RSS Feed (xml)
RINGKASAN
Pemuliaan selektif dan modifikasi genetik telah menjadi landasan peternakan. Namun, strategi pembiakan hewan selama beberapa generasi untuk mengintrogresi alel baru tidak praktis dalam mengatasi tantangan global seperti perubahan iklim, pandemi, dan perkiraan kebutuhan untuk memberi makan populasi 9 miliar pada tahun 2050. Akibatnya, terjadi pengeditan genom pada zigot untuk memungkinkan introgresi alel-alel baru yang mulus diperlukan, terutama pada sapi dengan interval generasi yang panjang. Kami untuk pertama kalinya melaporkan penggunaan editor genom CRISPR-Cas untuk memperkenalkan varian alelik PRNP baru yang telah terbukti memberikan ketahanan terhadap pandemi prion pada manusia. Dari satu putaran suntikan embrio, kami telah menghasilkan enam kebuntingan dan kelahiran tujuh keturunan yang telah diedit, dengan dua pendiri menunjukkan >90% modifikasi perbaikan yang diarahkan pada homologi yang ditargetkan. Studi ini menjabarkan kerangka kerja untuk optimasi in vitro, pengurutan mendalam yang tidak memihak untuk mengidentifikasi hasil pengeditan, dan pembuatan anak sapi yang diedit dengan perbaikan yang diarahkan oleh homologi frekuensi tinggi.
INTRUDUKSI
Modifikasi genetik ternak memiliki sejarah yang panjang dan bertingkat, dimulai dari domestikasi hewan. Awalnya, hewan yang menunjukkan sifat-sifat yang menguntungkan untuk domestikasi dan kinerjanya dipilih untuk dikawinkan (seleksi massal). Kemudian seiring berjalannya waktu, prosesnya menjadi lebih canggih dan mencakup seleksi silsilah, seleksi berbantuan penanda, dan dengan pengurutan genom, seleksi seluruh genom. Transgenik menandai tonggak sejarah besar pertama yang memungkinkan terjadinya introgresi alel dan sifat baru ke dalam hewan ternak.[1] Hal ini dikombinasikan dengan transfer inti sel somatik (SCNT) [2,3] menjadi bahan pokok untuk menghasilkan ternak hasil rekayasa genetika. Penemuan baru-baru ini dan keberhasilan validasi editor genom (ZFNs, TALENs, dan CRISPR-Cas9) kini memungkinkan modifikasi genetik secara langsung pada zigot tanpa memerlukan SCNT.[4–10]
Di antara editor genom, CRISPR-Cas9 telah digunakan secara luas untuk pengeditan genom ternak.[8–10] Sistem ini menggunakan urutan RNA nukleotida 17–20 (“spacer”) sebagai panduan bersama dengan urutan universal (“tracr”) yang memungkinkan pemuatan ke dalam protein Cas9 (single guide RNA [sgRNA] ).[11–13] Ketika protein Cas9 dan kompleks ribonukleoprotein (RNP) sgRNA yang telah dikomplekskan dimasukkan ke dalam sel target atau embrio, Cas9 menyebabkan pemutusan beruntai ganda pada lokasi DNA target.[13] Pada frekuensi yang lebih rendah, pemutusan beruntai ganda dapat menjalani perbaikan yang diarahkan oleh homologi (HDR) dengan adanya templat perbaikan yang homolog, atau pada frekuensi yang lebih tinggi melalui jalur penggabungan akhir nonhomolog (NHEJ) yang rawan kesalahan [14] Beberapa manuskrip terbaru menyoroti kelayakan pengeditan genom sapi dalam sel somatik, [15-20] dan pengiriman langsung editor ke zigot [6,21–23] Namun, hingga saat ini belum ada manuskrip yang melaporkan generasi anak sapi hidup dengan varian baru melalui pengeditan HDR genom sapi yang dimediasi CRISPR-Cas secara langsung di zigot.
Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk membangun jalur untuk (1) desain rasional dan pemilihan reagen penargetan, (2) pendekatan penyaringan keluaran tinggi untuk mengevaluasi hasil pengeditan, (3) teknik yang dioptimalkan untuk injeksi embrio untuk memaksimalkan hasil HDR, dan ( 4) pada akhirnya, generasi anak sapi yang diedit genom dengan introgresi varian baru yang dimediasi HDR dengan efisiensi tinggi.
Sebagai bukti konsep, pengenalan varian PRNP alelik (protein prion) baru telah dipilih untuk validasi jalur optimasi dan untuk menghasilkan ternak yang tahan terhadap penyakit prion.
Protein prion seluler (PrP) yang salah lipatan mengakibatkan gangguan sistem saraf pusat degeneratif yang disebut sebagai ensefalopati spongiform menular, [24] seperti bovine spongiform encephalopathy (BSE) pada sapi, scrapie pada domba, dan penyakit Creutzfeldt-Jakob pada manusia.[24] Meskipun ada larangan suplemen pakan yang berasal dari ruminansia membantu mengurangi kejadian kasus BSE, risiko BSE atipikal akibat kesalahan pelipatan PrP endogen secara spontan masih menjadi perhatian.[25–27] Untuk mengatasi kekhawatiran ini, ternak PRNP null telah dihasilkan melalui SCNT.[28]
Dengan ketersediaan Setelah CRISPR, beberapa kelompok mempertimbangkan kembali pembuatan PRNP pada sapi null, meskipun sebagian besar upaya masih terbatas pada upaya in vitro.[17,18] Beberapa varian alami PRNP telah diidentifikasi yang memberikan perlindungan terhadap penyakit prion yang diturunkan.[29,30] Salah satu varian PrP tertentu dengan glisin (G) pada posisi 127 diganti dengan valin (V), disebut sebagai G127V, terbukti memberikan perlindungan dominan-negatif terhadap penyakit (dalam heterozigositas) pada populasi “Depan” di Papua Nugini selama epidemi Kuru prion.[31]
Dalam sebuah penelitian yang elegan, tikus null untuk varian Prnp endogen dan transgenik untuk varian G127V manusia memberikan resistensi terhadap 18 isolat penyakit prion.[31] Substitusi asam amino tunggal (G127V) ini sama protektifnya dengan penghapusan atau penghancuran protein.[31] Meskipun demikian, tikus telah digunakan sebagai pengganti dalam penelitian ini dan penelitian lainnya,[31–36] mereplikasi temuan ini pada sapi—yang merupakan inang alami penyakit ini—akan bermanfaat dalam mengkonfirmasi temuan ini dan menghasilkan ras sapi elit yang tahan penyakit. Dalam penelitian ini, sebagai bukti konsep, tujuan kami adalah merekayasa alel G127V pada sapi menggunakan editor genom CRISPR-Cas.
