Respon berbagai spesies reservoir terhadap vaksinasi rabies oral

RINGKASAN

Vaksinasi rabies oral atau oral rabies vaccination (ORV) sangat efektif pada rubah dan anjing rakun, sedangkan untuk alasan yang tidak diketahui kemanjuran (efikasi) ORV pada spesies reservoir lain kurang terlihat. Untuk menyelidiki kemungkinan variasi dalam tropisme sel spesifik spesies dan replikasi lokal virus vaksin, spesies reservoir yang berbeda termasuk rubah, anjing rakun, rakun, luwak, anjing dan sigung diimunisasi secara oral (melalui mulut) dengan virus rabies yang dilemahkan, bertiter tinggi, yang mengekspresikan GFP (RABV). Pemeriksaan imunofluoresensi dan RT-qPCR mengungkapkan perbedaan yang jelas di antara spesies yang menunjukkan batasan spesifik inang terhadap ORV. Sementara untuk spesies yang responsif, tonsil palatina (tonsilla palatina) diidentifikasi sebagai tempat utama replikasi virus, penyebaran virus yang lebih sedikit diamati pada tonsil spesies liar yang sulit dikendalikan. Sementara perbandingan tropisme virus vaksin kami menekankan peran penting yang dimainkan oleh tonsilla palatina dalam menimbulkan respons imun terhadap ORV, data kami juga menunjukkan bahwa jaringan limfoid lain mungkin memiliki peran yang lebih penting daripada yang diantisipasi semula. Secara keseluruhan, data ini mendukung model di mana kerentanan terhadap infeksi vaksin RABV hidup oral pada jaringan limfatik merupakan penentu utama dalam kemanjuran vaksinasi. Hasil saat ini dapat membantu mengarahkan penelitian di masa depan untuk meningkatkan penyerapan vaksin dan kemanjuran vaksin rabies oral di bawah kondisi lapangan.

PENGANTAR

Rabies adalah contoh utama bagaimana vaksinasi oral membantu pengendalian dan eliminasi penyakit menular dengan relevansi zoonosis atau ekonomi, terutama yang berkaitan dengan satwa liar. Pada prinsipnya, vaksinasi spesies reservoir satwa liar harus menghasilkan kekebalan kawanan di atas ambang batas di mana siklus penularan penyakit berhenti berlangsung ^1,2. Sementara rabies satwa liar di Eurasia terutama dikaitkan dengan rubah dan anjing rakun ³, di Amerika, rakun dan sigung berfungsi sebagai spesies reservoir utama dan penular penyakit yang kuat ke hewan peliharaan4. Reservoir penting lainnya di Karibia dan Afrika Selatan adalah luwak⁵.

Anjing domestik merupakan reservoir utama dan sumber penularan bagi manusia, khususnya di negara berkembang di Afrika dan Asia6. Vaksinasi oral pada anjing yang berkeliaran bebas dianggap sebagai alat pelengkap yang penting untuk meningkatkan kekebalan kawanan dan dengan demikian kemungkinan eliminasi penyakit⁷.

Efektivitas lapangan dari kampanye vaksinasi oral dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti komposisi umpan yang diisi vaksin dan strategi distribusi umpan. Komponen penting lainnya adalah penggunaan vaksin rabies oral yang manjur dan aman. Sementara kampanye vaksinasi rabies oral menggunakan vaksin yang dilemahkan atau rekombinan telah berhasil pada rubah merah (Vulpes vulpes), rubah abu-abu (Urocyon cinereoargenteus) dan coyote (Canis latrans) di Amerika Utara ^8,9,10 dan pada rubah merah dan anjing rakun (Nyctereutes procyonoides) di Eropa ^3,11, tampaknya ada kemanjuran imunisasi oral yang tidak efisien atau bervariasi pada beberapa spesies target lain ¹². Faktanya, hanya ada sedikit keberhasilan dalam vaksinasi oral rakun (Procyon lotor) dan sigung belang (Mephitis mephitis) seperti yang ditunjukkan secara eksperimental ^13,14,15,16 dan dalam aplikasi lapangan ¹⁷. Sementara titer virus vaksin efektif minimum yang relatif rendah (<10 ^8.0 unit pembentuk fokus (FFU) / mL) dibutuhkan untuk spesies responsif termasuk rubah, anjing rakun dan luwak (Herpestes auropunctatus) ^{18,19,20,21,22,23}, sigung dan rakun tampaknya agak tahan terhadap vaksinasi rabies oral, bahkan ketika titer virus yang tinggi diberikan ^{13,16,24,25,26,27,28}. Dosis yang relatif tinggi juga diperlukan untuk berhasil mengimunisasi anjing (Canis lupus familiaris) melalui rute oral ^{14,29,30,31,32,33}.

Karena saluran pencernaan akan dengan cepat menonaktifkan dan menurunkan virus rabies yang menyelubungi, virus vaksin harus diambil dalam rongga mulut untuk pengembangan respon imun ³⁴. Meskipun vaksin rabies oral telah diterapkan secara luas selama beberapa dekade terakhir, vaksin ini masih belum sepenuhnya dipahami jika dan di mana virus vaksin rabies oral bereplikasi di rongga mulut spesies target.

Cincin Waldeyer adalah susunan cincin dari organ limfoid di faring dan terdiri dari berbagai tonsil35. Secara khusus, t. palatina diasumsikan berfungsi sebagai tempat utama untuk pengambilan dan replikasi virus vaksin dan oleh karena itu, tampaknya memainkan peran penting dalam memunculkan respons imun yang efektif36. Namun, data masih jarang dan hasil yang diperoleh dari beberapa studi eksperimental bertentangan. Pada rubah dan anjing misalnya, t. Palatina terbukti terinfeksi oleh virus vaksin rabies yang dilemahkan ^36,37,38. Namun, pengamatan ini bertentangan dengan penelitian lain di mana virus vaksin rabies tidak dapat dideteksi di t. Palatina luwak India kecil39. Juga pada sigung belang, virus vaksin lebih jarang terdeteksi setelah pemberian oral dibandingkan pada rubah merah selama studi komparatif 36. Penemuan terakhir menunjukkan penyerapan yang kurang efisien atau infeksi oleh virus vaksin di t. Palatina menyebabkan kekebalan yang tidak mencukupi terhadap rabies di spesies reservoir ini ^{16,26,27,28,40,41,42.}

Dengan latar belakang keanekaragaman hayati di antara spesies reservoir untuk rabies yang melibatkan perwakilan dari famili Canidae, Procyonidae, Herpestidae, Mephitidae, Viverridae, dan Mustelidae⁴³ serta minimnya pengetahuan mengenai serapan vaksin spesifik spesies di rongga mulut, diperlukan penelitian lebih lanjut. untuk menyelidiki masuknya virus vaksin dan replikasi di t. palatina dari spesies tersebut³⁶. Oleh karena itu, dalam penelitian ini tujuan utama kami adalah untuk menjelaskan perjalanan waktu rinci infeksi virus vaksin di t. palatina dari spesies reservoir rabies terpenting, mis. rubah merah, anjing rakun, musang, rakun, anjing dan sigung, setelah aplikasi oral dengan melakukan studi pelacakan in vivo percobaan komparatif. Untuk tujuan ini, kami menggunakan konstruksi virus vaksin berlabel GFP yang sangat dilemahkan dan memiliki titred tinggi, diikuti oleh mikroskop pemindaian laser confocal untuk memvisualisasikan dan menilai perbedaan antara berbagai spesies reservoir penting. Sebelum studi komparatif lengkap ini, kami melakukan studi percontohan untuk memastikan bahwa hasil yang diperoleh dengan strain virus vaksin yang dilemahkan³⁶ dapat diandalkan dengan menggunakan virus yang dimodifikasi secara genetik. Tujuan lain adalah untuk menjawab pertanyaan apakah jaringan saluran orofaring selain t. palatina juga terlibat dalam mediasi imunitas setelah vaksinasi oral dengan mendeteksi keberadaan virus RNA dan virus yang dapat hidup menggunakan teknik diagnostik molekuler yang sangat sensitif. Untuk tujuan ini, kami menganalisis struktur anatomi dan histologis jaringan limfoid terkait mukosa (MALT) dan cincin Waldeyer untuk mendeteksi apakah perbedaan yang diamati dapat berdampak pada efisiensi pengambilan vaksin.

