Peningkatan sensitivitas diagnosis infeksi SARS-CoV-2 menggunakan uji target ganda, gen E dan RdRp

 

Hayley Colton dkk telah melaporkan tulisannya tentang sensitivitas yang ditingkatkan dengan menggunakan uji target ganda, E dan RdRp untuk diagnosis infeksi SARS-CoV-2: Pengalaman di NHS Foundation Trust yang besar di Inggris.  Mereka menyebutkan bahwa tulisan Hao et al telah menyoroti isu-isu mengenai sensitivitas pengujian real time reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) dari sampel saluran pernapasan bagian atas untuk penyakit COVID-19 ^[1].  Pengujian RT-PCR ekstensif telah menjadi kunci untuk pengambilan keputusan klinis, analisis epidemiologi dan pengembangan kebijakan saat ini selama pandemi sindrom pernafasan akut parah coronavirus 2 atau severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2).  Mayoritas tes RT-PCR menargetkan RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), envelope protein (E) atau gen nucleocapsid protein (N) ^[2]. Namun, algoritma pengujian awal dan pendapat ahli dari Pusat Eropa untuk Pencegahan dan Pengendalian Penyakit atau European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) menyarankan bahwa amplifikasi gen E dalam isolasi harus diperlakukan dengan hati-hati, karena kekhawatiran non-spesifisitas dan masalah yang berkaitan dengan kontaminasi reagen ^[3]. Pengalaman awal di Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust (Inggris) pada pasien yang diambil sampelnya secara serial dengan infeksi SARS-CoV-2 yang dikonfirmasi menunjukkan bahwa deteksi gen E tetap ada di luar deteksi RdRp, dan mungkin menawarkan peningkatan sensitivitas diagnostik. Oleh karena itu perlu eksplorasi pentingnya deteksi gen E dalam kaitannya dengan RdRp, dan dengan tidak adanya deteksi RdRp dalam evaluasi retrospektif pengujian SARS-CoV-2 RT-PCR.

 

Hayley Colton dkk mengumpulkan sampel klinis sebanyak 12.015 sampel (sampel gabungan swab hidung / tenggorokan atau saluran pernapasan bawah) diuji untuk SARS-CoV-2 sebagai bagian dari diagnosa klinis rutin antara 2 Maret 2020 dan 5 April 2020 di Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust.  Sampel diekstraksi pada platform MagnaPure96 (Roche Diagnostics Ltd, Burgess Hill, UK).  SARS-CoV-2 RNA terdeteksi pada 6μl ekstrak menggunakan target ganda (gen E dan gen RdRp) in-house PCR dengan menggunakan ABI Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, Amerika Serikat) (bahan tambahan) ^[4].  Pengujian tersebut dimodifikasi menjadi pengujian sumur tunggal multipleks dengan penambahan primer PCR untuk mendeteksi gen housekeeping, Ribonuclease P (RNAse P), yang bertindak sebagai kontrol internal dan untuk menilai kualitas sampel.

 

Dari sampel yang diuji, 2.593 sampel (21,6%) positif dengan kurva amplifikasi untuk satu atau kedua gen target.  Di antara hasil positif, ditemukan amplifikasi gen E saja menjadi umum (n = 319, 12,3%), meskipun mayoritas positif untuk target gen RdRp dan E (n = 2273, 87,7%) dan hanya 1 sampel (<0,1%) ) memiliki amplifikasi gen RdRp saja.

