Penghambatan Telomerase dalam Terapi Kanker

Penghambatan Telomerase dalam Terapi Kanker

Terapi kanker standar saat ini (kemoterapi dan radiasi) sering menyebabkan efek samping yang serius dan merugikan. Oleh karena itu pada saat ini sedang dikembangkan strategi merancang obat yang lebih tepat yaitu menargetkan penghancuran sel-sel kanker namun sel-sel normal di sekitarnya relatif tidak terpengaruh. Telomerase terdapat banyak pada sebagian besar kanker manusia tetapi hampir tidak terdeteksi dalam sel somatik normal.  Hal ini akan memberikan target obat yang menarik. Ulasan ini merupakan pendekatan farmakogenomik terbaru untuk penghambatan telomerase yang dilaporkan oleh AP Cunningham dkk (56).

Rancangan obat di bidang terapi kanker sedang dikembangkan tren ke arah mekanisme yang lebih tepat dari penghancuran sel kanker sehingga meminimalkan efek samping yang ditimbulkan selama pengobatan kanker standar (mual, muntah, rambut rontok, rambut rontok, kelelahan, keracunan organ, dll) . Kunci untuk secara selektif menargetkan sel-sel kanker adalah untuk mengeksploitasi beberapa perbedaan dasar sel-sel ini telah dikembangkan dibandingkan dengan prekursor normal mereka. Salah satu perbedaan tersebut adalah aktivitas enzim telomerase.

Telomer, Telomerase, dan Kanker

Telomerase adalah ribonukleoprotein yang mensintesis telomer. Telomer terdiri dari pengulangan oligonukleotida tandem (5'-TTAGGG-3 'pada manusia) yang menutup ujung kromosom eukariotik. Sel somatik manusia normal mengandung hingga 10-15 kilobase pengulangan telomerik [ 1 , 2 ]. Telomer tampaknya memiliki fungsi ganda. Pertama, telomere dapat berfungsi untuk melindungi ujung-ujung kromosom dari kerusakan dan mencegah sel dari mengenali ujung-ujungnya sebagai putus-putus untaian ganda yang dapat menyebabkan rekombinasi yang merugikan. Kedua, telomer telah diduga bertindak sebagai 'jam mitosis' yang menghitung jumlah pembelahan sel yang telah dialami dan kapasitasnya untuk pembelahan berkelanjutan [ 3 , 4 ]. 

Leonard Hayflick mengamati beberapa tahun yang lalu bahwa sel-sel normal memiliki kapasitas replikasi terbatas hingga setelah itu mereka tetap aktif secara metabolik tetapi berhenti berkembang biak [ 5 ]. Periode penangkapan pertumbuhan ini disebut sebagai M1 (mortalitas 1) atau penuaan seluler. Hubungan langsung antara panjang telomer dan penuaan seluler telah diketahui [ 6 ]. Karena pada akhir replikasi sel [ 7 , 8 ], 50-200 bp DNA telomerik hilang pada setiap putaran replikasi sel. Pengulangan telomerik non-coding menyediakan buffer yang mencegah hilangnya informasi genetik selama setiap siklus replikasi sel.  Ketika telomer telah terkikis ke panjang minimum kritis (k5 kb), penuaan seluler terpicu. Senesensi sel mungkin dilewati oleh represi gen penekan tumor, aktivasi onkogen, atau mutasi lainnya [ 9 ]. Dengan lolos dari penuaan, sel-sel langka terus membelah dan telomer mereka terus memendek hingga mencapai tahap kritis (M2 atau krisis). Pada titik ini, ketidakstabilan kromosom muncul karena fusi ujung ke ujung dan / atau kerusakan kromosom. Pos pemeriksaan kerusakan DNA diaktifkan bersama dengan apoptosis. Kecuali jika sel mengembangkan mekanisme untuk menstabilkan panjang telomer, ia tidak akan bertahan. Sel-sel yang lepas dari krisis dan menjadi diabadikan umumnya mencapai stabilitas telomerik melalui reaktivasi telomerase. ( Gambar. 1 ).

Gambar 1. Telomer terkikis (terpotong) dalam sel somatik normal pada setiap populasi sel berlipat ganda karena tidak adanya telomerase. Reaktivasi telomerase tampaknya memainkan peran kunci dalam perkembangan kanker.

