Kesamaan Epitop Babi dan Manusia

Pengenalan Epitope dalam Model Perbandingan Manusia–Babi pada Materi yang Difiksasi dan Diembed

 

ABSTRAK

 

Kondisi dan spesifisitas di mana antibodi mengikat protein targetnya pada jaringan yang difiksasi dan diembed secara rutin masih belum diketahui. Metode langsung, seperti pewarnaan pada hewan knock-out atau pemindaian peptida epitope secara in vitro, memiliki biaya tinggi dan tidak praktis. Penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan spesifisitas antibodi dan kondisi pengikatannya menggunakan pewarnaan jaringan serta basis data genomik dan imunologi publik dengan membandingkan manusia dan babi—mamalia ternak yang secara evolusi paling dekat dengan manusia selain primata. Kami menggunakan basis data berisi 146 antibodi anti-manusia dan menemukan bahwa antibodi dapat mentoleransi substitusi asam amino yang sebagian terkonservasi tetapi tidak pada perubahan aksesibilitas target, sebagaimana didefinisikan oleh algoritma prediksi epitop. Beberapa epitop sensitif terhadap proses fiksasi dan embedding secara spesifik pada spesies tertentu. Kami juga menemukan bahwa setengah dari antibodi dapat mewarnai epitop jaringan babi yang memiliki kesamaan 60% hingga 100% dengan jaringan manusia pada tingkat urutan asam amino. Alasan mengapa antibodi lainnya gagal mewarnai jaringan tersebut masih belum jelas. Karena kemiripannya dengan manusia, jaringan babi menawarkan alternatif yang mudah untuk kontrol kualitas dalam imunohistokimia, baik di dalam maupun lintas laboratorium, serta menjadi model menarik untuk menyelidiki spesifisitas antibodi.

Kata kunci: antigen, epitop, imunohistokimia, babi, kontrol kualitas

 

PENDAHULUAN

 

Diagnosis Imunohistokimia (IHC) adalah teknik yang sudah mapan dalam praktik patologi manusia di seluruh dunia. Sebagian besar uji IHC dilakukan pada jaringan yang telah difiksasi dalam formalin, diembed dalam parafin (FFPE), dan disimpan pada suhu ruang. Pengenalan proses berbasis panas untuk mengembalikan reaktivitas imun jaringan (antigen retrieval; AR) (Shi et al., 1991) semakin memperkuat praktik ini. Saat ini, IHC adalah salah satu diagnostik pendamping yang paling serbaguna untuk terapi individual (Taylor, 2014).

 

Penggunaan diagnostik IHC membutuhkan standarisasi melalui adopsi protokol analitik umum (baik pra-analitik maupun analitik) dan program kontrol kualitas (QC), sebagaimana disarankan oleh College of American Pathologists (Fitzgibbons et al., 2014; Goldstein et al., 2007; Hardy et al., 2013; Robb et al., 2014). Di Eropa, setidaknya ada dua inisiatif (NordicQC di Denmark dan NEQAS di Inggris) yang menjalankan uji QC sukarela untuk IHC. Uji QC dilakukan pada sisa jaringan manusia dari ruang operasi yang digunakan sebagai sampel kontrol eksternal; meskipun demikian, terdapat keterbatasan dalam pengadaan dan kualitas jaringan normal seperti otak, batang otak, jantung, dan beberapa organ endokrin (hipofisis, paratiroid). Selain itu, pertimbangan etika dan aturan spesifik nasional membatasi pertukaran material di seluruh Eropa (Riegman dan van Veen, 2011; van Veen et al., 2006).

 

Terlepas dari penggunaan luas teknik ini, tugas paling sulit adalah memvalidasi pewarnaan in situ, mengingat jumlah antibodi yang tidak spesifik terhadap target yang dimaksud cukup tinggi (Bradbury dan Plückthun, 2015). Awalnya, imunisasi hewan dengan antigen yang dimurnikan secara biokimia dan pewarnaan dengan metode sensitivitas rendah sudah cukup untuk menghasilkan hasil dengan spesifisitas yang dapat diterima. Namun, proyek Genom Manusia membawa kebutuhan untuk menghasilkan antibodi spesifik terhadap protein pembawa antigen yang ditemukan secara molekuler, yang sering kali diekspresikan pada tingkat rendah dan memiliki domain urutan yang juga ditemukan pada protein lain yang tidak terkait.

 

Pengenalan metode imunisasi peptida sintetis dengan urutan unik dari protein yang diinginkan serta produksi antibodi monoklonal yang efektif pada jaringan FFPE (Jones et al., 1993) telah memperkuat keberadaan IHC dalam praktik harian. Antibodi yang dihasilkan terhadap peptida sintetis dapat mengenali epitop kontinu pada material FFPE (Jones et al., 1993; Sompuram et al., 2006). Bukti tidak langsung dari analisis antisera kelinci yang dihasilkan terhadap urutan rekombinan 50–150 asam amino menunjukkan bahwa komponen spesifik target dari antisera yang diarahkan terhadap epitop linear dapat mengenali target terdenaturasi pada western blot, sedangkan yang diarahkan terhadap epitop konformasi tidak dapat (Forsström et al., 2015).

 

Selain itu, pengikatan antibodi anti-peptida dapat dihambat melalui kompetisi dengan peptida imunisasi. Namun, ini tidak menjamin spesifisitas (Holmseth et al., 2012), sehingga spesifisitas hanya dapat disimpulkan melalui kombinasi kompleks dari bukti tidak langsung (Bordeaux et al., 2010; Smith dan Womack, 2014). Di sisi lain, menggunakan hewan eksperimen knock-out atau sel dengan gen yang disilensikan, meskipun merupakan metode paling ketat, sering kali tidak praktis dan mahal.

 

Idealnya, diperlukan jaringan yang diproses secara identik dengan biopsi manusia diagnostik, yang mengandung variasi epitop antibodi yang terkontrol dan diketahui serta protein bystander serupa yang melimpah untuk meniru kondisi pewarnaan pada material manusia. Penggunaan pengganti hewan untuk tugas ini dapat menjadi solusi yang mudah untuk eksplorasi. Probabilitas sangat rendah bahwa dua protein yang tidak terkait namun identik secara antigenik dapat ditemukan pada spesies lain yang mempertahankan kesamaan dari urutan yang tidak terkait akan membuat imunostaining diferensial antar dua spesies menjadi bukti bahwa antibodi tidak mengenali epitop yang secara unik mengidentifikasi protein. Sebaliknya, protein yang terkonservasi dan memiliki fungsi identik pada spesies terkait dapat ditemukan terdistribusi secara identik dan dengan demikian diwarnai secara serupa pada jaringan yang sama.

 

Babi domestik (Sus scrofa) dipelihara di seluruh Eropa untuk konsumsi manusia. Secara keseluruhan, genom babi memiliki homolog 84,1% dengan genom manusia (Fang et al., 2012), menjadikannya salah satu taksa terdekat setelah primata. Genom babi dan manusia mulai divergensi 97 juta tahun yang lalu; namun, genom babi memiliki banyak kesamaan dengan genom manusia, sehingga menjadikannya model penyakit yang menarik (Groenen et al., 2012). Sekitar 250 gen hilang atau bertambah pada masing-masing spesies setelah divergensi, terutama gen yang terkait dengan interferon dan penciuman, di antara lainnya (Fang et al., 2012; Groenen et al., 2012). Gen yang terkonservasi pada babi terkait fungsi kardiovaskular atau respons obat adalah yang paling banyak dipelajari.

 

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji antibodi diagnostik manusia pada target ortologus babi yang serupa namun tidak identik untuk memahami bagaimana antibodi mengikat jaringan FFPE, serta menentukan apakah epitop ini kontinu linear atau tidak kontinu, variasi epitop apa yang masih memungkinkan pengikatan, dan apakah jaringan babi dapat digunakan untuk QC dalam IHC.

 

MATERI DAN METODE

 

Jaringan dan Pernyataan Etika

Babi dewasa berumur 8 bulan yang telah dikebiri (Sus scrofa domesticus) dan sapi jantan berumur 10 tahun (Bos taurus) disembelih di rumah pemotongan hewan yang disertifikasi oleh Otoritas Kesehatan Lokal (ASL).

 

Material manusia anonim yang telah difiksasi dalam formalin dan disimpan dalam parafin (formalin-fixed, paraffin-embedded atau FFPE) tidak memerlukan persetujuan dari San Gerardo Institutional Review Board (IRB) berdasarkan regulasi rumah sakit (ASG-DA-050 Donazione di materiale biologico a scopo di ricerca e/o sperimentazione, Mei 2012).

 

Sampel difiksasi semalam pada suhu ruangan dalam formalin 10% yang dilarutkan dalam fosfat-buffer, pH 7,2–7,4 (Bio-Optica, Milano, Italia). Jaringan didehidrasi melalui serangkaian alkohol bertingkat, dipindahkan ke D-limonene (Bioclear; Bio-Optica), dan disimpan dalam parafin. Potongan jaringan setebal 3 μm dipotong, ditempatkan pada kaca objek bermuatan positif, dipanggang, dihilangkan parafinnya dalam xilena, lalu direhidrasi melalui serangkaian alkohol bertingkat hingga siap digunakan.

 

Sampel terpilih dibekukan secara cepat, dipotong dengan cryostat (Leica Microsystems, Milan, Italia), dan difiksasi dengan aseton.
Pewarnaan imun rutin dilakukan bersamaan dengan prosedur diagnostik pada blok jaringan “Multi-sausage” babi yang dimodifikasi (Battifora 1986) yang mengandung sampel manusia yang relevan sebagai kontrol untuk protokol pewarnaan.

 

Protokol Imunohistokimia (IHC)

Kriteria inklusi untuk antibodi adalah:

1.Dapat bekerja pada material FFPE,

2.Ditujukan pada antigen non-polimorfik pada manusia,

3. Relevan untuk diagnosis atau penelitian, dan

4.Telah dikarakterisasi dengan baik dalam hal spesifisitas.
Antibodi terhadap patogen manusia dan mutasi gen spesifik dikecualikan.

 

Potongan jaringan diwarnai sesuai pengenceran antibodi individu dan protokol yang telah ditetapkan di laboratorium kami untuk diagnostik IHC manusia menggunakan Dako Autostainer Link 48 (Dako, Glostrup, Denmark) sesuai protokol yang disarankan oleh pabrikan. Tidak ada yang memerlukan retrieval dengan protease. Untuk pewarnaan manual individu, lihat Supporting Information S1.

