Rahasia di Balik Protein Murni: Teknik Pemurnian Modern Mengubah Dunia Sains!

 

Pengantar Pemurnian Protein: Metode, Teknologi, dan Aplikasi

 

Teknik pemurnian protein yang maju meningkatkan aktivitas dan hasil protein, sehingga membuka peluang terobosan dalam penelitian.

 

Saat ini, kemampuan untuk memperoleh protein murni sangat penting untuk mengembangkan obat yang ditargetkan, membuat vaksin, dan memahami proses biologis pada tingkat molekuler. Pengembangan dan optimalisasi metodologi pemurnian protein menjadi semakin penting untuk memenuhi permintaan tinggi terhadap protein tersebut, sekaligus memastikan bahwa protein bebas dari kontaminan yang dapat memengaruhi fungsinya.

Teknik pemurnian tingkat lanjut meningkatkan hasil dan aktivitas protein, sehingga mendukung terobosan dalam penelitian medis dan aplikasi industri. Perbaikan berkelanjutan dalam metodologi ini memungkinkan produksi protein berkualitas tinggi yang lebih efisien, hemat biaya, dan mudah ditingkatkan skalanya, sehingga mendorong inovasi dan penemuan di berbagai bidang ilmu pengetahuan.

 

Daftar Isi

Apa itu pemurnian protein?

Seperti apa protokol pemurnian protein yang umum?

• Sumber protein
• Ekstraksi
• Solubilisasi dan stabilisasi
• Pemurnian
• Karakterisasi dan analisis

Metode ekstraksi protein

• Metode mekanis
• Metode non-mekanis

Teknik pemurnian protein

• Sentrifugasi
• Presipitasi
• Kromatografi
• Ultrafiltrasi dan dialisis
• Elektroforesis

Ekspresi protein rekombinan

Pemurnian protein rekombinan

1. Penandaan protein (protein tagging) dan pemurnian afinitas

2. Solubilisasi/pelipatan ulang (refolding)

Analisis protein

• Penentuan konsentrasi protein
• Analisis kemurnian
• Uji aktivitas
• Analisis struktur
• Pengujian stabilitas
• Analisis kuantitatif

Daftar pustaka

Penjelasan Daftar Isi

Apa itu pemurnian protein?

Pemurnian protein adalah proses dalam biologi molekuler dan biokimia yang bertujuan mengisolasi suatu protein tertentu dari campuran kompleks, yang biasanya berasal dari sel, jaringan, atau bahan biologis lainnya.¹˒² Proses ini sangat penting dalam berbagai bidang, termasuk:

• Riset biologi: untuk menghasilkan reagen seperti enzim dan antibodi yang digunakan sebagai alat biologi molekuler dalam memahami proses seluler.³
• Diagnostik: protein yang telah dimurnikan digunakan untuk mengembangkan uji dan tes penyakit.⁴
• Pemantauan lingkungan: biosensor berbasis protein digunakan untuk mendeteksi kontaminan.⁵
• Pangan dan kosmetik: kandungan protein dalam produk makanan dan kosmetik harus memenuhi standar keamanan tertentu karena risiko reaksi alergi.⁶
• Ilmu forensik: menggunakan protein untuk mengidentifikasi substansi dalam investigasi kriminal.⁷
• Pengembangan biofarmasi: protein yang dimurnikan sangat penting dalam pengembangan dan produksi obat, termasuk protein terapeutik dan vaksin.⁸

 

Apa itu protokol pemurnian protein yang khas?

Alur kerja pemurnian protein secara umum melibatkan beberapa langkah penting untuk mengisolasi dan memurnikan protein target dengan meminimalkan kontaminan serta memaksimalkan hasil dan aktivitasnya (Gambar 1). Pendekatan terstruktur ini memastikan isolasi yang efisien dan analisis protein yang mendetail.

 

Sumber protein

Protein dapat diisolasi dari jaringan atau sel alami tempat protein tersebut diekspresikan secara alami. Pendekatan ini digunakan untuk protein yang sulit diekspresikan secara rekombinan atau untuk mempelajari protein dalam konteks alaminya.

Sebaliknya, banyak protein diproduksi menggunakan organisme yang direkayasa secara genetik (lihat bagian “Ekspresi protein rekombinan”), sehingga memungkinkan hasil yang tinggi dan manipulasi ekspresi yang lebih mudah.¹˒⁸

 

Ekstraksi

Tujuan tahap ini adalah memecahkan sel untuk melepaskan isinya, termasuk protein target. Ekstraksi dapat dilakukan melalui berbagai pendekatan seperti:

• Disrupsi mekanis (umum digunakan untuk sel bakteri dan ragi)
• Disrupsi kimia (dengan deterjen, pelarut organik, atau agen kaotropik)
• Disrupsi enzimatis (untuk membantu memecah dinding sel, terutama pada sel bakteri)

Metode lain termasuk siklus pembekuan–pencairan dan pressure cycling yang juga efektif melisiskan sel.

Penjelasan lebih lanjut dapat dilihat pada bagian “Metode ekstraksi protein”.¹˒⁸

 

Solubilisasi dan stabilisasi

Tahap ini memastikan bahwa protein tetap larut dan stabil dalam larutan. Hal ini dicapai dengan menggunakan buffer yang sesuai, inhibitor protease untuk mencegah degradasi, serta agen lain untuk menjaga kelarutan protein.

