Deteksi Molekuler Gen Resistensi Metronidazol dan Tetrasiklin pada Sampel Lambung Positif Mirip Helicobacter pylori dari Babi

 

RINGKASAN

Resistensi antimikroba merupakan masalah kesehatan masyarakat yang utama. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai keberadaan gen resistensi antibiotik, yang sebelumnya dilaporkan pada Helicobacter pylori, dalam sampel lambung 36 babi, di mana DNA organisme mirip H. pylori telah terdeteksi. Berdasarkan analisis PCR dan sekuensing, dua sampel positif mengandung gen mutasi 16S rRNA yang menyebabkan resistensi tetrasiklin, dan satu sampel positif mengandung gen frxA dengan polimorfisme nukleotida tunggal yang menyebabkan resistensi metronidazol. Ketiga amplikon menunjukkan homologi tertinggi dengan rangkaian gen resistensi antibiotik terkait H. pylori. Temuan ini menunjukkan bahwa resistensi antimikroba yang didapat dapat terjadi pada organisme mirip H. pylori yang berhubungan dengan babi.

 

1. PENDAHULUAN

 

Lebih dari 50% populasi dunia terinfeksi bakteri Gram-negatif Helicobacter pylori (H. pylori), salah satu penyebab utama gastritis akut dan kronis, penyakit tukak lambung, adenokarsinoma lambung, dan jaringan limfoid terkait mukosa lambung (MALT) limfoma, yang juga dapat menyebabkan penyakit ekstra-gastrointestinal [1,2,3]. Manusia juga dapat terinfeksi spesies Helicobacter (NHPH) lambung non-Helicobacter pylori, dengan perkiraan prevalensi global 0,2-6% pada pasien yang menjalani gastroskopi [4,5] dan prevalensi 20,8-29,1% pada H. pylori tertentu. -kohort pasien lambung negatif [6,7]. Selain keterlibatan patofisiologis dalam penyakit lambung, NHPH lambung juga dikaitkan dengan penyakit ekstra-pencernaan [2].

 

Untuk mewujudkan penyakit lambung, spesies Helicobacter ini memiliki beberapa faktor virulensi yang terlibat dalam kolonisasi relung lambung (misalnya urease), menginduksi patologi dan menghindari sistem kekebalan tubuh sehingga mendorong persistensi infeksi. Meskipun dua faktor virulensi sitotoksik utama pada H. pylori, pulau patogenisitas gen terkait sitotoksin (cagPAI) dan vakuolasi sitotoksin A (VacA), tampaknya tidak ada dalam NHPH lambung, gamma-glutamyltranspeptidase (GGT) diduga memainkan peran patofisiologi yang penting. [8].

 

Pada hewan, ada beberapa penelitian yang melaporkan infeksi helicobacter dan hubungannya dengan perubahan lambung [4,9,10,11,12]. Di antaranya, terdapat laporan sporadis mengenai infeksi organisme mirip H. pylori pada babi [13,14,15,16,17,18]. Organisme mirip H. pylori ini tampaknya membawa gen yang mirip dengan H. pylori, termasuk gen ureAB. Namun, tidak ada amplifikasi gen glmM (ureC) yang dicapai pada sampel babi yang positif untuk uji PCR berbasis ureAB khusus H. pylori. Oleh karena itu, istilah organisme mirip H. pylori digunakan [18].

 

Pada manusia, terdapat pendekatan terapi yang berbeda terhadap infeksi H. pylori, meskipun pengobatan standar terdiri dari tiga terapi yang mencakup penghambat pompa proton dan dua antibiotik. Di antara pilihan antibiotik, amoksisilin, klaritromisin, dan metronidazol adalah yang paling umum digunakan, dan dianggap sebagai pengobatan lini pertama [1,19,20,21,22,23,24].

 

Resistensi antimikroba (AMR) adalah salah satu masalah One Health yang paling memprihatinkan di seluruh dunia [25]. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) telah mengklasifikasikan bakteri resisten yang paling penting di tingkat global sehingga memerlukan pengobatan baru yang mendesak [26]. Klasifikasi ini dilakukan berdasarkan spesies dan jenis resistensi sehingga menghasilkan tiga tingkatan prioritas: kritis, tinggi dan sedang, dimana H. pylori diklasifikasikan sebagai risiko tinggi, khususnya untuk resistensi klaritromisin [26]. Dalam pedoman penatalaksanaan terbaru untuk infeksi H. pylori (Laporan Konsensus Maastricht V/Florence), meningkatnya resistensi terhadap rejimen antibiotik yang ada merupakan salah satu kekhawatiran utama yang diangkat [27].