Telomerase adalah ribonukleoprotein yang bertindak memanjang telomer dalam sel yang memiliki aktivitasnya.  Enzim ini diekspresikan (diperoduksi) selama perkembangan embrionik, kehilangan ekspresinya selama diferensiasi sel somatik, dan hampir tidak terdeteksi pada sebagian besar sel somatik manusia normal [ 10 ]. Sebaliknya, telomerase diekspresikan pada ∼85% sel kanker pada manusia [ 11 ]. Ada beberapa jenis sel yang biasanya mengekspresikan telomerase termasuk sel line media kuman, sel punca, sel hematopoietik, sel yang melapisi usus, dan sel lain yang berkembang biak dengan cepat. Ekspresi telomerase dalam jumlah banyak terdapat dalam berbagai sel kanker manusia, sementara hampir tidak terdeteksi di sebagian besar sel normal. Hal ini menjadikannya target obat yang sangat menarik.  Sel somatik yang normal dianggap menyimpan cukup cadangan DNA telomer untuk bertahan dari terapi berbasis telomer, dan beberapa sel normal yang mengekspresikan telomerase juga harus memiliki cadangan yang cukup untuk menahan pengobatan dengan inhibitor telomerase. Telah ditunjukkan bahwa sel-sel kanker seringkali mempertahankan telomer yang jauh lebih pendek daripada sel normal (3-9 kb dibandingkan dengan 10-15 kb) [ 12 - 15 ].  Selain itu, sifat proliferasi sel kanker yang cepat menyebabkan erosi telomer stabil tanpa adanya telomerase.  Oleh karena itu terapi berbasis telomerase harus berdampak pada sel tumor sebelum memiliki efek yang berarti pada sel normal telomerase-positif.  Hasil potensial dari terapi berbasis telomerase diilustrasikan pada Gambar. 2 .

Gambar 2.  Diagram yang menggambarkan hasil yang mungkin dari penghambatan telomerase. Penghambatan telomerase mencegah pemeliharaan panjang telomer dalam sel-sel positif telomerase. Akibatnya, telomerase dapat memendek, yang mengarah ke penuaan replikatif atau apoptosis. Penghambatan telomerase juga dapat menyebabkan kematian sel yang cepat tanpa pemendekan telomer dan induksi jalur ekspresi gen baru (dibahas kemudian dalam ulasan)

Telomerase mengandung komponen RNA, hTR, dan komponen transkriptase balik katalitik, hTERT. Sementara hTR diekspresikan di mana-mana dalam sel normal, adanya hTERT menimbulkan aktivitas telomerase [ 6 ]. Tanpa ekspresi hTERT tidak ada aktivitas telomerase dan akibatnya perpanjangan telomer tidak terjadi.  Beberapa pendekatan berbeda terhadap penghambatan telomerase saat ini digunakan dalam laboratorium dengan yang baru terus dicari sebagai akibat dari meningkatnya minat terhadap penghambatan telomerase selektif sebagai strategi untuk desain farmasi yang rasional.  Molekul kecil seperti AZT (azidothymidine, non-spesifik reverse transcriptase inhibitor) [ 16 ], bahan kimia seperti retinoid [ 17 ], tamoxifen [ 18 ], atau EGCG (epigallocatechin gallate) [ 19 ], dan molekul yang mengganggu struktur telomer. (yaitu, penstabil G-quadruplex) [ 20 , 21 ] telah terbukti efektif in vitro inhibitor dari transkripsi atau fungsi telomerase. Sementara senyawa ini mungkin efektif secara in vitro, namun terdapat kekhawatiran terkait kekhususannya.  AZT telah terbukti menghambat pertumbuhan sel dan aktivitas telomerase sel kanker payudara secara in vitro [ 16 ]. Namun, AZT tidak spesifik untuk telomerase, yang paling dikenal untuk penggunaannya dalam mengelola infeksi HIV. Retinoid, yang merupakan analog vitamin A, mampu menginduksi pemendekan telomer, penghentian pertumbuhan sel, dan kematian sel pada sel leukemia promyelositik akut (APL) [ 17 ]. Namun, beberapa retinoid tingkat tinggi dapat menyebabkan toksisitas in vivo.  Oleh karena itu, jelas dibutuhan untuk mengembangkan terapi berbasis molekuler spesifik yang efektif dan menunjukkan profil efek samping yang dapat diterima.