Untuk protein membran, diperlukan deterjen untuk mencegah agregasi dan/atau presipitasi.¹˒⁸

 

Pemurnian

Pemurnian bertujuan mengisolasi protein target dari komponen seluler lainnya. Beberapa teknik utama yang digunakan antara lain:

i) Sentrifugasi: memisahkan debris seluler.
ii) Metode presipitasi: mengonsentrasikan protein dengan mengubah kelarutannya.
iii) Teknik kromatografi (afinitas, ion exchange, size exclusion, dan interaksi hidrofobik): memisahkan protein berdasarkan berbagai sifat (ukuran molekul, muatan, dll.).
iv) Ultrafiltrasi dan dialisis: mengonsentrasikan dan mendesalinasi sampel, yang penting untuk aplikasi lanjutan.

Penjelasan lebih rinci tersedia pada bagian “Teknik pemurnian protein”.¹˒⁸

 

Karakterisasi dan analisis

Tahap ini penting untuk memastikan identitas, kemurnian, dan fungsi protein yang telah dimurnikan. Beberapa metode umum yang digunakan antara lain:

i) Elektroforesis (SDS-PAGE), untuk menilai kemurnian dan berat molekul.
ii) Metode spektroskopi (UV-Vis, fluoresensi), untuk menentukan konsentrasi dan sifat struktur.
iii) Uji aktivitas, untuk memverifikasi integritas fungsional protein.
iv) Teknik lanjutan seperti spektroskopi resonansi magnet inti (NMR), kristalografi sinar-X, dan spektrometri massa, yang memberikan wawasan struktural dan fungsional secara mendetail.¹˒⁸

Gambar 1: Alur kerja prosedur pemurnian protein yang khas.

 

Metode Ekstraksi Protein

Ekstraksi protein merupakan langkah penting dalam proses pemurnian, yang melibatkan penghancuran atau pengacakan sel untuk melepaskan protein. Berbagai metode digunakan bergantung pada jenis sel dan kestabilan protein target (Gambar 2). Setiap metode memiliki keunggulan dan keterbatasannya masing-masing, yang akan dibahas di bawah ini.

 

Mencapai Pembersihan Agregat yang Unggul dalam Purifikasi mAb

Catatan aplikasi ini menunjukkan tiga strategi kromatografi berbeda, masing-masing dioptimalkan untuk membantu mengurangi spesies dengan berat molekul tinggi hingga ≤2% sambil mempertahankan pemulihan monomer yang tinggi.

 

Metode Mekanis

Homogenisasi:

Teknik ini menggunakan gaya geser mekanis untuk memecah sel. Metode ini sangat efektif untuk jaringan tumbuhan dan hewan yang keras serta dapat diskalakan. Namun, proses ini dapat menghasilkan panas yang dapat menyebabkan denaturasi protein yang sensitif.⁹

 

Sonikasi:

Menggunakan gelombang ultrasonik untuk mengganggu membran sel. Metode ini merupakan pendekatan cepat yang umum digunakan untuk sel bakteri dan sangat efektif untuk volume kecil. Proses ini memerlukan pendinginan untuk mencegah denaturasi protein akibat panas yang dihasilkan.¹

 

Siklus tekanan:

Melibatkan penggunaan tekanan tinggi untuk menginduksi lisis sel dan cocok untuk sel yang keras seperti ragi, serta lebih lembut terhadap protein. Kekurangan metode ini adalah perlunya peralatan khusus (barocycler) yang tidak banyak tersedia.¹⁰

 

Metode Nonmekanis

 

Detergen:

Melarutkan membran sel dengan mengganggu bilayer lipid. Beberapa detergen yang umum digunakan termasuk Triton X-100 dan SDS. Proses ini mudah digunakan dan sangat efektif untuk protein membran, namun dapat menyebabkan denaturasi jika digunakan pada konsentrasi tinggi. Detergen juga mungkin perlu dihilangkan sebelum proses purifikasi berikutnya.¹,⁸

 

Pelarut organik:

Pelarut seperti etanol atau aseton digunakan untuk mengendapkan protein dan mengganggu membran. Metode ini cepat, tetapi tidak cocok untuk semua jenis protein karena dapat menyebabkan denaturasi.¹,⁸

 

Agen kaotropik:

Mengganggu jaringan ikatan hidrogen pada protein sehingga membantu proses solubilisasi. Contohnya adalah urea dan guanidin hidroklorida. Pendekatan ini sangat berguna untuk protein yang tidak larut, namun dapat menyebabkan denaturasi dan sering memerlukan tahap pemulihan lipatan (refolding) setelahnya.¹,⁸,¹¹

 

Pembekuan-Pencairan:

Prosedur ini melibatkan siklus pembekuan dan pencairan berulang untuk melisiskan sel melalui pembentukan kristal es. Metode ini sederhana karena tidak memerlukan peralatan khusus. Namun, metode ini memakan waktu dan kurang efisien untuk beberapa jenis sel.¹,⁸

 

Perlakuan enzimatik:

Terkadang enzim seperti lisozim digunakan untuk memecah dinding sel bakteri, biasanya dikombinasikan dengan metode lain untuk meningkatkan efisiensi. Pendekatan ini sangat spesifik dan mempertahankan integritas protein. Sayangnya, penggunaannya terbatas pada sel bakteri dan memerlukan langkah tambahan untuk mencapai lisis sel yang lengkap.¹,⁸

 

Lima Tantangan Praanalitik Umum dalam Proteomik Plasma

Artikel ini menyoroti faktor-faktor praanalitik utama, termasuk teknik pengambilan darah, pilihan antikoagulan, kondisi sentrifugasi, waktu pemrosesan dan praktik penyimpanan yang memengaruhi kualitas data serta penemuan biomarker.

