Studi Kolaboratif untuk Validasi Uji Potensi Serologis Vaksin Rabies (inaktif) untuk Penggunaan Veteriner

 

ABSTRAK

 

Monograf 0451 dalam Farmakope Eropa (Ph. Eur.) mengenai vaksin rabies (inaktif) untuk penggunaan veteriner menjelaskan uji potensi batch in vivo yang didasarkan pada uji NIH. Uji ini menggunakan sejumlah besar tikus dan mengakibatkan tingkat penderitaan yang signifikan. Demi kepentingan penggantian, pengurangan, dan penyempurnaan uji hewan (3R), suatu uji potensi serologis untuk vaksin rabies (inaktif) untuk hewan, yang dikembangkan dan divalidasi di Institut Paul-Ehrlich, telah dievaluasi dalam studi kolaboratif yang diselenggarakan oleh EDQM (Direktorat Eropa untuk Kualitas Obat dan Perawatan Kesehatan). Tujuannya adalah untuk menunjukkan transferabilitas yang lebih luas dari uji yang diusulkan dan mengkonfirmasi kesesuaiannya. Studi ini melibatkan 13 laboratorium dan mengevaluasi 4 vaksin berbeda dari pasar Uni Eropa. Hasil studi mengonfirmasi bahwa uji batas dengan menggunakan jumlah hewan yang relatif sedikit dalam uji serologis dapat dilakukan, dapat diulang, dan dapat diandalkan. Jumlah hewan optimal per vaksin spesifik terhadap produk, tetapi secara umum dapat berkisar antara 8 hingga 10 untuk produk yang termasuk dalam studi ini. Hewan yang tidak merespons harus dimasukkan dalam analisis karena dapat mencerminkan vaksin yang kurang poten. Namun, mungkin perlu diberlakukan batas maksimum jumlah hewan yang tidak merespons yang diizinkan untuk vaksin referensi sebagai pemantau validitas uji. Uji ini memberikan peningkatan signifikan dalam aspek 3R, baik dalam jumlah hewan yang digunakan maupun tingkat penderitaan yang dialami, serta memberikan format uji yang lebih andal dan dapat diulang dibandingkan dengan uji tantangan vaksinasi. Uji ini juga mengurangi waktu yang dibutuhkan dibandingkan dengan uji tantangan vaksinasi. Direkomendasikan kepada kelompok ahli Ph. Eur. 15V agar uji ini dimasukkan sebagai alternatif untuk uji potensi batch dalam monograf Ph. Eur. 0451.

 

1. TUJUAN

 

Tujuan dari studi kolaboratif ini adalah untuk menunjukkan transferabilitas yang lebih luas dari uji yang diusulkan dan mengkonfirmasi kesesuaiannya untuk uji potensi vaksin rabies inaktif untuk penggunaan veteriner.

 

2. PENDAHULUAN

 

Monograf 0451 dalam Farmakope Eropa (Ph. Eur.) mengenai vaksin rabies (inaktif) untuk penggunaan veteriner [1] menjelaskan dalam bagian 3-5 sebuah uji potensi batch in vivo yang didasarkan pada uji NIH dan melibatkan uji tantangan vaksinasi dengan vaksin uji dan referensi. Bagian 2-4-3 dari monograf 0451 mengizinkan penggantian uji tantangan vaksinasi untuk potensi batch dengan metode alternatif yang divalidasi dan secara singkat menjelaskan uji berbasis serologi.

 

Uji tantangan vaksinasi diketahui memerlukan banyak hewan dan merupakan uji yang sangat berat bagi hewan. Uji ini juga diketahui memiliki variabilitas yang tinggi dan sering mengalami masalah dalam memenuhi semua kriteria validitas [2, 3]. Meskipun terdapat kemungkinan untuk menggunakan uji alternatif, uji tantangan vaksinasi masih banyak digunakan untuk pelepasan batch vaksin rabies inaktif untuk penggunaan veteriner karena upaya untuk menggunakan uji serologis yang diuraikan dalam monograf Ph. Eur. belum memberikan hasil yang meyakinkan.

 

Demi menerapkan prinsip 3R untuk alternatif uji hewan yang lebih manusiawi [4] dan untuk meningkatkan keselarasan uji dengan potensi reproduktibilitas yang lebih baik, Institut Paul-Ehrlich (PEI) telah mengembangkan dan memvalidasi uji serologi alternatif di laboratorium mereka [5]. Uji yang dipublikasikan melibatkan imunisasi kelompok tikus dengan vaksin uji yang telah diencerkan sesuai atau vaksin standar referensi yang disesuaikan dengan potensi minimum yang diperbolehkan. Empat belas hari setelah imunisasi, sampel darah diambil dan sera diuji secara individual untuk antibodi rabies menggunakan uji netralisasi virus dengan metode deteksi fluoresensi. Dilusi sera yang mengurangi jumlah sel fluoresen hingga 50 persen dihitung. Vaksin dianggap lolos uji jika titer antibodi yang diperoleh dari vaksin uji lebih besar atau sama dengan titer antibodi yang diperoleh dari standar referensi (P=0,95). Dua uji serupa, yaitu Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) dan Fluorescent Antibody Virus Neutralisation test (FAVN), dijelaskan dalam Manual Uji Diagnostik dan Vaksin dari Organisasi Kesehatan Hewan Dunia (OIE) dalam bab yang membahas rabies sebagai teknik standar yang disetujui [6].

 

Dr. Krämer mempresentasikan dengan meyakinkan uji potensi batch vaksin yang diuraikan dalam publikasi [5] serta data validasi dari laboratoriumnya pada pertemuan tahunan OMCL yang terlibat dalam pelepasan batch vaksin veteriner pada Mei 2008 di Strasbourg, dan kepada Komite Pengarah Standarisasi Biologi Farmakope Eropa pada Juni 2008 di Strasbourg. Hasilnya, Komite Pengarah Standarisasi Biologi menyetujui studi kolaboratif untuk memvalidasi transferabilitas yang lebih luas dari uji yang diusulkan dan mengkonfirmasi kesesuaiannya untuk vaksin rabies inaktif di pasar Eropa. Sebuah fase uji kelayakan skala kecil menunjukkan bahwa uji tersebut dapat berhasil ditransfer ke laboratorium lain, dan studi kolaboratif berikutnya kemudian dilaksanakan.

 

3. PARTISIPAN

 

Sebanyak 13 laboratorium dari 10 negara, termasuk Negara Anggota UE, Kanada, dan AS, berpartisipasi dalam studi kolaboratif ini. Dari jumlah tersebut, 8 laboratorium adalah laboratorium kontrol resmi dari Otoritas Regulatori, dan 5 lainnya adalah produsen. Partisipan dicantumkan secara alfabetis berdasarkan negara pada bagian 9 laporan ini. Sepanjang laporan ini, para partisipan disebut dengan nomor kode yang tidak berkaitan dengan urutan daftar.