Komponen RNA hTR dan reverse transcriptase hTERT bukan satu-satunya komponen telomerase yang diperlukan untuk mempertahankan panjang dan struktur telomer.  Ada juga sejumlah protein yang terkait dengan DNA telomer yang telah dieksplorasi sebagai target obat yang mungkin.  Sementara potensi mereka sebagai target obat tidak akan dibahas dalam ulasan ini, beberapa pemahaman dasar tentang protein ini bermanfaat.  Meskipun cukup banyak protein yang berperan dalam mempertahankan struktur dan panjang telomer, beberapa yang lebih terkenal termasuk protein telomer manusia TRF1 dan TRF2 dan POT1. (Untuk ulasan ekstensif tentang ini dan protein telomerik lainnya, lihat [ 22 ]).  singkat, TRF1 dan TRF2 adalah faktor pengikat pengulangan telomer.  TRF1 mengikat dupleks DNA telomer dan bertindak untuk mengatur panjang telomer melalui loop umpan balik negatif. Jumlah protein TRF1 hadir di ujung kromosom berkorelasi dengan panjang telomer [ 22 ]. TRF2 membantu untuk membentuk struktur t-loop di ujung telomer [ 23 ], dan kemungkinan membantu secara fisik mencegah telomerase agar tidak bekerja pada ujung telomer [ 22 ].  TRF2 memainkan peran kunci dalam perlindungan ujung kromosom (lihat ulasan [ 24 ]). POT1 (perlindungan telomer) adalah protein pengikat DNA telomerik untai tunggal yang dapat dikaitkan dengan TRF1 dan dapat mengatur jumlah atau frekuensi perpanjangan telomer [ 22 ].

Fokus dari tinjauan ini adalah pada inhibitor komponen hTR atau hTERT dari telomerase dan terapi yang sedang dikembangkan yang mengeksploitasi sifat unik ekspresi telomerase.

Penyesuaian Komponen Enzim Telomerase

Antisense dan Oligonukleotida Terkait

Salah satu kelas agen penghambat telomerase yang paling tua dan paling sering digunakan adalah antisense DNA oligonucleotides.  Penggunaan molekul antisense untuk memblokir terjemahan mRNA menjadi protein fungsional telah umum digunakan sejak 1990-an.  Dalam pengertian klasik, teknologi antisense memanfaatkan nukleotida dengan urutan saling melengkapi untuk RNA. Oligonukleotida ini dapat dirancang untuk menempati tempat pengikatan ribosom, mencegah ribosom dari mengikat mRNA target ( Gambar. 3 ). 

Gambar 3.  Ilustrasi mekanisme aksi antisense dalam memblokir ekspresi protein

Oligos antisense ditargetkan untuk urutan hilir dari situs pengikatan ribosom di mana saja dalam urutan pengkodean akan mencegah translokasi ribosom, menghentikan terjemahan dan menghasilkan protein non-fungsional atau terpotong [ 25 ].  Ada banyak modifikasi dari molekul antisense yang mencerminkan upaya untuk meningkatkan pengambilan seluler, potensi, dan waktu paruh ( Gambar 4 ).

Gambar 4.  Contoh modifikasi yang dibuat untuk oligonukleotida antisense tradisional (A)

Beberapa modifikasi membantu merekrut aktivitas RNase H, yang menurunkan untaian RNA dari dupleks RNA-DNA.  Setelah degradasi komponen mRNA dupleks, molekul DNA antisense dilepaskan dan menjadi bebas untuk mengikat molekul mRNA target lainnya.  Keterkaitan fosforotioat (PS) memperlambat degradasi molekul antisense dalam sel dan meningkatkan waktu paruh mereka [ 26 ]. Asam nukleat peptida (PNA) adalah molekul di mana basis antisense terhubung ke berbagai tulang punggung peptida ( Gambar. 5 ). 

Gambar 5.  Tiga variasi asam nukleat peptida (PNA)

Modifikasi ini telah ditemukan untuk meningkatkan paruh oligomer antisense dan meningkatkan sifat hibridisasi [ 27 ]. RNA yang dimodifikasi 2'- O- Metil-dan 2'-metoksietil meningkatkan afinitas molekul antisense untuk target spesifik mereka [ 25 ]. Beberapa dari berbagai jenis molekul antisense telah memasuki uji klinis. Satu, Vitravene, telah memperoleh persetujuan FDA untuk pengobatan retinitis yang diinduksi CMV [ 28 ].

Penggunaan teknologi antisense dalam penghambatan telomerase bukanlah hal baru. Faktanya, laporan pertama dari penghambatan aktivitas telomerase yang berhasil melibatkan penggunaan oligonukleotida antisense terhadap hTR 10 tahun yang lalu [ 29 ]. Feng et al . melaporkan pada 1995 bahwa antisense oligonukleotida saling melengkapi dengan urutan di dalam atau di dekat templat telomerik manusia RNA menghasilkan penekanan aktivitas telomerase sementara oligonukleotida antisense terhadap target yang lebih jauh dari templat telomer gagal untuk menghambat aksi ribonucleoprotein.  Akibatnya, sel HeLa yang ditransfusikan dengan konstruksi ekspresi antisense-hTR mengalami krisis setelah penggandaan 23 hingga 26 populasi dan menunjukkan hilangnya pengulangan DNA telomerik. Sebaliknya, sel-sel kulup negatif telomerase ditransfusikan dengan konstruk yang mengekspresikan antisense-hTR tidak memasuki krisis selama periode waktu yang sama. Penelitian ini adalah yang pertama menunjukkan potensi terapi ekspresi oligonukleotida antisense sebagai pengobatan untuk kanker manusia. 

