diamati.

Reaktivitas silang antigenik antara SARS-CoV dan kelompok hewan 1 CoV dilaporkan oleh beberapa kelompok penelitian ( 21 , 44 ), termasuk studi pendahuluan kami (HS Nagesha et al., Dipresentasikan pada pertemuan tahunan ke-23 American Society for Virology, McGill Universitas, Montreal, Quebec, Kanada, 2004), dan itu dikaitkan dengan protein-N ( 44 ; HS Nagesha et al., Dipresentasikan pada pertemuan tahunan ke-23 dari American Society for Virology, Universitas McGill, Montreal, Quebec, Kanada, 2004). Sejauh pengetahuan kami, tidak ada reaktivitas silang antigenik yang telah dilaporkan antara SARS-CoV dan kelompok hewan 2a atau 3 CoV, yang konsisten dengan temuan dalam laporan ini berdasarkan pada ELISA dan analisis Western blot.

Juga konsisten dengan hasil yang dipublikasikan sebelumnya, kami mengkonfirmasi bahwa antisera TGEV-P115, TGEV-M6, dan PRCV-ISU1 (Kelompok 1) dari babi gnotobiotik bereaksi silang dengan SARS-CoV dalam analisis ELISA dan Western blot. Babi gnotobiotik bebas dari mikroba asing dan Abs ibu terhadap CoV yang sudah ada sebelumnya. Mereka adalah spesies inang asli untuk TGEV dan PRCV, yang mencerminkan spektrum lengkap pasca-infeksi dan Abs yang diinduksi posthyperimunisasi (semua babi menerima oral / terpajan dengan CoVs dan pulih dari infeksi sebelum hiperimunisasi parenteral) yang dapat memengaruhi hasil spesifisitas dan ab spesifik. Reaktivitas silang dari antisera marmut yang diproduksi melawan CCoV dan FIPV yang tidak aktif dengan SARS-CoV lebih rendah daripada antisera TGEV, mungkin karena spektrum Ab yang diinduksi dalam inang heterolog dengan injeksi parenteral dari CoVs tidak aktif tidak setara dengan yang berkembang di inang alami pasca infeksi. Antiserum mouse hyperimmune SARS-CoV memungkinkan kita untuk mengkonfirmasi reaktivitas silang dua arah antara SARS-CoV dan grup 1 CoV, dengan tingkat reaktivitas tertinggi antara antiserum ini dan TGEV-P115 dan -M6. Reaktifitas luas dari kelompok 1 HCoV-NL63 dengan semua serum asal manusia menunjukkan kehadiran luas dari kelompok 1 CoV Abs terhadap HCoV-NL63 atau strain 229E lintas-reaktif dalam serum dewasa. Karena kami tidak mengamati reaktivitas silang antara SARS-CoV dan HCoV-NL63 (meskipun yang terakhir bereaksi dalam uji reaktivitas silang satu arah dengan semua antisera pada kelompok 1 CoVs), kami menyimpulkan bahwa reaktivitas silang yang diamati tidak umum fitur untuk semua CoV kelompok 1 dan SARS-CoV. Yang menarik, NL63 adalah cabang yang secara filogenetik terpisah relatif terhadap kelompok hewan 1 CoV yang kami uji dan dikelompokkan dengan HCoV-229E dan CoV epidemi diare ( 5 , 10 ). Kami tidak dapat menguji CoV epidemi diare karena pembatasan impor AS pada patogen hewan.

Dua protein struktural utama dan imunogen, protein nukleokapsid dan lonjakan, penting untuk penilaian sehubungan dengan reaktivitas silang. Kedua protein sebelumnya terbukti sangat imunogenik, dengan protein S yang mengandung situs antigenik untuk menetralkan Abs ( 13 , 14 , 16 , 57 ), sedangkan protein N adalah protein virus yang paling banyak, dengan penampilan paling awal selama SARS-CoV infeksi ( 2 , 24 , 25 , 45 , 49 ). Karena tidak adanya reaktivitas silang yang dimediasi melalui protein SARS-CoV S, kami memfokuskan pekerjaan kami yang tersisa pada penyelidikan kontribusi N-protein terhadap reaktivitas silang. Apakah protein struktural SARS-CoV lain (E, M) juga dapat berkontribusi terhadap reaktivitas silang belum ditentukan.