 

4. RANCANGAN STUDI

 

4.1. Prinsip Uji

Uji serologis yang digunakan melibatkan imunisasi kelompok tikus sebanyak 6 ekor dengan sekitar 1/5 volume dosis yang direkomendasikan dari vaksin uji yang telah diencerkan dengan tepat atau vaksin standar referensi yang disesuaikan dengan potensi minimum yang diizinkan dalam Ph. Eur. Empat belas hari setelah imunisasi, sampel darah diambil, dan serum diuji secara individual untuk antibodi rabies menggunakan uji netralisasi virus yang telah dijelaskan. Singkatnya, serum dititrasi pada pelat mikrotiter 96 sumur dan diinkubasi selama 1 jam dengan virus rabies. Setelah menambahkan sel BHK dan menginkubasi selama 48 jam, keberadaan virus rabies yang tidak ternetralisasi terungkap melalui imunofluoresensi. Dilusi serum yang mengurangi jumlah sel fluoresen sebesar 50 persen dihitung.

 

4.2. Desain Uji

Laboratorium diminta untuk menguji potensi dari 4 vaksin rabies inaktif yang berbeda untuk penggunaan veteriner dengan metode serologis kandidat. Sampel diberi kode (A-D) agar identitasnya tidak terungkap. Vaksin-vaksin tersebut mewakili berbagai produk yang tersedia di pasar UE dan diproduksi oleh produsen yang berbeda. Tiga pengulangan independen dari uji dengan 4 vaksin uji dan preparasi referensi harus dilakukan. Aktivitas netralisasi serum dari vaksin uji dinilai untuk kepatuhan dengan membandingkannya terhadap aktivitas vaksin referensi yang ditetapkan pada potensi minimum yang diperbolehkan.

 

Selain itu, para partisipan diberikan panel serum uji yang terdiri dari 3 jenis serum yang telah disiapkan dengan label Tinggi, Sedang, dan Rendah untuk diuji dalam uji netralisasi virus. Panel serum tersebut harus diuji pada 3 kesempatan yang berbeda. Semua uji termasuk sampel serum negatif.

 

Sebagai tambahan dari studi utama, 1 laboratorium bersedia untuk menguji ulang masing-masing sampel uji menggunakan uji tantangan vaksinasi Ph. Eur. untuk vaksin rabies (inaktif) untuk penggunaan veteriner (monograf Ph. Eur. 0451) guna mengonfirmasi potensi dari sampel uji.

 

4.3. Bahan

4.3.1. Bahan yang Disediakan oleh EDQM

4.3.1.1. Sampel Uji

Sampel A

Lot saat ini dari Rabdomun (Essex Animal Health-Pfizer) yang diproduksi secara komersial. Vaksin rabies (inaktif) dalam bentuk cair dengan strain Flury LEP. Dosis: 1 mL/dosis. Spesifikasi yang disetujui: >1 IU/dosis. Potensi yang diperkirakan oleh produsen saat dirilis: 7,3 IU/mL.

 

Sampel B

Lot saat ini dari Rabigen (Virbac) yang diproduksi secara komersial. Vaksin rabies (inaktif) dalam bentuk cair dengan strain PRV. Dosis: 1 mL/dosis. Spesifikasi yang disetujui: >1 IU/dosis. Potensi yang diperkirakan oleh produsen saat dirilis: 15 IU/mL.

 

Sampel C

Lot kedaluwarsa (tanggal kedaluwarsa 06, 2005) dari Biocan R inj. a.u.v. (Bioveta, a.s.) yang diproduksi secara komersial. Vaksin rabies (inaktif) dalam bentuk cair dengan strain SAD Vnukovo. Dosis: 1 mL/dosis. Spesifikasi yang disetujui: >2 IU/dosis. Potensi yang diperkirakan oleh produsen saat dirilis pada tahun 2003: 3 IU/mL. Potensi yang ditentukan oleh PEI pada tahun 2009: 0,25 IU/mL.

 

Sampel D

Lot saat ini dari Nobivac Rabies (Intervet/Schering-Plough Animal Health) yang diproduksi secara komersial. Vaksin rabies (inaktif) dalam bentuk cair dengan strain PRV. Dosis: 1 mL/dosis. Spesifikasi yang disetujui: >3 IU/dosis. Potensi yang diperkirakan oleh produsen saat dirilis: 8 IU/mL.

Semua sampel uji disumbangkan oleh produsen terkait. Setiap laboratorium menerima 6 vial (2 per uji) dari setiap sampel uji yang harus disimpan pada suhu 4°C setelah diterima.

 

4.3.1.2. Serum Kontrol (CS)

Serum kontrol disiapkan dan diuji sebelumnya di laboratorium salah satu pemimpin proyek di PEI.

Setiap jenis serum disediakan dalam 3 vial berisi 100 μL dan harus disimpan pada suhu -20 °C setelah diterima (1 vial per uji).

• Serum “rendah”

Rata-rata aktivitas yang diperkirakan dari 10 uji: 2,4 IU/mL, SD 0,98.

• Serum “sedang”

Rata-rata aktivitas yang diperkirakan dari 10 uji: 5,8 IU/mL, SD 1,12.

• Serum “tinggi”

Rata-rata aktivitas yang diperkirakan dari 10 uji: 28,1 IU/mL, SD 10,04.

• Serum negati

Aktivitas yang sangat rendah atau dapat diabaikan.

 

4.3.1.3. Bahan Referensi

Ph. Eur. BRP batch 4

Sediaan kering beku dengan 11 IU/vial yang harus dilarutkan dalam 1 mL larutan fosfat buffer saline (PBS) pH 7.1. Disimpan pada suhu -70 °C setelah diterima. Setiap laboratorium menerima 3 vial.

 

2nd WHO IS untuk imunoglobulin rabies (RAI) 30 IU/ampul

Bahan ini harus dilarutkan dan diencerkan dalam 15 mL PBS. Setelah benar-benar tersuspensi, bahan ini harus dibagi dalam volume 150 μL dan disimpan pada suhu -70 °C hingga digunakan. Setiap laboratorium menerima 1 vial.

 

4.3.1.4. Reagen Khusus

Antibodi berlabel fluorescein

Konjugat antibodi rabies fluorescein (FDI, Microtest) yang harus dilarutkan dalam 5 mL Aqua dest. 4 alikuot berisi 1,25 mL telah disiapkan dan disimpan pada suhu -20 °C setelah diterima. Setiap laboratorium menerima 1 vial.