 

Survei reaktivitas antibodi terhadap antigen manusia pada jaringan babi yang difiksasi dengan metode rutin telah diterbitkan sebelumnya (Brodersen et al. 1998; Chianini et al. 2001; Debeer et al. 2013; Driessen et al. 2002; Faldyna et al. 2007; Jacobsen et al. 1993; Lauweryns dan Van Ranst 1987; Lauweryns et al. 1987; Sierralta dan Thole 1996; Tanimoto dan Ohtsuki 1996).

 

Kriteria Penilaian

Hasil dinilai berdasarkan distribusi subseluler (nuklir, sitoplasmik, membran) dan kombinasi pewarnaan subseluler serta intensitasnya. Selain itu, distribusi arsitektural sel yang diwarnai dalam jaringan terstruktur juga dicatat (misalnya, pusat germinal yang berkembang biak dibandingkan dengan area mantel atau interfolikuler, sel basal di kelenjar usus dibandingkan dengan sel luminal apikal, sel saraf, dan serat dalam lapisan otot polos).

 

Pewarnaan dinilai positif jika:

1.Pewarnaan tersebut secara kualitatif dan kuantitatif berbeda dari pewarnaan negatif kontrol yang homogen, samar, dan menyebar secara non-spesifik; dan

2.Lokalisasi subseluler serta distribusi arsitektural yang diharapkan dipertahankan dalam jaringan babi dibandingkan dengan reaktivitas manusia referensi. Untuk antigen yang diekspresikan secara ubiquitin atau diketahui memiliki variasi jaringan- atau subunit-tergantung (misalnya, S-100 (Takahashi et al. 1984)), variasi taksonomi potensial diterima jika distribusi subseluler dan pola manusia sebagian dipertahankan pada babi.

 

Pengambilan dan Penyelarasan Sekuens

Sekuens epitop yang disediakan oleh produsen atau dikumpulkan dari literatur yang diterbitkan digunakan untuk perbandingan sekuens asam amino (aa) manusia–babi dan dilaporkan dalam Tabel 1. Jika sekuens tidak diketahui, sekuens 100–300 aa digunakan jika epitop secara umum tercantum sebagai “C-” atau “N-terminus.” Jika keduanya tidak tersedia, sekuens protein keseluruhan digunakan. Hanya pilihan terpendek dari tiga ini yang digunakan untuk analisis. Detail dan informasi tambahan terdapat dalam Supporting Information Tabel S1.

 