 

Berdasarkan pentingnya antimikroba untuk mengobati infeksi pada manusia dan antibiotik yang digunakan dalam kedokteran hewan, WHO menerbitkan daftar prioritas antimikroba yang dikelompokkan menjadi tiga kategori: (1) Sangat penting, dibagi lagi menjadi prioritas tertinggi dan prioritas tinggi, (2) Sangat penting dan (3) Penting [28]. Demikian pula, Organisasi Kesehatan Hewan Dunia (WOAH) mengembangkan daftar antimikroba yang penting bagi hewan yang selanjutnya diklasifikasikan menjadi: sangat penting bagi hewan, sangat penting bagi hewan, dan antimikroba yang penting bagi hewan [29]. Dalam daftar ini, amoksisilin diklasifikasikan sebagai sangat penting (WHO, WOAH), klaritromisin sebagai sangat penting (WHO), tetrasiklin sebagai sangat penting (WHO, WOAH), dan metronidazol sebagai penting (WHO) [28,29].

 

Penisilin dan tetrasiklin adalah kelas antimikroba yang paling umum digunakan pada babi [30,31]. Penggunaan antimikroba telah dikaitkan dengan dampak langsung dan tidak langsung terhadap mikrobiota gastrointestinal dan resistensi antimikrobanya [30]. Hal ini telah meningkatkan kekhawatiran kesehatan masyarakat karena tekanan selektif terhadap patogen oportunistik.

 

Mekanisme utama yang berkontribusi terhadap perkembangan resistensi Helicobacter adalah perolehan mutasi titik pada DNA. Dalam kasus spesifik H. pylori, ia memperoleh resistensi melalui mutasi kromosom dan transfer gen resistensi secara horizontal [32,33].

 

Mengenai metronidazol, nitroimidazol yang bertindak sebagai agen bakterisida dengan berinteraksi dengan homolog nitroreduktase, rdxA, resistensi terhadapnya pada H. pylori telah dikaitkan dengan mutasi pada gen rdxA, sedangkan perubahan pada gen frxA, yang mengkode NADH:flavin oksidoreduktase, juga terlibat [32].

 

Tetrasiklin berikatan dengan subunit ribosom 30S, menghambat sintesis protein. Resistensi tetrasiklin dapat diperoleh pada sebagian besar spesies bakteri melalui sistem penghabisan atau melalui protein perlindungan ribosom. Penurunan permeabilitas membran, perubahan pengikatan ribosom, degradasi antibiotik enzimatik, penghabisan aktif dan perubahan permeabilitas membran semuanya tampaknya berperan dalam resistensi tetrasiklin. Pada H. pylori, resistensi terhadap tetrasiklin tampaknya disebabkan oleh mutasi pada gen 16S rRNA [34].

 

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai adanya mutasi gen yang terkait dengan resistensi terhadap amoksisilin, metronidazol, klaritromisin, dan tetrasiklin dalam sampel lambung babi yang terbukti positif terhadap DNA mirip H. pylori pada penelitian sebelumnya [18].

 

2. HASIL

 

2.1. Hasil PCR

Dari 36 sampel yang diuji positif mirip H. pylori, tiga sampel pars esofagus (8,3%) positif PCR untuk gen yang memberikan resistensi terhadap antimikroba. Dua diantaranya ditemukan PCR-positif untuk gen mutasi 16S rRNA yang menyebabkan resistensi tetrasiklin dan satu lagi ditemukan PCR-positif untuk gen frxA yang dapat dikaitkan dengan resistensi metronidazol dengan adanya polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) (Tabel 1; Lihat Gambar S1 dan S2 untuk foto elektroforesis gel).

 

Tabel 1. Hasil PCR mengenai gen AMR per bagian lambung.