 

4.3.2. Bahan Lain yang Disediakan oleh Peserta

Rabies adalah penyakit zoonosis dan bersifat patogen bagi manusia. Saat bekerja dengan virus rabies, aturan keselamatan hayati lokal untuk bahan ini harus diterapkan secara ketat. Pengujian harus dilakukan di laboratorium dengan keamanan yang memadai. Staf laboratorium harus terbiasa dengan penanganan virus rabies. Hanya orang dengan titer antibodi rabies yang cukup yang boleh melakukan pengujian rabies.

 

4.3.2.1. Instrumen dan Bahan

• Aliran laminar
• Inkubator CO2
• Mikroskop fluoresensi, filter 450-490 nm
• Penangas air (37°C)
• Pengocok tabung uji (misalnya Vortex)
• Mikrotiter 96 sumur, dasar datar (Nunc, Greiner)
• Pipet variabel (misalnya 10-100 μL, 100-1000 μL)
• Pipet multi-saluran (50-200 μL)
• Suntikan (1 mL), jarum (0,45 x 25 mm, 26Gx1) untuk vaksinasi, (0,60 x 25 mm, 23Gx1) untuk pengambilan darah
• Tabung serum (1 mL, Eppendorf, Sarstedt)

 

4.3.2.2. Reagen, Media, Sel

• Sel BHK-21, 2,5 x 10⁵ sel/mL
• Virus tantangan rabies (diadaptasi pada sel BHK-21), diencerkan hingga 100 CCID50/50 μL MEM-Earle (Biochrom AG Cat.No. F0315)
• Media pertumbuhan sel dengan 10% FCS (1 L MEM-Earle dengan 10 mL L-glutamin, 10 mL NEA, 100 mL FCS)
• Media pengencer tanpa FCS
• PBS, pH 7.1
• 80% Aseton (diencerkan dengan H₂O)
• Anestesi tikus (misalnya Ketamin 10 mg/mL dengan Xylazin 0,4 mg/mL; aplikasi: 0,1 mL intraperitoneal per 10 g berat hewan)

 

4.3.2.3. Hewan

• Tikus NMRI, betina, 18-20 g; 6 tikus per vaksin dan referensi (30 tikus per uji)

4.4. Metode

Para peserta diberi protokol umum untuk melaksanakan uji, dengan rincian yang disediakan di bawah ini.

4.4.1. Persiapan Serum

Untuk setiap uji:

6 hewan untuk vaksin uji dan 6 hewan untuk standar referensi. Hewan diadaptasikan selama 2-3 hari sebelum imunisasi.

 

4.4.1.1. Persiapan sampel untuk injeksi

Standar BRP4 dilarutkan dan diencerkan hingga 1 IU/mL menggunakan PBS (1 mL BRP4 + 10 mL PBS).

• Sampel A: tidak diencerkan
• Sampel B: tidak diencerkan
• Sampel C: diencerkan 1:2 menggunakan PBS (1 mL vaksin + 1 mL PBS)
• Sampel D: diencerkan 1:3 menggunakan PBS (1 mL vaksin + 2 mL PBS)

 

4.4.1.2. Imunisasi

6 ekor tikus divaksinasi masing-masing dengan vaksin uji atau standar BRP4. Setiap tikus disuntikkan secara intraperitoneal dengan 0,2 mL vaksin atau BRP (disiapkan sesuai penjelasan di atas).

 

4.4.1.3. Pengambilan darah dan persiapan serum

Darah diambil 14 hari setelah imunisasi melalui puncture jantung setelah hewan dibius (puncture post-mortem dan pengambilan darah jugularis dapat diterima sebagai alternatif). Dalam setiap metode, staf harus terlatih dan berpengalaman. Anestesi yang digunakan perlu diuji pada 2-3 tikus kontrol sebelum uji. Serum dipisahkan setelah sentrifugasi (5.500 x g) dan disimpan pada suhu -20°C hingga pengujian netralisasi dilakukan.

 

4.4.2. Uji Netralisasi

Setiap uji membutuhkan:

• 2 pelat kontrol
• 2 pelat per sampel uji
• 2 pelat untuk standar referensi (BRP 4)

 

4.4.2.1. Persiapan pelat dan netralisasi

Persiapkan:

• Serum standar RAI 30 IU/mL (IS) diencerkan hingga 2 IU/mL.
• Sel BHK-21, 2,5 x 10⁵ sel/mL.
• Larutan kerja CVS = virus tantangan rabies (diadaptasi pada sel BHK-21) diencerkan hingga 100 CCID₅₀/50 μL.

 

Titrasi Virus:

Siapkan seri pengenceran 10 kali lipat (10⁻¹-10⁻⁴) dari larutan kerja untuk pelat kontrol; gunakan 50 μL setiap pengenceran virus (100 -10⁻⁴) per sumur.

PELAT KONTROL 1 (REFERENSI PADA TATA LETAK PELAT)

Titrasi RAI

• Tempatkan 80 μL media pada sumur A1-A6, 50 μL media pada sumur B1-G6, dan 200 μL media pada sumur H1-H6.
• Tambahkan 20 μL RAI (2 IU/mL) pada sumur A1-A6. Transfer 50 μL dari setiap sumur dari baris A ke H, buang 200 μL dari sumur H1-H6.

Titrasi Virus

Tempatkan 50 μL media pada sumur A7-E12. Tambahkan 50 μL setiap pengenceran virus (100 -10⁻⁴) sesuai instruksi.

Kontrol Negatif

Tempatkan 40 μL media pada sumur G7-G12 dan tambahkan 10 μL serum negatif pada setiap sumur.

Kontrol Sel

Tempatkan 100 μL media pada sumur H7-H12.

 

PELAT KONTROL 2 DAN PELAT TITRASI SERUM (REFERENSI PADA TATA LETAK PELAT)

• Tempatkan 80 μL media pada sumur A1-A12.
• Tempatkan 50 μL media pada sumur B1-G12.
• Tempatkan 200 μL media pada sumur H1-H12.
• Lakukan langkah pengenceran 2 kali lipat dengan 4 replikasi untuk setiap serum kontrol atau serum uji: pipet 20 μL serum uji pertama pada sumur A1-A4, 20 μL serum uji kedua pada sumur A5-A8, dan seterusnya. Transfer 50 μL setiap pengenceran serum dari baris A ke B hingga H. Buang 200 μL dari baris H.

Tambahkan 50 μL larutan kerja CVS ke setiap sumur di pelat kontrol 2 dan pelat titrasi serum, serta ke sumur RAI dan NC pada pelat kontrol 1.

• Inkubasi pelat selama 1 jam pada suhu 37°C dalam inkubator CO₂.
• Tambahkan 100 μL suspensi sel BHK-21 (2,5 x 10⁵ sel/mL) ke setiap sumur di pelat titrasi serum dan di setiap sumur pada pelat kontrol.
• Inkubasi pelat pada suhu 37°C dalam inkubator CO₂ selama 48 jam ± 1 jam.