Serangkaian reaktivitas silang yang moderat hingga lemah antara TGEV-P115, TGEV-M6, dan PRCV rNs dan sera fase konvalesen SARS tidak memberikan hasil konklusif, karena kemungkinan adanya Abs untuk mengelompokkan CoVs dalam sera ini, seperti yang disarankan oleh reaktivitas silang yang luas dari sera manusia SARS-CoV Ab-positif dan negatif dengan kelompok 1 HCoV-NL63 dan HCoV-NL63 rNs. Namun, tidak seperti lisat sel yang terinfeksi CoV mentah, rN tidak bereaksi dengan serum manusia negatif, mungkin karena reaktivitas silang dengan CoVs yang tidak dimurnikan dimediasi melalui Abs ke beberapa antigen CoVs kelompok 1 dan tidak hanya pada protein-N. Konsisten dengan temuan sebelumnya ( 30 , 51 ), SARS-CoV rN dalam analisis Western blot menghasilkan sedikit hasil positif dengan beberapa serum manusia negatif yang dikonfirmasi; Namun, itu memungkinkan diskriminasi yang dapat diandalkan antara fase pemulihan SARS dan serum manusia negatif dalam ELISA. Pola reaktifitas antisera terhadap porVine CoVs dengan SARS-CoV rN mirip dengan yang diperoleh dengan CoVs yang tidak dimurnikan, jadi kami menyimpulkan bahwa protein N bertanggung jawab untuk reaktivitas silang antara SARS-CoV dan kelompok babi 1 CoV, yang merupakan konsisten dengan hasil yang dipublikasikan sebelumnya ( 44 ). Namun, tidak ada kesimpulan seperti itu dapat ditarik untuk HCoV-NL63 rN, yang bereaksi dengan fase konvalesen manusia dan serum manusia negatif SARS tetapi tidak dengan antiserum hyperimmune tikus ke SARS-CoV. Mengingat tidak adanya reaktivitas silang yang dimediasi oleh protein-S SARS-CoV dan fakta bahwa respons imunologis pada pasien SARS sebagian besar diarahkan ke protein-N ( 2 , 8 , 45 ), kami berhipotesis bahwa beberapa situs antigenik reaktif-silang ) dalam protein-N SARS-CoV mungkin bertanggung jawab untuk reaktivitas silang yang diamati dan juga bahwa variasi dalam urutan primernya dapat mempengaruhi struktur situs antigenik ( 56 ), yang mengarah ke berbagai tingkat reaktivitas silang dengan kelompok hewan 1 CoV.

Identifikasi fragmen reaktif silang (dengan antisera TGEV-P115, TGEV-M6, dan PRCV-ISU1), aa 70 hingga 213, 120 hingga 208, dan 1 hingga 213, mengonfirmasi hasil yang diperoleh dengan CoVs yang tidak dibenarkan dan rN lengkap, menunjukkan efisiensi pengikatan terkuat untuk serum anti-P115 dan -M6 dan tingkat reaktivitas yang lebih rendah untuk fragmen yang terdiri dari aa 1 hingga 213 dengan hyperimmune anti-CCoV dan hyperimmune anti-FIPV sera. Karena reaktivitas silang yang diamati tertinggi untuk fragmen yang terdiri dari aa 1 hingga 213 tetapi tidak sangat menurun untuk fragmen terpendek, aa 120 hingga 208, kami berspekulasi bahwa sebagian besar situs antigenik reaktif-silang tertanam dalam fragmen aa-120- ke-208, mungkin membentang di luar perbatasannya, dan bahwa motif FYYLGTGP yang sangat kekal (aa 111 hingga 118) tidak mungkin menjadi sumber reaktivitas silang yang diamati, karena pengecualiannya dalam fragmen yang terdiri dari aa 120 hingga 208 tidak mempengaruhi reaktivitas silang dibandingkan dengan yang ada dalam fragmen yang terdiri dari 70 hingga 213.

Meskipun kami tidak memiliki kesempatan untuk menggunakan panel serum manusia yang cukup, dari hasil yang kami peroleh, fragmen protein-N SARS-CoV yang terdiri dari aa 1 hingga 213 dan 360 hingga 412 tampaknya merupakan komponen berharga untuk deteksi Ab ELISA SARS-CoV. Untuk fragmen-fragmen ini, sensitivitas dan spesifisitas 100% diperlihatkan (menggunakan set sera yang tersedia), dan lebih lanjut, fragmen-fragmen ini mampu mengenali semua sera fase fase pemulihan SARS dengan efisiensi yang lebih tinggi daripada sistem yang didasarkan pada protein S atau N panjang penuh, dengan efisiensi deteksi yang sama dengan ELISA berbasis SARS-CoV. Temuan ini menunjukkan bahwa fragmen-fragmen ini membawa situs linier yang sangat antigenik, yang merupakan target utama untuk respon imun terhadap seluruh protein N dan, mungkin, ke SARS-CoV yang utuh. Meskipun fragmen aa-360-ke-412 gagal bereaksi dengan antiserum SARS-CoV hyperimmune yang diproduksi pada tikus, ini tidak berkurang tetapi sebenarnya dapat meningkatkan nilainya untuk diagnosis SARS pada populasi manusia yang terinfeksi. Kegagalan ini mungkin terkait dengan perbedaan dalam penyajian antigen atau imunogenisitas dari situs-situs ini antara manusia dan tikus ( 16 , 28 ) atau fakta bahwa serum manusia mewakili serum fase-pemulihan fase-penyembuhan dan antiserum hyperimmune tikus diproduksi menggunakan SARS-CoV yang tidak aktif diberikan secara parenteral, diikuti oleh peningkatan dengan protein-N SARS-CoV  rekombinan. Fragmen yang terdiri dari aa 1 hingga 213 juga mengandung situs imunodominan, dan meskipun penelitian kami menunjukkan bahwa itu bertanggung jawab untuk reaktivitas silang dengan kelompok hewan 1 CoV, secara mengejutkan itu tampaknya tidak mengandung epitop yang reaktif silang dengan kelompok lain 1 HCoV, HCoV -NL63. Temuan ini menunjukkan bahwa evolusi SARS-CoV diisolasi dari HCoV-NL63 dan mungkin lebih terkait erat dengan evolusi hewan. Namun, studi lebih lanjut termasuk CoV manusia dan hewan lainnya diperlukan untuk mencapai kesimpulan yang lebih pasti.