BAHAN DAN METODE
Reagen
Semua bahan kimia diperoleh dari Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) kecuali dinyatakan sebaliknya. Semua reagen CRISPR-Cas, oligos penargetan, dan primer PCR yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari IDT DNA Technologies (Coralville, IA) dan ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Urutan reagen nukleotida yang digunakan dalam penelitian
Jaminan eksperimental pada hewan
Semua percobaan yang melibatkan hewan hidup dilakukan sesuai dengan pedoman yang disetujui dari komite perawatan dan penggunaan hewan institusional Universitas Maryland dan Thomas D. Morris Inc. Semua protokol eksperimental yang melibatkan hewan hidup telah disetujui oleh institusi perawatan dan penggunaan hewan di kedua Institut (protokol UMD No. 1418824-1 dan protokol TDMI No. 18-005: Pengeditan genom pada Sapi).
Pematangan in vitro, fertilisasi in vitro, dan injeksi mikro
Kompleks kumulus oosit (COC) dari sapi potong dibeli dari ART Inc. (Madison, WI) atau DeSoto Biosciences Inc. (Seymour, TN) dan dikirim ke laboratorium semalaman dalam media Pematangan pada suhu 38,5°C. Dua puluh dua jam (jam) setelah ditempatkan dalam media maturasi, fertilisasi in vitro (IVF) dilakukan sesuai dengan protokol yang ditetapkan menggunakan semen beku.[37] Singkatnya, dua sedotan semen yang telah dicairkan dicampur dengan larutan buffer fosfat Dulbecco (DPBS) ) mengandung 1 mg/mL BSA hingga volume akhir 10 mL dan disentrifugasi pada 1000 g, 25°C selama 4 menit, diikuti dengan dua kali pencucian spermatozoa dalam DPBS. Setelah pencucian terakhir, spermatozoa diinkubasi bersama dengan COC matang selama 6 jam dalam cawan NUNC empat lubang (50 COC/500 μL) dalam media isotonik Brackett dan Oliphant yang dimodifikasi yang mengandung 3 mg/mL BSA bebas asam lemak dan ditambah dengan PHE (20 μM D-penicillamine, 10 μM hipotaurin, dan 1 μM epinefrin), [38] pada konsentrasi akhir 2 × 106 spermatozoa/mL pada 38,5°C dan 5% CO2.
Enam jam setelah IVF, dugaan zigot divorteks dalam 0,1% hialuronidase dalam media buffer HEPES yang mengandung 0,01% poli vinil alkohol (PVA) selama 4 menit untuk menghilangkan sel kumulus dan spermatozoa asing. Zigot dugaan disuntik secara mikro dengan campuran Cas9 RNP yang bersumber secara komersial (protein Cas9 dan sgRNA) dan DNA untai tunggal menggunakan mikroinjektor FemtoJet (Eppendorf, Jerman). Embrio yang disuntikkan secara mikro dikultur hingga tahap blastokista dalam medium bebas serum (BO-IVC; IVF Bioscience, UK) selama 8 hari pada suhu 38,5°C, 5% CO2, 5% O2, dan kelembapan 100%. Perkembangan laju perkembangan embrio ke tahap pembelahan dan blastokista dicatat masing-masing pada hari ke 2 dan 8 pasca IVF.
Optimalisasi reagen penargetan CRISPR-Cas
Eksperimen 1. Desain dan validasi CRISPR-Cas sgRNA
Untuk menghasilkan varian G127V, urutan “GGA” yang mengkode glisin pada posisi 127 (posisi nukleotida 381) ditargetkan untuk dikonversi ke “GTA” untuk mengkode valin. Konversi GGA ke GTA menciptakan situs enzim restriksi AccI (GTATAC) dalam alel yang dimodifikasi untuk memungkinkan penyaringan berbasis polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP) untuk efisiensi penargetan gen. Dua sgRNA dengan motif PAM “NGG”, satu di dekat lokasi target pada untai indra (maju [F]) dan satu lagi tumpang tindih dengan lokasi target pada untai antisense (untai [R] terbalik) ditunjukkan (Tabel 1; Gambar 1A ).
Dalam uji coba awal, RNP CRISPR yang telah dikomplekskan dengan F- atau R-sgRNA yang sesuai diuji bersama dengan oligodeoksinukleotida (oligos) untai tunggal simetris 200 bp dengan urutan “TA” yang ditargetkan di tengah (200 bp; 99 bp TA 99 bp; Tabel 1). Embrio yang disuntikkan dibiarkan berkembang ke tahap blastokista, pada saat itu blastokista dilisiskan dalam buffer lisis blastokista (50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris pH 8,0, 0,5% NP-40, 0,5% Tween-20, dan 100 μg/ mL proteinase K), PCR diamplifikasi, dan restriksi dicerna dengan enzim restriksi AccI dan diselesaikan pada gel agarosa 2%. Penargetan yang berhasil dinilai berdasarkan resolusi tipe liar dan dua fragmen yang dihasilkan AccI (tipe liar 526 bp dan panjang 225 dan 301 bp) pada gel.