 

Dari kelompok E-only positif (n = 319), 69 (21,6%) sampel memiliki amplifikasi tingkat rendah pada gen E (cycle threshold (CT) ≥35) dan diselidiki lebih lanjut.  Dalam subset ini, mayoritas (n = 59, 85.5%) dianggap benar-benar positif karena mereka a) dikonfirmasi dengan uji alternatif (n = 48) atau b) sampel sebelum atau sesudahnya positif untuk E dan RdRp (n = 11) (Tabel 1).  Uji alternatif yang digunakan adalah versi modifikasi dari uji Centers for Disease Control and Prevention (CDC) yang menargetkan gen N (Micropathology Ltd, Coventry, UK) dalam banyak kasus (n = 47) atau uji RdRp alternatif (n = 1) ^[7].  Enam sampel (8,7%) tidak dapat dikonfirmasi dalam uji alternatif yang memiliki nilai CT tinggi untuk gen E (n = 4, nilai CT ≥39,0) atau memiliki kurva amplifikasi yang baik tidak mencapai ambang batas (n = 2).  Untuk lebih mengkonfirmasi keberadaan SARS-CoV-2 RNA dalam sampel dengan amplifikasi hanya gen E, 11 sampel dipilih dan berhasil menjalani sekuensing genom utuh (bahan pelengkap).  Analisis primer RdRp atau tempat pengikatan probe dalam sampel ini tidak menunjukkan ketidaksesuaian untuk menjelaskan kurangnya kepositifan RdRp RT-PCR (bahan tambahan).

 

Tabel 1. Ringkasan sampel dengan amplifikasi gen E tingkat rendah saja (CT ≥ 35).  CT, ambang batas siklus; E, gen amplop

	n	%
Dikirim untuk konfirmasi di laboratorium rujukan	54	78,26
Dikonfirmasi dengan uji alternatif	48	(88,89)
Belum dikonfirmasi	6	(11.11)
Ulangi sampel klinis positif	5	77,25
Sampel klinis sebelumnya positif	6	8,70
Dihasilkan tanpa pengujian lebih lanjut	4	5,80
Total	69

 

·     Sebagian besar sampel (n=53) diuji di Mikropathology Ltd. Conventry menggunakan uji gen SARS-CoV-2 N menggunakan Uji CDC yang dimodifikasi ^[6].  Sampel lain dikonfirmasi positif di PHE Colindale menggunakan uji alternatif RdRp SARS-CoV-2.

·     Sebagai bagian dari jaringan Penyakit Menular Akibat Tinggi, Sheffield menerima beberapa dari pasien positif pertama di Inggris Raya, yang diambil usap harian.  Amplifikasi gen E tampaknya bertahan dalam kohort ini setelah RdRp menjadi negatif.

·     Empat hasil diizinkan tanpa pengujian lebih lanjut karena probabilitas pra-uji yang tinggi, misalnya gejala yang kompatibel dengan keterpaparan rumah tangga yang dikonfirmasi terhadap SARS-CoV-2.

 

Lebih jauh telah dilakukan eksplorasi hubungan antara deteksi gen E dan deteksi gen RdRp.  Di antara sampel dengan amplifikasi gen RdRp dan gen E (n = 2273), kami menemukan bahwa nilai CT untuk target gen E secara signifikan lebih rendah daripada nilai CT untuk RdRP, dengan perbedaan rata-rata 5,8 (Paired t test, nilai p < 2.2e-16, 95% CI 5.79-5.92) (bahan tambahan).  Dalam subset sampel di mana onset gejala tersedia (145 sampel dari 128 pasien), jelas bahwa nilai CT untuk gen RdRp dan E paling rendah sekitar 48-72 jam setelah onset gejala.  Pada setiap tahap infeksi, nilai CT median untuk RdRp lebih tinggi daripada untuk gen E.

 

Hasil ambang siklus gen E dan gen RdRp dalam kaitannya dengan gejala.  Hasil amplifikasi E dan RdRp diplotkan terhadap hari timbulnya gejala pada 145 sampel dari 128 pasien.  Nilai CT terendah terlihat sekitar hari ke-3 gejala, dengan rata-rata CT RdRp lebih tinggi pada hari tertentu dibandingkan dengan nilai CT gen E.  Garis mewakili rata-rata bersyarat yang dihaluskan dengan interval kepercayaan 95% di bilah abu-abu.  E, gen amplop; RdRp, RNA-polimerase yang bergantung pada RNA

 