 

4.4.2.2. Pewarnaan sel yang terinfeksi (hari ke-2) (48 jam ± 1 jam)

• Buang medium dan cuci MTP sekali dengan menambahkan 100 μL PBS ke setiap sumur.
• Buang PBS, tambahkan 100 μL aseton (80% pada suhu ruang) per sumur.
• Inkubasi MTP selama 30 menit pada suhu ruang.
• Buang aseton dan keringkan MTP di udara.
• Encerkan alikuot konjugat rabies 1:100 dengan PBS (misalnya 1,2 mL konjugat + 118,8 mL PBS).
• Tambahkan 90 μL konjugat per sumur dan inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit.
• Buang konjugat, cuci dua kali dengan 150 μL PBS dan sekali dengan 150 μL air suling.
• Keringkan MTP di udara.

 

4.4.2.3. Evaluasi Tes

Baca pelat di bawah mikroskop UV (pembesaran 100 kali) dan catat hasilnya pada protokol uji:

• Virus dinetralisir → Imunofluoresensi negatif (tanda –)
• Virus tidak dinetralisir → Imunofluoresensi positif (tanda +)

Tes valid jika:

• semua kontrol sel (CC) bebas dari sel fluoresens;
• titer CVS yang digunakan berada di antara 1,5 dan 2,5 log₁₀ ID₅₀/50 μL.

Vaksin memenuhi syarat jika uji batas satu sisi (uji tepat Wilcoxon-Mann-Whitney) menunjukkan bahwa titer antibodi yang diperoleh dengan vaksin uji lebih tinggi daripada titer antibodi yang diperoleh untuk standar (P=0,95).

 

5. HASIL

 

Sebanyak 13 laboratorium mengirimkan hasil dari pengujian. Dalam laporan ini, mereka dirujuk dengan nomor kode mereka (1 hingga 13) yang diberikan secara acak dan tidak harus sesuai dengan urutan daftar peserta. Sebelas dari 13 laboratorium melakukan 3 pengujian independen penuh menggunakan 6 tikus per pengujian dan per vaksin, sesuai permintaan. Laboratorium 10 melaporkan hasil dari 1 pengujian saja, dan laboratorium 13 melakukan 3 pengujian menggunakan 6 tikus per pengujian per vaksin, tetapi semua serum dievaluasi dalam eksperimen yang sama. Evaluasi statistik dilakukan di EDQM.

 

5.1. Aktivitas Serum melalui Serologi

Rasio netralisasi virus dianalisis secara statistik menggunakan perangkat lunak CombiStats [7]. Kurva dosis/respon diperkirakan menggunakan model probit [8]. Jika kemiringan tidak dapat diperkirakan, metode Spearman/Kaerber digunakan. Aktivitas relatif per serum dihitung terhadap Standar Internasional ke-2 untuk RAI. Lembar contoh disediakan dalam Lampiran 1. Aktivitas di bawah batas kuantifikasi ditetapkan menjadi 0 IU/mL dan disebut sebagai "non-responders" dalam laporan ini. Aktivitas di atas batas kuantifikasi ditetapkan menjadi 999 IU/mL, yang merupakan nilai yang dipilih secara arbitrer lebih tinggi dari aktivitas tertinggi yang dapat diukur dengan desain yang dipilih. Nilai pastinya tidak relevan karena analisis selanjutnya didasarkan pada urutan peringkat. Lebih nyaman bekerja dengan aktivitas dalam skala aritmetika dan ditransformasi ke logaritma setelah penambahan 1 IU/mL untuk menghindari masalah dengan non-responders. Semua titer yang ditransformasi berada dalam rentang 0 (untuk non-responders) hingga 3 (untuk full responders). Tinjauan lengkap disajikan di Tabel 1 dan penyajian grafis dari data diberikan dalam Gambar 1.

 

Untuk menilai variasi intra- dan antar-laboratorium yang disebabkan oleh metode serologi itu sendiri, 3 serum kontrol yang disediakan secara terpusat dimasukkan dalam setiap uji. Semua laboratorium menyediakan data dari 3 pengujian independen sesuai permintaan, kecuali laboratorium 13 yang hanya menyediakan 1 set data. Aktivitas yang ditransformasikan ke log tercantum dalam Tabel 2, dan representasi grafis dari nilai rata-rata per laboratorium ditampilkan dalam Gambar 2. Rata-rata keseluruhan serum adalah 0,44 IU/mL, 0,85 IU/mL, dan 1,38 IU/mL untuk serum kontrol rendah, sedang, dan tinggi, dengan deviasi standar masing-masing 0,13 IU/mL, 0,18 IU/mL, dan 0,23 IU/mL. Ini menunjukkan bahwa terdapat pemisahan yang memadai antara ketiga serum dan bahwa sebagian besar hasil individu berada dalam rentang 2 kali lipat di sekitar rata-rata keseluruhan.

 

5.2. Potensi Vaksin

Potensi vaksin uji A, B, C, dan D dinilai dengan membandingkan aktivitas serum yang diinduksi dengan yang dihasilkan oleh persiapan referensi BRP Batch 4 (potensi yang ditetapkan 11 IU/vial). Skema pengenceran dirancang dengan hati-hati untuk diskriminasi optimal (lulus/gagal) pada tingkat kritis potensi yang tertera. BRP harus diencerkan menjadi 1 IU/mL dan 0,2 mL harus disuntikkan ke tikus, yang diharapkan akan menginduksi aktivitas terukur pada ujung bawah regresi dosis-respons. Vaksin uji harus diberikan pada dosis 0,2 IU berdasarkan potensi yang tertera. Untuk vaksin A dan B, yang masing-masing memiliki potensi tertera 1 IU/mL, ini berarti 0,2 mL vaksin yang tidak diencerkan. Jika vaksin uji menginduksi aktivitas yang lebih tinggi daripada BRP pada dosis ini, dapat disimpulkan bahwa dosis yang disuntikkan sebenarnya lebih dari 0,2 IU, dan sampel asli mengandung setidaknya 1 IU/mL. Untuk vaksin C dan D, yang masing-masing memiliki potensi tertera 2 IU/mL dan 3 IU/mL, ini berarti pengenceran 1:2 dan 1:3 sebelum penyuntikan 0,2 mL ke tikus. Jika aktivitas yang diinduksi lebih tinggi dari BRP, dosis yang disuntikkan sebenarnya lebih dari 0,2 IU, sehingga sampel yang diencerkan mengandung lebih dari 1 IU/mL. Maka, sampel yang tidak diencerkan masing-masing mengandung setidaknya 2 IU/mL dan 3 IU/mL.