H. pylori-like Positive Samples	frxA Gene PCR Positive (n/N) (%)	rdxA Gene PCR Positive (n/N) (%)	16S rRNA Mutation Gene PCR Positive (n/N) (%)	23S rRNA Gene PCR Positive (n/N) (%)	Pbp1A Gene PCR Positive (n/N) (%)
Pars oesophagea (N = 29)	1/29 (3.4%)	0/29 (0.0%)	2/29 (6.9%)	0/29 (0.0%)	0/29 (0.0%)
Oxyntic mucosa (N = 7)	0/7 (0.0%)	0/7 (0.0%)	0/7 (0.0%)	0/7 (0.0%)	0/7 (0.0%)

 

2.2. Sekuensing dan Analisis Urutan Produk PCR Positif

Analisis sekuensing dua arah dan alat pencarian penyelarasan lokal dasar (BLAST) dari rangkaian konsensus amplikon gen mutasi 16S rRNA parsial menunjukkan identitas berkisar antara 98,6–100% dengan H. pylori (aksesi nr. OP389222) Mutasi 16S rRNA memberikan resistensi terhadap tetrasiklin ( ARO:3003510) untuk kedua sampel positif.

Sampel positif lainnya juga dikenakan pengurutan dua arah dan analisis BLAST dari urutan konsensus. Amplikon menunjukkan identitas 99,85% terhadap H. pylori (aksesi nr. CP026515). Urutan yang diperoleh juga dianalisis menggunakan Resistance Gene Identifier (RGI) untuk memprediksi resistoma dari nukleotida pada model homologi dan SNP. Kriteria RGI sepenuhnya sesuai dengan mutasi H. pylori frxA yang memberikan resistensi terhadap metronidazol, dengan SNP Y62D, dengan identitas wilayah pencocokan 99,07% (ARO:3007059) [35,36,37] (Lihat Gambar S3–S9 untuk rincian analisis urutan lebih lanjut).

 

3. DISKUSI

 

Hasil kami menunjukkan bahwa gen mutasi terkait AMR menunjukkan homologi tertinggi dengan gen terkait H. pylori terjadi pada tiga sampel dari perut babi, yang sebelumnya dilaporkan positif mirip H. pylori.

 

Untuk mencapai hasil ini, kami sebagian mengandalkan metodologi yang dijelaskan oleh Diab dkk. (2018) [38] dan Lee dkk. (2018) [39] yang juga bertujuan untuk mendeteksi gen resistensi antibiotik (ARG) dari H. pylori yang memberikan resistensi terhadap klaritromisin, metronidazol, amoksisilin, dan tetrasiklin, pada pasien manusia. Yang pertama memeriksa spesimen biopsi lambung dari pasien yang ditemukan positif berdasarkan tes urease cepat dan adanya H. pylori 16S rRNA. Penelitian terakhir dilakukan dengan menggunakan isolat H. pylori yang diperoleh dari pasien. Amplikon positif PCR gen AMR pada kedua penelitian juga diurutkan dan dilakukan BLAST untuk analisis sekuens dan mutasi, tetapi tidak dianalisis menggunakan database resistensi antibiotik komprehensif (CARD). Meskipun AMR pada sampel positif mirip H. pylori belum diteliti, terdapat penelitian lain yang menyelidiki gen yang sama pada sampel hewan lain yang positif untuk spesies Helicobacter lainnya [40,41,42].

 

Dalam penelitian kami, dua sampel jaringan lambung babi yang dianalisis dari pars esofagus positif mengandung gen mutasi 16S rRNA yang memberikan resistensi terhadap tetrasiklin. Sampel lain dari pars esofagus positif mengandung gen frxA dengan mutasi SNP Y62D yang menyebabkan resistensi terhadap metronidazol. Ketiga sampel dikenakan BLAST dengan homologi dengan H. pylori berkisar antara 98,6 hingga 100%. Pada manusia, metronidazol dianggap sebagai salah satu obat pilihan dalam terapi rangkap tiga melawan infeksi H. pylori. Prevalensi keseluruhan resistensi H. pylori terhadap metronidazol ditemukan sebesar 47,2%, tertinggi di Afrika (75,0%), diikuti oleh Amerika Selatan (52,9%), Asia (46,6%), Eropa (31,2%) dan Amerika Utara. (30,5%) [43], berimplikasi pada berkurangnya kemanjuran pengobatan pada manusia [20]. Selain itu, tetrasiklin juga biasa digunakan dalam rejimen pemberantasan penyelamatan terhadap H. pylori, menunjukkan tingkat resistensi di seluruh dunia sebesar 11,7% [43]. Sebagai catatan, tidak satu pun sampel yang disertakan positif mengandung rRNA H. pylori 23S yang berpotensi terkait dengan mutasi titik pemberian klaritromisin. Karena ini adalah uji PCR spesifik spesies H. pylori (tidak bereaksi silang dengan rangkaian gen 23S rRNA dari NHPH lambung lainnya menurut analisis in silico), hal ini dapat lebih lanjut mengkonfirmasi temuan kami sebelumnya mengenai keberadaan DNA mirip H. pylori. dalam sampel lambung babi daripada DNA H. pylori itu sendiri.