Gambar. 1. Mengidentifikasi reagen penargetan CRISPR-Cas yang optimal.
(A) Skema yang menguraikan lokasi target lokus PRNP sapi endogen. Urutan pengkodean dipotong untuk kenyamanan (ditunjukkan dengan “//”). Situs yang mengkode glisin (GGC) pada posisi asam amino 127 yang ditargetkan untuk konversi menjadi valin (GTA) disorot dengan warna kuning. Penargetan gen yang berhasil akan menghasilkan pembentukan situs enzim restriksi AccI (GTATAC). Dua rangkaian pengatur jarak CRISPR yang menargetkan untai indera (panduan F) dan untai antisense (panduan R) ditunjukkan di atas lokasi target. Lokasi pemotongan yang diduga ditampilkan sebagai segitiga merah untuk setiap panduan.
(B) Gambar elektroforesis gel agarosa yang representatif menunjukkan bahwa pengenalan situs AccI ke dalam DNA genom hanya dihasilkan dari panduan-R, dan bukan dari panduan-F. Wilayah genom yang ditargetkan adalah PCR yang diamplifikasi dari embrio (diberi nomor), gel fragmen amplikon dimurnikan, pencernaan AccI, dan fragmen pencernaan diselesaikan pada gel agarosa 2%.
(C) Hasil dari penargetan gen dengan panduan F dan R dari tiga percobaan rangkap tiga. Tidak ada penargetan gen yang berhasil diidentifikasi dengan F-guide (n = 14 blastokista), sedangkan R-guide menghasilkan penargetan yang berhasil dengan temuan yang signifikan secara statistik (n = 16 blastokista; *P < 0.05).
(D) Hasil dari penargetan gen dengan R-guide dan oligos yang menargetkan indra (n = 39 blastokista) atau untai antisense (n = 39 blastokista). Oligo antisense menghasilkan efisiensi penargetan yang lebih baik dari eksperimen duplikat (*P < 0,05).
(E) Skema yang menguraikan Illumina miSeq menargetkan sekuensing amplikon blastokista dari penargetan gen embrio dengan berbagai iterasi oligos antisense (sense, antisense, reverse-asimetris). File FastQ dari proses miSeq dipangkas dan disejajarkan dengan urutan referensi. Peristiwa wildtype, perbaikan terarah homologi yang tidak dimodifikasi (HDR) dan penggabungan akhir nonhomolog (NHEJ) dari blastokista yang representatif dibuang. Semua embrio berbentuk mosaik yang menunjukkan berbagai kombinasi peristiwa penyuntingan.
(F) Hasil dari menyusun ulangan selama beberapa minggu dan menunjukkan peristiwa pengeditan ditampilkan (total 120 blastokista: 43 simetris, 24 asimetris, dan 53 asimetris terbalik). Persentase embrio yang tidak menunjukkan pembacaan HDR, <10% pembacaan HDR (frekuensi HDR rendah), dan >10% pembacaan yang ditampilkan. Oligo asimetris adalah yang paling tidak efisien di antara ketiga oligo yang diuji.
(G) Persentase embrio yang menunjukkan sepertiga alel target gen (>33 % HDR); dan
(H) lebih dari separuh alel yang dimodifikasi (>50% HDR) ditampilkan. Oligo asimetris terbalik menghasilkan efisiensi penargetan yang lebih baik dengan jumlah embrio yang lebih banyak yang menunjukkan frekuensi HDR tinggi. FWD, maju; REV, mundur.
Eksperimen 2. Desain dan validasi reagen penargetan (oligos sense versus antisense)
Setelah validasi bahwa R-guide efektif dalam merekayasa modifikasi yang ditargetkan, semua percobaan selanjutnya untuk optimasi reagen dan pembuatan hewan hidup di bawah ini dilakukan dengan panduan yang sama. Dua oligo simetris (200 bp; 99bp TA 99 bp dan 99 bp AT 99 bp), satu menargetkan untai indra dan satu lagi untai antisense, disuntikkan ke dalam zigot dugaan, dan blastokista pada kultur 8 hari disaring untuk HDR yang diinginkan hasil menggunakan pendekatan RFLP. Keberhasilan penargetan dinilai dengan resolusi dua fragmen (ukuran amplikon 641 bp; produk yang dicerna 313 bp dan panjang 328 bp) pada gel agarosa 2%. Setelah validasi awal oligo simetris terbalik menghasilkan efisiensi penargetan yang lebih baik, dua oligo tambahan yang menargetkan untai terbalik, varian asimetris (96 bp AT 29 bp) dan oligo asimetris terbalik (33 bp AT 92 bp) dirancang dan diuji untuk keberhasilan penargetan gen dalam embrio sapi menggunakan metodologi yang dijelaskan di atas.
Suntikan embrio, sinkronisasi estrus dan Transfer Embrio
Oosit yang tersedia secara komersial dibuahi secara in vitro dan disuntikkan dengan 0,2 μM protein Cas9 dengan 0,2 μM sgRNA dan 1 μM menargetkan oligo dan dikultur dalam lingkungan oksigen rendah. Pada hari ke 7 setelah mikroinjeksi pada tahap blastokista, transfer embrio dilakukan tanpa pembedahan. Dua belas sapi dara Holstein digunakan sebagai hewan penerima (sembilan penerima untuk embrio yang diinjeksi mikro dan tiga penerima digunakan untuk transfer embrio kontrol noninjeksi).
Sapi dara penerima disinkronkan dengan protokol pelepasan obat internal terkontrol (CIDR) yang dimodifikasi. Singkatnya, pada hari ke 0 suntikan tunggal hormon pelepas gonadotropin 10 μg (buserelin asetat) diberikan I/M dan CIDR (1,38 g progesteron dalam kumparan silastik; Zoetis, NJ) dimasukkan secara intravaginal. Pada hari ke 7, CIDR dihilangkan, dan suntikan tunggal 25 mg prostaglandin F2α (dinoprost tromethamine) diberikan melalui injeksi I/M.