 

Aktivitas dibandingkan dengan uji tepat satu sisi Wilcoxon-Mann-Whitney [9] menggunakan perangkat lunak CombiStats. Uji ini adalah uji non-parametrik berdasarkan urutan peringkat dan tahan terhadap distribusi tidak normal dan nilai ekstrem. Jika uji signifikan (P<0,05) dan respons rata-rata dari vaksin uji lebih tinggi dari rata-rata BRP, vaksin dikatakan lolos uji pelepasan. Jika tidak, vaksin gagal atau pengujian tambahan mungkin diperlukan. Perlu dicatat bahwa nilai p yang signifikan saja tidak cukup, karena juga dapat mengindikasikan bahwa vaksin uji secara signifikan kurang poten daripada batas yang diperlukan. Hal ini disebabkan perangkat lunak menentukan arah satu sisi uji berdasarkan respons rata-rata. Lembar contoh diberikan dalam Lampiran 2. Tinjauan nilai p yang dihasilkan tercantum dalam Tabel 3a untuk pengujian individual (6 tikus per vaksin) dan dalam Tabel 3b untuk hasil gabungan per laboratorium (18 tikus).

 

Sebagai bagian dari studi, 1 laboratorium melakukan uji tantangan pada tikus untuk mengonfirmasi potensi yang diharapkan. Ditemukan bahwa potensi masing-masing adalah 9,2 IU/vial, 3,9 IU/vial, 2,1 IU/vial, dan 19,2 IU/vial untuk vaksin A, B, C, dan D. Sebelum studi, pemimpin proyek juga menentukan potensi vaksin C menggunakan uji in vivo, dengan hasil rata-rata 0,25 IU/mL dari 2 pengujian.

 

Vaksin C dimasukkan dalam studi ini karena diketahui memiliki potensi rendah dan diharapkan gagal dalam uji. Vaksin lainnya diharapkan lolos. Seperti yang dapat dilihat dalam Tabel 3a, hal ini dikonfirmasi di sebagian besar pengujian dengan keputusan yang benar dalam 90%, 90%, 97%, dan 74% pengujian untuk masing-masing 4 vaksin uji. Ketika hasil dari 18 tikus per laboratorium digabungkan, jumlah keputusan yang benar mencapai 100% untuk vaksin A dan B. Laboratorium 2 mengalami masalah berulang dalam penilaian vaksin C, sementara laboratorium 5 memiliki masalah berulang dalam penilaian vaksin D. Karena keputusan lulus/gagal sangat jelas dan dapat direproduksi di semua laboratorium lainnya, akan berguna untuk menyelidiki mengapa kedua laboratorium ini berbeda jauh dari hasil keseluruhan.

 

5.3. Pengecualian atau Penyertaan Non-Responden

Diketahui bahwa beberapa hewan cenderung tidak menunjukkan respons imun, bahkan pada dosis yang relatif tinggi. Untuk mengatasi masalah ini, disarankan untuk mengecualikan non-responden dari analisis statistik. Nilai p yang dihasilkan setelah mengecualikan non-responden ditampilkan juga dalam Tabel 3a dan 3b. Namun, seperti yang terlihat pada Tabel 1, jumlah non-responden cenderung bergantung pada potensi vaksin. Tingkat non-responden adalah 5,9% untuk BRP, 3,6% untuk vaksin A, 2,3% untuk vaksin B, 7,2% untuk vaksin C, dan 2,7% untuk vaksin D. Tingkat non-responden pada vaksin sub-potent C jauh lebih tinggi dibandingkan dengan vaksin berpotensi tinggi A, B, dan D. Hal ini menunjukkan bahwa pengecualian non-responden dapat membias hasil uji karena ketidakresponsifan mungkin tidak sepenuhnya merupakan karakteristik intrinsik hewan, melainkan mencerminkan potensi vaksin yang kurang. Selain itu, seperti yang terlihat pada Tabel 3a dan 3b, pengecualian non-responden tidak memperbaiki jumlah keputusan lulus/gagal yang benar. Oleh karena itu, untuk mencerminkan potensi sebenarnya, non-responden harus tetap dimasukkan dalam analisis. Namun, mungkin perlu menetapkan batas maksimum jumlah non-responden yang diperbolehkan untuk vaksin referensi, misalnya tidak lebih dari 1 non-responden dalam satu set dari 6, atau tidak lebih dari 2 dalam satu set dari 8, untuk memantau validitas uji. Contoh perhitungan untuk menentukan jumlah tersebut disediakan dalam lampiran 3.

 

5.4. Jumlah Hewan yang Dibutuhkan

Seperti yang dapat diperkirakan, jumlah keputusan lulus/gagal yang benar meningkat seiring dengan jumlah hewan yang disertakan dalam uji. Sebanyak 6 hewan per vaksin mungkin cukup untuk vaksin yang jauh di atas potensi yang ditentukan, tetapi untuk vaksin yang mendekati batas ini, jumlah hewan yang lebih banyak mungkin diperlukan. Seperti yang terlihat pada Tabel 3b, jumlah keputusan lulus/gagal yang benar di banyak laboratorium hampir mencapai 100% ketika hasil dari 18 tikus digabungkan. Jumlah hewan yang optimal kemungkinan kurang dari 18. Untuk memperoleh gambaran tentang jumlah hewan yang optimal untuk vaksin yang termasuk dalam studi ini, hasilnya diajukan untuk bootstrap resampling untuk ukuran sampel antara 3 dan 12 yang diambil dari 18 tikus, dengan penggantian dan mengabaikan variasi antar-uji. Tingkat perkiraan keputusan "lulus" tercantum dalam Tabel 4. Setiap persentase merupakan hasil dari 100.000 simulasi bootstrap. Idealnya, persentase tersebut harus 100% untuk vaksin A, B, dan D, serta 0% untuk vaksin C. Terlihat bahwa daya diskriminasi yang memadai dapat dicapai dalam banyak kasus dengan menggunakan 8-10 hewan. Penggunaan hanya 6 hewan mungkin cukup dalam beberapa kasus, namun secara umum, disarankan untuk menggunakan setidaknya 8 hewan. Penggunaan lebih dari 10 hewan tidak meningkatkan daya uji secara signifikan.

 

6. DISKUSI

 

Monografi Ph. Eur. 0451 tentang vaksin rabies (inaktivasi) untuk penggunaan veteriner [1] menguraikan dalam bagian 3-5 uji potensi batch in vivo yang didasarkan pada uji NIH dan melibatkan uji tantangan vaksinasi dengan vaksin uji dan vaksin referensi. Sebuah uji in vivo tunggal untuk satu vaksin uji membutuhkan setidaknya 100 hewan. Karena sifat uji yang bervariasi dan kesulitan yang dihadapi dalam memenuhi kriteria validitas, seringkali perlu dilakukan pengulangan uji [2,3]. Bagian 2-4-3 dari monografi 0451 memungkinkan penggantian uji tantangan vaksinasi untuk potensi batch dengan metode alternatif yang tervalidasi dan secara singkat menjelaskan uji berbasis serologi. Meskipun ada kemungkinan menggunakan uji serologis, hingga saat ini hal ini belum diterapkan.