 

Meskipun penggunaan antibiotik untuk pemacu pertumbuhan dilarang di beberapa negara, termasuk negara-negara anggota Uni Eropa, tetrasiklin masih digunakan sebagai pemacu pertumbuhan di banyak negara. Pada babi, tetrasiklin umumnya merupakan antibiotik yang paling umum digunakan [31,42,44,45]. Gen resistensi tetrasiklin adalah salah satu ARG yang paling melimpah di mikrobioma babi [31,46]. Sebuah penelitian yang dilakukan oleh Liu dkk. (2019) mendeteksi ARG tetrasiklin di semua sampel daging babi yang dievaluasi (22/22) [42]. Ricker dkk. (2020) mengisolasi dan mengekstraksi DNA dari kotoran babi untuk analisis ARG retrospektif. Mereka melaporkan bahwa penggunaan tetrasiklin pada babi mendorong seleksi bersama untuk gen resistensi aminoglikosida dan tetrasiklin [47], meskipun hal ini belum dijelaskan pada spesies Helicobacter.

 

Terlepas dari penelitian kami, resistensi yang didapat terhadap tetrasiklin juga dilaporkan kadang-kadang terjadi pada isolat H. suis yang diperoleh dari perut babi [40].

 

Selama pengolahan karkas babi, permukaan karkas dan bagian-bagiannya yang akan dijual eceran dapat terkontaminasi organisme yang berasal dari kulit hewan, isi usus, tangan pekerja, dan lingkungan pemotongan [48]. Hal ini dapat mempengaruhi manusia untuk melakukan kontak dengan patogen AMR dan ARG seperti yang diungkapkan oleh Liu et al. (2019). Hal ini menunjukkan bahwa ARG berpotensi menular ke manusia melalui rantai industri daging/pasokan pakan, pakan babi, dan produksi daging babi [42].

 

Selain itu, penggunaan antibiotik menghilangkan patogen yang rentan sehingga strain yang resisten dapat terus berevolusi dan berkembang biak. Tekanan selektif dari paparan antimikroba memberikan patogen yang resisten dengan keuntungan evolusioner dan mendukung penyebarannya [30].

 

Meskipun hasil kami menunjukkan adanya ARG pada organisme mirip H. pylori yang menyebabkan resistensi terhadap tetrasiklin dan metronidazol, interpretasi temuan ini harus dilakukan dengan hati-hati. Signifikansinya terhadap kesehatan manusia dan hewan belum sepenuhnya jelas, karena tidak ada laporan mengenai infeksi mirip H. pylori pada manusia dan relevansi organisme mirip H. pylori pada hewan dan manusia memerlukan penyelidikan lebih lanjut. Studi harus dilakukan dengan ukuran sampel yang lebih besar dan idealnya, isolasi bakteri mirip H. pylori harus dilakukan untuk mengkarakterisasi organisme dan menguji kerentanan antimikroba secara mendalam.

 

4. BAHAN DAN METODE

 

4.1. Pemilihan Sampel

Ekstrak DNA dari 36 sampel lambung babi (29 sampel pars esofagus dan 7 sampel mukosa oksintik), mengandung DNA mirip H. pylori seperti yang ditunjukkan oleh PCR dan analisis sekuensing (lihat Tabel S1 untuk rincian PCR ini), dianalisis untuk kehadiran ARG spesifik H. pylori [16,17,18].

 

4.2. Kondisi dan Urutan PCR

Sampel positif mirip H. pylori menjadi sasaran uji PCR konvensional untuk menguji keberadaan gen yang terkait dengan AMR pada H. pylori, termasuk Pbp1A (amoksisilin), rdxA dan frxA (metronidazol), gen mutasi 16S rRNA (tetrasiklin) dan 23S rRNA (klaritromisin) untuk mengidentifikasi mutasi titik (Tabel 2).

 

Tabel 2.  Urutan primer dan kondisi termosiklik untuk mendeteksi gen dan gen mutasi yang memberikan resistensi terhadap antimikroba.