Enam sampai delapan hari setelah permulaan estrus tersinkronisasi, masing-masing sapi penerima dipindahkan dengan dua blastokista dengan menyimpan embrio pasca-serviks secara intravaginal. Kebuntingan terdeteksi dengan tes BioPryn ELISA (BioPryn; Moscow, ID) pada hari ke 28 dan konfirmasi akhir dengan ultrasonografi pada usia kebuntingan 90 hari.
Genotipe blastokista dan hewan yang diedit
Blastokista turunan embrio IVF yang dikultur selama 8 hari dicuci tiga kali dengan media PBS-PVA (pH 7,4) dan dipindahkan ke dalam 9 μL buffer lisis blastokista dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 65°C. Pencernaan dihentikan dengan memanaskan campuran pada suhu 95°C selama 10 menit, dan 2 μL supernatan digunakan sebagai templat PCR. DNA genom dari biopsi jaringan (takik telinga dan darah) dari anak sapi hidup diekstraksi menggunakan kit DNA genom PureLink (Life Technologies, CA) sesuai dengan instruksi pabrik. Semen dari anak sapi jantan berumur 6 bulan diperoleh dengan cara elektroejakulasi. Semen dicuci dua kali dalam 1 × PBS, dan DNA genom dari sperma diisolasi dengan kit DNA genom PureLink. Kuantitas dan kualitas DNA yang diekstraksi diperiksa dengan spektrofotometer Nanodrop (Thermo Fisher Scientific). DNA genom dari embrio di atas atau DNA genom yang diekstraksi dari darah dan jaringan diamplifikasi dengan PCR, dan efisiensi penargetan gen dievaluasi dengan pencernaan enzim restriksi (AccI). Selain itu, DNA digunakan untuk pengurutan amplikon yang ditargetkan pada platform Illumina iSeq atau miSeq (Illumina, CA).
Persiapan library, pengurutan MiSeq, dan iSeq
MiSeq
PCR awal dilakukan dengan 2 μL lisat blastokista menggunakan kit DNA polimerase LongAmp Taq (New England Biolabs). PCR dilakukan dengan kondisi sebagai berikut: 94°C selama 1 menit, 40 siklus 94°C selama 30 detik, 60°C selama 30 detik, dan 72°C selama 1 menit. Bersepeda selesai pada suhu 72°C selama 2 menit dan diadakan pada suhu 4°C.
Ini diikuti oleh PCR Langkah 1 dan Langkah 2 dengan indeks Truseq PCR (Illumina). Setelah amplifikasi, setiap sampel digabungkan menggunakan volume yang sama ke dalam satu kelompok, dibersihkan dengan manik-manik AMPure XP SPRI (ABM, Kanada), diukur menggunakan Qubit High Sensitivity (Thermo Fisher), dan diencerkan hingga 4 nM. Library yang dinormalisasi (5 μL) didenaturasi dan diencerkan hingga 10 pM, dengan 10 pM PhiX Spike 20% untuk memastikan keragaman library. Enam ratus mikroliter library dimuat ke dalam kartrid siklus MiSeq V2-300 yang dicairkan dan diurutkan menggunakan sequencer MiSeq dengan kit reagen Micro untuk menghasilkan file Fastq.
iSeq dijalankan
DNA genom dari sel somatik dan sperma diisolasi seperti dibahas di atas, dan amplikon 250 bp dihasilkan oleh PCR. Adaptor dan indeks unik ditambahkan ke setiap amplikon menggunakan Kit Persiapan Perpustakaan DNA NEBNext Ultra II (New England Biolab) sesuai dengan protokol pabrikan. Secara singkat, amplikon PCR dimurnikan dengan manik-manik Clean NA NGS SPRI (Bulldog Bio), dA tailed, dan ligated ke urutan adaptor universal. Indeks unik (NEBNext MuLtiplex oligos untuk Illumina) ditambahkan ke setiap amplikon yang diadaptasi dengan thermocycling singkat menggunakan NEBNext Ultra II Q5 Master Mix dan indeks/primer universal dalam kondisi berikut: denaturasi awal 98°C selama 30 detik diikuti oleh 8 siklus 98° C selama 10 detik dan 65°C selama 75 detik, dengan perpanjangan akhir pada 65°C selama 5 menit.
Produk PCR yang diindeks dimurnikan dengan manik-manik Clean NA NGS SPRI, dan 1 μL dari setiap amplikon yang diindeks diukur menggunakan fluorimeter Sensitivitas Tinggi Qubit (Thermo Fisher Scientific), kemudian diencerkan hingga 2 nm. Kemudian 2,5 μL dari setiap amplikon yang diindeks digabungkan untuk membuat perpustakaan bersama dengan 1 nM PhiX sequencing control V3 (Illumina) untuk memastikan keragaman library. Kira-kira, 20 μL library dan campuran PhiX dimuat ke dalam instrumen iSeq 100 (Illumina) untuk diurutkan guna menghasilkan file Fastq. File Fastq diselaraskan dengan urutan DNA referensi dengan CRISPResso2.039 untuk menentukan hasil pengeditan di lokus.
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak GraphPad Prism, versi 8. Perbandingan statistik rata-rata dilakukan dengan menggunakan uji-t Student dua sisi yang tidak berpasangan; P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Ketersediaan data
Semua file pengurutan DNA disimpan di National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive dengan nomor akses PRJNA641429.