Reaktivitas tingkat rendah yang diamati dari fragmen aa-1-ke-213, aa-212-ke-422, dan aa-1-ke-422 dengan beberapa serum negatif manusia dalam analisis Western blot tampaknya tidak terkait dengan lokasi. yang berbagi identitas urutan yang lebih tinggi antara SARS - dan HCoV lainnya, karena pewarnaan sama lemahnya untuk ketiga fragmen dan bisa disebabkan oleh alasan lain, termasuk kemungkinan identitas urutan protein N dengan beberapa jaringan manusia ( 51 ), reaktivitas silang dengan beberapa yang tidak terdeteksi. patogen manusia, atau afinitas spesifik IgG terhadap protein N rekombinan nonglikosilasi ( 29 , 30 ).

Penyelarasan urutan asam amino dari tiga protein-N babi CoV dan SARS-CoV tidak mengungkapkan perbedaan besar yang berpotensi bertanggung jawab untuk variasi yang diamati dalam tingkat reaktivitas silang untuk kelompok hewan 1 CoV (TGEV-P115, TGEV-M6, PRCV) , karena urutan N-protein sangat terkonservasi dalam kelompok dan ketiga protein kelompok babi 1 CoV N memiliki 97% identitas asam amino antara satu sama lain, dengan mutasi titik jarang ( 58 ). Hanya 1 dari 12 posisi polimorfik untuk protein TGEV-M6, TGEV-P115, dan PRCV-ISU1 N yang tampaknya sangat penting: satu valin (V) pada posisi 120 pada protei-Nn PRCV-ISU1 (dalam cross-reaktif wilayah) mungkin mengurangi reaktivitas silang dengan SARS-CoV, karena TGEV (M6 dan p115) dan SARS-CoV mengandung alanin (A) pada posisi ini ( 58 ). Mempertimbangkan bahwa reaktivitas silang yang diamati mungkin bukan konsekuensi langsung dari identitas urutan asam amino, satu fitur umum dari protein-N dari TGEV, PRCV, dan SARS-CoV harus dicatat: keberadaan situs imunodominan yang kuat pada bagian-N terminal (lintas reaktif). Ini sebelumnya dilaporkan untuk SARS-CoV ( 15 ), dan kami menemukan hasil yang serupa untuk TGEV dan PRCV (data yang tidak dipublikasikan). Protein TGEV dan SARS-CoV N ditunjukkan sebagai pendamping RNA dengan bagian yang panjang yang tidak teratur ( 60 ). Serupa, situs antigenik sangat pendek (sebagai lawan dari situs konformasi yang akan hilang selama pemurnian protein dalam kondisi denaturasi yang kami gunakan) mungkin terpapar selama infeksi alami pada spesies inang. Ini, bersama dengan keseluruhan identitas rendah dari urutan primer SARS-CoV dan porcine CoV, menunjukkan bahwa satu mutasi titik dalam wilayah reaktif-silang dapat menjadi penting untuk struktur situs lintas-reaktif dan bertanggung jawab untuk variasi yang diamati pada level. reaktivitas silang dengan kelompok babi 1 CoVs. Menariknya, situs yang paling antigenik dari rN HCoV-NL63, seperti yang tercermin oleh hiperimun antiserum, terletak di terminal C, sedangkan reaktivitas silang dengan kelompok 1 CoV dimediasi melalui setidaknya dua situs antigen pada N (mungkin aa. ke 39) dan C (aa 182 hingga 378) termini dari protein-N HCoV-NL63, sedangkan putatif cross-reactive (aa 39 hingga 183) protein-N fragmen HCoV-NL63 gagal bereaksi dengan Abs heterolog. Oleh karena itu, fragmen protein-N HCoV-NL63 ini berbeda dalam antigenisitasnya dan reaktivitas silang antigenik dari SARS-CoV dan kelompok hewan 1 CoV. Ini bisa menjelaskan tidak adanya reaktivitas silang dengan SARS-CoV, tetapi seperti yang dicatat untuk hewan kelompok 1 CoV, faktor penentu antigenisitas tidak dapat diidentifikasi pada tingkat urutan asam amino primer.

Sebagai kesimpulan, kami mengkonfirmasi reaktivitas silang antigenik dua arah antara SARS-CoV dan kelompok babi 1 CoV (TGEVs [M6 dan P115] dan PRCV-ISU1) dan menunjukkan bahwa hal itu disebabkan oleh SARS-CoV dan kelompok 1 protein-N CoV dan bukan protein S. Kami mengidentifikasi daerah reaktif silang dan satu titik mutasi dalam wilayah ini yang kemungkinan bertanggung jawab untuk variasi yang diamati pada tingkat reaktivitas silang dengan kelompok babi 1 CoVs. Selain itu, temuan kami menunjukkan bahwa fragmen yang terdiri dari 1 hingga 213 dan 360 hingga 412 protein-N SARS-CoV bila digunakan bersama-sama dapat menjadi reagen diagnostik diskriminatif yang berharga, dengan yang terakhir hanya mencerminkan spesifisitas SARS-CoV. Penggunaan reagen berpasangan tersebut dapat mengatasi masalah ketidak spesifikan yang ditunjukkan untuk protein-N penuh untuk menguji serum manusia dan hewan.