Antimicrobials		Sequence	Target Gene	Thermo Cycle Conditions			Reference
				Temp. (°C)	Time	Nr. Cycles
Amoxicillin	Forward	GCG ACA ATA AGA GTG GCA	Pbp1A	95 95 56 72 72	3′ 1′ 1′ 5′ 10′	35	[38,39]
	Reverse	TGC GAA CAC CCT TTT AAA T
Metronidazole	Forward	AAT TTG AGC ATG GGG CAG A	rdxA	95 94 60 72 72	5′ 30" 30" 1′ 10′	35	[38,39]
	Reverse	GAA ACG CTT GAA AAC ACC CCT
	Forward	TGG ATA TGG CAG CCG TTT A	frxA	95 95 58 72 72	5′ 30" 30" 1′ 10′	35	[38,39]
	Reverse	GGT TAT CAA AAA GCT AAC AGC G
Tetracycline	Forward	CGG TCG CAA GAT TAA AAC	16S rRNA mutation	95 95 55 72 72	10′ 5" 2" 30" 10′	45	[38]
	Reverse	GCG GAT TCT CTC AAT GTC
Clarithromycin	Forward	TCA GTG AAA TTG TAG TGG AGG TGA AAA	23S rRNA	95 92 60 72 72	10′ 15" 1′ 1′ 10′	40	[38]
	Reverse	CAG TGC TAA GTT GTA GTA AAG GTC CA

 

Aliquot dari masing-masing produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1,5% yang diwarnai dengan pewarna gel Xpert Green Safe DNA (GRISP, Porto, Portugal) dan diperiksa keberadaan fragmen spesifiknya di bawah sinar UV. Ukuran fragmen DNA dibandingkan dengan berat molekul standar, tangga DNA 100bp (GRISP, Porto, Portugal). Untuk kontrol negatif digunakan air suling. Tidak ada kontrol positif yang digunakan pada PCR untuk menguji gen resistensi.

 

Amplikon dari setiap sampel positif diurutkan. Urutan dua arah dilakukan dengan menggunakan metode Sanger di fasilitas inti Genomics dari Institut Patologi Molekuler dan Imunologi Universitas Porto, Portugal. Pengeditan urutan dan beberapa penyelarasan dilakukan dengan MegaX Molecular Evolutionary Genetic Analysis versi 10.1.8 [49]. Urutan yang diperoleh tunduk pada analisis BLAST menggunakan database nukleotida non-redundan (//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (diakses pada 22 September 2022)) [36,37]. Urutannya juga dianalisis melalui CARD untuk mengidentifikasi mutasi gen tambahan yang resisten terhadap antibiotik [35].

 

5. KESIMPULAN

 

AMR merupakan masalah One Health yang terutama terkait dengan penggunaan antibiotik pada hewan dan manusia. Hasil kami menunjukkan bahwa AMR dapat terjadi pada organisme mirip H. pylori dari babi karena kami mengidentifikasi gen mutasi 16S rRNA terkait H. pylori yang memberikan resistensi tetrasiklin dan mutasi pada gen frxA yang dapat memberikan resistensi metronidazol pada tiga sampel pars esofagus yang berbeda dalam penelitian ini. Pentingnya temuan ini bagi kesehatan masyarakat dan hewan memerlukan penyelidikan lebih lanjut, termasuk upaya untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi organisme ini secara mendalam dan untuk menentukan kemungkinan signifikansi patogeniknya.

 

6. REFERENSI

 

1. Mannion A., Dzink-Fox J., Shen Z., Piazuelo M.B., Wilson K.T., Correa P., Peek R.M., Jr., Camargo M.C., Fox J.G. Helicobacter pylori Antimicrobial Resistance and Gene Variants in High- and Low-Gastric-Cancer-Risk Populations. J. Clin. Microbiol. 2021;59:e03203-20. doi: 10.1128/JCM.03203-20. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Gorlé N., Bauwens E., Haesebrouck F., Smet A., Vandenbroucke R.E. Helicobacter and the Potential Role in Neurological Disorders: There Is More Than Helicobacter pylori. Front. Immunol. 2020;11:584165.