Dengan menggunakan target gen E selain target gen RdRp, telah diamati peningkatan diagnostik yang signifikan (11,9%). Pada satu pasien, amplifikasi gen E terdeteksi selama tiga hari setelah amplifikasi RdRp, menunjukkan kemungkinan pelebaran jendela diagnostik. Temuan ini Hayley Colton et al. mengkonfirmasi bahwa sampel klinis dengan amplifikasi hanya E tidak boleh dianggap sebagai hasil non-spesifik. Hayley Colton et al. tidak hanya dapat memperoleh seluruh urutan genom untuk SARS-CoV-2 dari subset kelompok ini, Hayley Colton et al. juga menemukan bahwa 85% dari sampel E hanya dengan nilai CT yang tinggi dikonfirmasi dengan pengujian kedua yang menargetkan gen N atau pengujian alternatif hanya RdRp.

 

Sensitivitas yang ditingkatkan terlihat untuk gen E dalam uji E-RdRP target ganda ini masih harus dijelaskan.  Terdapat  perbedaan rata-rata lebih dari lima nilai CT saat membandingkan gen E dengan nilai RdRp, yang mungkin menunjukkan kemungkinan jumlah salinan gen E yang lebih tinggi ada dalam sampel primer atau yang diekstraksi. Karena strategi transkripsi unik dari virus corona, gen menuju ujung 3' genom akan muncul dalam jumlah salinan yang lebih banyak selama replikasi virus aktif, yang dapat menjelaskan temuan ini ^[5].  Ada kemungkinan juga bahwa kondisi PCR yang dioptimalkan dalam sistem multipleks mendukung amplifikasi gen E, namun tidak ditemukan kehilangan deteksi RdRp yang signifikan saat membandingkan sistem tunggal dan multipleks selama validasi, dengan kenaikan CT yang diamati rata-rata 1-2 siklus.  Selain itu, tidak ditemukan bukti ketidakcocokan primer atau probe di wilayah RdRp.

 

Telah dipercaya pengujian target ganda, menggunakan gen E sebagai target kedua, akan membantu meningkatkan sensitivitas diagnostik dan respons klinis yang sesuai untuk pandemi ini.  Laoratorium penguji harus hati-hati mempertimbangkan penggunaan gen E sebagai target untuk mengoptimalkan diagnostik SARS-Cov-2, termasuk strategi untuk mengkonfirmasi sampel dengan amplifikasi hanya gen E seperti yang telah dijelaskan.

 

Daftar Pustaka

 

1.Hao W, Li M. Clinical features of atypical 2019 novel coronavirus pneumonia with an initially negative RT-PCR assay. J Infect. 2020; 80(6):671–693. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

2.Udugama B, Kadhiresan P, Kozlowski HN. Diagnosing COVID-19:The Disease and Tools for Detection. ACS Nano. 2020 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

3.Questions and answers regarding laboratory topics on SARS-CoV-2. Available at:https://www.ecdc.europa.eu/en/all-topics-z/coronavirus/threats-and-outbreaks/covid-19/laboratory-support/questions. Accessed 19th April.

4.Corman VM, Landt O, Kaiser M. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3) [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

5.Sawicki SG, Sawicki DL, Siddell SG. A contemporary view of coronavirus transcription. J Virol. 2007;81(1):20–29. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

6.CDC. Real-time RT-PCR Primer and Probe Information. Available at:https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html. Accessed 19th April 2020.

7.https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/emergency-use-authorizations#covid19ivd. Accessed 19th April 2020.

Sumber:

Hayley Colton, Michael Ankcorn, Mehmet Yavuz, Leeanne Tovey, Alison Cope, Mohammad Raza, Alexander J Keeley, Amy State, Bozena Poller, Matthew Parker, Thushan I de Silva, and Cariad Evans.  2020. Improved sensitivity using a dual target, E and RdRp assay for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection: Experience at a large NHS Foundation Trust in the UK.  J. Infect. May 2020.  doi: 10.1016 / j.jinf.2020.05.061.

x