Gambar 2: Metode ekstraksi protein yang umum digunakan.

 

Teknik pemurnian protein

Pemurnian protein melibatkan berbagai teknik yang dirancang untuk mengisolasi protein berdasarkan sifat tertentu, seperti ukuran, muatan atau afinitas. Berikut penjelasan rinci mengenai setiap metode:

Sentrifugasi

Sentrifugasi memisahkan komponen berdasarkan densitasnya dengan memutar sampel pada kecepatan tinggi. Selama proses ini, partikel yang lebih berat, seperti debris sel, akan mengendap di bagian bawah, sehingga supernatan yang lebih ringan dan mengandung protein dapat dikumpulkan. Teknik ini sering menjadi langkah awal pemurnian untuk menghilangkan kontaminan berukuran besar dan mengonsentrasikan protein dari ekstrak kasar.¹⁻¹²

Presipitasi

Presipitasi melibatkan perubahan kelarutan protein sehingga protein menggumpal dan mengendap keluar dari larutan. Hal ini dapat dicapai dengan menggunakan garam (salting out), seperti amonium sulfat, pelarut organik atau perubahan pH. Meskipun proses ini dapat menyebabkan ko-presipitasi kontaminan, metode ini berguna untuk tahap awal pengonsentrasian dan fraksinasi protein, terutama ketika bekerja dengan volume besar.¹⁻¹³

Kromatografi

Kromatografi mencakup berbagai teknik pemurnian yang serbaguna dan banyak digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan berbagai sifatnya (Gambar 3).

Kromatografi afinitas memanfaatkan interaksi spesifik antara protein dan ligan yang terikat pada resin. Protein target akan berikatan dengan ligan, sementara komponen lain dapat dicuci. Protein kemudian dielusi dengan kondisi tertentu. Teknik ini sangat cocok untuk protein yang memiliki pasangan ikatan spesifik atau protein ber-tag (misalnya protein ber-His-tag).¹⁻¹⁴

Meningkatkan Efisiensi Analisis LC-MS/MS untuk Deteksi Kontaminan yang Cepat

Disini membahas bagaimana berbagai sistem LC-MS/MS dievaluasi dan bagaimana kemajuan teknologi terbaru meningkatkan kualitas dan presisi data pada level jejak.

Kromatografi pertukaran ion (ion exchange chromatography) memisahkan protein berdasarkan muatannya. Protein berikatan dengan resin bermuatan (kationik atau anionik) dan dielusi dengan meningkatkan kekuatan ionik atau mengubah pH buffer. Teknik ini berguna untuk protein dengan muatan yang terdefinisi jelas dan sering digunakan sebagai langkah pemurnian intermediat.¹⁻¹⁵

Kromatografi eksklusi ukuran (size exclusion chromatography/SEC) memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan melewatkannya melalui kolom berisi manik berpori. Protein berukuran kecil memasuki pori-pori dan dielusi lebih lambat, sementara protein besar melewati pori-pori dan dielusi lebih cepat. Teknik ini biasanya digunakan untuk memisahkan monomer dari agregat dan sebagai langkah akhir pemolesan dalam proses pemurnian protein.¹⁻¹⁶

Kromatografi interaksi hidrofobik (hydrophobic interaction chromatography/HIC) memisahkan protein berdasarkan sifat hidrofobiknya. Protein berikatan dengan gugus hidrofobik pada resin pada konsentrasi garam tinggi dan dielusi saat konsentrasi garam diturunkan. Pendekatan ini cocok untuk protein dengan domain hidrofobik tinggi dan membantu menghilangkan agregat yang tidak diinginkan.¹⁷

Gambar 3: Skema kolom yang digunakan dalam beberapa teknik kromatografi umum untuk pemurnian protein.

Ultrafiltrasi dan dialisis

Ultrafiltrasi adalah metodologi yang menggunakan membran semipermeabel untuk memekatkan dan mendesalting larutan protein dengan menerapkan tekanan.¹,¹⁸

Sebaliknya, dialisis adalah proses yang melibatkan penempatan larutan protein ke dalam membran dengan permeabilitas selektif, sehingga molekul kecil dapat berdifusi keluar menuju larutan di sekitarnya. Metodologi ini digunakan untuk menghilangkan kontaminan kecil, menukar buffer dan memekatkan protein.¹,¹⁹

Elektroforesis

Elektroforesis memisahkan protein melalui matriks gel berdasarkan ukuran dan muatan dengan menerapkan medan listrik. Salah satu varian yang paling umum adalah SDS-PAGE, yang menggunakan deterjen (SDS) untuk mendenaturasi protein dan memisahkannya berdasarkan ukuran melalui matriks gel poliakrilamida.²⁰

Elektroforesis berfungsi sebagai teknik pemisahan protein sekaligus metode analitik untuk menilai kemurnian dan menentukan berat molekul protein.¹

Dengan memahami kelebihan dan keterbatasan setiap teknik (lihat Tabel 1), para peneliti dapat memilih metode yang paling sesuai untuk kebutuhan pemurnian protein tertentu, sehingga memastikan kemurnian dan fungsi protein target tetap optimal.