HASIL
Optimalisasi reagen penargetan gen CRISPR-Cas
Uji in vitro digunakan untuk mengidentifikasi sgRNA optimal dan menargetkan oligonukleotida untai tunggal (oligos). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1A, dua RNA pemandu yang menargetkan untai indra (panduan F) dan untai antisense (panduan R) di dekat lokasi target dirancang dan diuji. Tujuannya adalah untuk mengubah residu yang mengkode glisin menjadi valin (GGC menjadi GTA) di lokasi target seperti yang disorot dalam kotak kuning (Gambar 1A). Penargetan dan konversi urutan yang berhasil akan menghasilkan pembentukan situs enzim restriksi AccI yang baru (Gbr. 1A). SgRNA dan protein Cas9 yang bersumber secara komersial telah dikomplekskan dan disuntikkan bersama dengan indera simetris yang menargetkan oligo ke dalam zigot IVF (Tabel 1). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1B dan C, panduan F tidak efektif dalam memperkenalkan modifikasi genetik di lokasi seperti yang diungkapkan dengan analisis polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP) dengan AccI (Gambar 1B dan C). Oleh karena itu, semua percobaan selanjutnya dilakukan dengan R-guide. Mengikuti bukti awal dari R-guide aktif, dua oligo simetris 200 bp berbeda yang menargetkan untaian indra (99 bp TA 99 bp) dan antisense (99 bp AT 99 bp) pada lokus PRNP juga diuji dengan cara yang sama. Dalam uji coba dengan R-guide ini, oligos antisense memiliki efisiensi penargetan yang lebih baik dibandingkan dengan oligos sense (Gbr. 1D).
Variasi terakhir dari reagen yang diuji adalah penyempurnaan antisense yang menargetkan oligo. Tiga oligo antisense dengan keselarasan unik diuji untuk frekuensi penargetan gen. Ini termasuk simetris (urutan mengapit situs target dengan panjang identik; 99 bp AT 99bp), asimetris (urutan mengapit 5′ lebih panjang; 96 bp AT 29 bp), dan oligos antisense simetris terbalik (urutan mengapit 3′ lebih panjang 33 bp AT 92 bp) (Tabel 1).
Untuk mengevaluasi hasil pengeditan, pengurutan amplikon yang ditargetkan dari 120 blastokista (dari beberapa putaran injeksi dengan tiga oligo penargetan) dilakukan menggunakan platform Illumina MiSeq (Gbr. 1E). Minimal 3000 pembacaan diperoleh per blastokista (delapan hari setelah injeksi zigot) yang memberikan cakupan >10 × di seluruh lokasi target. Pembacaan yang diperoleh diselaraskan dengan urutan referensi dan disusun sebagai HDR, NHEJ, tidak dimodifikasi/wildtype, atau “kejadian modifikasi lainnya”.
Mirip dengan percobaan awal, semua embrio yang disuntikkan menunjukkan serangkaian modifikasi genetik, dari tanpa modifikasi (belum diedit) hingga HDR frekuensi rendah dengan modifikasi pembacaan HDR <10% (disebut sebagai <10% HDR), dan beberapa dengan pembacaan HDR frekuensi tinggi. (>50%HDR). Untuk menghasilkan anak sapi yang diedit HDR langsung, diinginkan oligo penargetan yang menghasilkan sepertiga hingga setengah alel dengan modifikasi HDR (>33% atau >50% pembacaan HDR).
Di antara ketiga kelompok perlakuan, oligo asimetris terbalik menghasilkan efisiensi penargetan dan hasil HDR yang lebih baik, sedangkan oligo asimetris berkinerja buruk (Gambar 1F – H). Eksperimen optimasi in vitro ini mengidentifikasi R-guide, dan oligo asimetris terbalik sebagai kandidat ideal untuk mengedit lokus ini.
Injeksi embrio dan transfer embrio untuk menghasilkan anak sapi yang telah diedit
CRISPR RNP (R-guide) yang telah dikomplekskan dan oligo antisense asimetris terbalik disuntikkan ke dalam zigot turunan IVF dan ditransfer ke sapi dara yang disinkronkan pada tahap blastokista untuk menghasilkan hewan yang diedit PRNP. Embrio yang tidak diinjeksi berfungsi sebagai kontrol untuk transfer embrio dan untuk evaluasi kultur embrio dan teknik transfer embrio. Rangkuman hasil kebuntingan dari transfer embrio ditunjukkan pada Tabel 2. Enam blastokista kontrol tanpa suntikan yang ditransfer ke 3 penerima (2 blastokista/penerima) menghasilkan satu kebuntingan (efisiensi 16%) yang mencapai cukup bulan dan menghasilkan kelahiran anak sapi hidup.
18 blastokista yang disuntikkan secara mikro lainnya ditransfer ke sembilan penerima. Enam dari sembilan penerima melahirkan tujuh anak sapi hidup (efisiensi 44%) dan satu anak sapi yang lahir mati (dua kebuntingan kembar; Tabel 2). Dari tujuh anak sapi yang masih hidup, satu anak sapi adalah seekor sapi dara, dan enam sisanya adalah anak sapi jantan, sehingga rasionya menjadi bias terhadap keturunan jantan.
Tabel 2. Hasil kebuntingan setelah transfer embrio
Evaluasi genotipe anak sapi yang diedit
Untuk melakukan genotipe pada anak sapi, DNA genom diekstraksi dari takik telinga dan darah semua keturunannya. Amplifikasi PCR di seluruh lokasi target dilakukan dengan menggunakan analisis RFLP throughput rendah (Gambar 2A) serta platform Illumina iSeq throughput tinggi (Gambar 2B). Kisaran 8.417–25.008 pembacaan urutan dari file keluaran FastQ per setiap hewan dianalisis menggunakan perangkat lunak CRISPResso 2.0 (dengan pengecualian satu sampel dengan pembacaan rendah: #752 darah).