 

B. Krämer dkk di PEI telah mengembangkan dan memvalidasi uji potensi serologis untuk vaksin rabies (inaktivasi) untuk penggunaan veteriner yang secara signifikan mengurangi jumlah hewan yang diperlukan dan mengurangi penderitaan yang timbul [5]. Tujuan dari studi kolaboratif ini adalah untuk menunjukkan transferabilitas yang lebih luas dari uji yang diusulkan dan mengonfirmasi kesesuaiannya untuk uji potensi vaksin rabies inaktivasi untuk penggunaan veteriner dengan tujuan akhir mendorong penggunaannya sebagai metode pengganti untuk uji tantangan vaksinasi untuk potensi batch. Studi ini melibatkan 13 laboratorium yang menguji 4 vaksin berbeda dari pasar Eropa dengan komposisi strain yang berbeda. Salah satu sampel tersebut diketahui memiliki potensi yang kurang. Serum kontrol yang disediakan secara terpusat dengan aktivitas yang berbeda juga disediakan untuk membantu mengevaluasi aspek in vitro dari metode ini.

 

Hasil menggunakan serum kontrol yang disediakan umum dengan potensi tinggi, sedang, dan rendah (Tabel 2 dan Gambar 2) menunjukkan variasi intra- dan antar-laboratorium yang baik dari komponen in vitro dari metode tersebut, seperti yang dibuktikan dengan pemisahan yang memadai antara ketiga serum tersebut dan sebagian besar hasil individu yang berada dalam kisaran 2 kali lipat dari rata-rata keseluruhan. Uji tantangan vaksinasi tradisional diketahui sangat bervariasi [2,3], dan sebagai cerminan dari ini, spesifikasi dalam monografi Ph. Eur. 0451 ditetapkan dengan batas kepercayaan tidak kurang dari 25 persen dan tidak lebih dari 400 persen dari potensi yang diperkirakan. Studi ini menunjukkan bahwa metode yang diusulkan dapat memberikan peningkatan signifikan terkait pengulangan dan reprodusibilitas uji. Perlu dicatat juga bahwa uji tantangan vaksinasi membutuhkan waktu setidaknya 4 minggu untuk penyelesaian, belum termasuk persiapan uji dan analisis data. Uji yang diusulkan dapat dilakukan dalam waktu kurang dari 3 minggu, sehingga mengurangi waktu yang dibutuhkan untuk menyelesaikan analisis.

 

Potensi vaksin uji dibandingkan dengan standar referensi (BRP4) menggunakan uji batas non-parametrik berdasarkan urutan peringkat yang tahan terhadap non-normalitas dan outlier. Tiga vaksin dengan potensi yang cukup (A, B, dan D) dan satu dengan potensi yang kurang (C) dievaluasi terhadap BRP. Seperti yang tercatat dalam Tabel 3a dan 3b, sebagian besar uji individu (6 tikus) menghasilkan hasil yang sesuai. Ketika hasil per laboratorium digabungkan (18 tikus), 100 persen hasil yang benar ditemukan untuk vaksin A dan B. Untuk vaksin C dan D, semua laboratorium kecuali 1 menemukan hasil yang benar. Laboratorium 2 memiliki masalah yang berulang dengan vaksin C, dan Laboratorium 5 memiliki masalah yang berulang dengan vaksin D. Tidak jelas mengapa kedua laboratorium ini mengalami perbedaan hasil dalam kasus tertentu ini. Meskipun metode ini baru bagi semua pengguna, tekniknya tampaknya telah ditransfer dengan baik seperti yang dibuktikan oleh hasil untuk vaksin lainnya di laboratorium tersebut. Mungkin ada masalah yang tidak terduga dengan pengenceran untuk uji individu, namun hal ini sulit untuk dipastikan. Semua peserta diminta menggunakan tikus NMRI betina, dan tidak ada yang melaporkan penyimpangan dari strategi ini. Namun, seperti biasa dalam eksperimen hewan, kemungkinan sumber strain yang digunakan dapat menjadi faktor yang berkontribusi pada perbedaan yang diamati.

 

Dalam strategi yang digunakan dalam studi ini, volume dosis vaksin uji yang direkomendasikan adalah 1/5, yang diencerkan dengan tepat, atau dari persiapan vaksin referensi yang disesuaikan dengan potensi minimum yang diizinkan dalam Ph. Eur., yang disuntikkan ke tikus. Persyaratan minimum Ph. Eur. monografi 0451 untuk potensi vaksin rabies inaktivasi untuk penggunaan veteriner adalah 1 IU/dosis. Bahan referensi (BRP4) diencerkan hingga 1 IU/mL (berdasarkan dosis 1 mL) dan 0,2 mL disuntikkan ke setiap tikus. Untuk vaksin uji A dan B, spesifikasi yang disetujui adalah 1 IU/mL sehingga 0,2 mL vaksin diberikan tanpa diencerkan. Namun, beberapa vaksin yang diuji memiliki spesifikasi yang disetujui di atas 1 IU/mL (2 IU/mL untuk vaksin C dan 3 IU/mL untuk vaksin D). Karena aktivitas vaksin uji akan dibandingkan dengan referensi (pada 1 IU/mL), vaksin uji diencerkan dengan tepat (masing-masing 1:2 atau 1:3) sebelum pemberian untuk perbandingan yang valid. Hasil menunjukkan bahwa strategi ini bekerja efektif dalam kondisi yang diberikan. Aplikasi strategi ini untuk vaksin tertentu harus divalidasi berdasarkan kasus per kasus.

 

Dalam pengaturan uji coba pada penelitian ini, 6 hewan digunakan per sampel. Meskipun ini menghasilkan sebagian besar uji coba individual mencapai hasil yang diharapkan, diperkirakan bahwa jumlah keputusan lulus/gagal yang benar meningkat seiring dengan jumlah hewan yang digunakan dalam uji coba. Analisis seluruh data yang tersedia dilakukan menggunakan simulasi untuk menentukan hasil berdasarkan ukuran sampel antara 3 hingga 12, dan hasilnya disajikan pada Tabel 4. Terlihat bahwa hasil yang memadai dengan kekuatan diskriminasi yang cukup dapat dicapai dalam banyak kasus dengan menggunakan 8-10 hewan. Meskipun penggunaan 6 hewan mungkin cukup dalam beberapa kasus, terutama jika potensi vaksin jauh di atas batas yang tertera, secara umum disarankan menggunakan setidaknya 8 hewan. Tergantung pada vaksin, mungkin diperlukan 10 hewan, namun lebih dari 10 tampaknya tidak memberikan keuntungan signifikan. Penggunaan 8-10 hewan per kelompok uji akan secara signifikan mengurangi jumlah hewan yang diperlukan per uji coba menjadi 16-20 (untuk referensi dan uji vaksin per uji coba) dibandingkan dengan 100 pada uji tantangan vaksinasi. Pemilihan akhir ukuran kelompok harus ditentukan berdasarkan bukti yang dikumpulkan selama validasi untuk vaksin tertentu.