Tabel 1. Protein Sasaran, Antibodi yang Digunakan, Urutan, Kesamaan, dan Hasil

Target	Sumber	Antibodi	Klon	Epitop	UniProt manusia	UniProt Babi	Kesamaan Man/Babi	Diuji	Kelas
Actin, alpha skeletal muscle	11	IgG1	HHF35	unknown	P68133	P68137	100%	POS	Basic cytoskeletal
Actin, aortic smooth muscle	5	IgG2a	1A4	10 N-term aa	P62736	C7AI81	100%	POS	Basic cytoskeletal
ALK (CD246)	4	Rb mAb	D5F3	C-term (cytoplasmic dom. aa 1060–1620)	Q9UM73	K7GQT6	83%	NEG	Receptor signaling
ALK (anaplastic lymphoma kinase; CD246)	5	IgG3	ALK1	aa 1359–1460 (419–520 chimera)	Q9UM73	K7GQT6	83%	NEG	Receptor signaling
ALK (CD246)	9	IgG1	5A4	aa 419–520 (chimera)	Q9UM73	K7GQT6	99%	NEG	Receptor signaling
ALK (CD246)	11	Rb mAb	SP8	tyrosine kinase catalytic domain & C-terminus	Q9UM73	K7GQT6	91%	NEG	Receptor signaling
AMACR	5	Rb mAb	13H4	unknown	Q9UHK6	F1SP14	78%	NEG	Cytoplasmic; misc
BCL-2	5	IgG1	Bcl-2-100	aa 41–54	P10415	A5A790	100%	POS	Apoptosis-related
BCL6	5	IgG1	PG-B6p	aa 3–484	P41182	F1FSH8	93%	NEG	TF
BCL6	6	IgG2b	LN22	aa 1–350	P41182	F1FSH8	93%	POS	TF
BCL6	9	Rb poly	BCL6 (N3)	aa 3–484	P41182	F1FSH8	93%	POS	TF
BRCA-1	7	IgG1	MS110	aa 1–304	Q3B891	A5A751	82%	NEG	Cell cycle; DNA replication
CA125	5	IgG1	M11	unknown	N/A	N/A	N/A	NEG	Cell–cell interaction
Calcitonin	5	Rb poly		unknown	P01258	A6P7L6	61%	POS	Cytoplasmic; misc
Calponin 2	5	IgG1	CALP	unknown	Q99439	Q08094	92%	POS	Basic cytoskeletal
Calretinin	5	IgG1	DAK-Calret 1	unknown	P22676	F1S3E7	97%	NEG	Cytoplasmic; misc
CCND1 (Cyclin D1)	11	Rb mAb	SP4	C-term (100 aa)	P24385	F1RY77	98%	NEG	Cell cycle; DNA replication
CD10	5	IgG1	56C6	external domain (52–750)	P08473	K7GMJ2	94%	POS	Receptor signaling
CD117 (c-kit)	5	Rb poly		aa 963–976 (C-term)	P10721	Q2HWD6	90%	POS	Receptor signaling
CD138	5	IgG1	MI15	ectodomain (aa 105–112)	P18827	M5DFN4	77%	NEG	Cell–cell interaction
CD14	10	Rb poly	HPA002127	aa 229–370	P08571	A2SW51	72%	NEG	Cell–cell interaction
CD141	1	Rb mAb	EPR4051	C-term (150 aa)	P07204	B3STX8	69%	NEG	Receptor signaling
CD15	5	IgM	C3D-1	Lewis-X	N/A	N/A	N/A	NEG	Cell–cell interaction
CD16	6	IgG2a	2H7	External domain (aa 17–208)	P08637	Q28942	60%	NEG	Cell–cell interaction
CD16	9	IgG1	DJ130c	unknown	P08637	Q28942	63%	NEG	Cell–cell interaction
CD163	11	IgG1	10D6	Domain 1–4 (N-term)	Q86VB7	Q28942	90%	NEG	Cell–cell interaction
CD163L1	9	Rb mAb	EPR6539	Intracellular	Q9NR16	J9T9K7	55%	NEG	Cell–cell interaction
CD1a	5	IgG1	O10	unknown	P06126	A0ZPR3	63%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD2	11	IgG1	TS2/18	unknown	P06729	F1SAX9	60%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD20	5	IgG2a	L26	Intracellular (aa 1–56; aa 106–120; aa 210–297)	P11836	I3LDX9	73%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD23	5	IgG1	DAK-CD23	aa 48–248	P06734	B8YM31	64%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD271 (NGF-R p75)	1	Rb mAb	EP1039Y	unknown	P08138	F1RVT6	72%	POS	Receptor signaling
CD3 epsilon	5	Rb poly	poly	aa 156–168	P07766	P79264	92%	POS	Cell–cell interaction; Immun
CD30	5	IgG1	Ber-H2	unknown	P28908	F1RF73	58%	NEG	Receptor signaling
CD31	5	IgG1	JC70A	unknown	P16284	Q95242	58%	NEG	Cell–cell interaction
CD34	1	Rb mAb	EP373Y	C-term (100 aa)	P28906	K7GKN6	93%	NEG	Cell–-cell interaction
CD34	5	IgG1	QBEnd10	Class II CD34	P28906	K7GKN6	63%	NEG	Cell–cell interaction
CD4	6	IgG1	1F6	External domain	P01730	Q6R3N4	59%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD43	5	IgG1	DF-T1	unknown	P16150	D9MNC9	50%	NEG	Cell–cell interaction
CD44	10	Rb poly		aa 176–313	P16070	F1SGT4	55%	NEG	Cell–cell interaction
CD45	5	IgG1	PD726 + 2B11	multiple	P08575	Q6SZ85	43%	NEG	Receptor signaling
CD45	9	IgG1	Bra-55	Extracellular (aa 24–575)	P08575	Q6SZ85	20%	NEG	Receptor signaling
CD5	5	IgG1	4C7	External domain aa 25–372	P06127	F1RIA2	62%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD5	5	IgG1	CD5/54/F6	aa 474–495	P06127	F1RIA2	91%	POS	Cell–cell interaction; Immun
CD56	5	IgG1	123C3.D5	unknown	P13591	K7GMV4	97%	POS	Cell–cell interaction
CD57	5	IgM	TB01	unknown	Q96E93	F1SLW9	70%	POS*	Cell–cell interaction
CD68	5	IgG1	KP1	unknown	P34810	F1S4M0	72%	NEG	Cytoplasmic; misc
CD68	5	IgG3	PGM1	unknown	P34810	F1S4M0	69%	NEG	Cytoplasmic; misc
CD68	9	Rb poly	CD68 (H-255)	aa 100–354	P34810	F1S4M0	69%	POS	Cytoplasmic; misc
CD7	11	IgG1	MEM-186	unknown	P09564	M5DNE0	47%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD79a	5	IgG1	JCB117	Extracellular (aa 33–143^)	P11912	K7GM80	93%	POS (subpop)	Cell–cell interaction; Immun
CD79a	10	IgG1	HM47	aa 208–222	P11912	K7GM80	93%	POS	Cell–cell interaction; Immun
CD8 alpha	5	IgG1	C8/144B	13 C-term aa	P01732	F1SVD3	59%	NEG	Cell–cell interaction; Immun
CD99 (HBA 71)	5	IgG1	12E7	unknown	P14209	F1RQ20	37%	NEG	Cell–cell interaction
CDKN1A (p21)	11	IgG2b	CP74	aa 1–80	P38936	I3LK35	83%	NEG	Cell cycle; DNA replication
CDKN1B (p27)	11	IgG1	DCS-72.F6	aa 83–204	P46527	I3LIR2	81%	POS	Cell cycle; DNA replication
CDKN1B (p27)	11	Rb poly		C-term (100 aa)	P46527	I3LIR2	86%	POS#	Cell cycle; DNA replication
CDKN2A (p16)	9	IgG2a	F-12	unknown	P42771	Q9TSY1	55%	NEG	Cell cycle; DNA replication
CDKN2A (p16)	9	IgG2a	JC8	unknown	P42771	Q9TSY1	55%	NEG	Cell cycle; DNA replication
CDX2	1	IgG1	CDX2-88	unknown	Q99626	D0V4H7	96%	POS	TF
CEA	5	IgG1	II-7	unknown	P06731	K7GKS4	66%	NEG	Cell–cell interaction
CFTR	9	IgG1	M3A7	aa 1370–1380	P13569	Q6PQZ2	91%	NEG	Receptor signaling
Chromogranin A	5	IgG2b	DAK-A3	aa 210–439	P10645	F1SD66	72%	POS	Cytoplasmic; misc
Cleaved Caspase 3	4	Rb poly	Asp175		P42574	Q95ND5	90%	POS	Apoptosis-related
Cleaved Caspase 3	4	Rb mAb	5A1E		P42574	Q95ND5	90%	POS	Apoptosis-related
Cleaved Notch	4	Rb mAb	D3B8	Val1744	P46531	F1SB08	50%	NEG	TF
Cleaved Notch	4	Rb poly		Val1744	P46531	F1SB08	50%	NEG	TF
Cleaved PARP	4	Rb mAb	D64E10	Asp214	P09874	I3LDH3	94%	NEG	TF
CTNNB1	2	IgG1	#14	aa 571–781 (mouse)	B4DGU4	Q8WNW4	99%	POS	Cell–cell interaction
Cytokeratin-A 34BETA E12	5	IgG1	34bE12	Ker 1, 5, 10, 14	N/A	N/A	N/A	POS	Basic cytoskeletal
Cytokeratins AE1-AE3	5	IgG1 (pooled)	AE1-AE3	multiple	N/A	N/A	N/A	POS	Basic cytoskeletal
Cytokeratins 5/6	5	IgG1	D5/16 B4	unknown	N/A	N/A	N/A	POS	Basic cytoskeletal
Cytokeratins 8/18	11	IgG2a	5D3	unknown	N/A	N/A	N/A	NEG	Basic cytoskeletal
Desmin	11	IgG1	D33	unknown	P17661	P02540	98%	POS	Basic cytoskeletal
E-Cadherin	5	IgG1	NCH-38	unknown	P12830	C6EVT4	84%	POS	Cell–cell interaction
E2-2/TCF4	10	IgG2a	6H5-3	aa 31–331	P15884	F1S1Z1	99%	POS	TF
E2A/E47/TCF3	10	Rb poly	N-649	aa 1–649	P15923	F1SDI1	71%	NEG	TF
EMA	5	IgG2a	E29	APDTRP repeat on Mucin-1	P15941	F1RGR9	40%	POS¥	Cell–cell interaction
Emerin	9	Rb poly	(FL-254)	aa 3–254	P50402	I3LHY0	50%	POS	Cell cycle; DNA replication
ER alpha	5	IgG1	1D5	N-term (aa 24–575)	P03372	Q29040	92%	POS	TF
Foxp3	1	IgG1	236A/E7	unknown	Q9BZS1	Q6BBQ1	90%	NEG	TF
FRMD6	10	Rb poly		unknown	Q96NE9-3	F1SFF5	96%	POS	Cell–cell interaction
GFAP	5	Rb poly		unknown	P14136	F1RR02	93%	POS	Basic cytoskeletal
gH2AX	4	Rb mAb		phospho-epitope	N/A	N/A	N/A	POS	Apoptosis-related
gH2AX	7	IgG1	JBW301	phospho-epitope	N/A	N/A	N/A	POS	Apoptosis-related
HER2/ErbB2	5	Rb poly		unknown	P04626	K7GS43	91%	NEG	Receptor signaling
HER2/ErbB2	11	IgG1	e2-4001	intracellular (aa 676–1255)	P04626	K7GS43	94%	NEG	Receptor signaling
HER2/ErbB2	11	Rb mAb	SP3	extracellular (aa 23–652)	P04626	K7GS43	89%	NEG	Receptor signaling
HTR2B	10	Rb poly		aa 240–326	P41595	F1SMV8	91%	POS	Receptor signaling
ID1	3	Rb mAb	BCH-1/195-14	unknown	P41134	B3W6M6	91%	NEG	TF
ID2	3	Rb mAb	BCH-3/9-2-8	unknown	Q02363	Q2VIU1	98%	POS	TF
ID3	3	Rb mAb	BCH-4/17-3	unknown	Q02535	B3W6M8	96%	NEG	TF
Inhibin alpha	5	IgG2a	R1	aa 1–32	P05111	P04087	83%	POS	Cytoplasmic; misc
IRF4	1	Rb mAb	EP5699	unknown	Q15306	A0MZ86	93%	POS	TF
IRF8	10	Rb poly		aa 90–211	Q02556	Q6T5D3	88%	POS	TF
Ki-67	5	IgG1	MIB 1	aa 1101–1112 (FKELF)	P46013	I3LNN3	40%	POS	Cell cycle; DNA replication
Ki-67	8	IgG2a	UMAB107	aa 1160–1493	P46013	I3LNN3	45%	POS	Cell cycle; DNA replication
Ki-67	11	Rb mAb	SP6	C-term (150 aa)	P46013	I3LNN3	92%	NEG#	Cell cycle; DNA replication
KRT18 (Cytokeratin 18)	1	Rb mAb	EPR1626	C-term (100 aa)	P05783	F1SGG1	93%	NEG	Basic cytoskeletal
KRT18 (Cytokeratin 18)	5	IgG1	DC-10	unknown	P05783	F1SGG1	79%	NEG	Basic cytoskeletal
KRT19 (Cytokeratin 19)	9	Goat poly	M-17	C-term (mouse)	P08727	F1S0J8	84%	NEG	Basic cytoskeletal
KRT20 (Cytokeratin 20)	5	IgG2a	Ks 20.8	unknown	P35900	Q29218	75%	NEG	Basic cytoskeletal
KRT7 (Cytokeratin 7)	1	Rb mAb	EPR1619Y	N-term (200 aa)	P08729	F1SGI7	57%	POS	Basic cytoskeletal
KRT7 (Cytokeratin 7)	5	IgG1	OV-TL 12/30	unknown	P08729	F1SGI7	65%	POS	Basic cytoskeletal
MART1 (Melan A)	5	IgG1	A103	unknown	Q16655	F1SMM1	73%	NEG	Cytoplasmic; misc
MCM5	9	IgG2b	E-10	aa 1-30	P33992	I3LR86	77%	POS	Cell cycle; DNA replication
Mel-18/PCGF2	9	Goat poly	MEL-18 (C20)	C-term	P35226	F2Z5D1	99%	NEG	Cell cycle; DNA replication
MMR MLH1	5	IgG1	ES05	unknown (210 aa)	P40692	D3K5L8	91%	NEG	Cell cycle; DNA replication
MMR MSH2	11	IgG1	FE11	C-term	P43246	D3K5K3	95%	POS	Cell cycle; DNA replication
MMR MSH6	1	Rb mAb	EPR3945	C-term	P52701	I3LHZ9	91%	POS	Cell cycle; DNA replication
MMR PMS2	9	Rb poly	(C-20)	C-term (300 aa)	P54278	F1RFM9	78%	POS	Cell cycle; DNA replication
Mucin-2	9	IgG1	Ccp58	5 tandem repeats	N/A	N/A	N/A	NEG	Cell–cell interaction
Mucin-6	9	IgG1	CLH5	tandem repeats	N/A	N/A	N/A	NEG	Cell–cell interaction
MYC	1	Rb mAb	Y69	N-term	P01106	Q29031	94%	POS	TF
MYC	9	Rb poly	(N-262)	aa 1–262	P01106	Q29031	94%	POS	TF
Myeloperoxidase	5	Rb poly		unknown	P05164	K7GRV6	87%	POS	Cytoplasmic; misc
Napsin A	1	Rb mAb	EPR6257	aa 60–90	O96009	F1RH37	84%	NEG	Cytoplasmic;misc
NF Pool	5	IgG1	2F11	unknown	N/A	N/A	N/A	POS	Basic cytoskeletal
NKX2-1 (TTF-1)	5	IgG1	8G7G3/1	unknown	P43699	F1SHK3	97%	POS	TF
Pax5	6	IgG1	1EW	unknown	Q02548	F1ST83	97%	NEG	TF
Pax5	11	Rb mAb	SP34	C-term (aa 251–261)	Q02548	F1ST83	63%	POS	TF
Perforin	11	IgG1	5B10	C-term (100 aa)	P14222	F1SUB6	75%	POS	Cytoplasmic; misc
Pmel 17 (HMB 45)	5	IgG1	HMB45	unknown	P40967	Q4LE84	79%	NEG	Cytoplasmic; misc
PRDM1 / Blimp-1	4	rat IgG2a	6D3	aa 255–395 (mouse)	O75626	F1RYP9	74%	NEG	TF
PRG Progesterone receptor	5	IgG1	PGR 636	unknown	P06401	D0EWS6	85%	NEG	TF
Pro-opiomelanocortin (ACTH)	5	IgG1	02A3	aa 1–39 (N-term)	P01189	P01192	100%	NEG	Cytoplasmic; misc
Prolactin (PRL)	5	Rb poly		unknown	P01236	P01238	79%	POS	Cytoplasmic; misc
PSA	11	Rb poly		unknown	P07288	P00752	59%	NEG	Cytoplasmic; misc
PTEN	4	Rb mAb	138G6	C-term	P60484	B8XSI6	99%	POS	Receptor signaling
S-100 alpha chain	11	IgG2a	4C4.9	unknown	P23297	K7GQ84	73%	POS	Cytoplasmic; misc
S-100 alpha+beta	5	Rb poly		unknown	N/A	N/A	N/A	POS	Cytoplasmic; misc
Somatotropin (Growth hormone)	5	Rb poly		unknown	P01241	P01248	68%	POS	Cytoplasmic; misc
Synaptophysin	5	IgG1	DAK-SYNAP	C-term	P08247	F1RW46	94%	POS	Cytoplasmic; misc
TdT	5	Rb poly		unknown	P04053	F1SBG2	86%	POS	Cell cycle; DNA replication
TFF3 (intestinal trefoil factor)	9	IgG1	H-425	unknown	Q07654	Q29183	80%	POS	Cell–cell interaction
Thyroglobulin	11	Rb poly		unknown	P01266	D1KKB3	74%	POS	Cytoplasmic; misc
Thyrotropin subunit beta (TSH)	11	IgG1	ZMTS2	unknown	P01222	P01224	89%	NEG	Cytoplasmic; misc
TP53	5	IgG2b	DO-7	aa 1–45	P04637	Q9TUB2	46%	POS	Cell cycle; DNA replication
TP53	12	IgG1	Pab 1801	aa 32–79	P04637	Q9TUB2	72%	NEG	Cell cycle; DNA replication
TP63	5	IgG2a	4A4	aa 1–205 (N-term)	Q9H3D4	I3LP4	99%	POS	Cell cycle; DNA replication
TP63	9	Rb poly	H-137	aa 15–151	Q9H3D4	I3LP4	98%	POS	Cell cycle; DNA replication
TP63 p40 (DN63)	7	Rb poly		aa 5–17	Q9H3D4-2	I3LPD4	99%	POS	Cell cycle; DNA replication
Vimentin	5	IgG1	V9	unknown	P08670	P02543	98%	POS	Basic cytoskeletal
vWF (von Willebrand Factor VIII)	5	Rb poly		unknown	P04275	Q28833	75%	POS	Cytoplasmic; misc
WT1 Protein	5	IgG1	6F-H2	aa 1–181	P19544	O62651	99%	POS*	TF
ZEB1	10	Rb poly		aa 498–627	P37275	F1RWD4	84%	POS	TF