3. Gravina A.G., Zagari R.M., De Musis C., Romano L., Loguercio C., Romano M. Helicobacter pylori and extragastric diseases: A review. World J. Gastroenterol. 2018;24:3204–3221. doi: 10.3748/wjg.v24.i29.3204. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Haesebrouck F., Pasmans F., Flahou B., Chiers K., Baele M., Meyns T., Decostere A., Ducatelle R. Gastric helicobacters in domestic animals and nonhuman primates and their significance for human health. Clin. Microbiol. Rev. 2009;22:202–223.

5. Ménard A., Smet A. Review: Other Helicobacter species. Helicobacter. 2019;24((Suppl. 1)):e12645.

6. Nakamura M., Øverby A., Michimae H., Matsui H., Takahashi S., Mabe K., Shimoyama T., Sasaki M., Terao S., Kamada T. PCR analysis and specific immunohistochemistry revealing a high prevalence of non-Helicobacter pylori Helicobacters in Helicobacter pylori-negative gastric disease patients in Japan: High susceptibility to an Hp eradication regimen. Helicobacter. 2020;25:e12700.

7. Taillieu E., De Witte C., De Schepper H., Van Moerkercke W., Rutten S., Michiels S., Arnst Y., De Bruyckere S., Francque S., van Aert F., et al. Clinical significance and impact of gastric non-Helicobacter pylori Helicobacter species in gastric disease. Aliment. Pharmacol. Ther. 2023.

8. Zhang G., Ducatelle R., De Bruyne E., Joosten M., Bosschem I., Smet A., Haesebrouck F., Flahou B. Role of γ-glutamyltranspeptidase in the pathogenesis of Helicobacter suis and Helicobacter pylori infections. Vet. Res. 2015;46:31.

9. Youssef A.I., Afifi A., Abbadi S., Hamed A., Enany M. PCR-based detection of Helicobacter pylori and non-Helicobacter pylori species among humans and animals with potential for zoonotic infections. Pol. J. Vet. Sci. 2021;24:445–450.

10. Kubota-Aizawa S., Matsubara Y., Kanemoto H., Mimuro H., Uchida K., Chambers J., Tsuboi M., Ohno K., Fukushima K., Kato N., et al. Transmission of Helicobacter pylori between a human and two dogs: A case report. Helicobacter. 2021;26:e12798.

11. Suárez-Esquivel M., Alfaro-Alarcón A., Guzmán-Verri C., Barquero-Calvo E. Analysis of the association between density of Helicobacter spp and gastric lesions in dogs. Am. J. Vet. Res. 2017;78:1414–1420.

12. Husnik R., Klimes J., Kovarikova S., Kolorz M. Helicobacter Species and Their Association with Gastric Pathology in a Cohort of Dogs with Chronic Gastrointestinal Signs. Animals. 2022;12:1254.

13. Ellis J.A., Waldner C.L., McIntosh K.A., Rhodes C., Harding J.C., Ringler S.S., Krakowka S. Age-dependent seroprevalence of antibodies against a Helicobacter pylori-like organism and Helicobacter pylori in commercially reared swine. Am. J. Vet. Res. 2006;67:1890–1894.

14. Krakowka S., Ringler S.S., Flores J., Kearns R.J., Eaton K.A., Ellis J.A. Isolation and preliminary characterization of a novel Helicobacter species from swine. Am. J. Vet. Res. 2005;66:938–944.

15. Krakowka S., Rings D.M., Ellis J.A. Experimental induction of bacterial gastritis and gastric ulcer disease in gnotobiotic swine inoculated with porcine Helicobacter-like species. Am. J. Vet. Res. 2005;66:945–952.

16. Cortez Nunes F., Letra Mateus T., Teixeira S., Barradas P., de Witte C., Haesebrouck F., Amorim I., Gärtner F. Presence of Helicobacter pylori and H. suis DNA in Free-Range Wild Boars. Animals. 2021;11:1269.

17. Cortez Nunes F., Letra Mateus T., Teixeira S., Barradas P.F., Gärtner F., Haesebrouck F., Amorim I. Molecular Detection of Human Pathogenic Gastric Helicobacter Species in Wild Rabbits (Oryctolagus cuniculus) and Wild Quails (Coturnix coturnix) Zoonotic Dis. 2021;1:42–50.

18. Cortez Nunes F., Letra Mateus T., Taillieu E., Teixeira S., Carolino N., Rema A., De Bruyckere S., Gärtner F., Haesebrouck F., Amorim I. Molecular detection of Helicobacter spp. and Fusobacterium gastrosuis in pigs and wild boars and its association with gastric histopathological alterations. Vet. Res. 2022;53:78.