 

Dalam setiap percobaan pada hewan, mungkin diharapkan menemukan beberapa hewan yang tidak responsif, yaitu hewan yang tidak menunjukkan reaksi imun meskipun pada dosis yang sangat tinggi. Diusulkan bahwa hewan yang tidak menunjukkan respons dalam uji coba ini dapat dianggap sebagai non-responder dan dikeluarkan dari analisis akhir. Untuk mengevaluasi dampak dari usulan ini, hasil dihitung baik dengan maupun tanpa non-responder yang diduga. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 3a dan 3b. Jumlah hewan yang tidak menunjukkan respons terukur tampaknya bergantung pada potensi vaksin. Jumlahnya lebih rendah pada vaksin A, B, dan D yang memiliki potensi di atas batas, dan lebih tinggi pada vaksin C yang memiliki potensi yang lebih rendah. Tingginya jumlah hewan yang tidak menunjukkan respons terukur pada vaksin C kemungkinan disebabkan oleh adanya non-responder 'sebenarnya' dan kurangnya respons terkait potensi vaksin yang lebih rendah. Oleh karena itu, pengecualian non-responder dapat memberikan bias pada hasil uji coba. Selain itu, pengecualian non-responder tidak meningkatkan jumlah keputusan lulus/gagal yang benar. Oleh karena itu, tidak disarankan untuk menghapus non-responder dari perhitungan akhir. Namun, mungkin berguna untuk memberlakukan batas maksimum jumlah non-responder yang diizinkan untuk vaksin referensi guna menjaga validitas uji coba setelah kondisi uji coba ditetapkan dan divalidasi, misalnya tidak lebih dari 1 non-responder dalam set 6 atau tidak lebih dari 2 dalam set 8 (contoh perhitungan disediakan dalam lampiran 3).

 

Uji coba yang diuraikan dalam studi kolaboratif ini adalah uji batas yang mampu membedakan sampel vaksin yang memiliki nilai potensi di atas minimum yang disetujui. Seperti yang dicatat di bagian 5 dan sepanjang diskusi, validasi individual untuk vaksin tertentu dapat menyesuaikan kekuatan diskriminasi untuk situasi spesifik dengan memilih kondisi yang paling sesuai dalam hal dosis referensi, pengenceran yang digunakan, dan jumlah hewan. Survei terhadap batch vaksin khas dari produsen Uni Eropa menunjukkan bahwa umumnya vaksin diformulasikan dengan margin yang cukup di atas potensi minimum yang diizinkan. Dengan demikian, uji ini dapat menjadi alat yang efektif sebagai uji potensi batch untuk mengonfirmasi kepatuhan terhadap spesifikasi. Ini memberikan keuntungan nyata dalam hal kesejahteraan hewan dan konsistensi uji coba. Namun, dalam kasus di mana potensi batch vaksin uji berada pada batas nilai potensi yang dapat diterima, diperlukan lebih banyak hewan untuk menentukan apakah batch tersebut sedikit di atas atau di bawah batas tersebut. Sebagai alternatif, dalam kasus tersebut uji tantangan vaksinasi dapat digunakan untuk menilai potensi, meskipun uji tantangan vaksinasi juga memiliki keterbatasan, terutama dalam hal presisi.

 

Meskipun hasil akhir dari uji coba adalah uji batas yang tidak melibatkan 'nilai potensi' akhir untuk vaksin uji, aktivitas relatif per serum dihitung terhadap standar umum untuk imunoglobulin rabies (2nd IS RAI) dan uji coba ini mencakup perhitungan rata-rata keseluruhan dari serum dari persiapan uji dan referensi. Nilai-nilai ini, jika dipantau dari waktu ke waktu, dapat digunakan untuk membantu memantau konsistensi uji coba (terkait nilai yang diperoleh untuk BRP) dan konsistensi produksi (dengan mengamati nilai yang diperoleh untuk batch berturut-turut dari vaksin uji).

 

7. KESIMPULAN DAN REKOMENDASI

 

Penelitian ini menunjukkan bahwa uji batas menggunakan jumlah hewan yang relatif kecil dalam uji serologis dibandingkan dengan uji potensi tantangan vaksinasi secara in vivo adalah mungkin, dapat direproduksi, dan dapat diandalkan. Jumlah hewan yang optimal per vaksin bersifat spesifik produk tetapi dapat diperkirakan berada antara 8 dan 10 untuk produk yang termasuk dalam studi ini. Non-responder harus dimasukkan dalam analisis karena mereka dapat mencerminkan vaksin dengan potensi yang lebih rendah. Namun, mungkin perlu memberlakukan batas maksimum jumlah non-responder yang diizinkan untuk vaksin referensi sebagai pemantauan validitas uji coba. Dalam studi ini, perlu untuk menetapkan dosis tertentu untuk referensi yang akan digunakan untuk membandingkan semua vaksin uji, tetapi dosis optimal untuk vaksin referensi dan vaksin uji harus ditentukan selama validasi internal metode untuk lebih meningkatkan kekuatan diskriminatifnya.

 

Uji ini memberikan perbaikan 3R yang signifikan untuk pengujian potensi batch vaksin rabies (inactivated) untuk penggunaan veteriner, baik dari segi jumlah hewan yang digunakan maupun jumlah penderitaan yang ditimbulkan, dan seperti yang dibuktikan oleh studi ini, memberikan format uji yang lebih andal dan dapat direproduksi dibandingkan dengan uji tantangan vaksinasi. Uji ini juga mengurangi waktu yang dibutuhkan dibandingkan dengan uji tantangan vaksinasi. Ph. Eur. sudah mengizinkan penggantian uji yang ditentukan dengan alternatif 3R selama validasi yang cukup telah dilakukan. Studi kolaboratif ini merupakan langkah besar dalam validasi uji semacam itu, dan semua pengguna sangat dianjurkan untuk mengambil langkah-langkah yang diperlukan untuk memvalidasi dan menerapkan uji ini dalam situasi spesifik mereka tanpa penundaan. Sangat disarankan juga agar rincian uji ini dibahas oleh kelompok ahli 15V dari Ph. Eur. untuk dimasukkan sebagai uji alternatif untuk uji potensi batch dalam monograf 0451. Ini akan menjadi langkah penting untuk memfasilitasi implementasi regulasi dari uji ini. Selain itu, mitra internasional didorong untuk meninjau data dan mempertimbangkan penerimaan uji ini dalam sistem mereka sendiri, karena ini merupakan faktor penting dalam keberhasilan penerapan metode alternatif mengingat sifat global industri vaksin veteriner.