 

Semua antibodi yang tercantum berasal dari tikus, kecuali jika dinyatakan berbeda [kelinci (Rb); tikus; kambing]. Epitope tercantum jika diketahui. Perlu dicatat bahwa persentase kemiripan antara manusia dan babi dihitung untuk urutan terpendek yang diketahui untuk babi, dan untuk protein panjang penuh jika epitope tidak diketahui. Prostat dan testis ventral serta difus diperoleh dari seekor sapi jantan. Pada kolom "Diuji": *Perbedaan pada jaringan terpilih; lihat teks; #Pewarnaan non-spesifik, lihat teks. ¥Jenis sel yang berbeda yang diwarnai. Singkatan: poly, poliklonal; mAb, antibodi monoklonal; N-term, N-terminal; C-term, C-terminal; POS, positif; NEG, negatif; TF, faktor transkripsi; Immun, imunitas; misc, berbagai.

 

Urutan protein manusia dan kode yang sesuai diperoleh dengan mencari di UNIPROT (Universal Protein Resource) (www.uniprot.org) (terakhir diakses pada 24 Maret 2015, tutorial di http://www.uniprot.org/help/). Urutan ini dicari di UNIPROT untuk taksa Sus, urutan hewan diselaraskan dan diperiksa untuk tingkat kemiripannya. Selain itu, urutan manusia dalam format FASTA diselaraskan dengan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) dengan pengaturan default (terakhir diakses pada 24 Maret 2015, tutorial di ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf) untuk taksa yang dibutuhkan (manusia, babi, tikus, lainnya). Urutan ini diblas, difilter untuk spesies taksonomi, dan diselaraskan untuk memperoleh identitas persentase. Penyelarasan urutan untuk kasus yang tidak sesuai (antibodi positif / identitas rendah atau sebaliknya) ditinjau dan diperiksa secara visual. Istilah "terkonsolidasi sebagian" akan digunakan sepanjang untuk substitusi asam amino antara kelompok dengan sifat yang sangat mirip dengan penilaian >0,5 dalam matriks Gonnet PAM 250 (lihat http://www.uniprot.org/help/sequence-alignments) (Mount 2008).

 

Basis data UniProtKB/Swiss-Prot lebih diutamakan daripada entri UniProtKB/TrEMBL jika tersedia. Antibodi yang diarahkan terhadap beberapa protein (misalnya, keratin dasar) atau karbohidrat tidak dipertimbangkan untuk penyelarasan.

Kode protein dan tautannya tersedia sebagai tabel Excel tambahan (Tabel S1 Informasi Pendukung).

 

Pemodelan prediksi epitope digunakan dalam kasus terpilih dengan platform IEDB Analysis Resource (http://tools.immuneepitope.org/bcell/) (terakhir diakses pada 24 Maret 2015, tutorial di http://tools.immuneepitope.org/bcell/help/). Urutan manusia dan babi dimodelkan dengan tiga algoritma (skala aksesibilitas permukaan Emini, skala antiginitas Kolaskar dan Tongaonkar, dan Prediksi Epitope Linier BepiPred) untuk memprediksi disposisi ruang epitope dan aksesibilitasnya; yang terakhir biasanya diberi skor positif pada sumbu y. Data diimpor ke dalam spreadsheet Excel dan grafik dihasilkan untuk wilayah yang menarik.

 

Penggambaran Seluruh Lembar Virtual

Gambar sel yang diwarnai diperoleh dengan pemindai seluruh lembar Aperio CS (Leica Microsystems, Italia) pada pembesaran 20× dan 40×. Gambar pewarnaan tunggal individual dalam mikroskop cahaya diperoleh dengan perangkat lunak ImageScope (Aperio), dioptimalkan untuk kontras dengan Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA), dan dipasang dengan Adobe Illustrator.

 

HASIL

 

Kemiripan Secara Umum dan Dampaknya pada Sampel yang Diuji FFPE

 

Skor kemiripan rata-rata (rata-rata ± SD) untuk daftar lengkap protein yang dievaluasi dengan panel antibodi adalah 79,2% ± 17,4% (rentang, 20% CD45 hingga 100% aktin, BCL2), dan persentase ini dipertahankan di antara antibodi yang digunakan secara rutin untuk diagnostik manusia atau reagen yang digunakan untuk proyek penelitian. Persentase serupa dilaporkan dalam perbandingan genome-wide manusia dan babi yang lebih luas (Dawson 2012).

 

Hasil positif, yang dinilai seperti yang ditentukan, tercatat untuk 74/146 antibodi individual (50,7%). Antibodi dengan pewarnaan positif cenderung mengelompok pada kelompok target dengan kemiripan tinggi (Tabel 1).

 

Protein tempat antibodi dibuat merupakan perwakilan dari kumpulan target yang luas, heterogen dalam fungsi, dan lokalisasi seluler serta subseluler. Untuk mendapatkan wawasan apakah ada reaktivitas preferensial berdasarkan target, kami membagi target ke dalam kategori luas, dan setiap kelompok dipetakan berdasarkan tingkat kemiripan dan hasil positif atau negatif pada FFPE (Gambar 1). Seperti yang dilaporkan sebelumnya (Fang et al. 2012; Groenen et al. 2012), beberapa kelompok berkembang lebih jauh daripada yang lain selama evolusi (misalnya, molekul yang terkait dengan imun); namun, di dalam setiap kelompok, antibodi yang reaktif dengan FFPE terkait dengan tingkat kemiripan target yang lebih tinggi (Gambar 1). Tidak ada reagen sekunder yang digunakan bereaksi dengan jaringan babi (tidak ditampilkan).

 

Gambar 1. Derajat Kemiripan (manusia ke babi) versus pewarnaan FFPE menggunakan antibodi anti-manusia, yang dikategorikan berdasarkan jenis kelas protein.

Protein manusia yang menjadi sasaran antibodi dikelompokkan berdasarkan kelas-kelas luas dan dipetakan pada skala kemiripan. Di dalam setiap kelas, simbol yang lebih gelap mewakili antibodi yang mewarnai FFPE, sedangkan simbol yang lebih terang mewakili antibodi yang tidak mewarnai.

 

Spesifisitas dan Reaktivitas Diferensial untuk Jaringan Manusia versus Babi

Korelasi antara derajat kemiripan dan pewarnaan positif pada material yang diawetkan (Gambar 1) disertai dengan distribusi pewarnaan yang umumnya sangat terkonsolidasi pada tingkat seluler dan subseluler (dengan beberapa pengecualian, lihat di bawah) (lihat contoh dalam Informasi Pendukung Gambar S1).

 

Empat dari 74 antibodi yang mewarnai positif (5,4%) menunjukkan reaktivitas tambahan atau kekurangan beberapa jenis sel yang diwarnai dalam perbandingan manusia-babi. Hal ini digambarkan pada Gambar 2 hingga 4. Hasil ini direplikasi pada irisan beku (tidak ditampilkan).

 

Gambar 2. Reaktivitas diferensial untuk antibodi anti-manusia pada jaringan babi.

(A, B) CD57 mewarnai sel T pembantu folikuler di amandel manusia (A), tetapi tidak pada jaringan babi (B). Sel saraf babi di pleksus Auerbach diwarnai (gambar kecil).

(C, D) Tumor Wilms 1 (WT1) mewarnai sitoplasma dan inti sel (panah) pada glomerulus ginjal manusia (C), tetapi hanya inti sel yang diwarnai pada ginjal babi (D). Skala, 100 µm.

 

Gambar 4. Antibodi CDKN1B (p27) mewarnai kompartemen yang berlawanan pada timus babi.

Timus babi (A, B, dan C), kelenjar getah bening (D, E, dan F), dan amandel manusia (G, H, dan I) diwarnai dengan antibodi Ki-67 MIB 1 (A, D, dan G), antibodi anti-p27 dari tikus (B, E, dan H), dan antibodi anti-p27 dari kelinci (C, F, dan I). Perhatikan pola pewarnaan yang berlawanan dari reagen tikus (B) dan kelinci (C) pada timus. Pada jaringan perifer babi dan manusia, sel-sel pusat germinal yang berkembang biak tidak terwarnai. Perhatikan intensitas pewarnaan yang terbalik dari kedua antibodi anti-p27 dengan jaringan babi dan manusia. Pewarnaan ganda untuk Ki-67 dan kedua antibodi anti-p27 menunjukkan bahwa kortikotimosit yang berkembang biak diberi label secara eksklusif oleh antibodi kelinci dan terekspresi bersama CDKN1B dengan reagen tikus; ekspresi bersama ini adalah distribusi yang diharapkan (Nagahama et al. 2001). Skala, 100 µm.

 

Gambar 3. Pola pewarnaan heterogen dari antibodi anti-manusia pada babi.

(A) Antibodi CD79a HM57 mewarnai limfosit yang tersebar di medula timus babi dan semua sel B nodus limfa (inset).

(B) Antibodi CD79a JCB11 mewarnai limfosit yang tersebar di medula timus babi tetapi tidak ada yang mewarnai di nodus limfa (inset).

(C) Antibodi Ki-67 SP6 mewarnai nukleus pada pleksus saraf Auerbach.

(D, E) Nukleus yang sama tidak terwarnai dengan antibodi anti-Ki-67 MIB 1 (D) dan antibodi anti-MCM5 dari tikus (E).