 

Tabel 1: Ringkasan teknik pemurnian protein beserta kelebihan, keterbatasan dan jenis sampel yang paling sesuai.

Teknik	Kelebihan	Keterbatasan	Sampel yang Sesuai
Sentifugasi	Sederhana, hemat biaya, dapat diskalakan	Tidak sangat selektif, mungkin tidak menghilangkan kontaminan berukuran kecil	Pemisahan awal, ekstrak kasar
Presipitasi	Hemat biaya, cepat, sederhana	Dapat mempresipitasi kontaminan, memerlukan optimasi	Konsentrasi awal, fraksionasi
Kromatografi afinitas	Spesifisitas dan kemurnian tinggi	Pengikatan ligan memerlukan optimasi, resin mahal	Protein bertag, protein dengan pasangan ikatan spesifik
Kromatografi pertukaran ion	Resolusi tinggi, dapat diskalakan	Memerlukan kontrol pH/kuat ion yang cermat	Protein dengan sifat muatan yang terdefinisi
Kromatografi eksklusi ukuran	Lembut, berguna untuk desalting dan pertukaran penyangga (buffer)	Resolusi lebih rendah, kapasitas terbatas	Pemurnian akhir, pemisahan monomer/agregat
Kromatografi interaksi hidrofobik	Efektif untuk protein hidrofobik	Memerlukan optimasi kadar garam, dapat mendenaturasi protein	Protein hidrofobik, penghilangan agregat
Ultrafiltrasi dan dialisis	Sederhana, tidak mendenaturasi, hemat biaya	Terbatas oleh ukuran pori membran	Konsentrasi, pertukaran buffer
Elektroforesis	Resolusi tinggi, analitik	Umumnya tidak preparatif, dapat mendenaturasi protein	Penilaian kemurnian, penentuan berat molekul

 

Ekspresi Protein Rekombinan

Protein rekombinan direkayasa secara genetik untuk diproduksi oleh sel inang yang telah ditransformasi dengan DNA rekombinan. DNA ini mengodekan protein yang diinginkan, sehingga sel inang dapat memproduksi protein tersebut dalam jumlah besar. Proses ekspresi protein rekombinan melibatkan beberapa tahapan (Gambar 4):¹²

1. Kloning gen: Gen yang mengodekan protein target diisolasi dan disisipkan ke dalam plasmid atau vektor lain. Konstruksi DNA rekombinan ini biasanya mencakup elemen regulasi seperti promoter dan terminator untuk memastikan ekspresi yang optimal.
2. Transformasi/transfeksi: DNA rekombinan dimasukkan ke dalam sel inang. Pada sel bakteri dan ragi, proses ini disebut transformasi, sedangkan pada sel mamalia dan serangga disebut transfeksi.
3. Seleksi: Sel inang yang berhasil memasukkan DNA rekombinan dipilih menggunakan penanda resistensi antibiotik atau sistem seleksi lain yang dikodekan dalam vektor.
4. Ekspresi: Sel inang terpilih kemudian dikultur dalam kondisi yang menginduksi ekspresi protein rekombinan. Tahap ini dapat mencakup optimasi kondisi pertumbuhan seperti suhu, pH, dan suplai nutrisi.
5. Pemanenan: Sel inang dilisis untuk melepaskan protein rekombinan, yang selanjutnya dimurnikan menggunakan teknik-teknik pemurnian yang telah dijelaskan sebelumnya.

 

Gambar 4: Alur kerja protokol umum ekspresi protein rekombinan.

 

Jelajahi Evolusi Analisis Pestisida

Infografik ini memandu Anda melalui perjalanan analitis dari keterbatasan deteksi awal hingga teknologi skrining mutakhir, memberikan wawasan yang diperlukan untuk memenuhi tuntutan modern terkait keamanan pangan dan kepatuhan regulasi.

Berbagai sistem ekspresi menawarkan keunggulan dan keterbatan yang berbeda, sehingga masing-masing cocok untuk aplikasi tertentu. Tabel 2 merangkum kekuatan dan keterbatasan setiap sistem, beserta aplikasi umum dan contohnya.

 

Tabel 2: Sistem ekspresi untuk protein rekombinan, termasuk keunggulan, keterbatasan, aplikasi umum dan contohnya.

Sistem	Kelebihan	Keterbatasan	Aplikasi	Contoh
Sel mamalia	Pelipatan protein yang benar dan modifikasi pascatranslasi (PTM) yang lengkap, aktivitas biologis tinggi	Biaya tinggi, pertumbuhan lambat, kebutuhan kultur kompleks	Protein terapeutik, glikoprotein kompleks	Antibodi monoklonal, eritropoietin
Sel serangga	Hasil tinggi, PTM kompleks, kondisi kultur lebih mudah dibanding sel mamalia	Biaya menengah, PTM dapat berbeda dari mamalia	Produksi vaksin, protein penelitian	Sistem ekspresi baculovirus
Sel ragi (yeast)	Pertumbuhan cepat, biaya rendah, kondisi kultur sederhana	PTM terbatas dibanding sistem mamalia, hiper-glikosilasi	Enzim industri, penelitian dasar, vaksin	Produksi vaksin Hepatitis B
Sel bakteri	Pertumbuhan cepat, hasil tinggi, kultur sederhana dan murah	Salah lipat, pembentukan inclusion bodies, tidak memiliki PTM, risiko kontaminasi endotoksin	Protein sederhana, enzim industri	Insulin, enzim rekombinan
Sel alga	Berkelanjutan, dapat diskalakan, biaya efektif	Teknologi kurang berkembang, hasil protein bervariasi	Biofuel, biofarmasi, suplemen nutrisi	Sistem kloroplas alga untuk antigen vaksin
Bebas sel (cell-free)	Cepat, dapat diskalakan, tanpa kultur sel, kontrol langsung terhadap kondisi reaksi	Biaya tinggi, hasil protein terbatas	Penelitian, biologi sintetis, penyaringan high-throughput	Prototipe cepat protein