 

Tabel 1 – Aktivitas yang diperkirakan per serum (log IU/mL)

 

Gambar 1. Diagram sebar aktivitas serum per vaksin

 

Tabel 2. Aktivitas yang diperkirakan dari serum kontrol (log IU/mL)

Penjelasan: >q.l. = di atas batas kuantifikasi. Hasil ini tidak termasuk dalam rata-rata

 

Gambar 2. Rata-rata Aktivitas Serum Kontrol per Laboratorium

 

Tabel 3a – Nilai P dari uji eksak satu sisi Wilcoxon-Mann-Whitney per uji

Tabel 3b – Nilai P dari uji eksak satu sisi Wilcoxon-Mann-Whitney dari uji gabungan

Penjelasan: Sel abu-abu menunjukkan vaksin yang gagal dalam uji rilis. Sel dengan nilai >0,500 menunjukkan bahwa rata-rata respons dari uji lebih rendah dibandingkan dengan rata-rata respons standar.

 

Tabel 4 – Probabilitas yang diperkirakan untuk lulus vaksin menggunakan jumlah tikus yang berbeda.

Penjelasan: persentase menunjukkan perkiraan probabilitas bahwa suatu vaksin akan lulus uji pelepasan di laboratorium tertentu dengan menggunakan N ekor tikus per persiapan. Setiap persentase didasarkan pada 100.000 resampling bootstrap berukuran N dengan pengembalian dari kumpulan serum per laboratorium dan vaksin, tanpa memperhitungkan variasi antar-uji.

 

LAMPIRAN 1

Versi 4.0 Senin, 11 Januari 2010. 11:42:28 (+01:00) Halaman 1 dari 2

Versi 4.0 Senin, 11 Januari 2010. 11:42:28 (+01:00) Halaman 2 dari 2

 LAMPIRAN 2

Versi 4.0 Rabu, 13 Januari 2010. 16:25:01 (+01:00) Halaman 1 dari 1

 

 

8. PESERTA (DAFTAR MENURUT URUTAN ABJAD BERDASARKAN NEGARA)

 

Els Goossens, Pieter-Jan Serreyn, Veterinary and Agrochemical Research Centre, Belgium

Aline Rinfret, Gayle Pulle, Health Canada, Canada

Ivana Benesova, Institute for State Control of Veterinary Biologicals and Medicaments, Czech Republic

Michael Caras, Petra Strnadová, Bioveta, a.s., Czech Republic

Claire Chouvet, Jacques Léchenet, Mérial, France

Florence Cliquet, Alexandre Servat, Agence Française de Securité Sanitaire des Aliments, Nancy, France

François-Xavier Deramoudt, Virbac S.A., France

Beate Krämer, Paul-Ehrlich-Institut, Germany

Karin Stünkel, Schering-Plough; Essex Animal Health, Germany

Gábor Kulcsár, Central Agricultural Office, Directorate of Veterinary Medicinal Products, Hungary

Imke Kross, Chistian Weiss, Wim Hesselink, Intervet/ Schering-Plough Animal Health, The Netherlands

Lukas Bruckner, Institute of Virology and Immunoprophylaxis, Switzerland

Christian Borgneit, Catrina Stirling, Pfizer, United Kingdom (Correspondence only)

Donna M. Gatewood, Alethea Fry, United States Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Center for Veterinary Biologics, USA

 

9. SINGKATAN

 

3R: Replacement, reduction, refinement of animal tests,

BHK: Baby hamster kidney cell line,

BRP: Biological Reference Preparation, BSP: Biological Standardisation Programme, CCID50: Cell culture infectious dose 50%,

CS: Control serum, CVS: Challenge virus strain,

EDQM: European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare, EU: European Union,

FAVN: Fluorescent Antibody Virus Neutralization,

FCS: Fœtal calf serum,

FDI: Fujirebio Diagnostics, Inc.,

IS: International standard,

IU: International unit,

IVI: Institute of Virology and Immunoprophylaxis,

LEP: Low egg passage,

MEM: Minimum Essential Medium,

MTP: Microtitre plate,

NEA: Non-essential amino acids,

NIH: National Institute of Health, NMRI: Naval Medical Research Institute,

OIE: World Organisation for Animal Health (Office International des Epizooties),

OMCL: Official Medicines Control Laboratory,

PBS: Phosphatebuffered saline, PEI: Paul-Ehrlich-Institut,

Ph. Eur.: Pharmacopée Européenne / European Pharmacopoeia,

PRV: Pseudo-rabies virus, RAI: Rabies immunoglobulin,

RFFIT: Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,

SAD: Street– Alabama–Dufferin,

SD: Standard deviation,

USA: United States of America,

UV: Ultraviolet

 

10. REFERENSI

 

[1] Rabies vaccine (inactivated) for veterinary use, monograph 0451. Ph. Eur. 6th Edition. Strabourg, France: Council of Europe; 2008.

[2] Daas A, Milne C. Establishment of Batch 4 of the Biological Reference Preparation (BRP) for Rabies Vaccine (Inactivated) for Veterinary Use. Pharmeuropa Bio 2004(1):17-22.

[3] Servat A. et al. In vivo Potency Tests of Rabies Inactivated Vaccines for Veterinary Use – A 2-year retrospective analysis of data according to the criteria of the European Pharmacopoeia. Pharmeuropa 2008;20(4): 655-64.

[4] Russel W.M. S, Burch R.L. The principles of humane experimental technique. London, UK: Methuen; 1959.

[5] Krämer B et al. The rapid fluorescent focus inhibition test is a suitable method for batch potency testing of inactivated rabies vaccines. Biologicals 2009;37(2):119-26.

[6] World Organisation for Animal Health (OIE). Manual of Diagnostic Tests & Vaccines for Terrestrial Animals, Chapter 2.1.13. Rabies. OIE 6th Ed.; 2008.

[7] EDQM, Council of Europe. CombiStats (4.0) [software]. Web: www.combistats.eu

[8] Finney D.J. Statistical Method in Biological Assay. 3rd Edition. London, UK: Griffin; 1978.

[9] Mann H. B, Whitney D. R. On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other. The Annals of Mathematical Statistics 1947;18(1): 50–60.

 

Sumber:

B. Krämer, L. Bruckner, A. Daas, C. Milne. Collaborative Study for Validation of a Serological Potency Assay for Rabies Vaccine (inactivated) for Veterinary Use. In Validation of a Serological Potency Assay for Rabies Vaccine (inactivated) for Veterinary Use.