(F, G) Antibodi Ki-67 SP6 mewarnai dengan lemah nukleus yang berkembang biak di nodus limfa babi (F) tetapi mewarnai dengan kuat pada amandel manusia (G). Urutan 250-aa pada C-terminal dari Ki-67 manusia setelah 16 motif berulang (imunogen untuk monoklonal ini) memiliki kesamaan kurang dari 40% dengan pasangan babi. Skala, 100 µm.

 

Penggunaan Kontrol Diagnostik IHC pada Jaringan Babi

Babi dapat menjadi sumber kontrol eksternal positif yang nyaman untuk antibodi diagnostik penting. Kami fokus pada target-target yang penting untuk diagnostik atau terapi dan sulit untuk distandarisasi dalam skema QC. Sekitar setengah dari antibodi diagnostik manusia yang digunakan secara rutin, termasuk antibodi terhadap ER, MYC, dan Ki-67 (Gambar S1 Informasi Pendukung), ditemukan mewarnai jaringan FFPE babi dengan cara yang identik dengan jaringan manusia.

 

Selanjutnya, kami fokus pada antigen untuk mana tidak ada jaringan normal yang saat ini digunakan sebagai kontrol. Protein anaplastic lymphoma kinase (ALK) diekspresikan secara abnorma pada kanker hematolymphoid dan tumor padat, di mana lesi genetik menyebabkan overekspresi (Roskoski 2013). Selain itu, ALK telah terbukti diekspresikan sebagai transkrip di usus kecil manusia (Morris et al. 1994; Tennstedt et al. 2014) dan sebagai protein di sistem saraf pusat dan pons (Pulford et al. 1997). Repositori publik data cDNA microarray (BioGPS, http://biogps.org) (terakhir diakses pada 2 Oktober 2014) melaporkan ekspresi ALK pada jaringan adrenal (GeneAtlas U133A, gcrma; probe 208212_s_at), pada astrosit (Primary Cell Atlas; probe 208212_s_at) dan secara heterogen pada tingkat rendah di jaringan normal, termasuk otak (Barcode pada jaringan normal).

 

Kami menguji empat antibodi berbeda pada tiga sampel usus kecil manusia dan satu sampel usus kecil babi; korteks otak babi, batang otak, dan serebelum; serta adrenal babi dan sapi dan gagal mendeteksi sinyal spesifik untuk ALK. Alasan mengapa gen ALK ditranskripsi, tetapi tidak diterjemahkan pada jaringan dewasa normal masih belum diketahui.

 

Demikian pula, kami tidak dapat mendeteksi sinyal Her2 dengan tiga antibodi pada payudara dan jantung babi, yang berbeda dari yang dilaporkan pada manusia (Fuchs et al. 2003).

 

Pemetaan Epitope antar Spesies

Untuk 84 antibodi, seluruh epitope telah dipetakan, daerah yang diidentifikasi secara lebih luas (C- atau N-term) atau epitope dapat disimpulkan dari peptida imunisasi: Kami menganggap kelompok ini informatif. Empat puluh empat antibodi dalam kelompok ini mengenali bahan FFPE, signifikan untuk target di atas batas kesamaan 60% (40/70 ≥60% mirip vs 4/14 <60%; Chi square p= 1.66×10-9): Ini dapat mewakili ambang batas yang berguna untuk mengidentifikasi antibodi positif pada bahan FFPE antar spesies.
Untuk memperoleh wawasan tentang substitusi asam amino dalam epitope, kami memilih dan memeriksa kelompok kecil antibodi yang epitope-nya relatif pendek (kurang dari 24 aa; Gambar 5). Semua urutan non-identik yang membawa substitusi asam amino yang terkonservasi memungkinkan pengikatan antibodi spesifik manusia. Epitope CD8, yang memiliki banyak substitusi asam amino yang tidak terkonservasi (Gambar 5), tidak. Dengan demikian, komposisi linier dari epitope yang tahan terhadap FFPE akan memungkinkan perubahan dalam urutan sepanjang perubahan tersebut terkonservasi sepenuhnya atau sebagian.

 

Gambar 5. Komposisi epitope dari enam antibodi anti-manusia yang positif pada bahan swine yang difiksasi dengan formalin dan disematkan dalam parafin (FFPE).

Penyusunan urutan manusia (tebal, atas) dan urutan babi (terang, bawah) untuk enam epitop protein ditampilkan, dengan nama antibodi di atas setiap penyusunan urutan. Posisi asam amino pertama dalam urutan manusia dilaporkan di kiri atas. Epitope CD79a/JCB117 dibagi menjadi dua bagian untuk alasan grafis. Satu-satunya antibodi yang memberi pewarnaan negatif adalah CD8. Kotak menunjukkan substitusi yang tidak terkonservasi. Legenda diambil dari http://www.uniprot.org/help/sequence-alignments dan http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/help/faq.html#24. Tampilan urutan kode warna diperoleh dengan penyusunan urutan menggunakan Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) (terakhir diakses pada 24 Maret 2015).

 

Tiga antibodi yang positif pada FFPE, untuk mana tingkat kesamaan targetnya di bawah 60% dan diperkirakan negatif, selanjutnya diselidiki, mengungkapkan kemungkinan reaktivitas silang dengan protein-protein yang memiliki fungsi biologis yang sama.

 

Keratin 7 tidak memiliki urutan homolog langsung pada babi; homolog terdekat adalah Keratin 75 (identitas 65%, cakupan 85%), dan antibodi tersebut memberi label pada epitel bertingkat tetapi juga pada sel-sel lapisan mesotelium limpa, konsisten dengan keratin dan mirip dengan pewarnaan keratin manusia 7.

 

Tidak ditemukan urutan babi yang dekat dengan Emerin manusia melalui pencarian BLAST, meskipun pola pewarnaan identik. Namun, urutan manusia memiliki homologi cakupan rendah 50% dengan protein babi yang memiliki distribusi membran nuklir serupa, Protein Membran Nuklir Dalam Man1, yang sendiri 93% mirip dengan pasangan manusia (Informasi Pendukung Gambar S1); reaktivitas silang dengan Man1 babi mungkin menjelaskan pola pewarnaan imun yang identik.

 

Antibodi anti-EMA (Muc-1) yang kami gunakan (E29) diarahkan terhadap epitop APDTRP (Price et al. 1998), sensitif terhadap glikosilasi, dan tersebar luas: Antibodi ini tidak mewarnai sel epitel tetapi secara positif mengidentifikasi sel mononuklear yang jarang. Kami mengklasifikasikannya sebagai positif; namun, jenis antigen dan distribusi jaringan yang berbeda pada babi menunjukkan reaktivitas silang melalui glikosilasi yang mirip dari protein yang tidak berhubungan.

 

Tidak ditemukan representasi preferensial jenis antibodi (poliklonal, monoklonal kelinci, isotipe tikus) pada pengikat dengan kesamaan rendah dalam kelompok ini.

 

Di antara antibodi yang negatif pada bahan FFPE babi, antibodi CD20 L26 diarahkan terhadap bagian sitoplasmik yang tidak terdefinisi dari protein MS4A1; tiga bagian sitoplasmik protein tersebut, aa 1–56, 106–120, dan 210–297, masing-masing memiliki kesamaan 75%, 60%, dan 81% dengan MS4A1 babi. Syndecan-1 (CD138), yang menunjukkan 77% kesamaan antara manusia dan babi, memiliki kesamaan lebih rendah (67%) pada domain ekstodomain aa 100–140, wilayah di mana antibodi MI15 dan B-B4 bersaing untuk pengikatan (Dore et al. 1998).

 

Antibodi yang mewarnai jaringan manusia mungkin tidak mengenali jaringan FFPE babi jika antibodi tersebut diarahkan terhadap epitop konformasional yang terbatas pada babi, yang tidak bertahan pada proses fiksasi dan penyematan, atau karena epitop tersebut hilang sama sekali. Irisan beku dari bahan yang tidak difiksasi seharusnya menyediakan epitop dalam bentuk asli dan dengan demikian memungkinkan penyelidikan mengenai alasan mengapa kelompok reagen ini tidak mewarnai bahan babi yang diperlakukan secara rutin. Untuk tujuan ini, 19 antibodi diuji: semuanya negatif pada bahan FFPE, 13 diarahkan pada protein dengan ≥75% kesamaan, dan 3 digunakan sebagai kontrol positif. Antibodi-antibodi ini diuji pada iris beku dari usus kecil babi (Tabel Informasi Pendukung 1). Hanya 3 antibodi dari 19 yang bereaksi positif: anti-Keratin 20, anti-cleaved PARP, dan anti-BCL6 klon PGB6p.

 

Perbandingan Proyeksi Epitope antara Manusia dan Babi Persentase kesamaan mentah dari urutan linier epitope babi yang sebanding dengan epitope manusia mungkin tidak sepenuhnya menjelaskan pengikatan antibodi yang dibuat terhadap mamalia lain. Untuk menjelaskan lebih lanjut kondisi pengikatan antibodi anti-manusia pada jaringan babi, 13 urutan yang diidentifikasi oleh tujuh antibodi negatif dan lima antibodi positif (sebagai kontrol) digambarkan dan dibandingkan menggunakan algoritma prediksi epitope linier. Tujuh urutan terbatas pada manusia dipilih di antara yang memiliki kesamaan 70% atau lebih dan lebih pendek dari 24 asam amino. Lima dari tujuh antibodi negatif menunjukkan perbedaan yang nyata dalam konformasi urutan antigen linier pada babi dengan setidaknya satu metode pemodelan (Gambar 6). Hal ini tidak terlihat pada antibodi yang menunjukkan pewarnaan positif. Sebelas pengulangan Ki-67 yang diketahui pada manusia dan pada babi disusun, meskipun ada penggantian asam amino yang sebagian terkonservasi pada babi (Gambar 5).

 

Gambar 6. Prediksi epitope untuk 13 urutan dari 7 antibodi negatif dan 5 antibodi positif pada pewarnaan.