19. Megraud F., Bruyndonckx R., Coenen S., Wittkop L., Huang T.D., Hoebeke M., Bénéjat L., Lehours P., Goossens H., Glupczynski Y. Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Europe in 2018 and its relationship to antibiotic consumption in the community. Gut. 2021;70:1815–1822.

20. Marques B., Donato M.M., Cardoso O., Luxo C., Martinho A., Almeida N. Study of rdxA and frxA genes mutations in metronidazole-resistant and -susceptible Helicobacter pylori clinical isolates from the central region of Portugal. J. Glob. Antimicrob. Resist. 2019;17:300–304.

21. Alba C., Blanco A., Alarcón T. Antibiotic resistance in Helicobacter pylori. Curr. Opin. Infect. Dis. 2017;30:489–497.

22. Chey W.D., Leontiadis G.I., Howden C.W., Moss S.F. ACG Clinical Guideline: Treatment of Helicobacter pylori Infection. Off. J. Am. Coll. Gastroenterol. 2017;112:212–239.

23. Jung H.K., Kang S.J., Lee Y.C., Yang H.J., Park S.Y., Shin C.M., Kim S.E., Lim H.C., Kim J.H., Nam S.Y., et al. Evidence-Based Guidelines for the Treatment of Helicobacter pylori Infection in Korea 2020. Gut Liver. 2021;15:168–195. doi: 10.5009/gnl20288.

24. Katelaris P., Hunt R., Bazzoli F., Cohen H., Fock K.M., Gemilyan M., Malfertheiner P., Mégraud F., Piscoya A., Quach D., et al. World Gastroenterology Organisation Global Guidelines, Helicobacter pylori. [(accessed on 16 May 2022)]. Available online: https://www.worldgastroenterology.org/guidelines/helicobacter-pylori/helicobacter-pylori-english

25. Palma E., Tilocca B., Roncada P. Antimicrobial Resistance in Veterinary Medicine: An Overview. Int. J. Mol. Sci. 2020;21:1914.

26. WHO W.H.O. Prioritization of Pathogens to Guide Discovery, Research and Development of New Antibiotics for Drug-Resistant Bacterial Infection, Including Tuberculosis. [(accessed on 12 October 2022)]. Available online: https://www.who.int/medicines/areas/rational_use/PPLreport_2017_09_19.pdf

27. Malfertheiner P., Megraud F., O’Morain C.A., Gisbert J.P., Kuipers E.J., Axon A.T., Bazzoli F., Gasbarrini A., Atherton J., Graham D.Y., et al. Management of Helicobacter pylori infection-the Maastricht V/Florence Consensus Report. Gut. 2017;66:6–30.

28. WHO W.H.O. Criticaly Important Antimicrobials for Human Medicine. [(accessed on 12 October 2022)]. Available online: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/312266/9789241515528-eng.pdf

29. OIE World Organisation for Animal Health OIE List of Antimicrobial Agents of Veterinary Importance. [(accessed on 13 October 2022)]. Available online: https://www.oie.int/app/uploads/2021/03/a-oie-list-antimicrobials-may2018.pdf

30. Zeineldin M., Aldridge B., Lowe J. Antimicrobial Effects on Swine Gastrointestinal Microbiota and Their Accompanying Antibiotic Resistome. Front. Microbiol. 2019;10:1035.

31. Lekagul A., Tangcharoensathien V., Yeung S. Patterns of antibiotic use in global pig production: A systematic review. Vet. Anim. Sci. 2019;7:100058.

32. Zhang Y., Wen Y., Xiao Q., Zheng W., Long G., Chen B., Shu X., Jiang M. Mutations in the Antibiotic Target Genes Related to Clarithromycin, Metronidazole and Levofloxacin Resistance in Helicobacter pylori Strains from Children in China. Infect. Drug Resist. 2020;13:311–322.

33. Fischer W., Tegtmeyer N., Stingl K., Backert S. Four Chromosomal Type IV Secretion Systems in Helicobacter pylori: Composition, Structure and Function. Front. Microbiol. 2020;11:1592.

34. Bujanda L., Nyssen O.P., Vaira D., Saracino I.M., Fiorini G., Lerang F., Georgopoulos S., Tepes B., Heluwaert F., Gasbarrini A., et al. Antibiotic Resistance Prevalence and Trends in Patients Infected with Helicobacter pylori in the Period 2013-2020: Results of the European Registry on H. pylori Management (Hp-EuReg) Antibiotics. 2021;10:1058.