REFERENSI

1. ↵

Bradford, MM 1976 . Metode cepat dan sensitif untuk kuantisasi jumlah protein mikrogram menggunakan prinsip ikatan pewarna protein. Anal Biokem. 72 : 248 -254.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

1a. ↵

Chan, KH, VC Cheng, PC Woo, SK Lau, LL Poon, Y. Guan, WH Seto, KY Yuen, dan JS Peiris. 2005 Respon serologis pada pasien dengan infeksi coronavirus sindrom pernafasan akut parah dan reaktivitas silang dengan human coronaviruses 229E, OC43, dan NL63. Clin. Diagnosis Laboratorium. Immunol. 12 : 1317 -1321.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

2. ↵

Che, XY, W. Hao, Y. Wang, B. Di, K. Yin, YC Xu, CS Feng, ZY Wan, VC Cheng, dan KY Yuen. 2004 Protein nukleokapsid sebagai penanda diagnostik awal untuk SARS. Muncul. Menulari. Dis. 10 : 1947 -1949.

OpenUrl PubMed Web of Science Google Scholar

3. ↵

Che, XY, LW Qiu, ZY Liao, YD Wang, K. Wen, YX Pan, W. Hao, YB Mei, VC Cheng, dan KY Yuen. 2005 Reaktivitas silang antigenik antara koronavirus akut yang berhubungan dengan sindrom pernapasan akut dan coronavirus manusia 229E dan OC43. J. Menginfeksi. Dis. 191 : 2033 -2037.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

4. ↵

Chen, W., M. Yan, L. Yang, B. Ding, B. He, Y. Wang, X. Liu, C. Liu, H. Zhu, B. You, S. Huang, J. Zhang, F Mu, Z. Xiang, X. Feng, J. Wen, J. Fang, J. Yu, H. Yang, dan J. Wang. 2005 Coronavirus terkait-SARS ditularkan dari manusia ke babi. Muncul. Menulari. Dis. 11 : 446-448.

OpenUrl PubMed Web of Science Google Scholar

5. ↵

Dijkman, R., MF Jebbink, B. Wilbrink, K. Pyrc, HL Zaaijer, PD Minor, S. Franklin, B. Berkhout, V. Thiel, dan L. van der Hoek. 2006 Human coronavirus 229E mengkodekan protein ORF4 tunggal antara spike dan gen amplop. Virol. J. 3 : 106 .

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

6. ↵

Drosten, C., W. Preiser, S. Gunther, H. Schmitz, dan HW Doerr. 2003 Sindrom pernapasan akut berat: identifikasi agen etiologi. Tren Mol. Med. 9 : 325 -327.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

7. ↵

Fang, Y., A. Pekosz, L. Haynes, EA Nelson, dan RR Rowland. 2006 Produksi dan karakterisasi antibodi monoklonal terhadap protein nukleokapsid dari SARS-CoV. Adv. Exp. Med. Biol. 581 : 153 -156.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

8. ↵

Flego, M., P. Di Bonito, A. Ascione, S. Zamboni, A. Carattoli, F. Grasso, A. Cassone, dan M. Cianfriglia. 2005 Pembuatan fragmen antibodi manusia yang mengenali epitop berbeda dari protein nukleokapsid (N) SARS-CoV menggunakan pendekatan tampilan fag. Infeksi BMC. Dis. 5 : 73 .

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

9. ↵

Gibbs, AJ, MJ Gibbs, dan JS Armstrong. 2004 Filogeni dari coronavirus SARS. Lengkungan. Virol. 149 : 621 -624.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

10. ↵

Gorbalenya, AE, EJ Snijder, dan WJ Spaan. 2004 Sindrom koronavirus pernafasan akut akut: menuju konsensus. J. Virol. 78 : 7863 -7866.

OpenUrl GRATIS Teks Lengkap Google Scholar

11. ↵

Guan, Y., BJ Zheng, YQ He, XL Liu, ZX Zhuang, CL Cheung, SW Luo, PH Li, LJ Zhang, YJ Guan, KM Butt, KL Wong, KW Chan, W. Lim, KF Shortridge, KY Yuen , JS Peiris, dan LL Poon. 2003 Isolasi dan karakterisasi virus yang terkait dengan coronavirus SARS dari hewan di Cina selatan. Sains 302 : 276 -278.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

12. ↵

Hasoksuz, M., SL Lathrop, KL Gadfield, dan LJ Saif. 1999 . Isolasi coronavirus pernapasan sapi dari sapi penggemukan dan perbandingan sifat biologis dan antigeniknya dengan coronavirus enterik sapi. Saya. J. Vet. Res. 60 : 1227 -1233.