Skor asam amino (aa) individual yang diperoleh dengan dua algoritma (BepiPred: garis kontinu; Emini: garis putus-putus) untuk setiap urutan target antibodi diplot pada sumbu-y untuk urutan manusia (hitam) dan babi (abu-abu). Untuk kejelasan grafik, dua skala yang berbeda (kiri dan kanan) kadang-kadang digunakan dalam grafik yang sama untuk setiap model. Arah panah pada sumbu-y menunjuk pada nilai 0, di atasnya algoritma memprediksi epitope (lihat Informasi Pendukung untuk plot individual). Setiap nomor posisi asam amino terdaftar pada sumbu-x. Nama antibodi dan klon, urutan asam amino target manusia, serta hasil pewarnaan (+ atau -) terdaftar di bagian atas setiap grafik. Sebelas skor BepiPred untuk pengulangan Ki-67 diplot dengan menyelaraskan urutan dodekapeptida manusia dan babi yang bersesuaian, yang dibatasi dengan 13 asam amino dan ruang kosong untuk rendering grafis. Bintang terbuka menunjukkan area perbedaan yang signifikan antara manusia dan babi dengan setidaknya satu model prediksi. Dua baris teratas menggambarkan antibodi negatif pada bahan FFPE dan bahan beku babi: pada semua kecuali tiga (CD20 AA 106-120, CFTR, POMC), perubahan konformasi yang signifikan pada babi dapat menyoroti urutan yang tidak dapat diakses oleh pasangan babi. Dua baris terbawah menggambarkan antibodi yang positif pewarnaannya. Perubahan konformasi pada N-terminus dari epitope CDKN1A dan CD79a-JB117 mungkin tidak mempengaruhi pengikatan pada urutan yang tersisa. Perhatikan bahwa urutan target Ki-67 yang dikenal FKELF, di pusat setiap pengulangan, memiliki skor negatif dengan model BepiPred. Skor yang diperoleh dengan skala antigenisitas Kolaskar dan Tongaonkar tidak ditampilkan karena ini hanya ditemukan berguna dalam beberapa kasus. Kekosongan urutan dan urutan terminal yang hilang dengan algoritma Emini ditunjukkan. Urutan sitoplasma CD20 aa 210–297, yang tidak informatif, tidak ditampilkan.

 

Karena algoritma prediksi tidak dapat sepenuhnya menjelaskan kegagalan pengikatan beberapa epitop yang sangat homolog, kami meninjau kembali detail urutan, dimulai dengan motif anti-Ki-67 MIB 1, yang dikenali pada manusia, babi, anjing, tetapi tidak pada tikus atau mencit (Endl dan Gerdes 2000). Algoritma BepiPred berhasil menyelaraskan motif anti-Ki-67 manusia, babi, dan tikus (Informasi Pendukung Gambar S2). Namun, pemeriksaan urutan-urutan ini mengungkapkan adanya urutan asam amino yang tidak terkonservasi pada motif tikus dan mencit yang tidak terdapat pada motif babi atau anjing yang bersesuaian. Substitusi asam amino yang tidak terkonservasi ini dekat dengan inti pusat motif, dan telah dijelaskan sebagai merugikan pengikatan antibodi anti-Ki-67 ini (Kubbutat et al. 1994). Oleh karena itu, perubahan asam amino yang diketahui mengubah pengenalan epitope, seperti yang ditunjukkan oleh pemindaian peptida, mungkin tidak diperhitungkan oleh algoritma yang kami gunakan.

 

Pemeriksaan ulang terhadap penyelarasan asam amino untuk dua epitop yang sangat homolog menunjukkan tiga substitusi asam amino yang tidak terkonservasi pada Proopiomelanokortin (POMC) babi dalam 8 asam amino pertama dan satu pada aa 23. Namun, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), yang juga tidak menunjukkan pewarnaan positif pada babi, hanya memiliki satu substitusi yang sebagian terkonservasi dalam epitop 10-asam amino dan profil yang tidak informatif dengan algoritma (Gambar 6 dan Informasi Pendukung).

 

Dengan demikian, selain substitusi asam amino yang tidak terkonservasi, ada faktor lain yang tidak diketahui yang menghalangi pengikatan antibodi spesifik manusia pada epitop FFPE babi dan ini tidak dapat diprediksi sepenuhnya oleh algoritma yang tersedia.

 

Untuk 62 antibodi, tidak tersedia spesifisitas epitope, antibodi ini diarahkan terhadap determinan yang dibagi oleh dua atau lebih protein (misalnya keratin asam), atau antibodi poliklonal yang dibangkitkan terhadap antigen campuran (misalnya S-100). Kelompok reagen ini oleh karena itu dianggap tidak informatif untuk bagian analisis epitope dari penelitian, kecuali untuk berkontribusi pada tren antibodi yang lebih memilih menandai target dengan kesamaan yang lebih tinggi: hanya 3 dari 23 antibodi yang positif pada jaringan babi diarahkan pada target yang memiliki kesamaan kurang dari 70% (p Chi square = 0,022).

 

PEMBAHASAN

 

Dengan menggunakan variasi asam amino yang terjadi secara alami yang diperkenalkan selama evolusi pada spesies terkait, kami menunjukkan bahwa antibodi dapat mentolerir substitusi asam amino yang sebagian terkonservasi tetapi gagal untuk menandai urutan yang hampir identik yang mengandung perubahan halus dalam aksesibilitas epitope atau menunjukkan substitusi yang tidak terkonservasi. Pemahaman ini dapat dipahami apabila informasi yang cukup terperinci mengenai epitope yang diduga tersedia. Hasil ini sebelumnya hanya diperoleh secara in vitro dengan pemindaian peptida sintetis (Geysen et al. 1984; Kubbutat et al. 1994). Dimulai dengan reaktivitas pada bahan FFPE manusia—yang dianggap sebagai status "default" (yaitu 100% pewarnaan, 100% spesifik)—kami menghasilkan katalog informasi yang diterapkan pada setiap antibodi yang diterapkan pada jaringan FFPE babi secara umum dan pada antibodi yang spesifik untuk FFPE secara keseluruhan.

 

Antibodi yang Tahan Terhadap FFPE Sebagian Besar Dapat Ditafsirkan Dengan Model Epitope Linear dan Mengakomodasi Variasi Epitope

 

Epitope bisa bersifat linear atau kontinu. Karena kami menerapkan pemodelan epitope, yang mengasumsikan komposisi linear, dan kami menemukan bahwa model ini dapat menafsirkan reaktivitas jaringan dari antibodi, temuan kami memperkuat asumsi bahwa antibodi ini sebagian besar mengenali epitope linear pada jaringan babi dan, sebagai perpanjangan, pada jaringan manusia yang tetap dan terbenam. Usulan bahwa antigen FFPE bersifat linear telah dibuat sebelumnya; semua antigen ini bertahan dalam pemrosesan FFPE, panas tinggi selama pemulihan antigen (AR), dan bahkan perlakuan dengan 2-merkaptoetanol dan SDS (Gendusa et al. 2014), dan oleh karena itu tahan terhadap denaturasi. Antibodi yang tahan terhadap FFPE dibuat terhadap peptida sintetis (Jones et al. 1993; Mason et al. 1989) atau antigen yang terdenaturasi (Wang et al. 2005), yang merupakan indikasi lain bahwa mereka mendeteksi epitope kontinu linear, bukan yang bergantung pada konformasi, discontinuous (Barlow et al. 1986; Fowler et al. 2011; Kringelum et al. 2013).

 

Untuk beberapa antibodi, urutan imunogeniknya sudah diketahui. Antibodi dalam kelompok ini mengikat target dengan kesamaan keseluruhan serendah 60%. Ini menunjukkan bahwa antibodi yang dipilih untuk bereaksi pada jaringan FFPE memungkinkan variasi cukup besar dalam komposisi urutan target, mengingat skor yang diperoleh berasal dari perhitungan matriks untuk substitusi asam amino individual, bukan rasio identik/tidak identik yang sederhana.

 

Beberapa epitope, yang diselaraskan dengan sempurna menurut algoritma dan sangat mirip dengan manusia, tidak terdeteksi pada bahan FFPE atau beku babi: Kami tidak memiliki penjelasan yang baik untuk pengamatan ini. Penyambungan alternatif bisa menjadi salah satu penjelasan, tetapi basis data genom babi tidak memiliki cukup informasi untuk menyelidiki kemungkinan ini lebih lanjut. Modifikasi protein pasca-transkripsi atau kompleks dengan protein lain bisa menjadi penyebabnya; pewarnaan mosaik oleh antibodi CD79a JCB117 bisa menjadi contoh yang baik.

 

Satu alasan tambahan terakhir untuk reaktivitas antibodi yang berbeda pada bahan FFPE manusia dan babi mungkin adalah idiosinkrasi paratope untuk lingkungan pengikatan unik, yang tidak terdeteksi oleh alat pemodelan yang masih tidak tepat (Ponomarenko dan Bourne 2007). Sebagian urutan pengikatan yang dibutuhkan mungkin terletak pada loop protein yang berdekatan, seperti yang ditunjukkan untuk beberapa antibodi terapeutik (de Weers et al. 2011); perubahan spesifik babi pada urutan ini bisa menghalangi pewarnaan FFPE.

 

Untuk alasan ini, akan sangat sulit untuk memprediksi apakah antibodi anti-manusia akan mengikat mamalia terkait, kecuali dengan membuat perkiraan yang terinformasi berdasarkan kesamaan urutan epitop dan mewarnai jaringan.

 

Kami mengesampingkan kondisi AR yang suboptimal untuk pewarnaan negatif, karena beberapa target protein yang sangat mirip (>80%) seperti CD34, Keratin Sitokeratin, Mucin, Napsin A, dan Reseptor Progesteron, tetap negatif meskipun diekspresikan dalam jumlah banyak dan dapat dideteksi bahkan tanpa AR.

 

Urutan epitop bertahan setelah fiksasi, penyematan, dan AR, yang membalikkan banyak ikatan kimia yang dipicu oleh formalin yang menghalangi akses antibodi ke epitop. Tidak semua ikatan dapat diselesaikan; di antaranya mungkin terdapat ikatan yang lebih stabil akibat dehidrasi (Fowler et al. 2008), seperti yang terlihat pada target FFPE-proof manusia yang hanya terdeteksi pada irisan beku pada babi. Menariknya, hanya satu dari tiga antibodi yang dibuat terhadap setengah bagian N-terminal protein BCL6 yang sensitif terhadap fiksasi pada babi, yang semakin mengisyaratkan bahwa ikatan stabil yang tidak terpengaruh AR memiliki efek lokal tetapi tidak memodifikasi situs pengikatan tetangga atau konformasi urutan antigenik keseluruhan BCL6 N-terminal babi, yang memberikan petunjuk lebih lanjut tentang linearitas epitop FFPE.