 

Pemurnian Protein Rekombinan

Pemurnian protein rekombinan sering kali memerlukan teknik khusus untuk mengisolasi protein target secara efisien sambil mempertahankan fungsinya. Metode-metode utama meliputi penandaan protein (protein tagging), pemurnian afinitas, serta solubilisasi/pelipatan ulang (refolding) (Gambar 5). ^33,34

 

1. Penandaan Protein dan Pemurnian Afinitas

Penandaan protein (protein tagging) dilakukan dengan menambahkan urutan asam amino tertentu pada protein target untuk mempermudah proses pemurnian. Tag yang paling umum digunakan adalah tag His dan GST, tetapi terdapat pula jenis tag lain seperti MBP, FLAG, dan Strep (lihat Tabel 3).^22,35

 

Pemurnian Protein Bertag His (His-tag)

His-tag terdiri atas urutan enam hingga sepuluh residu histidin yang berikatan kuat dengan ion logam seperti nikel atau kobalt. Ikatan ini dimanfaatkan dalam kromatografi afinitas logam terimobilisasi (IMAC).

Protein yang diberi His-tag akan berikatan dengan resin yang bermuatan ion nikel atau kobalt. Kontaminan akan dicuci, dan protein dielusi menggunakan imidazol atau dengan menurunkan pH.³⁶

 

Pemurnian Protein Bertag GST (GST-tag)

GST-tag adalah enzim glutation S-transferase yang berikatan dengan glutation yang terimobilisasi pada resin. Protein bertag GST akan berikatan dengan resin glutation, kemudian setelah kontaminan dicuci, protein dielusi menggunakan glutation tereduksi.³⁷

 

Tabel 3: Beberapa Jenis Tag Protein yang Umum Digunakan.³⁸

Tag	Deskripsi	Mitra Pengikat	Ukuran	Aplikasi
His	Urutan polihistidin	Ion nikel/kobalt	Kecil	Purifikasi umum, interaksi protein
GST	Glutathione S-transferase	Glutation	Besar	Peningkatan kelarutan, uji aktivitas
MBP	Protein pengikat maltosa	Amilosa	Besar	Peningkatan kelarutan, pelipatan protein
FLAG	Peptida pendek (DYKDDDDK)	Antibodi anti-FLAG	Kecil	Western blotting, imunopresipitasi
Strep	Peptida pengikat streptavidin	Streptavidin	Kecil	Kondisi elusi yang lembut

 

2. Solubilisasi/Refolding

Terkadang, protein rekombinan membentuk agregat tidak larut yang disebut inclusion bodies, terutama pada sistem ekspresi bakteri. Teknik refolding dan solubilisasi digunakan untuk memperoleh kembali protein yang fungsional. Prosedur ini meliputi solubilisasi inclusion bodies menggunakan agen kao-tropik seperti urea atau guanidin hidroklorida yang mendnaturasi protein. Setelah itu, protein perlahan-lahan difolding ulang dengan secara bertahap menghilangkan agen kao-tropik, sering kali dengan penambahan zat aditif yang membantu proses pelipatan protein secara benar.⁽³⁹˒⁴⁰⁾

Setiap pendekatan pemurnian untuk protein rekombinan memiliki kelebihan dan keterbatasan (lihat Tabel 4), dan peneliti harus memilih metode yang paling sesuai untuk memastikan kemurnian dan fungsi tertinggi sesuai kebutuhan aplikasi.

Gambar 5: Skema umum dari metode utama untuk pemurnian protein rekombinan.

 

Tabel 4: Perbandingan teknik pemurnian untuk protein rekombinan.

Teknik	Kelebihan	Keterbatasan	Protein yang Sesuai
Purifikasi His-tag	Sederhana, kuat (robust), hemat biaya	Potensi pelepasan logam, mungkin tidak mengikat semua protein	Beragam jenis protein, terutama yang diekspresikan di E. coli
Purifikasi GST-tag	Afinitas tinggi, meningkatkan kelarutan	Tag berukuran besar dapat memengaruhi fungsi, memerlukan pelepasan tag	Protein yang memerlukan peningkatan kelarutan, protein eukariotik
Refolding/solubilisasi	Menghasilkan kembali protein fungsional dari inclusion bodies	Memakan waktu, membutuhkan optimasi	Protein tidak larut, protein yang diekspresikan pada bakteri

 

Analisis protein

Setelah protein dimurnikan, analisis terhadap konsentrasi, kemurnian, aktivitas, struktur, stabilitas dan interaksinya menjadi sangat penting. Berikut ini adalah teknik-teknik paling umum untuk analisis protein.