OpenUrl PubMed Web of Science Google Scholar

13. ↵

Dia, Y., Y. Zhou, S. Liu, Z. Kou, W. Li, M. Farzan, dan S. Jiang. 2004 Domain pengikat reseptor protein spike SARS-CoV menginduksi antibodi penawar yang sangat potensial: implikasi untuk mengembangkan vaksin subunit. Biokem. Biophys. Res. Komunal. 324 : 773 -781.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

14. ↵

Dia, Y., Y. Zhou, P. Siddiqui, dan S. Jiang. 2004 Vaksin SARS-CoV yang tidak aktif memunculkan titer tinggi dari antibodi spesifik protein yang menghambat pengikatan reseptor dan masuknya virus. Biokem. Biophys. Res. Komunal. 325 : 445 -452.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

15. ↵

Dia, Y., Y. Zhou, H. Wu, Z. Kou, S. Liu, dan S. Jiang. 2004 Pemetaan situs antigenik pada protein nukleokapsid dari coronavirus syndrome pernapasan akut. J. Clin. Mikrobiol. 42 : 5309 -5314.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

16. ↵

Dia, Y., Y. Zhou, H. Wu, B. Luo, J. Chen, W. Li, dan S. Jiang. 2004 Identifikasi situs imunodominan pada protein lonjakan coronavirus syndrome pernapasan akut (SARS) parah: implikasi untuk mengembangkan diagnostik dan vaksin SARS. J. Immunol. 173 : 4050 -4057.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

17. ↵

Huang, Y., ZY Yang, WP Kong, dan GJ Nabel. 2004 Generasi pseudopartikel sindrom pernapasan akut sindrom pernapasan akut: implikasi untuk perakitan dan produksi vaksin. J. Virol. 78 : 12557 -12565.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

18. ↵

Ismail, MM, KO Cho, LA Ward, LJ Saif, dan YM Saif. 2001 Coronavirus bovine eksperimental pada ayam kalkun dan ayam muda. Avian Dis. 45 : 157 -163.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

19. ↵

Kan, B., M. Wang, H. Jing, H. Xu, X. Jiang, M. Yan, W. Liang, H. Zheng, K. Wan, Q. Liu, B. Cui, Y. Xu, E Zhang, H. Wang, J. Ye, G. Li, M. Li, Z. Cui, X. Qi, K. Chen, L. Du, K. Gao, YT Zhao, XZ Zou, YJ Feng, YF Gao , R. Hai, D. Yu, Y. Guan, dan J. Xu. 2005 Analisis evolusi molekuler dan investigasi geografis dari virus seperti coronavirus syndrome pernapasan akut di musang di pasar hewan dan di peternakan. J. Virol. 79 : 11892 -11900. (Erratum, 80 : 7786.)

OpenUrl Google Scholar

20. ↵

Kim, OJ, DH Lee, dan CH Lee. 2006 Hubungan yang erat antara SARS-coronavirus dan coronavirus grup 2. J. Microbiol. 44 : 83 -91.

OpenUrl PubMed Google Scholar

21. ↵

Ksiazek, TG, D. Erdman, CS Tukang Emas, SR Zaki, T. Peret, S. Emery, S. Tong, C. Urbani, Comer JA, W. Lim, PE Rollin, SF Dowell, AE Ling, CD Humphrey, WJ Shieh, J. Guarner, CD Paddock, P. Rota, B. Fields, J. DeRisi, JY Yang, N. Cox, JM Hughes, JW LeDuc, WJ Bellini, LJ Anderson, LJ Anderson, dan Grup SW. 2003 Sebuah coronavirus baru yang terkait dengan sindrom pernapasan akut parah. N. Engl. J. Med. 348 : 1953 -1966.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

22. ↵

Kuiken, T., RA Fouchier, M. Schutten, GF Rimmelzwaan, G. van Amerongen, D. van Riel, Halaman JD, T. de Jong, G. van Doornum, W. Lim, AE Ling, PK Chan, JS Tam , MC Zambon, R. Gopal, C. Drosten, S. van der Werf, N. Escriou, JC Manuguerra, K. Stohr, JS Peiris, dan AD Osterhaus. 2003 Koronavirus yang baru ditemukan sebagai penyebab utama sindrom pernapasan akut. Lancet 362 : 263 -270.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

23. ↵

Lau, SK, PC Woo, KS Li, ​​Y. Huang, HW Tsoi, BH Wong, SS Wong, SY Leung, KH Chan, dan KY Yuen. 2005 Sindrom seperti virus pernapasan akut yang parah pada kelelawar tapal kuda Cina. Proc Natl. Acad. Sci. AS 102 : 14040 -14045.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

24. ↵

Leung, DT, FC Tam, CH Ma, PK Chan, JL Cheung, H. Niu, JS Tam, dan PL Lim. 2004 Respon antibodi pasien dengan sindrom pernapasan akut (SARS) menargetkan nukleokapsid virus. J. Menginfeksi. Dis. 190 : 379 -386.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

25. ↵

Li, S., L. Lin, H. Wang, J. Yin, Y. Ren, Z. Zhao, J. Wen, C. Zhou, X. Zhang, X. Li, J. Wang, Z. Zhou, J Liu, J. Shao, T. Lei, J. Fang, N. Xu, dan S. Liu. 2003 Studi epitop pada protein nukleokapsid SARS-CoV. Genomics Proteomics Bioinformatika 1 : 198 -206.