HASIL

Replikasi terbatas dan penyebaran terbatas virus vaksin (SAD L16 GFP) infeksi di t. palatina setelah inokulasi oral rubah merah

Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa t. palatina adalah jaringan target utama untuk infeksi oleh vaksin RABV yang diberikan secara oral ^36,37,38. Dalam studi percontohan, kami fokus pada rubah merah sebagai spesies yang sangat responsif terhadap vaksinasi rabies oral. Di sini, kami membuktikan kesesuaian dan fungsionalitas virus vaksin model pengekspresian Green-Fluorescence-Protein (GFP) (SAD L16 GFP) untuk pelacakan in vivo untuk mengikuti kinetika dan penyebaran virus vaksin dengan segera di rongga mulut setelah aplikasi.

Tidak ada fokus tetapi hanya sel yang terinfeksi virus vaksin tunggal yang terdeteksi pada hari ke 10 pi. Sebaliknya, pada sebagian besar amandel yang dianalisis dari spesies yang agak tahan api, yaitu rakun, anjing dan sigung, tidak ada sinyal spesifik virus vaksin yang diamati dengan pencitraan mikroskop pemindaian laser, yang menunjukkan bahwa infeksi jaringan amandel pada spesies ini adalah sangat terbatas atau bahkan tidak terjadi. Mirip dengan percobaan percontohan yang digambarkan, pemisahan parsial dari auto fuorescence GFP dan imunofuoresensi spesifik protein virus N diamati, seperti yang ditunjukkan oleh fokus infeksi pada rubah. palatina pada hari ke 2 pi. Rinciannya menunjukkan sel-sel GFP positif dengan deteksi N sedang dan sel dengan sinyal N yang lebih kuat tetapi tanpa fuoresensi GFP yang terdeteksi. Spesies karnivora yang dianalisis memiliki konfigurasi anatomi yang sebanding dengan cincin Waldeyer, dengan variasi kecil pada MALT. Pada langkah berikutnya, kami ingin menjelaskan apakah perbedaan yang diamati dalam efisiensi pengambilan vaksin antar spesies dapat dijelaskan dengan perbedaan anatomis dan histologis dalam struktur morfologi cincin Waldeyer dan MALT. Studi perbandingan penuh dimulai dengan sigung, dan teknik nekropsi standar untuk persiapan lidah dan adneksa cincin Waldeyer dilakukan. Namun, hal ini menghasilkan representasi yang kurang optimal dari fitur anatomi cincin Waldeyer.

Oleh karena itu, kami memutuskan untuk memvariasikan teknik nekropsi seperti yang dijelaskan dalam bahan dan metode untuk hasil yang optimal. Semua spesies memiliki konfigurasi anatomi yang sebanding dengan cincin tonsil Waldeyer. Literatur saat ini terutama berfokus pada cincin spesies anjing Waldeyer di mana tonsilla (t.) Lingualis, t. palatina dan t. faring dapat dibedakan⁴⁴. Informasi ini kurang untuk spesies karnivora lain, oleh karena itu kami secara komparatif menyelidiki ada atau tidaknya MALT di semua spesies yang diteliti. Khususnya, di semua karnivora yang dipelajari, t. palatina adalah struktur limfoid yang paling menonjol, diikuti oleh t. faring yang mudah terlihat dorsocaudal dari pembukaan tuba eustachius sebagai daerah yang tidak rata dengan folikel limfoid yang terlihat, kecuali pada luwak. Secara histologis, seluruh struktur ditutupi oleh epitel pernafasan dengan membran basal yang hampir terus menerus yang jarang dibesarkan oleh limfosit dan makrofag. Di. veli palatina atau t. lingualis tidak terdeteksi di salah satu spesies karnivora yang diteliti yang menerapkan kriteria MALT. Epitel skuamosa berlapis non-keratin dan lapisan tipis epitel pernapasan di sisi nasofaring menutupi langit-langit mulut secara orofaringeal.

T. palatina pada masing-masing individu ditutupi oleh epitel skuamosa non-keratin yang dikembangkan secara ekstensif oleh limfosit dan makrofag (limfoepitel). Dalam variabel submukosa yang mendasari, folikel limfoid sekunder menonjol dengan makrofag dan zona interfolikuler terlihat. Pada semua spesies, morfologi struktural reguler dapat diamati terdiri dari epitel skuamosa non-keratinisasi sitokeratin positif berlapis variabel tebal. Banyak sel B CD20 positif, lebih sedikit sel T CD3 positif dan makrofag positif IBA1, beberapa dengan morfologi sel dendritik, menggembungkan lymhoepithelium.

Seringkali, sarang atau kantong terjalin dari kombinasi variabel dari sel-sel kekebalan yang disebutkan di atas diamati dalam epitel skuamosa. Sel RABV-nukleoprotein-positif terlihat jelas dan sebagian besar terikat pada epitel non-keratinisasi pada 2 dari 2 rubah pada 1 dpi, dan pada 1 dari 2 rubah pada 2 dan 3 dpi, masing-masing. Relatif, RABV-antigen terdeteksi dalam sel epitel pada 1 dari 2 anjing rakun pada 2 dpi, dan pada 2 dari 2 anjing rakun pada 3 dpi. Arsitektur submukosa yang mendasari tidak menunjukkan perbedaan spesifik spesies yang jelas dalam pola pewarnaan folikel limfoid yang kaya sel B dan zona interfollicular yang didominasi sel T. Viral load relatif di t. palatina sedang hingga rendah tergantung pada spesies target. Untuk menetapkan korelasi antara tropisme virus vaksin dan infeksi di t. palatina seperti yang diamati dengan mikroskop laser-scan confocal pada spesies target yang berbeda, kami menyelidiki keberadaan RNA virus. RNA virus vaksin dapat dideteksi di t. palatina dari spesies yang lebih responsif, yaitu rubah, anjing rakun dan luwak, di hampir semua titik waktu pi dibandingkan dengan rakun, anjing dan sigung. Dengan 31,04, nilai ct rata-rata sebagai pengganti untuk viral load relatif secara signifikan lebih rendah (p <0,0004) untuk kelompok spesies yang lebih responsif dibandingkan dengan spesies yang agak tahan api (rata-rata nilai ct ^35,89), yang menguatkan temuan imunofuoresensi. analisis. Seiring dengan temuan dari skrining RT-qPCR, virus menular hanya dapat diisolasi dari t. palatina spesies lebih responsif terhadap vaksinasi oral dengan pengecualian satu rakun pada hari ke 2 pi. Untuk rubah, virus yang dapat hidup terdeteksi dari 2 sampai 4 dpi dan untuk anjing rakun pada hari ke 2 dan 3 pi. Deteksi virus yang layak hidup tertinggi di t. palatina luwak sebagai virus menular dapat diisolasi di semua titik waktu.

Tingkat kepositifan untuk deteksi RNA virus vaksin di jaringan lain dari saluran orofaring juga mengikuti pola spesies-spesifik yang sama.