 

Penentuan konsentrasi protein

 

Uji Bradford (Bradford assay):

Uji kolorimetri ini menggunakan pewarna Coomassie Brilliant Blue yang berikatan dengan protein sehingga menyebabkan pergeseran absorbansi. Metode ini cepat dan sederhana, tetapi hasilnya dapat dipengaruhi oleh keberadaan deterjen.⁴¹

Uji asam bicinchoninat (Bicinchoninic acid/BCA assay):

Merupakan uji kolorimetri lain yang mengukur reduksi ion Cu²⁺ menjadi Cu⁺ oleh protein dalam lingkungan basa. Metode ini kompatibel dengan deterjen, tetapi kurang sensitif terhadap variasi komposisi protein.⁴¹

Uji fluoresensi:

Uji ini menggunakan pewarna berfluoresensi yang berikatan dengan protein, memberikan sensitivitas dan akurasi tinggi.⁴¹

Spektrofotometri UV-Vis:

Teknik ini mengukur absorbansi pada 280 nm karena keberadaan asam amino aromatik. Metode ini tidak merusak sampel, tetapi kurang akurat untuk campuran kompleks tanpa kurva standar.⁴²,⁴³

 

Analisis kemurnian

SDS-PAGE:

Teknik ini memisahkan protein berdasarkan ukuran. Metode ini sangat efektif untuk menilai kemurnian dan menentukan berat molekul.²⁰

Western blotting:

Setelah SDS-PAGE, protein dipindahkan ke membran dan dideteksi menggunakan antibodi spesifik. Teknik ini sangat baik untuk mengonfirmasi keberadaan dan kemurnian protein target.⁴⁴,⁴⁵

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA):

ELISA menggunakan antibodi untuk mendeteksi protein tertentu.⁴⁶ Teknik ini sensitif dan kuantitatif, serta sangat berguna untuk mendeteksi protein sel inang dalam produk biofarmasi.⁴⁷

 

Uji Aktivitas (Activity assays)

ELISA: Mengukur aktivitas protein dengan mendeteksi interaksi fungsional antara protein dengan antibodi atau ligannya.⁴⁸

Uji radioligan (Radioligand assays): Menggunakan ligan berlabel radioaktif untuk mempelajari interaksi pengikatan, memberikan sensitivitas yang sangat tinggi.⁴⁹

Surface plasmon resonance (SPR): Mengukur interaksi pengikatan secara real-time antara protein dan ligan tanpa memerlukan pelabelan, serta menyediakan data kinetik.⁵⁰

 

Analisis Struktur (Structural analysis)

Spektroskopi NMR: Memberikan informasi detail tentang struktur, dinamika, dan interaksi protein. Teknik ini sangat baik untuk protein berukuran kecil hingga menengah, tetapi membutuhkan jumlah protein yang besar serta pelabelan isotop.^51,52

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM): Menentukan struktur resolusi tinggi dari kompleks berukuran besar dalam kondisi mendekati keadaan alami. Teknik ini sangat kuat namun memerlukan peralatan khusus.⁵³

Circular dichroism: Mengukur perbedaan penyerapan cahaya terpolarisasi sirkular kiri dan kanan, sehingga memberikan gambaran mengenai kandungan struktur sekunder protein.⁵⁴

Spektroskopi fluoresensi: Menganalisis fluoresensi intrinsik atau ekstrinsik untuk mempelajari pelipatan dan perubahan konformasional protein.⁵⁵

Kristalografi sinar-X: Memberikan struktur resolusi atom dari protein yang telah dikristalkan.^56,57

 

Teknik Kunci dalam Biologi Struktur, Kekuatan dan Keterbatasannya

Pengujian stabilitas

Stabilitas protein dipelajari menggunakan differential scanning calorimetry (DSC), yaitu teknik yang mengukur perubahan panas yang terkait dengan proses penggulungan (unfolding) protein, sehingga memberikan data mengenai stabilitas termal dan proses pelipatan protein.⁵⁸

Analisis kuantitatif

Spektrometri massa merupakan teknik yang paling banyak digunakan untuk melakukan analisis kuantitatif yang akurat, termasuk pengukuran kelimpahan protein, analisis struktural, identifikasi struktur protein, pengamatan pelipatan dan interaksi, serta deteksi modifikasi pascatranslasi (PTM) seperti fosforilasi dan glikosilasi.⁵⁹⁻⁶⁰

Dengan memanfaatkan berbagai teknik ini, para peneliti dapat mengkarakterisasi protein yang telah dimurnikan secara komprehensif, sehingga memastikan kesesuaiannya untuk beragam aplikasi dalam penelitian, diagnostik dan terapi.

Pemurnian protein merupakan langkah penting dalam bioteknologi, pengembangan farmasi dan penelitian, yang memungkinkan produksi protein berkualitas tinggi untuk berbagai aplikasi. Dengan menggunakan teknik pemurnian yang maju dan metode analisis yang canggih, ilmuwan dapat mengisolasi serta mengkarakterisasi protein secara mendalam. Proses ini memastikan bahwa protein memenuhi standar yang diperlukan untuk efektivitas dan keamanan produk akhir.