OpenUrl PubMed Google Scholar

26. ↵

Li, W., Z. Shi, M. Yu, W. Ren, C. Smith, JH Epstein, H. Wang, G. Crameri, Z. Hu, H. Zhang, J. Zhang, J. McEachern, H. Field, P. Daszak, BT Eaton, S. Zhang, dan LF Wang. 2005 Kelelawar adalah reservoir alami dari virus corona yang mirip SARS. Sains 310 : 676 -679.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

27. ↵

Li, W., SK Wong, F. Li, JH Kuhn, IC Huang, H. Choe, dan M. Farzan. 2006 Asal hewan dari coronavirus sindrom pernafasan akut yang parah: wawasan dari interaksi ACE2-S-protein. J. Virol. 80 : 4211 -4219.

OpenUrl GRATIS Teks Lengkap Google Scholar

28. ↵

Liu, SJ, CH Leng, SP Lien, HY Chi, CY Huang, CL Lin, WC Lian, CJ Chen, SL Hsieh, dan P. Chong. 2006 Karakterisasi imunologi dari kandidat vaksin SARS berbasis protein nukleokapsid. Vaksin 24 : 3100 -3108.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

29. ↵

Lu, W., XD Wu, MD Shi, RF Yang, YY He, C. Bian, TL Shi, S. Yang, XL Zhu, WH Jiang, YX Li, LC Yan, YY Ji, Y. Lin, GM Lin, L. Tian, ​​J. Wang, HX Wang, YH Xie, G. Pei, JR Wu, dan B. Sun. 2005 Peptida sintetis yang berasal dari protein Sona coronavirus SARS dengan potensi diagnostik dan terapeutik. FEBS Lett. 579 : 2130 -2136.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

30. ↵

Maache, M., F. Komurian-Pradel, A. Rajoharison, M. Perret, JL Berland, S. Pouzol, A. Bagnaud, B. Duverger, J. Xu, A. Osuna, dan G. Paranhos-Baccala. 2006 Hasil positif palsu dalam rekombinan koronavirus akut yang berhubungan dengan sindrom pernapasan akut parah (SARS-CoV) berbasis uji western blot nukleapsapsid diperbaiki dengan menggunakan dua subunit (S1 dan S2) dari lonjakan untuk mendeteksi antibodi terhadap SARS-CoV. Clin. Vaksin Immunol. 13 : 409-414.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

31. ↵

Majhdi, F., HC Minocha, dan S. Kapil. 1997 . Isolasi dan karakterisasi virus corona dari anak sapi rusa dengan diare. J. Clin. Mikrobiol. 35 : 2937 -2942.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

32. ↵

Marra, MA, SJ Jones, CR Astell, RA Holt, A. Brooks-Wilson, YS Butterfield, J. Khattra, JK Asano, Tukang cukur SA, SY Chan, A. Cloutier, SM Coughlin, D. Freeman, N. Girn, OL Griffith, SR Leach, M. Mayo, H. McDonald, SB Montgomery, PK Pandoh, AS Petrescu, AG Robertson, JE Schein, A. Siddiqui, DE Smailus, JM Stott, GS Yang, F. Plummer, A. Andonov, H. Artsob, N. Bastien, K. Bernard, Booth TF, D. Bowness, M. Czub, M. Drebot, L. Fernando, R. Flick, M. Garbutt, M. Gray, A. Grolla, S. Jones , H. Feldmann, A. Meyers, A. Kabani, Y. Li, S. Normand, U. Stroher, GA Tipples, S. Tyler, R. Vogrig, D. Ward, B. Watson, RC Brunham, M. Krajden , M. Petric, DM Skowronski, C. Upton, dan RL Roper. 2003 Urutan genom dari coronavirus terkait-SARS. Sains 300 : 1399 -1404.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

33. ↵

Martina, BE, BL Haagmans, T. Kuiken, RA Fouchier, GF Rimmelzwaan, G. Van Amerongen, JS Peiris, W. Lim, dan AD Osterhaus. 2003 Virologi: Infeksi virus SARS pada kucing dan musang. Alam 425 : 915 .

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

34. ↵

Peiris, JS, Y. Guan, dan KY Yuen. 2004 Sindrom pernapasan akut berat. Nat. Med. 10 : S88 -97.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

35. ↵

Qin, E., H. Shi, L. Tang, C. Wang, G. Chang, Z. Ding, K. Zhao, J. Wang, Z. Chen, M. Yu, B. Si, J. Liu, D Wu, X. Cheng, B. Yang, W. Peng, Q. Meng, B. Liu, W. Han, X. Yin, H. Duan, D. Zhan, L. Tian, ​​S. Li, J. Wu , G. Tan, Y. Li, Y. Li, Y. Liu, H. Liu, F. Lv, Y. Zhang, X. Kong, B. Fan, T. Jiang, S. Xu, X. Wang, C Li, X. Wu, Y. Deng, M. Zhao, dan Q. Zhu. 2006 Imunogenisitas dan kemanjuran perlindungan pada monyet vaksin Vero-sel SARS yang tidak aktif yang dimurnikan. Vaksin 24 : 1028 -1034.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

