Urutan gen ompA dari Chlamydophila psittaci mengungkapkan adanya genotipe baru, E/B, dan kebutuhan akan metode genotipe diskriminatif yang cepat

 

RINGKASAN

Dua puluh satu isolat Chlamydophila psittaci dari burung yang berasal dari berbagai negara di Eropa dianalisis menggunakan metode restriksi fragmen panjang polimorfisme ompA, pengurutan ompA, dan serotipe protein membran luar utama. Hasilnya menunjukkan keberadaan genotipe baru, E/B, di beberapa negara Eropa dan menekankan kebutuhan akan metode genotipe diskriminatif yang cepat.

 

ISI HASIL PENELITIAN

Chlamydophila psittaci diklasifikasikan menjadi 6 serovar, yaitu A hingga F. Serovar A endemik pada burung psittacine dan menyebabkan penyakit zoonosis pada manusia. Serovar B endemik pada merpati, pernah diisolasi dari kalkun, dan menyebabkan keguguran pada ternak sapi perah. Isolat serovar C (GD, MT1, dan 91/1264, 91/1301, CT1, dan Par1) diperoleh dari bebek di Jerman, Bulgaria, dan Belgia, angsa putih, kalkun dari California, dan burung puyuh. Serovar D umumnya diisolasi dari kalkun, namun juga ditemukan pada burung camar, burung kenari, dan manusia. Serovar C dan D dikenal sebagai risiko kerja bagi pekerja unggas. Isolat serovar E, yang dikenal sebagai Cal-10, MP, atau MN (meningopneumonitis), diisolasi selama wabah pneumonitis pada manusia pada akhir 1920-an dan awal 1930-an. Kemudian, isolat MN diperoleh dari berbagai burung di seluruh dunia, termasuk bebek, merpati, burung unta, dan rhea. Satu-satunya isolat serovar F, VS225, diperoleh dari burung parkit.

 

Serotyping dilakukan menggunakan panel antibodi monoklonal (MAbs) spesifik serovar dalam uji imunofluoresensi. Hibridoma penghasil MAb sebelumnya diuji menggunakan pewarnaan imunofluoresensi dengan organisme utuh dan, seperti Chlamydia trachomatis, diyakini mengenali protein membran luar utama (MOMP). Hanya MAb spesifik serovar A dan D yang telah dikarakterisasi menggunakan Western blotting dan uji radioimunopresipitasi (RIPA), dan memang MAb tersebut mengenali MOMP. Namun, MAb spesifik serovar lainnya masih perlu dikarakterisasi. Oleh karena itu, tujuan pertama dari studi ini adalah karakterisasi panel lengkap MAb spesifik serovar. Tujuan kedua adalah membandingkan serotipe MOMP, ompA RFLP, dan pengurutan ompA untuk mengkarakterisasi strain C. psittaci dari burung Psittaciformes, Columbiformes, Anseriformes, dan Galliformes.

 