Berdasarkan temuan Feng et al ., yang lain telah menggunakan vektor ekspresi anti-hTR untuk menghambat aktivitas telomerase dalam sel line kanker lainnya. Sel-sel kanker lambung manusia yang ditransfeksi dengan vektor yang mengekspresikan antisense-hTR menunjukkan pemendekan panjang telomer dan peningkatan level apoptosis, menunjukkan bahwa telomer pemendekan antisense yang diperpendek dalam sel kanker lambung bertindak untuk menginduksi apoptosis [ 30 ]. Bahkan jika apoptosis tidak diinduksi oleh pengenalan vektor ekspresi antisense-hTR, konstruk tersebut mungkin masih efektif dalam mengurangi agresivitas sel kanker (menurunkan kapasitas invasif dan tumorigenisitas). Ini ditemukan menjadi kasus dengan berbagai sel line glioma ganas [ 31 ]. Setelah pengenalan antisense-hTR, apoptosis hanya terjadi pada beberapa populasi sel setelah 30 kali lipat populasi sel. Populasi sel lain menghindari apoptosis, tetapi tampaknya berdiferensiasi dan menyimpang dalam morfologi dari sel induknya, menunjukkan bahwa penghambatan telomerase dapat memicu hasil yang sangat berbeda yang diinginkan: apoptosis atau diferensiasi. Meskipun bukan efek langsung dari kematian sel tumor, diferensiasi mungkin merupakan hasil terapi yang layak karena terkait efek fenotip ganas.

Pengiriman agen penghambat telomerase sebagai komponen terapi kanker menunjukkan perlunya ekspresi stabil dari inhibitor in vivo . Pendekatan yang semakin umum untuk ekspresi stabil terapi genomik spesifik adalah penggunaan sistem pengiriman retroviral, lentiviral, atau adenoviral yang dimodifikasi. Keberhasilan pengiriman dan ekspresi antisense RNA oleh retrovirus yang kekurangan replikasi dalam sel HeLa dan sel karsinoma ginjal manusia telah terbukti efektif dalam menghambat aktivitas telomerase oleh setidaknya 75% in vitro [ 32 ]. Selain itu, virus adenovirus / adeno terkait hybrid telah digunakan untuk mengekspresikan antisense-hTR dalam sel kanker payudara MCF-7 [ 33 ]. Ekspresi stabil antisense hTR dalam sel-sel ini menghasilkan penekanan yang signifikan dari aktivitas telomerase dan pemendekan telomer progresif untuk penggandaan 30 populasi bersama dengan induksi apoptosis, pengurangan proliferasi sel, dan pengurangan pembentukan koloni seperti yang ditunjukkan dengan uji agar lembut.

Sementara dominan literatur tampaknya melaporkan penggunaan molekul antisense yang menargetkan komponen RNA telomerase (hTR), penghambatan hTERT yang dimediasi antisense juga telah berhasil dicapai. Tindakan antitumor diamati ketika antisense oligodeoxynucleotides (kebanyakan 20-mers) terhadap berbagai daerah mRNA hTERT dimasukkan ke dalam sel kanker kandung kemih manusia dengan transfeksi [ 34 ]. Jumlah transkrip hTERT berkurang, viabilitas sel terganggu secara signifikan, dan penangkapan G1 diinduksi. Menariknya, ketika pengkodean vektor antisense ekspresi untuk antisense RNA melawan hTERT ditransfusikan menjadi sel kanker payudara manusia, penurunan aktivitas telomerase diamati serta apoptosis yang signifikan [ 35 ]. Namun, fenomena ini diamati 24 jam pasca transfeksi dan tidak disertai dengan pemendekan signifikan DNA telomer. Temuan ini mendukung hasil penelitian lain dari penghambatan telomerase yang secara cepat menginduksi apoptosis yang terlepas dari erosi telomer [ 36 , 37 ], dan signifikan karena mereka mengatasi kekhawatiran tradisional bahwa penghambatan telomerase akan menimbulkan jeda waktu yang substansial antara timbulnya hambatan telomerase dan erosi yang cukup dari telomer menyebabkan pertumbuhan sel kanker. Penghambatan simultan hTR dan hTERT telah ditemukan untuk menghambat aktivitas telomerase secara sinergis [ 38 ], menyarankan strategi lain untuk terapi oligonukleotida antisense.