Untuk menyelidiki apakah jaringan selain t. palatina juga terlibat dalam pengambilan virus vaksin, sembilan jaringan saluran orofaring disaring dengan RT-qPCR. Viral RNA dapat dideteksi di semua jaringan, meskipun dengan perbedaan tingkat kepositifan. Tingkat kepositifan yang tinggi diamati di t. palatina, diikuti oleh t. faring, mukosa, lidah, dan jaringan dasar lingual. Te t. palatina rubah, anjing rakun dan luwak menunjukkan tingkat kepositifan yang lebih tinggi dan nilai Ct yang lebih rendah dibandingkan dengan rakun, anjing dan sigung. Data ini mungkin menunjukkan bahwa frekuensi infeksi virus vaksin dan viral load relatif meningkat di t. palatina rubah, anjing rakun dan luwak dibandingkan dengan spesies lain.

Ketika spesies digabungkan sesuai dengan asumsi respons mereka terhadap vaksinasi rabies oral, terlepas dari titik waktu setelah inokulasi, tingkat kepositifan keseluruhan di semua jaringan pada spesies responsif (54%), yaitu rubah, anjing rakun dan luwak, lebih tinggi dibandingkan dengan spesies agak tahan api (32%), yaitu rakun, anjing dan sigung, meskipun tidak signifikan secara statistik. Sebaliknya, perbedaan diamati untuk t. jaringan palatina, mukosa dan lidah menunjukkan secara signifikan (p <0,01) tingkat kepositifan yang lebih tinggi pada spesies responsif dibandingkan dengan spesies yang agak sulit dikendalikan. Meskipun viral load juga terdeteksi dalam sampel dari kelenjar getah bening, tingkat kepositifan tidak melebihi 30% di sebagian besar spesies.

Virus vaksin yang layak hanya dapat dideteksi hingga empat jam setelah inokulasi, sementara RNA hadir hingga empat hari setelah inokluasi pada usap oral.

Untuk menyelidiki umur panjang RNA virus dan virus yang dapat hidup di rongga orofaring dan untuk melihat apakah deteksi virus vaksin rabies oral di orofaring dan infeksi sel atau jaringan target tertentu merupakan penentu untuk pengambilan vaksin, usap mulut dikumpulkan 2 , 4 dan 24 jam pi dan pada hari eutanasia. Deteksi virus dengan RT-qPCR umumnya tertinggi pada usap oral yang diambil segera setelah pemberian virus vaksin langsung. Sementara kecuali sigung, hampir semua sampel yang diambil 2 jam pi positif RNA virus, setelah 4 jam deteksi virus menurun. Pada titik ini, hanya sampel usap oral rubah, rakun dan anjing yang RNA virus positif, sedangkan tingkat positif pada anjing rakun, luwak dan sigung berkisar antara 30% dan 70%. Secara sporadis, RNA virus dapat dideteksi pada individu dari beberapa spesies hingga hari ke 4 pi. Sebaliknya, virus yang hidup hanya dapat ditemukan hingga 4 jam pi. Khususnya, virus hanya dapat diisolasi dari tiga usapan mulut dari sigung dan tidak ada virus yang dapat hidup terdeteksi di salah satu usap mulut dari anjing, sedangkan semua spesies lain memiliki setidaknya 12 usapan mulut masing-masing selama 4 jam pertama dengan hasil positif. Menariknya, hampir semua spesimen air liur rakun dalam 4 jam pertama positif virus yang dapat hidup. Virus yang dapat hidup ini tidak dapat disebabkan oleh penyebaran aktif virus vaksin keturunan tetapi hanya virus vaksin yang diberikan dan belum dibersihkan dari rongga mulut.

Semua hewan terlepas dari spesiesnya menghasilkan antibodi spesifik RABV pada hari ke 10 setelah inokulasi.

Untuk melihat apakah aplikasi oral dari GFP berlabel vaksin virus strain SAD B19 menimbulkan respon imun yang terukur, keberadaan antibodi spesifik rabies diuji dengan dua tes diagnostik yang berbeda.

Semua hewan masih naif pada saat aplikasi virus vaksin seperti yang ditunjukkan oleh tidak adanya antibodi spesifik rabies yang diukur dengan RFFIT dan ELISA. Khususnya, pada hari ke 10 pi semua hewan mengalami serokonversi seperti yang ditunjukkan oleh ELISA, dan dengan pengecualian satu sigung, semua hewan menunjukkan titer antibodi penawar virus (VNA) di atas ambang batas 0,5 IU / ml. Ketika spesies reservoir dikelompokkan menurut anggapan responsivitas terhadap ORV, perbedaan yang signifikan antara yang lebih responsif, yaitu rubah, anjing rakun dan musang, dibandingkan dengan spesies kurang responsif yang tersisa hanya dapat diamati untuk titer VNA.

DISKUSI

Vaksinasi rabies oral pada satwa liar merupakan tantangan karena ada berbagai spesies reservoir yang perlu ditargetkan45. Secara kebetulan, rubah merah, spesies awal untuk pengembangan konsep vaksinasi rabies oral, juga merupakan spesies yang sangat rentan terhadap vaksinasi rabies oral; dosis efektif minimum yang relatif rendah diperlukan untuk memperoleh respons imun pelindung ^19-21,46. Hanya berdasarkan pengalaman dari data eksperimen dan data lapangan, spesies reservoir lain memerlukan dosis yang jauh lebih tinggi agar berhasil diimunisasi melalui jalur oral. Pada prinsipnya, karena ketidakstabilan virus rabies, saluran pencernaan akan menyebabkan degradasi antigen yang cepat, oleh karena itu vaksin virus rabies harus diambil dalam rongga mulut untuk pengembangan respon imun ³⁴. Namun, dari beberapa penelitian studi awal pada rubah ini, menjadi jelas bahwa vaksin virus rabies yang dilemahkan secara oral tidak menyebabkan kekebalan pelindung ^47,48, menunjukkan bahwa replikasi virus vaksin di dalam inang adalah penting. Oleh karena itu, saat ini semua vaksin rabies oral yang tersedia adalah konstruksi virus yang mampu mereplikasi hidup. Berdasarkan temuan ³⁶ kami sebelumnya, penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan serapan spesifik spesies, distribusi dan kinetika vaksin rabies oral di rongga mulut dari spesies reservoir rabies terestrial yang paling penting untuk mengidentifikasi hambatan imunisasi dengan fokus pada spesies yang diketahui. menjadi agak refrakter terhadap vaksinasi oral. Untuk tujuan ini, dalam studi pelacakan in vivo komparatif dan komprehensif pertama ini dengan pendekatan standar, kami menggunakan konstruksi virus vaksin yang dimodifikasi secara genetik, diikuti dengan teknik mutakhir dalam pencitraan dan deteksi RNA virus. Penelitian sebelumnya dapat mengidentifikasi sel yang terinfeksi ^36,37. Dalam studi ini, dengan menggunakan konstruksi SAD L16 GFP kami juga dapat mengidentifikasi sel tempat ekspresi gen virus aktif berlangsung.

Data kami menegaskan bahwa virus vaksin rabies yang diberikan secara oral berkembang biak pada tingkat yang rendah dalam rongga mulut rubah, khususnya, tetapi tidak secara eksklusif di t. palatina, seperti yang ditunjukkan sebelumnya³⁷. Saat menganalisis perjalanan waktu infeksi di t. palatina, analisis imunofuoresensi dari nukleoprotein virus dan fuoresensi GFP mengungkapkan fokus sel yang terinfeksi RABV di lapisan sel perifer tonsil rubah pada hari 1 sampai 4 pi. Data ini mengkonfirmasi snapshot sebelumnya dari infeksi virus vaksin SPBN GASGAS dari lapisan tonsil perifer rubah merah36 dan menunjukkan kegunaan strain virus vaksin berlabel GFP untuk pelacakan in-vivo. Keterbatasan penyebaran infeksi virus baik secara vertikal maupun lateral, sangat menunjukkan pembatasan spatio-temporal dari tropisme virus vaksin dan replikasi pada tonsil rubah.