 

DAFTAR PUSTAKA

1. Janson J-C, ed. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications. 3rd ed. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, Inc.; 2011:1–517.
2. Labrou NE, ed. Protein Downstream Processing: Design, Development and Application of High and Low-Resolution Methods. Humana Press; 2021:1–555.
3. Murphy C, Devine T, O’Kennedy R. Technology advancements in antibody purification. Antib Technol J. 2016;6:17–32. doi:10.2147/ANTI.S64762
4. Queiroz de Sousa M, Sobreira Galdino A, dos Santos JC, et al. A recombinant multiepitope protein for hepatitis B diagnosis. Biomed Res Int. 2013:148317. doi:10.1155/2013/148317
5. Wang X, Lu X, Chen J. Development of biosensor technologies for analysis of environmental contaminants. Trends Environ Anal Chem. 2014;2:25–32. doi:10.1016/j.teac.2014.04.001
6. Tuzimski T, Petruczynik A. Review of new trends in the analysis of allergenic residues in foods and cosmetic products. J AOAC Int. 2020;103(4):997–1028. doi:10.1093/jaoacint/qsaa015
7. Schulte KQ, Curtis Hewitt F, Manley TE, et al. Fractionation of DNA and protein from individual latent fingerprints for forensic analysis. Forensic Sci Int Genet. 2021;50:102405. doi:10.1016/j.fsigen.2020.102405
8. Cutler P, ed. Protein Purification Protocols. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2012:1–484.
9. Kula M-R, Schütte H. Purification of proteins and the disruption of microbial cells. Biotechnol Prog. 1987;3(1):31–42. doi:10.1002/btpr.5420030107
10. Cai X, Xue Z, Wu C, et al. High-throughput proteomic sample preparation using pressure cycling technology. Nat Protoc. 2022;17:2307–2325. doi:10.1038/s41596-022-00727-1
11. Salvi G, de los Rios P, Vendruscolo M. Effective interactions between chaotropic agents and proteins. Proteins Struct Funct Bioinf. 2005;61:492–499. doi:10.1002/prot.20626
12. Roush DJ, Lu Y. Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology. Biotechnol Prog. 2008;24:488–495. doi:10.1021/bp070414x
13. Burgess RR. Protein precipitation techniques. Methods Enzymol. 2009;463:331–342. doi:10.1016/S0076-6879(09)63020-2
14. Urh M, Simpson D, Zhao K. Affinity chromatography: general methods. Methods Enzymol. 2009;463:417–437. doi:10.1016/S0076-6879(09)63026-3
15. Jungbauer A, Hahn R. Ion-exchange chromatography. Methods Enzymol. 2009;463:349–371. doi:10.1016/S0076-6879(09)63022-6
16. Fekete S, Beck A, Veuthey J-L, Guillarme D. Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates. J Pharm Biomed Anal. 2014;101:161–173. doi:10.1016/j.jpba.2014.04.011
17. McCue JT. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 2009;463:405–413. doi:10.1016/S0076-6879(09)63025-1
18. Van Reis R, Zydney AL. Protein ultrafiltration. In: Flickinger MC, ed. Encyclopedia of Industrial Biotechnology. 2010. doi:10.1002/9780470054581.eib515
19. García-Fruitós E, ed. Insoluble Proteins: Methods and Protocols. Humana Press; 2015:1–425.
20. Gallagher SR. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Curr Protoc Essent Lab. 2012;6(1):7–3:1–28. doi:10.1002/9780470089941.et0703s06
21. Tuan RS, ed. Recombinant Gene Expression Protocols. Totowa, NJ: Humana Press; 1997.
22. Young CL, Britton ZT, Robinson AS. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnol J. 2012;7:620–634. doi:10.1002/biot.201100155
23. Andersen DC, Krummen L. Recombinant protein expression for therapeutic applications. Curr Opin Biotechnol. 2002;13(2):117–123. doi:10.1016/S0958-1669(02)00300-2
24. Brondyk WH. Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein. Methods Enzymol. 2009;463:131–147. doi:10.1016/S0076-6879(09)63011-1
25. Siegel DL. Recombinant monoclonal antibody technology. Transfus Clin Biol. 2002;9:15–22. doi:10.1016/S1246-7820(01)00210-5
26. Inoue N, Takeuchi M, Ohashi H, Suzuki T. The production of recombinant human erythropoietin. Biotechnol Annu Rev. 1995;1:297–313. doi:10.1016/S1387-2656(08)70055-3
27. Chambers AC, Aksular M, Graves LP, Irons SL, Possee RD, King LA. Overview of the baculovirus expression system. Curr Protoc Protein Sci. 2018;91:5.4.1–5.4.6. doi:10.1002/cpps.47
28. Assad S, Francis A. Over a decade of experience with a yeast recombinant hepatitis B vaccine. Vaccine. 2000;18:57–67. doi:10.1016/S0264-410X(99)00179-6
29. Ladisch MR, Kohlmann KL. Recombinant human insulin. Biotechnol Prog. 1992;8:469–478. doi:10.1021/bp00018a001
30. Espejo-Mojica AJ, Alméciga-Díaz CJ, Rodríguez A, et al. Human recombinant lysosomal enzymes produced in microorganisms. Mol Genet Metab. 2015;116:13–23. doi:10.1016/j.ymgme.2015.06.001
31. Specht EA, Mayfield SP. Algae-based oral recombinant vaccines. Front Microbiol. 2014;5(60):1–7. doi:10.3389/fmicb.2014.00060
32. Karim AS, Jewett MC. Cell-free synthetic biology for pathway prototyping. Methods Enzymol. 2018;608:31–55. doi:10.1016/bs.mie.2018.04.029