Peningkatan dalam teknologi antisense telah menyebabkan peningkatan dalam pengenalan molekul ke dalam sel, stabilitas, perpanjangan paruh, dan spesifisitas pengikatan target. Modifikasi oligonukleotida antisense tradisional yang digunakan dalam penghambatan telomerase meliputi 2'-5'-oligoadenylate (2-5A) keterkaitan [ 39 , 40 ], 2'- O -metil-RNA [ 41 ], oligodeoksinukleotida yang dimodifikasi fosforotiate (PS-ODN) [ 34 , 42 , 43 ], asam nukleat peptida (PNA) [ 44 - 46 ], dan asam nukleat terkunci (LNA) [ 47 ].

Satu kelompok senyawa yang tersisa yang memerlukan diskusi termasuk fosforamidat oligonukleotida N3'-P5 'dan thio-fosforamidate N3'-P5'. Kelas oligonukleotida ini telah menarik perhatian belakangan ini karena salah satu turunannya, GRN163L, sedang dipersiapkan untuk menjadi inhibitor telomerase pertama yang tersedia untuk perawatan kanker. Dalam lima tahun terakhir, oligonukleotida fosforamidat dirancang dengan urutan saling melengkapi baik untuk daerah templat hTR atau wilayah ∼100 nukleotida di hilir wilayah templat [ 48 - 50 ]. Fosforamidate N3'-P5 '(NP oligonukleotida) dan thio-phosphoramidates N3'-P5 (NPS oligonukleotida) membentuk dupleks spesifik urutan dengan target RNA. Thio-fosforamidat N3'-P5 dirancang untuk menggabungkan afinitas pengikatan RNA dan spesifisitas urutan fosforamidat dengan kemampuan oligonukleotida fosforat untuk berinteraksi dengan protein (yaitu, hTERT) [ 51 ]. Baik oligonukleotida NP dan NPS menghambat aktivitas telomerase, menyebabkan pemendekan telomer, penuaan, dan akhirnya apoptosis; Namun, oligonukleotida NP tidak efisien tanpa menggunakan pembawa lipid untuk memfasilitasi pengenalannya ke dalam sel.  Oligonukleotida NPS secara signifikan lebih kuat sebagai penghambat telomerase daripada molekul induknya, bahkan tanpa menggunakan pembawa lipid. NP deoxyoligonucleotides menunjukkan nilai IC ₅₀ dalam kisaran 0,5-1 μM dibandingkan dengan NPS deoxyoligonucleotides, yang memiliki nilai IC ₅₀ dalam kisaran 0,5-5 nM (keduanya dengan penambah penyerapan seluler) [ 49 ].

GRN163 13-mer telah muncul sebagai kandidat terapi thio-phosphoramidate N3'-P5 yang menarik, yang dihasilkan dari optimalisasi strategi penghambatan NP dan NPS [ 51 ]. Pengujian awal dalam uji sel bebas menunjukkan nilai IC50 serendah 26-44 pM [ 51 ]. Secara signifikan, GRN163 terbukti menghambat aktivitas telomerase dalam berbagai sel line kanker in vitro 24-72 jam setelah pengobatan (menggunakan uji TRAP berbasis sel T elomeric Repeat A mplification P rotocol); kelangsungan hidup sel manusia normal, WI-38 dan BJ fibroblas, tidak terpengaruh, bahkan dengan perawatan hingga 100 μM GRN163 selama 72 jam [ 51 ]. Pengobatan dengan GRN163 telah terbukti menginduksi pemendekan telomer, pertumbuhan, dan kematian sel pada multiple myeloma manusia [ 52 , 53 ] dan limfoma non-Hodgkin [ 53 ], sel, serta penekanan pertumbuhan tumor pada model xenograft kanker prostat [ 54 ].

Sebuah oligonukleotida generasi kedua, GRN163L, baru-baru ini terbukti lebih kuat daripada pendahulunya GRN163, menyebabkan pemendekan telomer yang lebih cepat dan penghambatan pertumbuhan sel dan memiliki rata-rata tujuh kali lipat nilai IC ₅₀ lebih rendah di berbagai lini sel yang diuji [ 55 ]. Perbedaan GRN163L adalah modifikasi lipid dari oligonukleotida generasi pertama. Tantangan dalam pengiriman terapeutik oligonukleotida sering membuatnya perlu untuk menggunakan reagen transfeksi berbasis lipid atau pembawa untuk eksperimen in vitro . Modifikasi lipid oligonukleotida dalam kasus ini tampaknya telah menghilangkan persyaratan untuk pembawa lipid asing. Pembuatan GRN163L telah berlangsung untuk memasok cukup obat untuk toksisitas dan studi farmakokinetik pada hewan dan studi klinis Fase I, sehingga berpotensi menjadi inhibitor telomerase pertama untuk terapi kanker ¹ . Penggunaan teknologi antisense dalam penghambatan telomerase dirangkum dalam Tabel 1.