Untuk mengikuti serapan virus vaksin dan tropisme berikutnya dan perjalanan waktu infeksi di t. palatina, di samping auto fuorescence GFP, kami juga berfokus pada pewarnaan protein N. Fenomena yang diamati dari akumulasi agregat protein N dan hilangnya fuoresensi GFP pada amandel rubah dari hari ke-2 dan seterusnya dengan jelas menunjukkan kinetika yang berbeda dari akumulasi GFP dan protein N dan pergantian dalam sel yang terinfeksi virus vaksin. Protein Te N sebagai bagian dari ribonukleoprotein intraseluler (RNP) terakumulasi dalam badan inklusi yang besar dan cenderung kurang rentan terhadap degradasi, sedangkan GFP terlarut mungkin kurang stabil dalam sel yang terinfeksi dan dapat dengan cepat dihilangkan oleh sistem kekebalan tubuh.

Secara mencolok, analisis imunofuoresensi komparatif mengungkapkan secara substansial lebih banyak virus vaksin dan sel yang terinfeksi virus pada spesies yang lebih responsif terhadap vaksinasi oral, sehingga menguatkan asumsi umum dan pengamatan lapangan pada perbedaan antara spesies reservoir dalam efisiensi penyerapan vaksin ^8,17,49–52 dan daya tanggap terhadap vaksinasi rabies oral ^18-23. Pewarnaan virus N-protein yang membatasi area sel yang terinfeksi RABV yang terbatas secara lokal di lapisan perifer t. palatina rubah, anjing rakun dan musang dengan penyebaran infeksi virus vertikal dan lateral terbatas yang serupa, tetapi gagal untuk mengidentifikasi bahkan sel tunggal yang terinfeksi pada spesies lain. Pengamatan ini dikuatkan oleh perbedaan dalam deteksi virus menular dan viral load relatif di t. palatina dari masing-masing spesies sasaran. Alasan untuk perbedaan yang jelas ini tetap sulit dipahami. Seperti yang telah dibahas sebelumnya³⁶, morfologi jaringan limforetik pada faring tidak dapat menjelaskan perbedaan yang diamati dalam pengambilan vaksin di antara spesies yang dipelajari di sini. Semua spesies memiliki konfigurasi anatomi yang sebanding dari cincin tonsil Waldeyer dengan t yang mendominasi. palatina.dll Juga secara histologis, tidak ada perbedaan dalam struktur seluler tonsil, yang diwakili oleh lapisan sel epitel skuamosa bertingkat non-keratin perifer diikuti oleh pusat germinal yang terdiri dari limfosit.

Dalam penelitian kami, kami diminta untuk menggunakan dosis vaksin yang sangat tinggi (10 ^8.0 FFU / mL) untuk meningkatkan kemungkinan untuk mengamati setiap perbedaan dalam pengambilan vaksin di MALT rongga mulut dari berbagai spesies sama sekali. Ini bisa menjadi alasan mengapa semua hewan terlepas dari spesies menunjukkan antibodi spesifik RABV pada hari 10 pi yang diukur dengan RFFIT⁵³ standar dan ELISA ^53,54 yang lebih sensitif, terlepas dari identifikasi sel yang terinfeksi di t. palatina.dll Oleh karena itu, jaringan lain di rongga orofaring harus terlibat dalam pengambilan virus dan interaksi selanjutnya dengan sistem kekebalan. Skrining untuk RNA virus menunjukkan keberadaannya di semua jaringan yang diselidiki, meskipun dengan perbedaan yang signifikan pada tingkat kepositifan. Tingkat kepositifan amandel lebih tinggi untuk spesies yang diketahui lebih responsif terhadap vaksinasi oral seperti viral load relatif yang menguatkan temuan analisis imunofuoresensi. Selain t. palatina, secara signifikan meningkatkan deteksi virus dengan RT-qPCR juga terlihat pada sampel mukosa dan lidah dari spesies yang lebih responsif, menunjukkan bahwa infeksi jaringan orofaring lainnya juga berkontribusi pada kemanjuran vaksin. Namun, berdasarkan data kami, tampaknya tidak ada situs preferensial untuk pengambilan dan replikasi virus vaksin pada spesies yang responsif rendah. Hasil serologi kuantitatif kami menunjukkan korelasi dengan daya tanggap terhadap vaksinasi oral pada berbagai spesies untuk RFFIT, di mana titer VNA dari spesies responsif secara signifikan lebih tinggi (p <0,05) dibandingkan dengan spesies responsif rendah. Bahkan dengan memperhitungkan jumlah hewan yang terbatas ini, hal ini menguatkan temuan sebelumnya⁵³.

Jendela waktu yang singkat (hari 10 pi untuk deteksi virus RNA, hari 4 pi untuk deteksi antigen) di mana virus vaksin (SAD L16 GFP) dapat dideteksi pada amandel. Ketika diseminasi vaksin strain C konvensional atau vaksin penanda hidup yang dimodifikasi (CP7_E2alf) untuk demam babi klasik di jaringan diselidiki, genom virus vaksin secara konsisten terdeteksi pada tonsil limfoid hingga hari ke 7 pi55, hari ke 42 pi⁵⁶ dan hari 77⁵⁷ pi oleh RT-qPCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa, seperti vaksin oral lainnya, deteksi virus vaksin biasanya bersifat sementara bahkan pada organ limfatik. Namun, berbeda dengan vaksin lainnya, durasi pemberian vaksin rabies pada tonsil jauh lebih pendek dan viral load relatif di t. palatina tetap agak rendah⁵⁶.

Dalam penelitian sebelumnya, deteksi virus vaksin dan RNA pada usap mulut pasca vaksinasi terbukti menjadi virus masukan sisa dan bukan pelepasan virus seperti itu³⁶. Khususnya, perbedaan yang jelas antara spesies responsif dan tahan api seperti yang terlihat pada tropisme virus vaksin dan infeksi di t. palatina dan jaringan lain di rongga orofaring hanya sebagian terlihat ketika menilai deteksi SAD L16 GFP di usap mulut, sebagian kontras temuan sebelumnya dengan virus vaksin rekayasa genetika membangun SPBN GASGAS ³⁶. Dalam penelitian kami, virus vaksin hanya dapat diisolasi kembali dari usap mulut dalam waktu 4 jam kecuali untuk anjing yang hanya memiliki RNA. Deteksi RNA vaksin di jendela waktu ini menunjukkan degradasi input virus oleh lingkungan di rongga mulut. Deteksi sesekali RNA virus vaksin dalam jaringan mulut setelah hari 1 pi mungkin disebabkan oleh pelepasan partikel virus non-infeksius dari sel yang terinfeksi atau deteksi sel yang terlepas yang mengandung RNA virus vaksin.

Secara bersama-sama, data tersebut menguatkan hipotesis pembersihan cepat vaksin virus rabies yang dilemahkan di rongga mulut seperti yang dijelaskan sebelumnya terlepas dari spesies target ^37,58. Mekanisme di balik ini dapat dikaitkan dengan aktivasi gen terkait NFκB, yang mungkin mengarah pada pembersihan yang cepat di situs utama infeksi seperti yang ditunjukkan untuk SPBN GASGAS⁵⁹. Masih cukup tidak diketahui apakah infeksi RABV pada sel kekebalan terkait, yang dapat memicu respons spesifik antigen yang kuat, memengaruhi perkembangan kekebalan pelindung. Studi in vitro dan in vivo mengungkapkan bahwa virus rabies dapat secara langsung menginfeksi sel kekebalan. Infeksi RABV pada limfosit T manusia dan tikus menginduksi apoptosis, yang kemudian mengarah pada peningkatan respon imun dengan mengaktifkan makrofag, kaskade sitokin dan peningkatan presentasi antigen⁶⁰. Selain itu, RABV terbukti menginfeksi dan mengaktifkan sel B primer, yang kemudian secara langsung menyiapkan dan mengaktifkan sel CD4 + T secara in vitro⁶¹. Untuk menyelidiki apakah infeksi sel B dan T terjadi secara in vivo, karakterisasi fungsional lebih lanjut dari sel target, seperti limfosit pada lapisan sel epitel dari tonsil yang terinfeksi, diperlukan.