Serotipe MOMP dan ompA RFLP sebelumnya telah dibandingkan dan terkadang memberikan hasil yang tidak konsisten. Oleh karena itu, pengurutan ompA dimasukkan sebagai metode pengetikan referensi. Dua puluh satu isolat C. psittaci dari Belgia (n=7), Jerman (n=6), Italia (n=7), dan Belanda (n=1) dikarakterisasi. Selain itu, strain referensi serovar A hingga F, VS1, CP3, GD, NJ1, MN, dan VS225, juga digunakan. Bakteri ditumbuhkan dalam sel Buffalo Green Monkey (BGM) seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. MAbs spesifik serovar VS1/7A7/E8, CP3/4C6/G2, GD/2H9, NJ1/2GB/C2, MN/4A10/A4, dan VS225/D6/36 dikarakterisasi menggunakan imunoblotting dan RIPA. Isotipe ditentukan menggunakan kit Hbt Mouse Monoclonal Isotyping (Sanbio, Uden, Belanda). Imunoblotting dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Antibodi monoklonal tidak relevan dengan isotipe yang sama serta larutan buffer fosfat (PBS) digunakan sebagai kontrol negatif, sedangkan MAb spesifik keluarga (7B6III) digunakan sebagai kontrol positif. Lisat sel RIPA disiapkan menggunakan modifikasi metode yang dijelaskan oleh Caldwell dan Perry. Singkatnya, strain referensi dikultur dalam sel BGM yang diobati dengan sikloheksimid menggunakan media esensial minimum tanpa metionin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) yang dilengkapi dengan 25 Ci (35S) L-metionin (TRAN35S-LABEL; MP Biomedicals, Irvine, CA) per ml. Tiga hari pasca-inokulasi (PI), monolayer terinfeksi dan tidak terinfeksi dicuci dengan PBS (pH 7,4) dan dihancurkan dengan larutan lisis RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Trizma base, 1 mM EDTA, 0,2 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 0,1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 0,1% NaN3, 1% Triton X-100, dan 10% sodium deoxycholate) pada suhu 37°C selama 30 menit. Suspensi klamidia berlabel disentrifugasi (10.000 g, 10 menit, 4°C). Supernatan dipulihkan dan digunakan sebagai antigen uji untuk imunopresipitasi. Imunopresipitasi dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Sambrook et al. menggunakan kontrol yang sama seperti pada imunoblotting. Sampel dianalisis secara elektroforetik pada gel slab vertikal SDS-poliakrilamida 12% (Mini Protean 3; Bio-Rad, Hercules, CA). Setelah itu, gel dicuci dalam larutan asam asetat 7% (5 menit), air suling ganda (15 menit), dan akhirnya Amplify (30 menit) (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.). Setelah itu, gel dikeringkan dalam pengering gel slab (Hoefer; Amersham Biosciences) dan dianalisis 24 jam kemudian menggunakan phosphoimager Typhoon 9200 (Amersham Biosciences).

DNA genomik untuk sekuensing ompA dipersiapkan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Wilson et al. (25). ompA diperbanyak menggunakan PCR seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (22), menghasilkan fragmen sepanjang 1.065 hingga 1.098 bp tergantung pada strainnya. Produk PCR dimurnikan menggunakan kolom spin QIAGEN (Westburg, Leusden, Belanda) dan diklon ke dalam pGemT (Promega, Madison, WI) sesuai dengan protokol pabrikan. Sel kompeten JM109 yang ditransformasi dengan heat shock (30 s, 42°C) (Promega) dikembangkan pada lempeng Luria-Bertani (LB) dengan tambahan karbenisilin (30 g/ml; Duchefa, Haarlem, Belanda). Lima klon dipilih dan kemudian dikembangkan dalam medium LB cair untuk pemurnian plasmid (QIAGEN Tip 100 Westburg). Analisis sekuens ompA dilakukan oleh VIB Genetic Service Facility (Universitas Antwerpen, Belgia) dan Laboratorium Fisiologi dan Imunologi Hewan Domestik (KULeuven, Belgia) menggunakan situs priming T7 dan SP6 yang terkait dengan vektor. Sekuens ompA yang diperoleh diserahkan ke GenBank, diselaraskan dengan sekuens ompA yang telah dipublikasikan sebelumnya menggunakan perangkat lunak ClustalX (16), dan kemudian diimpor ke TreeconW (17) menggunakan algoritma Jukes dan Cantor serta metode Neighbor-Joining (12) untuk membuat pohon filogenetik ompA (Gambar 1). Dua ribu bootstrap dihitung (9). Pohon tersebut di-root dengan sekuens ompA Chlamydophila caviae (GPIC) (26) (GenBank AF269282).

 