35. Alcock B.P., Raphenya A.R., Lau T.T.Y., Tsang K.K., Bouchard M., Edalatmand A., Huynh W., Nguyen A.V., Cheng A.A., Liu S., et al. CARD 2020: Antibiotic resistome surveillance with the comprehensive antibiotic resistance database. Nucleic Acids Res. 2020;48:D517–D525.

36. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990;215:403–410.

37. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Rapp B.A., Wheeler D.L. GenBank. Nucleic Acids Res. 2002;30:17–20.

38. Diab M., El-Shenawy A., El-Ghannam M., Salem D., Abdelnasser M., Shaheen M., Abdel-Hady M., El-Sherbini E., Saber M. Detection of antimicrobial resistance genes of Helicobacter pylori strains to clarithromycin, metronidazole, amoxicillin and tetracycline among Egyptian patients. Egypt. J. Med. Hum. Genet. 2018;19:417–423.

39. Lee S.M., Kim N., Kwon Y.H., Nam R.H., Kim J.M., Park J.Y., Lee Y.S., Lee D.H. rdxA, frxA, and efflux pump in metronidazole-resistant Helicobacter pylori: Their relation to clinical outcomes. J. Gastroenterol. Hepatol. 2018;33:681–688.

40. Berlamont H., Smet A., De Bruykere S., Boyen F., Ducatelle R., Haesebrouck F., De Witte C. Antimicrobial susceptibility pattern of Helicobacter suis isolates from pigs and macaques. Vet. Microbiol. 2019;239:108459.

41. Hamada M., Elbehiry A., Marzouk E., Moussa I.M., Hessain A.M., Alhaji J.H., Heme H.A., Zahran R., Abdeen E. Helicobacter pylori in a poultry slaughterhouse: Prevalence, genotyping and antibiotic resistance pattern. Saudi J. Biol. Sci. 2018;25:1072–1078.

42. Liu Z., Klümper U., Shi L., Ye L., Li M. From Pig Breeding Environment to Subsequently Produced Pork: Comparative Analysis of Antibiotic Resistance Genes and Bacterial Community Composition. Front. Microbiol. 2019;10:43.

43. Ghotaslou R., Leylabadlo H.E., Asl Y.M. Prevalence of antibiotic resistance in Helicobacter pylori: A recent literature review. World J. Methodol. 2015;5:164–174.

44. Muurinen J., Richert J., Wickware C.L., Richert B., Johnson T.A. Swine growth promotion with antibiotics or alternatives can increase antibiotic resistance gene mobility potential. Sci. Rep. 2021;11:5485.

45. De Briyne N., Atkinson J., Pokludová L., Borriello S.P. Antibiotics used most commonly to treat animals in Europe. Vet. Rec. 2014;175:325.

46. Monger X.C., Gilbert A.-A., Saucier L., Vincent A.T. Antibiotic Resistance: From Pig to Meat. Antibiotics. 2021;10:1209.

47. Ricker N., Trachsel J., Colgan P., Jones J., Choi J., Lee J., Coetzee J.F., Howe A., Brockmeier S.L., Loving C.L., et al. Toward Antibiotic Stewardship: Route of Antibiotic Administration Impacts the Microbiota and Resistance Gene Diversity in Swine Feces. Front. Vet. Sci. 2020;7:255.

48. Driessen B., Freson L., Buyse J. Fasting Finisher Pigs before Slaughter Influences Pork Safety, Pork Quality and Animal Welfare. Animals. 2020;10:2206.

49. Stecher G., Tamura K., Kumar S. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) for macOS. Mol. Biol. Evol. 2020;37:1237–1239.

50. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987;4:406–425.

51. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution. 1985;39:783–791.

52. Tamura K., Nei M., Kumar S. Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004;101:11030–11035.

53. Tamura K., Stecher G., Kumar S. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Mol. Biol. Evol. 2021;38:3022–3027.

SUMBER

Francisco Cortez Nunes, Emily Taillieu, Teresa Letra Mateus, Sílvia Teixeira, Freddy Haesebrouck, and Irina Amorim. 2023. Molecular Detection of Metronidazole and Tetracycline Resistance Genes in Helicobacter pylori-Like Positive Gastric Samples from Pigs. Antibiotics (Basel). 2023 May; 12(5): 906.