KESIMPULAN

Perbandingan tropisme in vivo dan perjalanan waktu infeksi virus vaksin rabies oral yang dilemahkan di saluran orofaring dari spesies reservoir rabies yang paling penting⁴³ setelah penanaman oral langsung dengan jelas mengungkapkan perbedaan spesies-spesifik. Meskipun mekanisme rinci pengambilan dan pemrosesan virus vaksin serta keterlibatan sel kekebalan yang berpotensi terinfeksi di t. palatina membutuhkan klarifikasi lebih lanjut, hasilnya memperkuat hipotesis bahwa spesies reservoir tertentu tampak lebih tahan terhadap vaksinasi oral daripada yang lain. Apakah efektivitas lapangan ORV misalnya pada sigung dan rakun tampaknya dibatasi oleh penyerapan umpan yang buruk atau konsumsi vaksin yang tidak memadai daripada dari kemanjuran vaksin yang buruk⁶² masih harus dibuktikan.

Di sebelah t. palatina sebagai tempat utama pengambilan virus vaksin, jaringan lain di rongga orofaring mungkin memainkan peran lebih besar dalam pengambilan virus dan interaksi selanjutnya dengan sistem kekebalan daripada yang diasumsikan sebelumnya. Memahami mekanisme pengambilan dan replikasi virus vaksin sangat penting untuk pengembangan dan optimalisasi vaksin. Selain vaksin yang ditingkatkan atau baru yang mengarah pada peningkatan kinerja lapangan¹⁷, penelitian lebih lanjut harus menyelidiki bagaimana efektivitas penyerapan vaksin pada rakun, sigung, dan spesies reservoir tahan api lainnya dapat ditingkatkan, misalnya dengan meningkatkan titer vaksin, interval vaksinasi, atau dengan menambahkan perekat mukosa dan / atau zat peningkat permeasi ^63-66 untuk memungkinkan strategi eliminasi di masa depan.

BAHAN DAN METODE

VIRUS

Strain laboratorium SAD L16 adalah klon lengkap rekombinan dari strain vaksin oral yang dilemahkan SAD B19 ^67,68. Varian yang mengekspresikan GFP dihasilkan oleh protokol penyelamatan standar⁶⁹ setelah penyisipan unit transkripsi tambahan antara gen virus G dan L pada posisi genom SAD L16 5338. Urutan yang disisipkan terdiri dari duplikasi urutan batas gen N / P (posisi SAD L16 nt 1413– 1500) diikuti oleh ORF coding untuk protein EGFP dengan N- dan C-terminal Strep- dan His-tag, masing-masing.

PERNYATAAN ETIKA

Semua hewan dipelihara sesuai dengan pedoman yang berlaku dan perawatan umum diberikan sesuai kebutuhan. Sementara studi pilot rubah (42502-3-725) dan studi pada anjing (42502-3-762) dievaluasi dan disetujui oleh Komite Etik Negara Bagian Federal Saxony Anhalt, Landesverwaltungsamt Sachsen-Anhalt, 06003 Halle, Jerman, semua penelitian lain dievaluasi dan disetujui oleh Komite Etik Negara Bagian Federal Mecklenburg-Western Pomerania, Landesamt für Landwirtschaf, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, 18003 Rostock, Jerman (7221.3-1-058 / 15).

HEWAN

10 hewan per spesies (rubah, anjing rakun, musang, rakun, anjing dan sigung bergaris) digunakan untuk inokulasi oral dan studi diseminasi.

Rubah dewasa, anjing rakun, rakun, sigung dan anjing (berkembang biak: beagle HsdRcc: DOBE, 4–5 kg) dibeli dari peternak komersial, sedangkan luwak ditangkap menggunakan perangkap kotak berumpan di pulau bebas rabies Korčula, Kroasia, dan diangkut ke Jerman. Kecuali untuk anjing dan rubah dalam studi percontohan, semua hewan disimpan dalam kandang stainless steel individu pada suhu kamar 20 ° C, kelembaban 60–80% dan kontrol pencahayaan 12 jam / 12 jam (mode peredupan selama malam hari) dalam mode kipas paksa draft ventilasi dilengkapi fasilitas hewan BSL3 ** di Friedrich-Loefer-Institute (FLI), Greifswald - Insel Riems, Jerman. Anjing dan rubah dari studi percontohan disimpan dalam kandang tunggal pada suhu ruangan 20-25 ° C, kelembaban 20-70% dan kontrol gelap terang 12 jam / 12 jam dalam fasilitas hewan di Ceva Innovation Center GmbH (Dessau- Roßlau, Jerman). Hewan diberi makan setiap hari dengan pakan yang diproduksi secara komersial untuk rubah yang dipelihara di peternakan dan anjing rakun (Schirmer und Partner GmbH Co KG, Döhlen, Jerman; Michael Hassel GmbH, Langenargen, Jerman). Diet itu dilengkapi dengan vitamin, mineral, dan item seperti ayam umur 1 hari. Air ditawarkan secara ad libitum. Status kesehatan umum semua hewan, asupan pakan dan buang air besar diamati dan dicatat setiap hari.

Sampel darah diambil sebelum imunisasi dan pada hari nekropsi. Untuk hewan di FLI (rubah studi banding, anjing rakun, luwak, rakun, dan sigung), pengambilan sampel darah dan pemberian virus dilakukan dengan anestesi menggunakan Zoletil® (kombinasi Tiletamin dan Zolazepam, Virbac, Prancis). Darah diambil dari vena superfisial besar pada ekstremitas (misalnya Vena cephalica antebrachii, Vena saphena). Untuk eutanasia, hewan pertama kali dianestesi dengan Zoletil® diikuti dengan perdarahan jantung dan selanjutnya administrasi T61® (Intervet, Jerman). Rubah studi percontohan dibius dengan kombinasi Xylazine dan Ketamine sedangkan untuk anjing tidak diperlukan anestesi untuk pengambilan sampel darah dan pemberian virus. Untuk eutanasia, rubah dan anjing pertama kali dibius menggunakan kombinasi Xylazine dan Ketamine (rubah) dan Medetomidine, Acepromazine dan Butorphanol (anjing) diikuti dengan perdarahan jantung dan administrasi T61® berikutnya.

Studi inokulasi dan penyebaran oral

Untuk menyelidiki perbedaan spesies-spesifik dalam tropisme virus vaksin, semua hewan menerima 1.0mL SAD L16 GFP (10⁸ FFU / mL) dengan aplikasi oral langsung (d.o.A.). Dosis yang agak tinggi ini dipilih karena meningkatkan kemungkinan keberhasilan imunisasi pada semua spesies berdasarkan pengalaman dengan vaksin virus rabies oral yang diturunkan dari SAD B19 atau SAD B19 ^{19,20,23,28,32}.

Untuk membuktikan kesesuaian dan fungsionalitas dari virus vaksin model pengekspresian Green-Fluorescence-Protein (GFP) dan mengikuti perjalanan waktu infeksi virus vaksin di t. palatina setelah aplikasi oral pada spesies yang sangat responsif, dalam studi percontohan (Gbr. 1), dua rubah dikorbankan 2, 3, 4 dan 10 hari dan satu hewan 1 hari pasca inokulasi (pi). Di nekropsi, sampel t tersebut. palatina, jaringan kelenjar getah bening, mukosa, dan lidah dikumpulkan untuk analisis imunofuoresensi.