Analisis RFLP berbasis AluI dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (21). Fragmen dipisahkan pada gel agarosa LSI MP 2% (Life Science International, Zellik, Belgia). Sebagai kontrol, sekuens strain referensi dimasukkan ke Webcutter 2.0 (http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html), dan pita yang diperoleh secara in silico dibandingkan dengan hasil perhitungan berbasis gel (Perangkat Lunak Demo Magelan; Incogen, Williamsburg, VA). Serotipe dilakukan dengan menggunakan pewarnaan imunofluoresensi tidak langsung pada monolayer BGM yang terinfeksi C. psittaci yang ditumbuhkan pada coverslip berdiameter 13 mm di bagian bawah Chlamydia Trac Bottles (CTB; International Medical, Brussels, Belgia). Setiap isolat diinokulasi ke dalam 8 CTB, dan 72 jam pasca infeksi (hpi), monolayer diperbaiki dengan metanol (10 menit, 20°C), setelah itu situs pengikatan non-spesifik diblokir dengan PBS (pH 7.3) plus 5% FCS (1 jam, suhu kamar). Semua pengenceran disiapkan dalam PBS plus 1% albumin serum sapi (BSA), dan semua inkubasi dilakukan di ruang lembap pada suhu 37°C selama 1 jam. Setelah pemblokiran, 25 μl PBS, kontrol spesifik keluarga MAb 7B6III, atau pengenceran pembeda dari enam MAb spesifik serovar A hingga F ditambahkan. Pengenceran pembeda dari MAb spesifik serovar ditentukan sebagai pengenceran di mana MAb spesifik serovar hanya bereaksi dengan strain referensi yang sesuai. Pengenceran pembeda adalah 1/5.000 untuk semua MAb, kecuali untuk MAb spesifik serovar D, di mana pengenceran 1/500 harus digunakan. Monolayer diinkubasi dan dicuci tiga kali (5 menit) dalam PBS plus 1% BSA, dan kemudian 25 μl imunoglobulin (IgG HL) anti-tikus yang terkonjugasi dengan isothiocyanate fluorescein kelinci (DakoCytomation; diencerkan 1/200) ditambahkan. CTB diinkubasi dan dicuci dua kali (5 menit) dalam PBS diikuti oleh dua kali (30 detik) dalam air destilasi ganda. Coverslip diambil, dipasang pada slide kaca mikroskop, dan diperiksa dengan mikroskop pemindai laser konfokal (600; Radiance 2000; Bio-Rad). Tidak ada MAb, kecuali kontrol spesifik keluarga MAb 7B6III, yang mengenali MOMP dalam imunoblotting, baik dalam kondisi reduksi atau nonreduksi. Namun, semua MAb mengenali MOMP dalam RIPA, yang menunjukkan bahwa mereka mengenali epitop konformasi, yang masuk akal karena 90% epitop antigen diperkirakan diskontinu dan sangat konformasi (19). Epitop sel B dianggap mengandung 15 hingga 20 residu yang berasal dari dua hingga lima segmen peptida, menempati permukaan seluas 70 hingga 90 nm (7). Anehnya, MAb spesifik serovar A dan D mengenali MOMP dalam imunoblotting dan RIPA sebelumnya tetapi sekarang gagal bereaksi dalam imunoblotting (22). Mencari penjelasan, ditemukan bahwa MAb spesifik serovar A dan D yang digunakan sekarang dan sebelumnya berasal dari klon yang berbeda (A. A. Andersen, komunikasi pribadi). Pengenalan oleh MAb yang digunakan sebelumnya mungkin kurang bergantung pada konformasi tinggi, atau MAb menunjukkan afinitas yang lebih tinggi terhadap epitop spesifik serovar. Namun, mungkin MOMP C. psittaci, seperti pada C. trachomatis, dapat membawa lebih dari satu epitop spesifik serovar (4), dan MAb yang digunakan sekarang dan sebelumnya diarahkan pada epitop spesifik serovar yang berbeda pada MOMP. Pemetaan epitop dapat memberikan jawaban. Isotiping mengungkapkan hasil berikut: IgG1 (7B6III), IgG2b (VS1/7A7/E8, MN/4A10/A4, VS225/D6/36), dan IgG3 (CP3/4C6/G2, GD/2H9, NJ1/2GB/C2). Sekuensing ompA dari 21 isolat mengungkapkan delapan genotipe A, lima genotipe B, dua genotipe D, dan satu genotipe E dan F (Tabel 2).

 