 

Jaringan Babi Bisa Menjadi Sumber Material Referensi FFPE untuk Kontrol Kualitas Manusia

 

Tidak satu pun dari 146 antibodi yang diuji menghasilkan pewarnaan "latar belakang" atau non-spesifik; hanya empat dari 74 antibodi yang menghasilkan pewarnaan jaringan atau sel yang dapat diklasifikasikan sebagai berbeda secara substansial dari jaringan manusia, yaitu EMA, WT1, CD57, dan antibodi Ki-67 SP6. Spesifisitas pewarnaan sitoplasmik WT1 pada sel endotel manusia telah dibahas (Carpentieri et al. 2002), dan tidak ditemukan pada jaringan babi, yang mengisyaratkan bahwa pewarnaan sitoplasmik tersebut adalah spurious. Pewarnaan non-spesifik (sitoplasmik) antibodi Ki-67 pada sel non-manusia telah dijelaskan sebelumnya (Falini et al. 1989).

 

Untuk sebagian besar antibodi yang menunjukkan pewarnaan positif, jaringan babi memberikan pola pewarnaan histologis dan imunohistokimia yang identik dengan jaringan manusia.

 

Jaringan babi dari rumah pemotongan hewan dengan demikian menjadi material mirip manusia yang dapat digunakan sebagai jaringan kontrol eksternal dan hampir di mana-mana, murah, dapat dipertukarkan secara bebas, serta bebas dari kendala etis yang membatasi penggunaan jaringan manusia. Ini sangat penting untuk organ penting (otak, batang otak, jantung) atau jaringan kecil (kelenjar endokrin, ganglia) yang tidak sering tersedia dalam jumlah yang cukup sebagai jaringan kontrol manusia yang sehat. Selain itu, jaringan babi dapat digunakan untuk menstandarisasi deteksi target yang dimodifikasi terapi (misalnya, reseptor estrogen (Sierralta dan Thole 1996), MYC (Kluk et al. 2012)) dalam praktik sehari-hari untuk antibodi yang terbukti mewarnai babi.

 

Antibodi yang diarahkan terhadap protein yang bermutasi (V600E BRAF (Capper et al. 2011), R132H IDH1 (Capper et al. 2010)), patogen (EBV, KSHV, TB, dan lainnya) atau protein yang diekspresikan berlebihan karena modifikasi genetik spesifik tumor (misalnya, pertukaran promotor oleh translokasi kromosom untuk ALK atau amplifikasi gen untuk Her2) masih memerlukan jaringan patologi manusia atau blok sel dari garis sel yang dikultur. Untuk beberapa antigen yang secara struktural lebih berbeda selama evolusi (CD30, reseptor imun (Dawson 2012)), baik taksa yang berbeda dapat diselidiki atau jaringan manusia masih dibutuhkan.

 

Sejumlah kecil antibodi yang mengenali jaringan FFPE babi menunjukkan reaktivitas berbeda yang substansial, yang membenarkan dalam beberapa kasus tersebut kekhawatiran tentang monospecificity antibodi tersebut, yang patut diselidiki lebih lanjut. Sebaliknya, spesifisitas sebagian besar reagen yang tersisa yang saat ini digunakan untuk diagnosis pada sampel manusia, yang mengakomodasi variasi epitop setidaknya 50% dari waktu, adalah temuan yang menggembirakan; antibodi ini dapat digunakan pada target yang kadang-kadang bermutasi secara besar, seperti melanoma dan kanker paru-paru (Schumacher dan Schreiber 2015), karena mutasi non-sinonim. Saat kami menambahkan lebih banyak antibodi yang diuji pada kedua spesies, kami terus menemukan antibodi yang dapat diandalkan dan, jarang, pewarnaan yang mencurigakan atau tak terduga (data tidak ditampilkan).

 

Tidak setiap produsen merinci spesifisitas epitop yang menjadi sasaran antibodi, sering kali karena dianggap sebagai informasi yang bersifat kepemilikan, meskipun banyak bukti yang menunjukkan bahwa, untuk satu imunogen, ada berbagai epitop individu unik, yang masing-masing dikenali oleh antibodi monoklonal atau antiserum (Geysen et al. 1984). Namun, kami telah menunjukkan bahwa ketersediaan informasi tersebut dapat membantu dalam memilih satu reagen dibandingkan yang lain untuk penggunaan lintas spesies atau untuk studi validasi (Bordeaux et al. 2010; Smith dan Womack 2014). Idealnya, lembar data yang menyertai vial antibodi harus memuat urutan imunogen lengkap dan informasi mengenai apakah antibodi tersebut mengenali jaringan mamalia FFPE selain manusia, yang sebaiknya dapat diperoleh dari rumah pemotongan hewan.

 

REFERENSI

 

1.Barlow DJ, Edwards MS, Thornton JM. (1986). Continuous and discontinuous protein antigenic determinants. Nature 322:747-748.

2.Battifora H. (1986). The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest 55:244-248.

3.Bordeaux J, Welsh A, Agarwal S, Killiam E, Baquero M, Hanna J, Anagnostou V, Rimm D. (2010). Antibody validation. Biotech 48:197-209.

4.Bradbury A, Plückthun A. (2015). Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature 518:27-29.

5.Brodersen R, Bijlsma F, Gori K, Jensen KT, Chen W, Dominguez J, Haverson K, Moore PF, Saalmüller A, Sachs D, Slierendrecht WJ, Stokes C, Vainio O, Zuckermann F, Aasted B. (1998). Analysis of the immunological cross reactivities of 213 well characterized monoclonal antibodies with specificities against various leucocyte surface antigens of human and 11 animal species. Vet Immunol Immunopathol 64:1-13.

6.Capper D, Preusser M, Habel A, Sahm F, Ackermann U, Schindler G, Pusch S, Mechtersheimer G, Zentgraf H, von Deimling A. (2011). Assessment of BRAF V600E mutation status by immunohistochemistry with a mutation-specific monoclonal antibody. Acta Neuropathol 122:11-19.

7.Capper D, Sahm F, Hartmann C, Meyermann R, von Deimling A, Schittenhelm J. (2010). Application of mutant IDH1 antibody to differentiate diffuse glioma from nonneoplastic central nervous system lesions and therapy-induced changes. Am J Surg Path 34:1199-1204.

8.Carpentieri DF, Nichols K, Chou PM, Matthews M, Pawel B, Huff D. (2002). The expression of WT1 in the differentiation of rhabdomyosarcoma from other pediatric small round blue cell tumors. Mod Pathol 15:1080-1086.

9.Chianini F, Majó N, Segalés J, Dominguez J, Domingo M. (2001). Immunohistological study of the immune system cells in paraffin-embedded tissues of conventional pigs. Vet Immunol Immunopathol 82:245-255.

10.Dawson H. (2012). A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. In, CRC Press, 323-342.

11.de Weers M, Tai Y-T, van der Veer MS, Bakker JM, Vink T, Jacobs DCH, Oomen LA, Peipp M, Valerius T, Slootstra JW, Mutis T, Bleeker WK, Anderson KC, Lokhorst HM, van de Winkel JGJ, Parren PWHI. (2011). Daratumumab, a novel therapeutic human CD38 monoclonal antibody, induces killing of multiple myeloma and other hematological tumors. J Immunol 186:1840-1848.

12.Debeer S, Le Luduec J-B, Kaiserlian D, Laurent P, Nicolas J-F, Dubois B, Kanitakis J. (2013). Comparative histology and immunohistochemistry of porcine versus human skin. Eur J Dermatol 23:456-466.

13.Dore JM, Morard F, Vita N, Wijdenes J. (1998). Identification and location on syndecan-1 core protein of the epitopes of B-B2 and B-B4 monoclonal antibodies. FEBS Lett 426:67-70.

14.Driessen A, Van Ginneken C, Creemers J, Lambrichts I, Weyns A, Geboes K, Ectors N. (2002). Histological and immunohistochemical study of the lymphoid tissue in the normal stomach of the gnotobiotic pig. Virchows Archiv 441:589-598.

15.Endl E, Gerdes J. (2000). The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. Exp Cell Res 257:231-237.

16.Faldyna M, Samankova P, Leva L, Cerny J, Oujezdska J, Rehakova Z, Sinkora J. (2007). Cross-reactive anti-human monoclonal antibodies as a tool for B-cell identification in dogs and pigs. Vet Immunol Immunopathol 119:56-62.

17.Falini B, Flenghi L, Fagioli M, Stein H, Schwarting R, Riccardi C, Manocchio I, Pileri S, Pelicci PG, Lanfrancone L. (1989). Evolutionary conservation in various mammalian species of the human proliferation-associated epitope recognized by the Ki-67 monoclonal antibody. J Histochem Cytochem 37:1471-1478.

18 Fang X, Mou Y, Huang Z, Li Y, Han L, Zhang Y, Feng Y, Chen Y, Jiang X, Zhao W, Sun X, Xiong Z, Yang L, Liu H, Fan D, Mao L, Ren L, Liu C, Wang J, Li K, Wang G, Yang S, Lai L, Zhang G, Li Y, Wang J, Bolund L, Yang H, Wang J, Feng S, Li S, Du Y. (2012). The sequence and analysis of a Chinese pig genome. GigaScience 1:16.

19.Fitzgibbons PL, Bradley LA, Fatheree LA, Alsabeh R, Fulton RS, Goldsmith JD, Haas TS, Karabakhtsian RG, Loykasek PA, Marolt MJ, Shen SS, Smith AT, Swanson PE. (2014). Principles of Analytic Validation of Immunohistochemical Assays: Guideline From the College of American Pathologists Pathology and Laboratory Quality Center. Arch Path Lab Med 138:1432-1433.

20.Forsström B, Bisławska Axnäs B, Rockberg J, Danielsson H, Bohlin A, Uhlén M. (2015). Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes. PLoS ONE 10:e0121673.

21.Fowler CB, Evers DL, O’Leary TJ, Mason JT. (2011). Antigen retrieval causes protein unfolding: evidence for a linear epitope model of recovered immunoreactivity. J Histochem Cytochem 59:366-381.

22.  Fowler CB, O’Leary TJ, Mason JT. (2008). Modeling formalin fixation and histological processing with ribonuclease A: effects of ethanol dehydration on reversal of formaldehyde cross-links. Lab Invest 88:785-791.

23.  Fuchs IB, Landt S, Bueler H, Kuehl U, Coupland S, Kleine-Tebbe A, Lichtenegger W, Schaller G. (2003). Analysis of HER2 and HER4 in human myocardium to clarify the cardiotoxicity of trastuzumab (Herceptin). Br Cancer Res Treat 82:23-28.

24.  Gendusa R, Scalia CR, Buscone S, Cattoretti G. (2014). Elution of High Affinity (>10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining. J Histochem Cytochem 62:519-531.