Table 1.Efek Antisense Oligonucleotide dalam penghambatan telomerase (56)

Target	Cells Tested*	Effect of treatment	Efficiency of inhibiton	Ref.
hTR	HeLa (cervical)	Loss of telomeric DNA; crisis after 23-26 PD	Reduction of activity	[29]
hTR	SGC7901 (gastric)	Telomere length shortening; increased apoptosis	Significant reduction of activity	[30]
hTR	U251-MG (malignant glioma)	Apoptosis only in some populations after 30 PD; differentiation of some populations	Complete ablation of activity	[31]
hTR	HeLa (cervical) A498 (kidney)	Reduction in cell viability; appearance of giant, senescent-like cells; reduction in growth rate	≥75% inhibition of telomerase activity	[32]
hTR	MCF-7 (breast)	Progressive telomere shortening for 30 PD; induction of apoptosis; reduction of proliferation and colony formation	significant suppression of telomerase activity	[33]
hTERT	EJ28, 5637, J28, HT1197 (bladder)	Reduction of hTERT mRNA (≤88%); impairment of cell viability; G1 arrest	≤60% inhibition of activity	[34]
hTERT	PMC42 (breast)	Decreased telomerase activity; significant apoptosis; Rapid effect: 24 hours post-transfection No significant telomere shortening	Up to 50% reduction of activity	[35]
hTR and hTERT simultaneously	SW480 (colon)	Significant inhibition of proliferation by 24 hours Decrease in telomerase activity by 48 hours continuing to decrease through 72 hours Significant increase in apoptosis	combination treatment 0.2 mmol/L for 72 hours; 80% inhibition of activity	[38]
hTR (2-5A)	U251-MG (malignant glioma)	Significant decrease in cell viability after 5 days Significant impairment of tumor growth in nude mice	hTR undetectable after treatment	[39]
hTR (2-5A)	PC3, DU145 (prostate)	Significant decrease in cell viability within 6 days Significant suppression of tumor growth in nude mice	Cell viability reduced to 9-18% within 6 days of treatment	[40]
hTR (2′-O-Me)	DU145, LNCaP (prostate)	Telomere shortening; halt of cell proliferation after delay (in relation to telomere shortening); 90% reduction in colony forming ability in LNCaP cells	>75% inhibition of activity up to >85% inhibition in DU145	[91]
hTERT (PS)	EJ28 (bladder)	Maximum decrease in hTERT mRNA 12 hours after treatment; immediate and continued reduction of cell viability with successive transfections of constructs	>60% inhibition of activity; up to 88% reduction in hTERT mRNA	[34]
hTR (PS)	HL-60 (leukemia)	Efficient but not selective; non-complementary constructs had nearly same effect as complementary; more efficient than PNA	IC50 of 0.5 and 0.6 nM	[42]
hTR (PS)	MKN-28, SGC7901, MKN-45 (gastric)	After 96 hours, significant growth inhibition in poor and moderately differentiated cell lines but not in well-differentiated Apoptosis in poor and moderately differentiated lines	Inhibition of activity at 5 mmol/L; complete inhibition at 10 mmol/L	[43]
hTERT (PNA)	DU145 (prostate) U2OS (osteogenic sarcoma)	Efficient introduction of naked PNA against hTERT using photochemical internalization approach; effect most prominent 6 hours after treatment becoming less pronounced 24-48 hours after treatment	Telomerase activity reduced to 8.4 ± 0.79% of control	[46]
single stranded G-rich overhang (PNA)	AT-SV1 †(Ataxia telangiectasia)	No inhibition of telomerase activity; decrease in colony sizes; slight decrease in median telomere length Synergistic effect with PNA blocking telomerase activity	Virtual elimination of colony formation when combined with telomerase inhibitor	[44]
hTR (PNA)	AT-SV1 †(Ataxia telangiectasia)	Inhibition of telomerase activity; proliferation arrest after 5 to 30 generations; median telomere length shortened by 377 bp; reduction in colony size	62% reduction of telomerase activity with 10 mM treatment	[45]
hTR (LNA)	DU145 (prostate)	Inhibition of activity up to 40 hours post-transfection High-affinity binding and selectivity	Some LNAs resulted in >80% inhibition of telomerase activity	[47]
hTR (NP and NPS)	various	Telomerase inhibition by both NP and NPS resulting in reduction of telomere length NP: most effective targets within template region NPS: may use PS group interacting with hTERT to stabilize secondary structure	NP: sub-nM IC50 NPS: ∼50 pM IC50	[48]
hTR (NP and NPS)	HME50-5E †(spontaneously immortalized breast epithelial cells)	NP inefficient without lipid carrier; NPS efficient with or without carrier; 0.5 mM NPS caused telomere shortening, senescence by day 100, massive apoptosis by day 115 Addition of -thio group significantly increased potency	NP: IC50 ∼0.5-1 mM with lipid NPS: IC50 0.5-5 nM with lipid	[49]
hTR (GRN163)	various	Inhibition of telomerase activity within 24-72 hours after treatment WI-38 and BJ fibroblast survival not affected by up to 100 mM treatment for 72 hours Induction of telomere shortening, growth arrest, cell death, and tumor growth suppression in nude mice	IC50 of 26-44 pM	[51- 54]
(GRN163L)	various	Sevenfold lower IC50 in tested cell lines; more rapid telomeric attrition and growth inhibition; lipid modification eliminates need for carrier In early clinical trials		[55]