Dalam studi perbandingan berikutnya yang bertujuan untuk menjelaskan perbedaan dalam efisiensi pengambilan vaksin, dua hewan dari masing-masing spesies dikorbankan masing-masing 1, 2, 3, 4 dan 10 hari pi. Pada nekropsi, tengkorak dibedah dengan hati-hati menjadi dua bagian dengan gergaji pita berlian untuk memperlihatkan cincin dan lidah Waldeyer. Selanjutnya, jaringan berikut dipersiapkan dengan hati-hati dan sampel kelenjar getah bening (lymphonodii (lnn.) Mandibulares, ln. Parotidei, ln. Retropharyngei), mukosa, lidah dan bagian dari cincin Waldeyer (lingual ground, t. Palatina, t. faring, sof palatum) dikumpulkan dan diskrining untuk pembentukan virus vaksin dengan RT-qPCR. Satu setengah dari setiap tengkorak dengan cincin Waldeyer terpasang segera diubah dalam 4% formaldehida berbahan netral selama setidaknya 14 hari. Sampel jaringan serupa seperti yang disebutkan di atas diproses, ditanamkan dalam lilin parafn dan bagian 2-4 µm diwarnai dengan hematoksilin dan eosin (HE). Spesimen dinilai secara histologis untuk keberadaan lesi, dan terjadinya jaringan limfoid terkait mukosa (MALT) mengikuti kriteria standar: zona sel-T interfollicular variabel, beberapa folikel sel B, kurangnya limfatik aferent, pengambilan sampel antigen eksogen langsung oleh mukosa permukaan dengan sel mikrofold / membran (M )³⁵ menggunakan mikroskop Axio Imager M2 (Mikroskopi Carl Zeiss). Untuk analisis imunofuoresensi, jaringan difiksasi dalam 4% bufered formaldehyde (pH 7,4). Usap saliva diambil sebelum (0 jam) dan 2 jam, 4 jam dan 24 jam setelah pemberian RABV oral serta selama nekropsi (lihat Gambar Tambahan S1). Sampel air liur dikumpulkan dengan menyeka rongga mulut selama minimal 1 menit. Ujung kapas disimpan pada suhu -80 ° C sampai analisis selanjutnya dari konstruksi virus dengan RT-qPCR dan uji infeksi kultur jaringan rabies (RTCIT).

PENGUJIAN DIAGNOSTIK

Untuk mendeteksi RABV RNA dalam sampel jaringan orofaring dan penyeka air liur, RNA diekstraksi sepenuhnya otomatis menggunakan Kit MagAttract Viral RNA M18 yang dikombinasikan dengan BioSprint 96 Workstation (Quiagen, Hilden) sesuai dengan petunjuk pabrik. Selanjutnya, PCR kuantitatif transkripsi terbalik (RT-qPCR) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya⁷⁰. Saliva teruji positif dan t. Sampel palatina selanjutnya dianalisis untuk keberadaan virus rabies menular dengan RTCIT ^71,72 menggunakan garis sel BHK-21 [BSR / 5] (Koleksi Garis Sel dalam Kedokteran Hewan (CCLV), Friedrich-Loefer-Institut, No. 0194). Untuk memastikan hasil negatif, dilakukan tiga bagian kultur sel yang berurutan.

Untuk mendeteksi antibodi penawar virus (VNA), sampel darah yang dikumpulkan dianalisis dengan uji penghambatan fokus fuorescent cepat (RFFIT) seperti dijelaskan di tempat lain⁵³. Antibodi pengikat terdeteksi oleh ELISA penghambatan spesifik virus rabies menurut spesifikasi pabrik (kit ELISA Ab BioPro Rabies, O.K. Servis BioPro, Praha, Republik Ceko) ⁵⁴.

ANALISIS IMUNOFUORESCENCE

Untuk analisis imunofuoresensi selanjutnya, bagian vibratome dari fxed tonsil dengan ketebalan 150 µm disiapkan. Karena ukurannya yang kecil, bagian cryostat dari luwak t. palatina dengan ketebalan 20 µm disiapkan dan dipasang pada slide. Potongan amandel diinkubasi semalaman dengan antibodi primer spesifik terhadap nukleoprotein RABV (poliklonal kelinci-α-RABV N 161-573, diencerkan 1: 3000 dalam 0,1% Triton / PBS), diikuti dengan inkubasi dengan antibodi sekunder yang digabungkan fuorofor (Alexa Fluor® 568 kambing-α-kelinci, 0,7 µg / mL dalam 0,1% Triton / PBS, TermoFisher Scientifc) selama 4 jam. Inti divisualisasikan dengan Hoechst 33342 (1 µg / mL di PBS, TermoFisher Scientifc). T bernoda. irisan palatina didokumentasikan menggunakan mikroskop confocal laser-scan Leica DMI 6000 TCS SP5 dengan tujuan pencelupan minyak 63 kali lipat (Leica Microsystems).

IMUNOHISTOCHEMISTRY

Untuk mengkarakterisasi morfologi seluler t. palatina di setiap spesies, imunohistokimia diaplikasikan menggunakan metode avidin-biotin-peroksidase-kompleks (ABC) memanfaatkan kit standar Vectastain® Elite ABC (Laboratorium Vektor) dengan bufer sitrat (10mM, pH 6,0) pra-perawatan, untuk memberi label epitop tonsil berikut: cytokeratins ^{1–8, 10, 13–17, 19} (clone AE1 / AE3, mouse anti-human, monoclonal, encer 1: 500, Dako, Deutschland GmbH, Hamburg, Germany), makrofag dan sel dendritik ( anti IBA1, kelinci anti manusia, poliklonal, diencerkan 1: 200, FUJIFILM Wako Chemicals, Jerman), sel B (CD20, kelinci anti manusia, poliklonal, diencerkan 1: 200, Termo Fisher, Jerman), sel T (CD3, kelinci anti-manusia, poliklonal, diencerkan 1: 200, Dako, Jerman,) dan RABV-nukleoprotein (poliklonal, kelinci-α-N161-5; diencerkan 1: 2000 ⁷³) dengan diinkubasi semalaman. Visualisasi antigen dilakukan dengan 3-amino-9-ethyl-carbazol sebagai chromogen dan hematoxylin sebagai counterstain. Sebagai kontrol negatif, bagian berturut-turut diinkubasi dengan serum kelinci atau saline tris-bufered sebagai pengganti antibodi primer.

ANALISIS STATISTIK

Signifikansi statistik dalam perbedaan antara dua cara (RT-qPCR positif) antara berbagai jaringan limfoid dalam spesies responsif versus responsif rendah dinilai dengan ANOVA dua arah diikuti dengan uji perbandingan berganda Šidák. Data lain termasuk kepositifan RT-qPCR keseluruhan, nilai-ct di t. palatina, dan hasil serologis diuji signifikansinya menggunakan uji-T tidak berpasangan. Analisis dilakukan menggunakan Graphpad Prism 7 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, CA, USA), dengan nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik dan nilai P <0,01 dianggap sangat signifikan.

Ketersediaan data Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini disertakan dalam artikel yang dipublikasikan ini (dan File Informasi Tambahannya). Diterima: 6 Juni 2019; Diterima: 3 Februari 2020.

 

REFERENSI

1.      Tulke, H. & Eisinger, D. Te strength of 70%: revision of a standard threshold of rabies control. In Towards the elimination of rabies in Eurasia Development in Biologicals (eds B. Dodet, A. R. Fooks, T. Müller, & N. Tordo) 291–298 (Karger, 2008).

2.      Aubert, M. In Wildlife Rabies Control (eds K. Bögel, F. X. Meslin, & M. Kaplan) 9–18 (Wells Medical Ltd., 1992).

3.      Müller, T. et al. Terrestrial rabies control in the European Union: historical achievements and challenges ahead. Vet. J. 203, 10–17, https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2014.10.026 (2015).

4.      Ma, X. et al. Rabies surveillance in the United States during 2016. J. Am. Veterinary Med. Assoc. 252, 945–957, https://doi. org/10.2460/javma.252.8.945 (2018).