36. ↵

Istirahat, JS, dan DP Mindell. 2003 Coronavirus terkait SARS memiliki polimerase rekombinan dan coronavirus memiliki riwayat pergeseran tuan rumah. Menulari. Genet. Evol. 3 : 219 -225.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

37. ↵

Roberts, A., L. Vogel, J. Guarner, N. Hayes, B. Murphy, S. Zaki, dan K. Subbarao. 2005 Infeksi koronavirus sindrom pernapasan akut parah hamster Suriah emas. J. Virol. 79 : 503 -511.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

38. ↵

Rowe, T., G. Gao, RJ Hogan, RG Crystal, TG Voss, RL Grant, P. Bell, GP Kobinger, NA Wivel, dan JM Wilson. 2004 Model kera untuk sindrom pernapasan akut parah. J. Virol. 78 : 11401 -11404.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

39. ↵

Saif, LJ 2004 . Virus korona hewan: apa yang bisa mereka ajarkan tentang sindrom pernafasan akut yang parah? Pdt. Sci. Tech. 23 : 643 -660.

OpenUrl PubMed Google Scholar

40. ↵

Saif, LJ 2005 . Biologi komparatif virus hewan korona: pelajaran untuk SARS, hal. 84 -89. Dalam M. Peiris, Anderson, LJ, Osterhaus, ADME, Stohr, K. dan Yuen, KY (ed.), Sindrom pernapasan akut yang parah. Blackwell Publishing, Oxford, Kerajaan Inggris.

Google Scholar

41. ↵

Snijder, EJ, PJ Bredenbeek, JC Dobbe, V. Thiel, J. Ziebuhr, LL Poon, Y. Guan, M. Rozanov, WJ Spaan, dan AE Gorbalenya. 2003 Ciri-ciri genom dan proteom dari SARS-coronavirus yang unik dan dilestarikan, pemisahan awal dari garis keturunan kelompok 2 coronavirus. J. Mol. Biol. 331 : 991 -1004.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

42. ↵

Stavrinides, J., dan DS Guttman. 2004 Evolusi mosaik dari coronavirus sindrom pernafasan akut yang parah. J. Virol. 78 : 76 -82.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

43. ↵

Subbarao, K., J. McAuliffe, L. Vogel, G. Fahle, S. Fischer, K. Tatti, M. Packard, WJ Shieh, S. Zaki, dan B. Murphy. 2004 Infeksi sebelumnya dan transfer pasif antibodi penawar mencegah replikasi koronavirus sindrom pernafasan akut yang parah di saluran pernapasan tikus. J. Virol. 78 : 3572 -3577.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

44. ↵

Sun, ZF, dan XJ Meng. 2004 Reaktivitas silang antigenik antara protein nukleokapsid dari coronavirus sindrom pernafasan akut (SARS) yang parah dan antisera poliklonal dari coronaviruses hewan kelompok I hewan antigen: implikasi untuk diagnosis SARS. J. Clin. Mikrobiol. 42 : 2351 -2352.

OpenUrl GRATIS Teks Lengkap Google Scholar

45. ↵

Tan, YJ, PY Goh, BC Fielding, S. Shen, CF Chou, JL Fu, HN Leong, YS Leo, EE Ooi, AE Ling, SG Lim, dan W. Hong. 2004 Profil tanggapan antibodi terhadap protein rekombinan koronavirus sindroma akut yang parah dan potensi penggunaannya sebagai penanda diagnostik. Clin. Diagnosis Laboratorium. Immunol. 11 : 362 -371.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

46. ↵

Tripp, RA, LM Haynes, D. Moore, B. Anderson, A. Tamin, BH Harcourt, LP Jones, M. Yilla, GJ Babcock, T. Greenough, DM Ambrosino, R. Alvarez, J. Callaway, S. Cavitt , K. Kamrud, H. Alterson, J. Smith, JL Harcourt, C. Miao, R. Razdan, JA Comer, PE Rollin, TG Ksiazek, A. Sanchez, PA Rota, WJ Bellini, dan LJ Anderson. 2005 Antibodi monoklonal terhadap coronavirus terkait SARS (SARS-CoV): identifikasi netralisasi dan antibodi yang reaktif terhadap protein virus S, N, M dan E. J. Virol. Metode 128 : 21 -28.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

47. ↵

Tsunemitsu, H., ZR el-Kanawati, DR Smith, HH Reed, dan LJ Saif. 1995 Isolasi virus corona tidak dapat dibedakan secara antigen dari virus corona sapi dari ruminansia liar dengan diare. J. Clin. Mikrobiol. 33 : 3264 -3269.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

48. ↵

van der Hoek, L., K. Pyrc, Jebbink MF, W. Vermeulen-Oost, RJ Berkhout, KC Wolthers, PM Wertheim-van Dillen, J. Kaandorp, J. Spaargaren, dan B. Berkhout. 2004 Identifikasi coronavirus manusia baru. Nat. Med. 10 : 368 -373.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