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2C, semua anak sapi dari embrio yang disuntikkan telah diedit. Seperti yang diharapkan dari pemeriksaan in vitro, semua anak sapi berbentuk mosaik dan memiliki kombinasi hasil perbaikan yang dimediasi NHEJ dan HDR yang bervariasi. Di antara anak sapi yang diedit, pengenalan varian G127V yang dimediasi HDR diidentifikasi pada lima dari enam anak sapi dengan frekuensi berkisar antara 9,53% hingga 94% dari telinga, dan 4% hingga 93% dari sampel darah (Gbr. 2C), dengan tiga di antaranya enam anak sapi hidup yang menunjukkan pembacaan HDR >33% (nomor 769, 786, dan 789E), dan dua anak sapi dengan pembacaan HDR >90% (786 dan 789E).
Dua dari enam anak sapi (769 dan 789) memiliki representasi lebih besar dari kejadian NHEJ out-of-frame 1-bp dan 4-bp yang mengakibatkan genotipe PRNP null. Kami melakukan eutanasia terhadap salah satu pendiri (789E), yang mengembangkan masalah kesehatan yang tidak terkait dengan pengeditan PRNP, dan mengumpulkan sampel dari delapan jaringan berbeda (selain sampel telinga dan darah), mengisolasi DNA, dan melakukan genotipe pada jaringan berbeda ini melalui throughput rendah yang serupa. RFLP (Gambar 3A) dan analisis iSeq throughput tinggi (Gambar 3B) untuk mengidentifikasi apakah genotipe dari telinga dan darah secara akurat menangkap frekuensi alel dalam seluruh hewan.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3B, penyelarasan pembacaan dari berbagai jaringan berada dalam rentang frekuensi yang diidentifikasi dari sampel telinga dan darah yang menunjukkan frekuensi HDR tinggi yang serupa (∼94%). Untuk memastikan penularan germline dari alel yang telah diedit, semen dari lima anak sapi jantan pada usia 6 bulan diejakulasi secara elektro. Dengan pengecualian satu anak sapi jantan, spermatozoa diperoleh dari ejakulasi (Gambar 4A). Analisis iSeq terhadap spermatozoa mengidentifikasi frekuensi alel yang diedit HDR berkisar antara 23% hingga 57% di antara tiga anak sapi yang diedit (Gbr. 4B).
Gambar. 2. Genotip anak sapi yang telah diedit
(A) Biopsi telinga dan darah dari anak sapi digunakan untuk isolasi DNA dan genotipe. Amplikon PCR dimurnikan, dicerna dengan AccI dan diselesaikan pada gel agarosa untuk mengidentifikasi hasil penargetan gen yang berhasil. (B) Urutan amplikon bertarget keluaran tinggi pada platform iSeq. File keluaran urutan FastQ dianalisis menggunakan platform CRISPResso 2.0. (C)% dari HDR, NHEJ, tidak dimodifikasi, dan kejadian lainnya (penyisipan, transposisi, modifikasi lainnya) dibuang dan ditampilkan dalam grafik. Semua keturunan telah diedit dan berbentuk mosaik serta memiliki kombinasi HDR, NHEJ, dan kejadian lainnya. Anak sapi 752 dan 774 memiliki kejadian HDR rendah. Anak sapi 769, 786, dan 789 memiliki frekuensi HDR yang tinggi. Anak sapi 769 dan 789 memiliki frekuensi mutasi out-of-frame 1 bp dan 4 bp yang tinggi.
Gambar. 3. Genotipe beberapa jaringan dari anak sapi hidup dengan frekuensi HDR tinggi. (A) Biopsi dari beberapa jaringan selain telinga dan darah, termasuk usus, limpa, hati, paru-paru, jantung, pankreas, ginjal, dan ekor diambil dan DNA diisolasi untuk genotipe. Amplikon PCR dimurnikan, dicerna dengan AccI dan diselesaikan pada gel agarosa untuk mengidentifikasi hasil penargetan gen yang berhasil. (B) Urutan amplikon bertarget throughput tinggi pada platform iSeq. File keluaran urutan FastQ dianalisis menggunakan platform CRISPResso 2.0. % dari HDR, NHEJ, peristiwa yang tidak dimodifikasi dan peristiwa lainnya (penyisipan, transposisi, peristiwa lainnya) dibuang dan ditampilkan dalam grafik. Hasil dari semua jaringan mengidentifikasi peristiwa dalam rentang yang lebih kecil, menyoroti homogenitas pengeditan di seluruh jaringan.
Gambar. 4. Genotipe spermatozoa dari anak sapi hidup dengan frekuensi HDR tinggi.
(A) DNA genom dari spermatozoa diisolasi untuk genotipe. Amplikon PCR dimurnikan, dicerna dengan AccI, dan diselesaikan pada gel agarosa untuk mengidentifikasi hasil penargetan gen yang berhasil. DNA genom dari anak sapi yang di-eutanasia dengan pengeditan HDR tinggi (789 E) dan sel tipe liar digunakan sebagai kontrol. Kami tidak dapat mengambil air mani dari salah satu anak sapi jantan yang diejakulasi secara elektro (827) dan tidak dimasukkan ke dalam proses iSeq.
(B)% peristiwa HDR, NHEJ, tidak dimodifikasi, dan peristiwa lainnya (penyisipan, transposisi, peristiwa lainnya) dibuang dan ditampilkan dalam grafik.
Singkatnya, dari satu putaran transfer embrio kami telah menghasilkan tiga pendiri dengan frekuensi transmisi germline alel G127V yang tinggi (nomor anak sapi 769, 49,02%; anak sapi 786, 57,15%; dan anak sapi 789: 23,06%; sperma), dengan satu dari para pendiri juga membawa alel PRNP penghapusan 1-bp frekuensi tinggi (769, 44,18% terbaca).