Serotipe tidak selalu dapat dilakukan langsung pada sampel klinis, karena mungkin terdapat antigen yang tidak cukup, sehingga memerlukan kultur. Namun, kultur memerlukan biaya tinggi dan tenaga kerja yang intensif, membutuhkan tingkat biosafety khusus, serta menunda serotipe setidaknya selama 3 hingga 6 hari. Interpretasi pewarnaan imunofluoresensi memakan waktu dan memerlukan ketelitian dari interpretator. Saat ini, serotipe belum dapat secara konklusif mendeteksi genotipe E/B. Secara teori, analisis RFLP ompA lebih sensitif dan spesifik, lebih murah, dan jauh lebih cepat. Namun, amplifikasi gen ompA utuh langsung dari sampel klinis kadang-kadang tidak mungkin dilakukan tanpa kultur sebelumnya. RFLP menghasilkan pola restriksi yang jelas, memberikan hasil pengetikan yang konklusif ketika melihat keberadaan pita spesifik yang sudah dikenal kecuali untuk genotipe E/B baru, yang menghasilkan pola E. Seperti analisis RFLP, sekuensing ompA kadang-kadang memerlukan kultur sebelumnya untuk mendapatkan produk PCR utuh untuk kloning selanjutnya. Sekuensing lebih mahal dan memakan waktu lebih lama daripada RFLP. Namun, saat ini, sekuensing ompA adalah satu-satunya metode pengetikan yang mampu mengidentifikasi semua genotipe yang diketahui, termasuk genotipe E/B. Sebagaimana diamati sebelumnya, genotipe tertentu cenderung, meskipun tidak secara ketat, dikaitkan dengan spesies burung tertentu (21). Genotipe A terjadi pada semua psittacina, genotipe B ditemukan pada tiga dari lima merpati, dan genotipe E/B hadir pada semua bebek. Menariknya, sejauh ini, genotipe F hanya ditemukan pada parkit Amerika (VS225) dan burung beo Jerman (84/2334) (2, 18). Saat ini, kami mengisolasi strain genotipe F tambahan di peternakan kalkun Belgia yang mengalami penyakit pernapasan. Serotipe dulunya sangat penting tetapi kini telah digantikan oleh RFLP ompA. Namun, RFLP tidak dapat membedakan genotipe E dari genotipe E/B yang baru ditemukan. Sekuensing ompA saat ini adalah satu-satunya cara untuk menemukan semua genotipe ompA unggas yang diketahui dan genotipe baru lainnya. Kami dengan jelas menunjukkan bahwa genotipe baru tidak selalu dapat ditemukan dengan RFLP maupun serotipe, karena polimorfisme nukleotida tunggal tidak menghasilkan pola restriksi lain (kecuali muncul pada situs restriksi) dan mutasi basa tidak mempengaruhi konformasi epitop spesifik serovar. Studi ini menekankan perlunya teknik pengetikan yang lebih diskriminatif dan cepat untuk memeriksa baik burung maupun manusia mengingat risiko zoonosis dari infeksi C. psittaci. Untuk tujuan ini, real-time PCR spesifik spesies dan genotipe kombinasi saat ini sedang dievaluasi. Nomor akses sekuens nukleotida. Sekuens gen ompA untuk genotipe A, B, D, E, F, dan E/B telah diserahkan ke GenBank dan diberi nomor akses AY762608, AY762609, AY762610, AY762611, AY762612, dan AY762613. Institut Penelitian Ilmiah Flemish (Grant S2/5DPE174) diakui atas dukungan finansial. Universitas Ghent diakui karena menyediakan hibah (Grant 01113401) untuk T. Geens.

 

REFERENSI

1. Andersen, A. A. 1991. Serotyping of Chlamydia psittaci isolates using serovarspecific monoclonal antibodies with the microimmunofluorescence test. J. Clin. Microbiol. 29:707–711.

2. Andersen, A. A. 1997. Two new serovars of Chlamydia psittaci from North American birds. J. Vet. Diagn. Investig. 9:159–164.

3. Andersen, A. A., and R. A. Van Deusen. 1988. Production and partial characterization of monoclonal antibodies to four Chlamydia psittaci isolates. Infect. Immun. 56:2075–2079.

4. Batteiger, B. E. 1996. The major outer membrane protein of a single Chlamydia trachomatis serovar can possess more than one serovar-specific epitope. Infect. Immun. 64:542–547.

5. Bush, R. M., and K. D. Everett. 2001. Molecular evolution of the Chlamydiaceae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:203–220.

6. Caldwell, H. D., and L. J. Perry. 1982. Neutralization of Chlamydia trachomatis infectivity with antibodies to the major outer membrane protein. Infect. Immun. 38:745–754.