5.      Everard, C. O. R. & Everard, J. D. Mongoose Rabies. Rev. Infect. Dis. 10, 610–614 (1988).

6.      Hampson, K. et al. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLOS Negl. Trop. Dis. 9, e0003709, https://doi. org/10.1371/journal.pntd.0003709 (2015).

7.      Cliquet, F. et al. Oral vaccination of dogs: a well-studied and undervalued tool for achieving human and dog rabies elimination. Vet. Res. 49, 61, https://doi.org/10.1186/s13567-018-0554-6 (2018).

8.      Sidwa, T. J. et al. Evaluation of oral rabies vaccination programs for control of rabies epizootics in coyotes and gray foxes: 1995–2003. J. Am. Vet. Med. Assoc. 227, 785–792 (2005).

9.      MacInnes, C. D. et al. Elimination of rabies from red foxes in eastern Ontario. J. Wildl. Dis. 37, 119–132, https://doi. org/10.7589/0090-3558-37.1.119 (2001).

10.   Velasco-Villa, A. et al. Te history of rabies in the Western Hemisphere. Antiviral Res., https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2017.03.013 (2017).

11.   Freuling, C. M. et al. Te elimination of fox rabies from Europe: determinants of success and lessons for the future. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 368, 20120142, https://doi.org/10.1098/rstb.2012.0142 (2013).

12.   Maki, J. et al. Oral vaccination of wildlife using a vaccinia-rabies-glycoprotein recombinant virus vaccine (RABORAL V-RG((R))): a global review. Vet. Res. 48, 57, https://doi.org/10.1186/s13567-017-0459-9 (2017).

13.   Tolson, N. D., Charlton, K. M., Lawson, K. F., Campbell, J. B. & Stewart, R. B. Studies of Era/Bhk-21 Rabies Vaccine in Skunks and Mice. Can. J. Vet. Res. 52, 58–62 (1988).

14.   Rupprecht, C. E., Dietzschold, B., Cox, J. H. & Schneider, L. G. Oral vaccination of raccoons (Procyon lotor) with an attenuated (SAD-B19) rabies virus vaccine. J. Wildl. Dis. 25, 548–554, https://doi.org/10.7589/0090-3558-25.4.548 (1989).

15.   Rupprecht, C. E. et al. Oral immunization and protection of raccoons (Procyon lotor) with a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus vaccine. Proc. Natl Acad. Sci. USA Biol. Sci 83, 7947–7950 (1986).

16.   Tolson, N. D. et al. Mutants of rabies viruses in skunks: immune response and pathogenicity. Can. J. Vet. Res. 54, 178–183 (1990).

17.   Slate, D. et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Negl. Trop. Dis. 3, e549, https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000549 (2009).

18.   Cliquet, F. et al. Safety and efcacy of the oral rabies vaccine SAG2 in raccoon dogs. Vaccine 24, 4386–4392, https://doi.org/10.1016/j. vaccine.2006.02.057 (2006).

19.   Neubert, A., Schuster, P., Müller, T., Vos, A. & Pommerening, E. Immunogenicity and efcacy of the oral rabies vaccine SAD B19 in foxes. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Public. Health. 48, 179–183 (2001).

20.   Schuster, P. et al. Comparative immunogenicity and efcacy studies with oral rabies virus vaccine SAD P5/88 in raccoon dogs and red foxes. Acta Vet. Hung. 49, 285–290 (2001).

21.   Cliquet, F. et al. Efcacy of a square presentation of V-RG vaccine baits in red fox, domestic dog and raccoon dog. Dev. Biol. 131, 257–264 (2008).

22.   Blanton, J. D. et al. Vaccination of Small Asian Mongoose (Herpestes javanicus) Against Rabies. J. Wildl. Dis. 42, 663–666 (2006).

23.   Vos, A. et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. J. Wildl. Dis. 49, 1033–1036, https://doi.org/10.7589/2013-02-035 (2013).

24.   Brown, L. J. et al. Oral vaccination and protection of striped skunks (Mephitis mephitis) against rabies using ONRAB(R). Vaccine 32, 3675–3679, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2014.04.029 (2014).

25.   Charlton, K. M. et al. Oral rabies vaccination of skunks and foxes with a recombinant human adenovirus vaccine. Arch. Virol. 123, 169–179 (1992).

26.   Grosenbaugh, D. A., Maki, J. L., Rupprecht, C. R. & Wall, D. K. Rabies Challenge of Captive Striped Skunks (Mephitis mephitis) following Oral Administration of a Live Vaccinia-Vectored Rabies Vaccine. J. Wildl. Dis. 43, 124–128 (2007).

27.   Rupprecht, C. E. et al. Inefectiveness and Comparative Pathogenicity of Attenuated Rabies Virus-Vaccines for the Striped Skunk (Mephitis-Mephitis). J. Wildl. Dis. 26, 99–102 (1990).

28.   Vos, A., Pommerening, E., Neubert, L., Kachel, S. & Neubert, A. Safety studies of the oral rabies vaccine SAD B19 in striped skunk (Mephitis mephitis). J. Wildl. Dis. 38, 428–431 (2002).

29.   Fekadu, M. et al. Immunogenicity, efcacy and safety of an oral rabies vaccine (SAG-2) in dogs. Vaccine 14, 465–468 (1996).

30.   Cliquet, F. et al. Te safety and efcacy of the oral rabies vaccine SAG2 in Indian stray dogs. Vaccine, 257–264 (2007).

31.   WHO. Oral immunization of dogs against rabies: report of the Sixth Consultation. (WHO, 1998).

32.   Aylan, O. & Vos, A. Efcacy studies with SAD B19 in Turkish dogs. J. ETLIK Veterinary Microbiology 9, 93–102 (1998).

33.   Rupprecht, C. E. et al. Oral vaccination of dogs with recombinant rabies virus vaccines. Virus Res. 111, 101–105 (2005).

34.   Baer, G. M., Broderson, J. R. & Yager, P. A. Determination of the site of oral rabies vaccination. Am. J. Epidemiol. 101, 160–164 (1975).

35.   Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R. & Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1, 31–37, https://doi.org/10.1038/mi.2007.9 (2008).

36.   Vos, A. et al. Oral vaccination of wildlife against rabies: Diferences among host species in vaccine uptake efciency. Vaccine 35, 3938–3944, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2017.06.022 (2017).

37.   Orciari, L. A. et al. Rapid clearance of SAG-2 rabies virus from dogs afer oral vaccination. Vaccine 19, 4511–4518 (2001).

38.   Ortmann, S. et al. In Vivo Safety Studies With SPBN GASGAS in the Frame of Oral Vaccination of Foxes and Raccoon Dogs Against Rabies. Front. Vet. Sci. 5, 91, https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00091 (2018).

39.   Ortmann, S. et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Vet. Res. 14, 90, https://doi.org/10.1186/s12917-018-1417-0 (2018).

40.   Hanlon, C. A., Niezgoda, M., Morrill, P. & Rupprecht, C. E. Oral efcacy of an attenuated rabies virus vaccine in skunks and raccoons. J. Wildl. Dis. 38, 420–427 (2002).

41.   Fekadu, M. et al. Oral vaccination of skunks with raccoon poxvirus recombinants expressing the rabies glycoprotein or the nucleoprotein. J. Wildl. Dis. 27, 681–684, https://doi.org/10.7589/0090-3558-27.4.681 (1991).

42.   Tolson, N. D., Charlton, K. M., Stewart, R. B., Campbell, J. B. & Wiktor, T. J. Immune Response in Skunks to a Vaccinia Virus Recombinant Expressing the Rabies Virus Glycoprotein. Can. J. Vet. Res. 51, 363–366 (1987).

43.   World Health Organization. WHO expert consultation on rabies, third report. World Health Organ. Tech. Rep. Ser. 1012, 195 (2018).