49. ↵

Wang, J., J. Wen, J. Li, J. Yin, Q. Zhu, H. Wang, Y. Yang, E. Qin, B. Anda, W. Li, X. Li, S. Huang, R Yang, X. Zhang, L. Yang, T. Zhang, Y. Yin, X. Cui, X. Tang, L. Wang, B. He, L. Ma, T. Lei, C. Zeng, J. Fang , J. Yu, J. Wang, H. Yang, MB Barat, A. Bhatnagar, Y. Lu, N. Xu, dan S. Liu. 2003 Penilaian peptida sintetis imunoreaktif dari protein struktural koronavirus sindrom pernafasan akut. Clin. Chem 49 : 1989 -1996.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

50. ↵

Wang, M., M. Yan, H. Xu, W. Liang, B. Kan, B. Zheng, H. Chen, H. Zheng, Y. Xu, E. Zhang, H. Wang, J. Ye, G Li, M. Li, Z. Cui, YF Liu, RT Guo, XN Liu, LH Zhan, DH Zhou, A. Zhao, R. Hai, D. Yu, Y. Guan, dan J. Xu. 2005 Infeksi SARS-CoV di restoran dari luwak sawit. Muncul. Menulari. Dis. 11 : 1860 -1865.

OpenUrl PubMed Web of Science Google Scholar

51. ↵

Wang, Y., S. Sun, H. Shen, L. Jiang, M. Zhang, D. Xiao, Y. Liu, X. Ma, Y. Zhang, N. Guo, dan T. Jia. 2004 Reaksi silang antigen SARS-CoV dengan autoantibodi pada penyakit autoimun. Sel. Mol. Immunol. 1 : 304-307.

OpenUrl PubMed Google Scholar

52. ↵

Welch, SK, dan LJ Saif. 1988 . Antibodi monoklonal terhadap strain virulen virus gastroenteritis yang dapat ditularkan: perbandingan reaktivitas dengan virus yang virulen dan dilemahkan. Lengkungan. Virol. 101 : 221 -235.

OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science Google Scholar

53. ↵

Wentworth, DE, L. Gillim-Ross, N. Espina, dan KA Bernard. 2004 Tikus rentan terhadap coronavirus SARS. Muncul. Menulari. Dis. 10 : 1293 -1296.

OpenUrl PubMed Web of Science Google Scholar

54. ↵

Wu, D., C. Tu, C. Xin, H. Xuan, Q. Meng, Y. Liu, Y. Yu, Y. Guan, Y. Jiang, X. Yin, G. Crameri, M. Wang, C Li, S. Liu, M. Liao, L. Feng, H. Xiang, J. Sun, J. Chen, Y. Sun, S. Gu, N. Liu, D. Fu, BT Eaton, LF Wang, dan X. Kong. 2005 Musang sama-sama rentan terhadap infeksi eksperimental oleh dua isolat yang berbeda coronavirus sindrom akut pernapasan. J. Virol. 79 : 2620 -2625.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

55. ↵

Yap, YL, XW Zhang, dan A. Danchin. 2003 Hubungan SARS-CoV dengan virus RNA patogen lainnya dieksplorasi dengan profil penggunaan tetranukleotida. BMC Bioinformatika 4 : 43 .

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

56. ↵

Yoo, D., dan D. Deregt. 2001 Suatu perubahan asam amino tunggal dalam domain antigenik II dari protein lonjakan bovine coronavirus memberikan resistensi terhadap netralisasi virus. Clin. Diagnosis Laboratorium. Immunol. 8 : 297 -302.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

57. ↵

Zhang, H., G. Wang, J. Li, Y. Nie, X. Shi, G. Lian, W. Wang, X. Yin, Y. Zhao, X. Qu, M. Ding, dan H. Deng. 2004 Identifikasi penentu antigenik pada domain S2 dari glikoprotein spike sindrom pernafasan sindrom akut akut yang mampu menginduksi antibodi penawar. J. Virol. 78 : 6938 -6945.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

58. ↵

Zhang, X., M. Hasoksuz, D. Spiro, R. Halpin, S. Wang, S. Stollar, D. Janies, N. Hadya, Y. Tang, E. Ghedin, dan L. Saif. 2007 Urutan genom lengkap, residu utama dalam protein lonjakan dan penghapusan protein nonstruktural 3b dari strain AS dari virus corona yang virulen dan dilemahkan, virus gastroenteritis yang dapat ditularkan, dan coronavirus pernapasan babi. Virologi 358 : 424 -435.

OpenUrl CrossRef PubMed Google Scholar

59. ↵

Zhu, G., dan HW Chen. 2004 Hubungan monofiletik antara coronavirus sindrom pernafasan akut yang parah dan coronavirus kelompok 2. J. Menginfeksi. Dis. 189 : 1676 -1678.

OpenUrl Abstract / Teks Lengkap GRATIS Google Scholar

60. ↵

Zuniga, S., I. Sola, JL Moreno, P. Sabella, J. Plana-Duran, dan L. Enjuanes. 2007 Protein nukleokapsid coronavirus adalah pendamping RNA. Virologi 357 : 215 -227.


Sumber:

Anastasia N. Vlasova , Xinsheng Zhang , Mustafa Hasoksuz , Hadya S. Nagesha , Lia M. Haynes , Ying Fang , Shan Lu , Linda J. Saif
DOI: 10.1128 / JVI.01169-07
Journal of Virology

https://jvi.asm.org/content/81/24/13365