7. Chakrabarti, P., and J. Janin. 2002. Dissecting protein-protein recognition sites. Proteins 47:334–343.

8. Everett, K. D., R. M. Bush, and A. A. Andersen. 1999. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:415–440.

9. Felsenstein, J. 1985. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39:783–791.

10. Francis, T., Jr., and T. P. Magill. 1938. An unidentified virus producing acute meningitis and pneumonitis in experimental animals. J. Exp. Med. 68:147–163.

11. Illner, V. F. 1960. Zur Frage der Ubertragung des Ornithosevirus durch das Ei. Monatsh Veterina¨rmed. 17:116–117.

12. Saitou, N., and M. Nei. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4:406–425.

13. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Detection and analysis of proteins expressed from cloned genes, p. 19–75. In N. Ford, C. F. M. Nolan, and M. Ockler (ed.), Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

14. Sayada, C., A. A. Andersen, C. Storey, A. Milon, F. Eb, N. Hashimoto, K. Hirai, J. Elion, and E. Denamur. 1995. Usefulness of omp1 restriction mapping for avian Chlamydia psittaci isolate differentiation. Res. Microbiol. 146:155–165.

15. Sudler, C., L. E. Hoelzle, I. Schiller, and R. K. Hoop. 2004. Molecular characterisation of chlamydial isolates from birds. Vet. Microbiol. 98:235– 241.

16. Thompson, J. D., T. J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, and D. G. Higgins. 1997. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 25:4876–4882.

17. Van de Peer, Y., and R. De Wachter. 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Appl. Biosci. 10:569–570.

18. Van Loock, M., D. Vanrompay, B. Herrmann, S. J. Vander, G. Volckaert, B. M. Goddeeris, and K. D. Everett. 2003. Missing links in the divergence of Chlamydophila abortus from Chlamydophila psittaci. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53:761–770.

19. Van Regenmortel, M. H. V. 1996. Mapping epitope structure and activity: from one-dimensional prediction to four-dimensional description of antigenic specificity. Methods 9:465–472.

20. Vanrompay, D., A. A. Andersen, R. Ducatelle, and F. Haesebrouck. 1993. Serotyping of European isolates of Chlamydia psittaci from poultry and other birds. J. Clin. Microbiol. 31:134–137.

21. Vanrompay, D., P. Butaye, C. Sayada, R. Ducatelle, and F. Haesebrouck. 1997. Characterization of avian Chlamydia psittaci strains using omp1 restriction mapping and serovar-specific monoclonal antibodies. Res. Microbiol. 148:327–333.

22. Vanrompay, D., E. Cox, J. Mast, B. Goddeeris, and G. Volckaert. 1998. High-level expression of Chlamydia psittaci major outer membrane protein in COS cells and in skeletal muscles of turkeys. Infect. Immun. 66:5494–5500.

23. Vanrompay, D., R. Ducatelle, and F. Haesebrouck. 1992. Diagnosis of avian chlamydiosis: specificity of the modified Gimenez staining on smears and comparison of the sensitivity of isolation in eggs and three different cell cultures. J. Vet. Med. 39:105–112.

24. Vanrompay, D., T. Geens, A. Desplanques, T. Q. Hoang, L. D. Vos, M. V. Loock, E. Huyck, C. Mirry, and E. Cox. 2004. Immunoblotting, ELISA and culture evidence for Chlamydiaceae in sows on 258 Belgian farms. Vet. Microbiol. 99:59–66.

25. Wilson, P. A., J. Phipps, D. Samuel, and N. A. Saunders. 1996. Development of a simplified polymerase chain reaction-enzyme immunoassay for the detection of Chlamydia pneumoniae. J. Appl. Bacteriol. 80:431–438.

26. Zhang, Y. X., S. G. Morrison, H. D. Caldwell, and W. Baehr. 1989. Cloning and sequence analysis of the major outer membrane protein genes of two Chlamydia psittaci strains. Infect. Immun. 57:1621–1625.

 

SUMBER:

Tom Geens, Ann Desplanques, Marnix Van Loock, Brigitte M. Bo¨nner, Erhard F. Kaleta, Simone Magnino, Arthur A. Andersen, Karin D. E. Everett, and Daisy Vanrompay. 2005. Sequencing of the Chlamydophila psittaci ompA Gene Reveals a New Genotype, E/B, and the Need for a Rapid Discriminatory Genotyping Method. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2005, p. 2456–2461