44.   Casteleyn, C., Breugelmans, S., Simoens, P. & Van den Broeck, W. Te tonsils revisited: review of the anatomical localization and histological characteristics of the tonsils of domestic and laboratory animals. Clin. Dev. Immunol. 2011, 472460, https://doi. org/10.1155/2011/472460 (2011).

45.   Rupprecht, C. E., Hanlon, C. A. & Slate, D. Oral vaccination of wildlife against rabies: opportunities and challenges in prevention and control. Dev. Biol. 119, 173–184 (2004).

46.   Baer, G. M., Abelseth, M. K. & Debbie, J. G. Oral vaccination of foxes against rabies. Am. J. Epidemiol. 93, 487–490 (1971).

47.   Brochier, B., Godfroid, J., Costy, F., Blancou, J. & Pastoret, P. P. Vaccination of young foxes (Vulpes vulpes, L.) against rabies: trials with inactivated vaccine administered by oral and parenteral routes. Ann. Rech. Vet. 16, 327–333 (1985).

48.   Rupprecht, C. E., Dietzschold, B., Campbell, J. B., Charlton, K. M. & Koprowski, H. Consideration of inactivated rabies vaccines as oral immunogens of wild carnivores. J. Wildl. Dis. 28, 629–635 (1992).

49.   Vos, A., Müller, T., Schuster, P., Schlüter, H. & Neubert, A. Oral vaccination of foxes against rabies with SAD B19 in Europe, 1983 - 1998: A review. Veterinary Bull. 70, 1–6 (2000).

50.   Zienius, D., Pridotkas, G., Lelesius, R. & Sereika, V. Raccoon dog rabies surveillance and post-vaccination monitoring in Lithuania 2006 to 2010. Acta Vet. Scand. 53, https://doi.org/10.1186/1751-0147-53-58 (2011).

51.   Niin, E., Laine, M., Guiot, A. L., Demerson, J. M. & Cliquet, F. Rabies in Estonia: Situation before and afer the frst campaigns of oral vaccination of wildlife with SAG2 vaccine bait. Vaccine 26, 3556–3565 (2008).

52.   Rosatte, R. et al. Prevalence of tetracycline and rabies virus antibody in raccoons, skunks, and foxes following aerial distribution of V-RG baits to control raccoon rabies in Ontario, Canada. J. Wildl. Dis. 44, 946–964, https://doi.org/10.7589/0090-3558-44.4.946 (2008).

53.   Moore, S. et al. Rabies Virus Antibodies from Oral Vaccination as a Correlate of Protection against Lethal Infection in Wildlife. Trop. Med. Infect. Dis. 2, https://doi.org/10.3390/tropicalmed2030031 (2017).

54.   Wasniewski, M. et al. Evaluation of an ELISA to detect rabies antibodies in orally vaccinated foxes and raccoon dogs sampled in the feld. J. Virol. Methods 187, 264–270, https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2012.11.022 (2013).

55.   Drager, C., Petrov, A., Beer, M., Teifke, J. P. & Blome, S. Classical swine fever virus marker vaccine strain CP7_E2alf: Shedding and dissemination studies in boars. Vaccine 33, 3100–3103, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.04.103 (2015).

56.   Koenig, P. et al. Detection of classical swine fever vaccine virus in blood and tissue samples of pigs vaccinated either with a conventional C-strain vaccine or a modified live marker vaccine. Vet. Microbiol. 120, 343–351, https://doi.org/10.1016/j. vetmic.2006.10.034 (2007).

57.   Tignon, M. et al. Classical swine fever: comparison of oronasal immunisation with CP7E2alf marker and C-strain vaccines in domestic pigs. Vet. Microbiol. 142, 59–68, https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2009.09.044 (2010).

58.   Vos, A. et al. An assessment of shedding with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in target and non-target species. Vaccine 36, 811–817, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2017.12.076 (2018).

59.   Li, J., McGettigan, J. P., Faber, M., Schnell, M. J. & Dietzschold, B. Infection of monocytes or immature dendritic cells (DCs) with an attenuated rabies virus results in DC maturation and a strong activation of the NFkappaB signaling pathway. Vaccine 26, 419–426, https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2007.10.072 (2008).

60.   Toulouze, M. I., Lafage, M., Montano-Hirose, J. A. & Lafon, M. Rabies virus infects mouse and human lymphocytes and induces apoptosis. J. Virol. 71, 7372–7380 (1997).

61.   Lytle, A. G., Norton, J. E. Jr., Dorfmeier, C. L., Shen, S. & McGettigan, J. P. B cell infection and activation by rabies virus-based vaccines. J. Virol. 87, 9097–9110, https://doi.org/10.1128/JVI.00800-13 (2013).

62.   Wohlers, A., Lankau, E. W., Oertli, E. H. & Maki, J. Challenges to controlling rabies in skunk populations using oral rabies vaccination: A review. Zoonoses Public. Health 65, 373–385, https://doi.org/10.1111/zph.12471 (2018).

63.   Fry, T., Van Dalen, K., Hurley, J. & Nash, P. Mucosal adjuvants to improve wildlife rabies vaccination. J. Wildl. Dis. 48, 1042–1046, https://doi.org/10.7589/2011-11-331 (2012).

64.   Borsutzky, S. et al. Te mucosal adjuvant macrophage-activating lipopeptide-2 directly stimulates B lymphocytes via the TLR2 without the need of accessory cells. J. Immunol. 174, 6308–6313 (2005).

65.   Benediktsdottir, B. E., Baldursson, O. & Masson, M. Challenges in evaluation of chitosan and trimethylated chitosan (TMC) as mucosal permeation enhancers: From synthesis to in vitro application. J. controlled release: Of. J. Controlled Rel. Soc. 173, 18–31 (2014).

66.   Sharma, S., Kulkarni, J. & Pawar, A. P. Permeation enhancers in the transmucosal delivery of macromolecules. Pharmazie 61, 495–504 (2006).

67.   Conzelmann, K. H., Cox, J. H., Schneider, L. G. & Thiel, H. J. Molecular Cloning and Complete Nucleotide Sequence of the Attenuated Rabies Virus SAD B19. Virology 175, 485–499, https://doi.org/10.1016/0042-6822(90)90433-R (1990).

68.   Schnell, M. J., Mebatsion, T. & Conzelmann, K. K. Infectious Rabies Viruses from Cloned Cdna. EMBO J. 13, 4195–4203 (1994).

69.   Finke, S., Granzow, H., Hurst, J., Pollin, R. & Mettenleiter, T. C. Intergenotypic replacement of lyssavirus matrix proteins demonstrates the role of lyssavirus M proteins in intracellular virus accumulation. J. Virol. 84, 1816–1827, https://doi.org/10.1128/ JVI.01665-09 (2010).

70.   Hoffmann, B. et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR “double check” strategy. J. Clin. Microbiol. 48, 3970–3978, https://doi.org/10.1128/JCM.00612-10 (2010).

71.   Webster, W. A. A tissue culture infection test in routine rabies diagnosis. Can. J. Vet. Res. 51, 367–369 (1987).

72.   Webster, W. A. & Casey, G. A. Virus isolation in neuroblastoma cell culture. In Laboratory techniques in rabies, 4th ed.; Meslin, F. X., Kaplan, M. M. & Koprowski, H., Eds. World Health Organization: Geneva, pp. 93–104 (1996).

73.   Orbanz, J. & Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Arch. Virol. 155, 1631–1641, https://doi.org/10.1007/s00705-010-0743-8 (2010).

 

Sumber:

Verena te Kamp et al., 2020. Responsiveness of various reservoir species to oral rabies vaccination correlates with differences in vaccine uptake of mucosa associated lymphoid tissues. Scientific Reports volume 10, Article number: 2919 (2020) Nature Report.