DISKUSI
Tujuan utama dari naskah ini adalah untuk membangun jalur optimasi reagen penargetan gen untuk menghasilkan modifikasi HDR frekuensi tinggi pada embrio, sehingga temuan dapat dengan mudah diterjemahkan untuk menghasilkan hewan hidup yang diedit. Sebagaimana dibuktikan dalam naskah, dua kekuatan utama yang saling bersaing perlu diseimbangkan untuk menghasilkan sapi yang telah diedit genomnya untuk aplikasi komersial—yang pertama adalah efisiensi tinggi dalam pengeditan genom dan yang lainnya adalah hasil kebuntingan. Proses selanjutnya, yang bergantung pada kualitas embrio, juga dipengaruhi oleh pilihan reagen penyuntingan. Singkatnya, mengoptimalkan reagen penyuntingan genom adalah langkah pertama yang penting untuk meningkatkan hasil penyuntingan dan menghasilkan embrio berkualitas tinggi untuk keberhasilan kebuntingan.
Seperti yang telah kami amati dan catat juga oleh peneliti lain di lapangan, tidak semua sgRNA CRISPR dan reagen penargetan memiliki efisiensi penargetan yang sama. Misalnya, panduan F dengan lokasi pemotongan CRISPR terjauh (5 bp) dari lokasi target tidak menghasilkan penargetan gen yang terlihat dibandingkan dengan panduan R dengan lokasi pemotongan yang berjarak 2 bp dari lokasi target dan tertanam di dalamnya. urutan pengatur jarak; demikian pula, penargetan oligo cis- to cut-site (antisense oligo) menghasilkan efisiensi yang lebih tinggi dibandingkan sense oligo. Dalam penyempurnaan lebih lanjut dari proses penyaringan ini, kami mengadopsi platform Illumina miSeq dengan throughput tinggi untuk melakukan amplifikasi yang ditargetkan pada cakupan 10 × di seluruh lokasi pemotongan.
Layar keluaran tinggi ini menyajikan pembacaan kuantitatif dibandingkan kualitatif dan memberikan penilaian yang tidak memihak terhadap berbagai hasil pengeditan genom. Sepengetahuan kami, ini adalah manuskrip pertama yang secara sistematis menyelidiki penggunaan sistem CRISPR-Cas untuk penargetan gen yang dimediasi HDR secara langsung pada embrio untuk menghasilkan anak sapi yang ditargetkan dengan gen hidup.
Setelah optimalisasi reagen ex vivo yang menghasilkan efisiensi penargetan yang optimal, kami melanjutkan dengan suntikan embrio dan melakukan transfer embrio non-bedah. Keenam keturunan yang dihasilkan telah diedit gen yang mengonfirmasi efisiensi pengeditan yang tinggi setelah injeksi CRISPR RNP, konsisten dengan eksperimen pengoptimalan kami. Demikian pula, seperti yang dilaporkan oleh beberapa kelompok, mosaikisme pada embrio yang disuntikkan merupakan hasil yang konsisten.[40] Mosaikisme khususnya menjadi perhatian utama dalam penyuntingan genom pada sapi dengan kebuntingan dan interval generasi yang panjang. Publikasi terbaru telah berupaya untuk mengatasi hambatan ini, termasuk memodifikasi reagen CRISPR dan waktu penyuntikan.[41,42] Hal ini masih harus diuji pada hewan ternak dan akan menjadi fokus penyelidikan kami di masa depan.
Pengamatan menarik lainnya adalah inkonsistensi representasi alel yang diedit antara soma (jaringan) dan germline (sperma). Meskipun, kami tidak mengidentifikasi variasi yang lebih besar di antara frekuensi alel yang diedit di antara berbagai jaringan somatik yang dianalisis (Gambar 3), hal yang sama tidak terjadi pada germline (Gambar 4). Hal ini mungkin terjadi karena sel germinal primordial—prekursor sperma dan sel telur—muncul dari sekelompok kecil sel pada tahap primitif yang sedang mengalami gastrulasi embrio dan kemungkinan besar merupakan hasil editan dalam kelompok sel yang lebih kecil. Terlepas dari itu, dari serangkaian transfer embrio kami telah menghasilkan lima hewan yang telah diedit; dua pendirinya memiliki frekuensi HDR tinggi (anak sapi 769 dan 786) dan akan digunakan untuk kawin dan propagasi pengeditan HDR.
Demikian pula, dua anak sapi yang memiliki efisiensi NHEJ tinggi dengan penghapusan satu nukleotida (769) atau empat nukleotida (789) yang menghasilkan penghapusan di luar bingkai, juga akan digunakan untuk menghasilkan anak sapi nol PRNP. Hal ini akan menjadi bagian dari upaya masa depan dan berada di luar cakupan publikasi saat ini. Sebagai kesimpulan, kami telah membangun jalur untuk optimasi reagen, penyaringan keluaran tinggi, dan transfer embrio untuk menghasilkan ternak hidup yang ditargetkan secara gen melalui suntikan zigotik.
REFERENSI
1. Hammer RE, Pursel VG, Rexroad CE Jr, et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 1985;315:680–683.
2. Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature. 1996;380:64–66.
3. Wall RJ, Powell AM, Paape MJ, et al. Genetically enhanced cows resist intramammary Staphylococcus aureus infection. Nat Biotechnol. 2005;23:445–451.
4. Lillico SG, Proudfoot C, Carlson DF, et al. Live pigs produced from genome edited zygotes. Sci Rep. 2013;3:2847.
5. Carlson DF, Tan W, Lillico SG, et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:17382–17387.
6. Proudfoot C, Carlson DF, Huddart R, et al. Genome edited sheep and cattle. Transgenic Res. 2015;24:147–153. DOI: 10.1007/s11248-014- 9832-x. 7. Tan W, Carlson DF, Lancto CA, et al. Efficient nonmeiotic allele introgression in livestock using custom endonucleases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(41):16526-31.
8. Park KE, Kaucher AV, Powell A, et al. Generation of germline ablated male pigs by CRISPR/Cas9 editing of the NANOS2 gene. Sci Rep. 2017;7:40176.