25.  Geysen HM, Meloen RH, Barteling SJ. (1984). Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. PNAS 81:3998-4002.

26.  Goldstein NS, Hewitt SM, Taylor CR, Yaziji H, Hicks DG, Standardization MoA-HCOI (2007). Recommendations for improved standardization of immunohistochemistry. In Appl Immunohistochem Mol Morphol. 124-133.

27.  Groenen MAM, Archibald AL, Uenishi H, Tuggle CK, Takeuchi Y, Rothschild MF, Rogel-Gaillard C, Park C, Milan D, Megens H-J, Li S, Larkin DM, Kim H, Frantz LAF, Caccamo M, Ahn H, Aken BL, Anselmo A, Anthon C, Auvil L, Badaoui B, Beattie CW, Bendixen C, Berman D, Blecha F, Blomberg J, Bolund L, Bosse M, Botti S, Bujie Z, Bystrom M, Capitanu B, Carvalho-Silva D, Chardon P, Chen C, Cheng R, Choi S-H, Chow W, Clark RC, Clee C, Crooijmans RPMA, Dawson HD, Dehais P, De Sapio F, Dibbits B, Drou N, Du Z-Q, Eversole K, Fadista J, Fairley S, Faraut T, Faulkner GJ, Fowler KE, Fredholm M, Fritz E, Gilbert JGR, Giuffra E, Gorodkin J, Griffin DK, Harrow JL, Hayward A, Howe K, Hu Z-L, Humphray SJ, Hunt T, Hornshøj H, Jeon J-T, Jern P, Jones M, Jurka J, Kanamori H, Kapetanovic R, Kim J, Kim J-H, Kim K-W, Kim T-H, Larson G, Lee K, Lee K-T, Leggett R, Lewin HA, Li Y, Liu W, Loveland JE, Lu Y, Lunney JK, Ma J, Madsen O, Mann K, Matthews L, Mclaren S, Morozumi T, Murtaugh MP, Narayan J, Nguyen DT, Ni P, Oh S-J, Onteru S, Panitz F, Park E-W, Park H-S, Pascal G, Paudel Y, Perez-Enciso M, Ramirez-Gonzalez R, Reecy JM, Rodriguez-Zas S, Rohrer GA, Rund L, Sang Y, Schachtschneider K, Schraiber JG, Schwartz J, Scobie L, Scott C, Searle S, Servin B, Southey BR, Sperber G, Stadler P, Sweedler JV, Tafer H, Thomsen B, Wali R, Wang J, Wang J, White S, Xu X, Yerle M, Zhang G, Zhang J, Zhang J, Zhao S, Rogers J, Churcher C, Schook LB. (2012). Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution. Nature 491:393-398.

28.  Hardy LB, Fitzgibbons PL, Goldsmith JD, Eisen RN, Beasley MB, Souers RJ, Nakhleh RE. (2013). Immunohistochemistry Validation Procedures and Practices: A College of American Pathologists Survey of 727 Laboratories. Arch Path Lab Med 137:19-25.

29.  Holmseth S, Zhou Y, Follin-Arbelet VV, Lehre KP, Bergles DE, Danbolt NC. (2012). Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. J Histochem Cytochem 60:174-187.

30.Jacobsen CN, Aasted B, Broe MK, Petersen JL. (1993). Reactivities of 20 anti-human monoclonal antibodies with leucocytes from ten different animal species. Vet Immunol Immunopathol 39:461-466.

31.Jones M, Cordell JL, Beyers AD, Tse AG, Mason DY. (1993). Detection of T and B cells in many animal species using cross-reactive anti-peptide antibodies. J Immunol 150:5429-5435.

32. Kluk MJ, Chapuy B, Sinha P, Roy A, Dal Cin P, Neuberg DS, Monti S, Pinkus GS, Shipp MA, Rodig SJ. (2012). Immunohistochemical Detection of MYC-driven Diffuse Large B-Cell Lymphomas. PLoS ONE 7:e33813.

33.  Kringelum JV, Nielsen M, Padkjær SB, Lund O. (2013). Structural analysis of B-cell epitopes in antibody:protein complexes. Mol Immunol 53:24-34.

34.  Kubbutat MH, Key G, Duchrow M, Schlüter C, Flad HD, Gerdes J. (1994). Epitope analysis of antibodies recognising the cell proliferation associated nuclear antigen previously defined by the antibody Ki-67 (Ki-67 protein). J Clin Path 47:524-528.

35.Lauweryns JM, Van Ranst L. (1987). Leu-7 immunoreactivity in human, monkey, and pig bronchopulmonary neuroepithelial bodies and neuroendocrine cells. J Histochem Cytochem 35:687-691.

36.Lauweryns JM, Van Ranst L, Lloyd RV, O’Connor DT. (1987). Chromogranin in bronchopulmonary neuroendocrine cells. Immunocytochemical detection in human, monkey, and pig respiratory mucosa. J Histochem Cytochem 35:113-118.

37.Mason DY, Cordell J, Brown M, Pallesen G, Ralfkiaer E, Rothbard J, Crumpton M, Gatter KC. (1989). Detection of T cells in paraffin wax embedded tissue using antibodies against a peptide sequence from the CD3 antigen. J Clin Path 42:1194-1200.

38.Morris SW, Kirstein MN, Valentine MB, Dittmer KG, Shapiro DN, Saltman DL, Look AT. (1994). Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin’s lymphoma. Science 263:1281-1284.

39.Mount DW. (2008). Using PAM Matrices in Sequence Alignments. CSH protocols 2008:pdb top38.

40.Nagahama H, Hatakeyama S, Nakayama K, Nagata M, Tomita K, Nakayama K. (2001). Spatial and temporal expression patterns of the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors p27Kip1 and p57Kip2 during mouse development. Anat Embryol 203:77-87.

41.Ponomarenko JV, Bourne PE. (2007). Antibody-protein interactions: benchmark datasets and prediction tools evaluation. BMC Struct Biol 7:64.

42.Price MR, Rye PD, Petrakou E, Murray A, Brady K, Imai S, Haga S, Kiyozuka Y, Schol D, Meulenbroek MF, Snijdewint FG, von Mensdorff-Pouilly S, Verstraeten RA, Kenemans P, Blockzjil A, Nilsson K, Nilsson O, Reddish M, Suresh MR, Koganty RR, Fortier S, Baronic L, Berg A, Longenecker MB, Hilgers J. (1998). Summary report on the ISOBM TD-4 Workshop: analysis of 56 monoclonal antibodies against the MUC1 mucin. San Diego, Calif, November 17-23, 1996. Tumour Biol 19 Suppl 1:1-20.

43.Pulford K, Lamant L, Morris SW, Butler LH, Wood KM, Stroud D, Delsol G, Mason DY. (1997). Detection of anaplastic lymphoma kinase (ALK) and nucleolar protein nucleophosmin (NPM)-ALK proteins in normal and neoplastic cells with the monoclonal antibody ALK1. Blood 89:1394-1404.

44.Riegman PHJ, van Veen E-B. (2011). Biobanking residual tissues. Hum Genetics 130:357-368.

45.Robb JA, Gulley ML, Fitzgibbons PL, Kennedy MF, Cosentino LM, Washington K, Dash RC, Branton PA, Jewell SD, Lapham RL. (2014). A call to standardize preanalytic data elements for biospecimens. Arch Path Lab Med 138:526-537.

46.Roskoski R., Jr (2013). Anaplastic lymphoma kinase (ALK): Structure, oncogenic activation, and pharmacological inhibition. Pharmacological Research 68:68-94.

47.Schumacher TN, Schreiber RD. (2015). Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348:69-74.

48.Shi SR, Key ME, Kalra KL. (1991). Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem 39:741-748.

49.Sierralta WD, Thole HH. (1996). Retrieval of estradiol receptor in paraffin sections of resting porcine uteri by microwave treatment. Immunostaining patterns obtained with different primary antibodies. Histochem Cell Biol 105:357-363.

50.Smith NR, Womack C. (2014). A matrix approach to guide IHC-based tissue biomarker development in oncology drug discovery. J Pathol 232:190-198.

51.Sompuram SR, Vani K, Hafer LJ, Bogen SA. (2006). Antibodies immunoreactive with formalin-fixed tissue antigens recognize linear protein epitopes. Am J Clin Pathol 125:82-90.

52.Takahashi K, Isobe T, Ohtsuki Y, Sonobe H, Takeda I, Akagi T. (1984). Immunohistochemical localization and distribution of S-100 proteins in the human lymphoreticular system. Am J Pathol 116:497-503.

53.Tanimoto T, Ohtsuki Y. (1996). Evaluation of antibodies reactive with porcine lymphocytes and lymphoma cells in formalin-fixed, paraffin-embedded, antigen-retrieved tissue sections. Am J Vet Res 57:853-859.

54.Taylor CR. (2014). Predictive biomarkers and companion diagnostics. The future of immunohistochemistry: “in situ proteomics” or just a “stain”? Appl Immunohistochem Mol Morphol 22:555-561.

55.Tennstedt P, Strobel G, Bölch C, Grob T, Minner S, Masser S, Simon R. (2014). Patterns of ALK expression in different human cancer types. J Clin Pathol 67:477-481.

56.van Veen EB, Riegman PHJ, Dinjens WNM, Lam KH, Oomen MHA, Spatz A, Mager R, Ratcliffe C, Knox K, Kerr D, van Damme B, Van De Vijver M, van Boven H, Morente MM, Alonso S, Kerjaschki D, Pammer J, Lopez-Guerrero JA, Llombart Bosch A, Carbone A, Gloghini A, Teodorovic I, Isabelle M, Passioukov A, Lejeune S, Therasse P, Oosterhuis JW. (2006). TuBaFrost 3: regulatory and ethical issues on the exchange of residual tissue for research across Europe. Eur J Cancer 42:2914-2923.

57. Wang X, Campoli M, Cho HS, Ogino T, Bandoh N, Shen J, Hur SY, Kageshita T, Ferrone S. (2005). A method to generate antigen-specific mAb capable of staining formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. J Immunol Methods 299:139-151.

 

SUMBER

Carla Rossana Scalia, Rossella Gendusa, Maria Basciu, Lorella Riva, Lorenza Tusa, Antonella Musarò, Silvio Veronese, Angelo Formenti, Donatella A’Angelo, Angela Gabriella Ronzio, Giorgio Cattoretti, Maddalena Maria Bolognesi. 2015. Epitope Recognition in the Human–Pig Comparison Model on Fixed and Embedded Material. J Histochem Cytochem. 2015 Jun 24;63(10):805–822.