Open in a separate window

Antisense modifications: 2-5A = 2′-5′-oligoadenylate; 2′-O-Me = 2′-O-methyl-RNA; PS = phosphorothioate; PNA = peptide nucleic acid; LNA = locked nucleic acid; NP = oligonucleotide N3′-P5′ phosphoramidates; NPS = N3′-P5′ thio-phosphoramidates.

^*All listed are cancer cell lines unless otherwise specified (†)

Daftar Referensi

1. Blackburn EH. Nature. 1991;350:569.

2. Greider CW. Curr. Opin. Cell Biol. 1991;3:444.

3. Harley CB. Mutat. Res. 1991;256:271.

4. Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Nature. 1990;345:458.

5. Hayflick L. Exp. Cell Res. 1965;37:614.

6. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB, Harley CB, Shay JW, Lichtsteiner S, Wright WE. Science. 1998;279:349.

7. Olovnikov AM. Dokl. Akad. Nauk. SSSR. 1971;201:1496.

8. Watson JD. Nat. New Biol. 1972;239:197.

9. Shay JW, Pereira-Smith OM, Wright WE. Exp. Cell Res. 1991;196:33.

10. Masutomi K, Yu EY, Khurts S, Ben-Porath I, Currier JL, Metz GB, Brooks MW, Kaneko S, Murakami S, DeCaprio JA, Weinberg RA, Stewart SA, Hahn WC. Cell. 2003;114:241.

11. Shay JW, Bacchetti S. Eur. J. Cancer. 1997;33:787.

12. de Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus HE. Mol. Cell Biol. 1990;10:518.

13. Engelhardt M, Drullinsky P, Guillem J, Moore MA. Clin.Cancer Res. 1997;3:1931.

14. Engelhardt M, Okaynak MF, Drullinsky P, Sandoval C, Tugal O, Jayabose S, Moore MA. Leukemia. 1998;12:13.

15. Hastie ND, Dempster M, Dunlop MG, Thompson AM, Green DK, Allshire RC. Nature. 1990;346:866.

16. Melana SM, Holland JF, Pogo BG. Clin. Cancer Res. 1998;4:693.

17. Pendino F, Flexor M, Delhommeau F, Buet D, Lanotte M, Segal-Bendirdjian E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001;98:6662.

18. Aldous WK, Marean AJ, DeHart MJ, Matej LA, Moore KH. Cancer. 1999;85:1523.

19. Naasani I, Seimiya H, Tsuruo T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998;249:391.

20. Gomez D, Lemarteleur T, Lacroix L, Mailliet P, Mergny JL, Riou JF. Nucleic Acids Res. 2004;32:371.

21. Fu W, Begley JG, Killen MW, Mattson MP. J. Biol. Chem. 1999;274:7264.

22. Smogorzewska A, de Lange T. Annu. Rev. Biochem. 2004;73:177.

23. Stansel RM, de Lange T, Griffith JD. EMBO J. 2001;20:5532.

24. de Lange T. Oncogene. 2002;21:532.

25. Braasch DA, Corey DR. Biochemistry. 2002;41:4503.

26. Geary RS, Yu RZ, Levin AA. Curr. Opin. Investig. Drugs. 2001;2:562.

27. Egholm M, Buchardt O, Christensen L, Behrens C, Freier SM, Driver DA, Berg RH, Kim SK, Norden B, Nielsen PE. Nature. 1993;365:566.