9. Crispo M, Mulet AP, Tesson L, et al. Efficient generation of myostatin knock-out sheep using CRISPR/Cas9 technology and microinjection into zygotes. PLoS One. 2015;10:e0136690.
10. Wang Y, Du Y, Shen B, et al. Efficient generation of gene-modified pigs via injection of zygote with Cas9/sgRNA. Sci Rep. 2015;5:8256.
11. Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013;339:823–826.
12. Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/ Cas systems. Science. 2013;339:819–823.
13. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337:816–821.
14. Mao Z, Bozzella M, Seluanov A, et al. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 2008;7:1765–1771.
15. Ghahfarokhi MK, Dormiani K, Mohammadi A, et al. Blastocyst formation rate and transgene expression are associated with gene insertion into safe and non-safe harbors in the cattle genome. Sci Rep. 2017;7:15432.
16. Heo YT, Quan X, Xu YN, et al. CRISPR/Cas9 nuclease-mediated gene knock-in in bovine-induced pluripotent cells. Stem Cells Dev. 2015;24:393–402.
17. Bevacqua RJ, Fernandez-Martin R, Savy V, et al. Efficient edition of the bovine PRNP prion gene in somatic cells and IVF embryos using the TARGETED GENETIC MODIFICATION IN CATTLE ZYGOTES 533 CRISPR/Cas9 system. Theriogenology. 2016;86:1886–1896 e1881.
18. Choi W, Kim E, Yum SY, et al. Efficient PRNP deletion in bovine genome using gene-editing technologies in bovine cells. Prion. 2015;9:278–291.
19. Namula Z, Wittayarat M, Hirata M, et al. Genome mutation after the introduction of the gene editing by electroporation of Cas9 protein (GEEP) system into bovine putative zygotes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2019;55:598–603.
20. Shanthalingam S, Tibary A, Beever JE, et al. Precise gene editing paves the way for derivation of Mannheimia haemolytica leukotoxin-resistant cattle. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:13186–13190.
21. Daigneault BW, Vilarino M, Rajput SK, et al. CRISPR editing validation, immunostaining and DNA sequencing of individual fixed bovine embryos. BioTechniques. 2018;65:281–283.
22. Wei J, Wagner S, Maclean P, et al. Cattle with a precise, zygote-mediated deletion safely eliminate the major milk allergen beta-lactoglobulin. Sci Rep. 2018;8:7661.
23. Wei J, Wagner S, Lu D, et al. Efficient introgression of allelic variants by embryo-mediated editing of the bovine genome. Sci Rep. 2015;5:11735.
24. Collinge J. Prion diseases of humans and animals: their causes and molecular basis. Annu Rev Neurosci. 2001;24:519–550.
25. Biacabe AG, Laplanche JL, Ryder S, et al. Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases. EMBO Rep. 2004;5:110–115.
26. Yamakawa Y, Hagiwara K, Nohtomi K, et al. Atypical proteinase K-resistant prion protein (PrPres) observed in an apparently healthy 23-month-old Holstein steer. Jpn J Infect Dis. 2003;56:221–222.
27. Casalone C, Zanusso G, Acutis P, et al. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: Molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:3065–3070.
28. Richt JA, Kasinathan P, Hamir AN, et al. Production of cattle lacking prion protein. Nat Biotechnol. 2007;25:132–138.
29. Shibuya S, Higuchi J, Shin RW, et al. Protective prion protein polymorphisms against sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Lancet. 1998;351:419.
30. Wadsworth JD, Asante EA, Desbruslais M, et al. Human prion protein with valine 129 prevents expression of variant CJD phenotype. Science. 2004;306:1793–1796.
31. Asante EA, Smidak M, Grimshaw A, et al. A naturally occurring variant of the human prion protein completely prevents prion disease. Nature. 2015;522:478–481.
32. Bueler H, Aguzzi A, Sailer A, et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 1993;73:1339–1347.
33. Bueler H, Fischer M, Lang Y, et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 1992;356:577–582.
34. Manson JC, Clarke AR, Hooper ML, et al. 129/Ola mice carrying a null mutation in PrP that abolishes mRNA production are developmentally normal. Mol Neurobiol. 1994;8:121–127.
35. Nico PB, de-Paris F, Vinade ER, et al. Altered behavioural response to acute stress in mice lacking cellular prion protein. Behav Brain Res. 2005;162:173–181.
36. Sakaguchi S, Katamine S, Nishida N, et al. Loss of cerebellar Purkinje cells in aged mice homozygous for a disrupted PrP gene. Nature. 1996;380:528–531.
37. Takahashi Y, Kanagawa H. Effects of glutamine, glycine and taurine on the development of in vitro fertilized bovine zygotes in a chemically defined medium. J Vet Med Sci. 1998;60:433–437.
38. Miller GF, Gliedt DW, Rakes JM, et al. Addition of penicillamine, hypotaurine and epinephrine (PHE) or bovine oviductal epithelial cells (BOEC) alone or in combination to bovine in vitro fertilization medium increases the subsequent embryo cleavage rate. Theriogenology. 1994;41:689–696.
39. Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37:224– 226.
40. Mehravar M, Shirazi A, Nazari M, et al. Mosaicism in CRISPR/Cas9- mediated genome editing. Dev Biol. 2019;445:156–162.
41. Gu B, Posfai E, Gertsenstein M, et al. Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR. Curr Protoc Mouse Biol. 2020;10:e67.
42. Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576:149–157.
SUMBER:
Ki-Eun Park, Juli Foster Frey, Jerel Waters, Sean G Simpson, Chris Coutu, Sarah Plummer, Matthew Campbell, David M Donovan, Bhanu P Telugu. 2020. One-Step Homology Mediated CRISPR-Cas Editing in Zygotes for Generating Genome Edited Cattle. The CRISPR Journal Vol. 3, No. 6: 523-534