33. Saraswat M, Musante L, Ravidá A, Shortt B, Byrne B, Holthofer H. Preparative purification of recombinant proteins: current status and future trends. Biomed Res Int. 2013;2013:1–18. doi:10.1155/2013/312709
34. Wingfield PT. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 2016;80:6.1.1–6.1.35. doi:10.1002/0471140864.ps0601s80
35. Arnau J, Lauritzen C, Petersen GE, Pedersen J. Protein Expr Purif. 2006;48:1–13. doi:10.1016/j.pep.2005.12.002
36. Spriestersbach A, Kubicek J, Schäfer F, Block H, Maertens B. Purification of His-tagged proteins. Methods Enzymol. 2015;559:1–15. doi:10.1016/bs.mie.2014.11.003
37. Schäfer F, Seip N, Maertens B, Block H, Kubicek J. Purification of GST-tagged proteins. Methods Enzymol. 2015;559:127–139. doi:10.1016/bs.mie.2014.11.005
38. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2015;73:9.9. doi:10.1002/0471140864.ps0909s73
39. Sing SM, Panda AK. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 2005;99(4):303–310. doi:10.1263/jbb.99.303
40. Hashemzadeh MS, Mohammadi M, Ghaleh HEG, Sharti M, Choopani A, Panda AK. Expression, solubilization, refolding and final purification of recombinant proteins as expressed in the form of “classical inclusion bodies” in E. coli. Protein Pept Lett. 2021;28(2):122–130. doi:10.2174/0929866527999200729182831
41. Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002:1–1146.
42. Antosiewicz JM, Shugar D. UV-Vis spectroscopy of tyrosine side-groups in studies of protein structure. Part 2: selected applications. Biophys Rev. 2016;8:163–177. doi:10.1007/s12551-016-0197-7
43. Reinmuth-Selzle K, Tchipilov T, Backes AT, et al. Determination of the protein content of complex samples by aromatic amino acid analysis, liquid chromatography-UV absorbance, and colorimetry. Anal Bioanal Chem. 2022;414:4457–4470. doi:10.1007/s00216-022-03910-1
44. Kurien BT, Scofield RH. Western blotting. Methods. 2006;38:283–293. doi:10.1016/j.ymeth.2005.11.007
45. Mishra M, Tiwari S, Gomes AV. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 2017;14(11):1037–1053. doi:10.1080/14789450.2017.1388167
46. Jia C-P, Zhong X-Q, Hua B, Liu M-Y, Jing F-X, Lou X-H, et al. Nano-ELISA for highly sensitive protein detection. Biosens Bioelectron. 2009;24:2836–2841. doi:10.1016/j.bios.2009.02.024
47. Zhu-Shimoni J, Yu C, Nishihara J, et al. Host cell protein testing by ELISA and the use of orthogonal methods. Biotechnol Bioeng. 2014;111(12):2367–2379. doi:10.1002/bit.25327
48. Meyerkord CL, Fu H, eds. Protein–Protein Interactions: Methods and Applications. 2nd ed. Humana Press; 2015:1–620.
49. Davenport AP, ed. Receptor Binding Techniques. 3rd ed. Humana Press; 2012:1–309.
50. Drescher DG, Selvakumar D, Drescher MJ. Analysis of protein interactions by surface plasmon resonance. Adv Protein Chem Struct Biol. 2018;110:1–30. doi:10.1016/bs.apcsb.2017.07.003
51. Cavanagh J, ed. Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice. Academic Press; 1996:1–542.
52. Meyer B, Peters T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew Chem Int Ed. 2003;42(8):864–890. doi:10.1002/anie.200390233
53. Yip KM, Fischer N, Paknia E, Chari A, Stark H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 2020;587:157–161. doi:10.1038/s41586-020-2833-4
54. Kelly SM, Jess TJ, Price NC. How to study proteins by circular dichroism. Biochim Biophys Acta. 2005;1751:119–139. doi:10.1016/j.bbapap.2005.06.005
55. Ladokhin AS. Fluorescence spectroscopy in peptide and protein analysis. In: Meyers RA, ed. Encyclopedia of Analytical Chemistry. 2000. doi:10.1002/9780470027318.a1611
56. Ilari A, Savino C. Protein structure determination by X-ray crystallography. Methods Mol Biol. 2008;452:63–87. doi:10.1007/978-1-60327-159-2_3
57. Kermani AA. A guide to membrane protein X-ray crystallography. FEBS J. 2021;288:5788–5804. doi:10.1111/febs.15676
58. Johnson CM. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch Biochem Biophys. 2013;531:100–109. doi:10.1016/j.abb.2012.09.008
59. Zhang S, Jian W. Recent advances in absolute quantification of peptides and proteins using LC-MS. Rev Anal Chem. 2014;33(1):31–47. doi:10.1515/revac-2013-0019
60. Van de Merbel. Protein quantification by LC-MS: a decade of progress through the pages of Bioanalysis. Bioanalysis. 2019;11(07):629–644. doi:10.4155/bio-2019-0032

 

SUMBER:

Héctor Zamora Carreras (2024) An Introduction to Protein Purification: Methods, Technologies and Applications. Advanced protein purification techniques enhance protein activity and yield, facilitating breakthroughs in research.

https://www.technologynetworks.com/immunology/articles/an-introduction-to-protein-purification-methods-technologies-and-applications-388443

#protein 

#purifikasi 

#bioteknologi 

#laboratorium 

#risetilmiah