28. Orr RM. Curr. Opin. Mol. Ther. 2001;3:288.

29. Feng J, Funk WD, Wang SS, Weinrich SL, Avilion AA, Chiu CP, Adams RR, Chang E, Allsopp RC, Yu J, et al. Science. 1995;269:1236.

30. Zhang FX, Zhang XY, Fan DM, Deng ZY, Yan Y, Wu HP, Fan JJ. World J. Gastroenterol. 2000;6:430.

31. Kondo S, Tanaka Y, Kondo Y, Hitomi M, Barnett GH, Ishizaka Y, Liu J, Haqqi T, Nishiyama A, Villeponteau B, Cowell JK, Barna BP. FASEB J. 1998;12:801.

32. Bisoffi M, Chakerian AE, Fore ML, Bryant JE, Hernandez JP, Moyzis RK, Griffith JK. Eur. J. Cancer. 1998;34:1242.

33. Zhang X, Chen Z, Chen Y, Tong T. Oncogene. 2003;22:2405.

34. Kraemer K, Fuessel S, Schmidt U, Kotzsch M, Schwenzer B, Wirth MP, Meye A. Clin. Cancer Res. 2003;9:3794.

35. Cao Y, Li H, Deb S, Liu JP. Oncogene. 2002;21:3130.

36. Cao Y, Li H, Mu F-T, Ebisui O, Funder JW, Liu J-P. FASEB J. 2001;01.

37. Saretzki G, Ludwig A, von Zglinicki T, Runnebaum IB. Cancer Gene Ther. 2001;8:827.

38. Fu XH, Zhang JS, Zhang N, Zhang YD. World J. Gastroenterol. 2005;11:785.

39. Kondo S, Kondo Y, Li G, Silverman RH, Cowell JK. Oncogene. 1998;16:3323.

40. Kondo Y, Koga S, Komata T, Kondo S. Oncogene. 2000;19:2205.

41. Pitts AE, Corey DR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998;95:11549.

42. Matthes E, Lehmann C. Nucleic Acids Res. 1999;27:1152.

43. Ye J, Wu YL, Zhang S, Chen Z, Guo LX, Zhou RY, Xie H. World J. Gastroenterol. 2005;11:2230.

44. Shammas MA, Liu X, Gavory G, Raney KD, Balasubramanian S, Shmookler Reis RJ. Exp. Cell Res. 2004;295:204.

45. Shammas MA, Simmons CG, Corey DR, Shmookler Reis RJ. Oncogene. 1999;18:6191.

46. Folini M, Berg K, Millo E, Villa R, Prasmickaite L, Daidone MG, Benatti U, Zaffaroni N. Cancer Res. 2003;63:3490.

47. Elayadi AN, Braasch DA, Corey DR. Biochemistry. 2002;41:9973.

48. Gryaznov S, Pongracz K, Matray T, Schultz R, Pruzan R, Aimi J, Chin A, Harley C, Shea-Herbert B, Shay J, Oshima Y, Asai A, Yamashita Y. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001;20:401.

49. Herbert BS, Pongracz K, Shay JW, Gryaznov SM. Oncogene. 2002;21:638.

50. Pruzan R, Pongracz K, Gietzen K, Wallweber G, Gryaznov S. Nucleic Acids Res. 2002;30:559.

51. Gryaznov S, Asai A, Oshima Y, Yamamoto Y, Pongracz K, Pruzan R, Wunder E, Piatyszek M, Li S, Chin A, Harley C, Akinaga S, Yamashita Y. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003;22:577.

52. Akiyama M, Hideshima T, Shammas MA, Hayashi T, Hamasaki M, Tai YT, Richardson P, Gryaznov S, Munshi NC, Anderson KC. Cancer Res. 2003;63:6187. 

53. Wang ES, Wu K, Chin AC, Chen-Kiang S, Pongracz K, Gryaznov S, Moore MA. Blood. 2004;103:258.

54. Asai A, Oshima Y, Yamamoto Y, Uochi TA, Kusaka H, Akinaga S, Yamashita Y, Pongracz K, Pruzan R, Wunder E, Piatyszek M, Li S, Chin AC, Harley CB, Gryaznov S. Cancer Res. 2003;63:3931.

55. Herbert BS, Gellert GC, Hochreiter A, Pongracz K, Wright WE, Zielinska D, Chin AC, Harley CB, Shay JW, Gryaznov SM. Oncogene. 2005;24:5262.]

56. AP Cunningham , Cinta WK , RW Zhang , LG Andrews , and  TO Tollefsbol.  2006, Curr Med Chem. 2006; 13(24): 2875–2888.