Analisis Filogenetik dan Hasil Pengujian Isolat Virus H5N1 Asal Itik

Oleh: Hendra Wibawa (Staf Laboratorium Bioteknologi, BBVET Wates)

LATAR BELAKANG

Akhir-akhir ini telah dilaporkan adanya peningkatan kasus penyakit pada itik, disertai tingkat morbiditas dan mortalitas yang tinggi, di tiga provinsi yaitu Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta, dan Jawa Timur sejak bulan September 2012. Hasil pengujian patologi dan histopatologi, virologi dan biologi molekuler yang telah dilakukan oleh Balai Besar Veteriner (BBVet) Wates mengindikasikan bahwa virus H5N1 merupakan agen utama penyebab kasus penyakit ini. DNA sekuensing terhadap gen hemagglutinin (HA) dari beberapa isolat  H5N1 menunjukkan bahwa virus H5N1 yang diisolasi dari itik-itik saat wabah penyakit terjadi tergolong dalam clade 2.3.2, tepatnya termasuk dalam clade 2.3.2.1, sebuah galur virus H5N1 yang sebelumnya tidak ditemukan di Indonesia (Wibawa et al., 2012).

Walaupun isolat-isolat H5N1 dari itik ini sudah berhasil diindentifikasi termasuk dalam golongan clade 2.3.2.1, ada dua pertanyaan yang muncul yaitu:

1)    Bagaimana hubungan kekerabatan genetik (phylogenetic/filogenetik) isolat-isolat virus dari itik ini dengan isolat-isolat H5N1 clade 2.3.2.1 yang telah diindentifikasi sebelumnya dari negara-negara lain di Asia,

2) Bagaimana sensitifitas uji biologi molekular, khususnya real time reverse transcription PCR (rRT-PCR) dalam mendeteksi adanya infeksi yang disebabkan oleh virus-virus clade 2.3.2.1.

Oleh karena itu, perkembangan terkini berkaitan dengan analisis filogenetik dan sensitifitas uji rRT-PCR didiskusikan dalam laporan ini.

METODOLOGI

Analisis Filogenetik dan Jarak Susunan Nukleotida

Untuk menentukan grup atau kluster dari isolat-isolat H5N1 itik ini, Dr Ken Inui (FAO) telah memberikan 99 data sekuen nukleotida gen hemagglutinin (HA) dari virus clade 2.3.2.1 yang telah diindentifikasi sebelumnya. Sekuen-sekuen ini selanjutnya dialignment  bersama-sama dengan sekuen HA virus-virus H5N1 yang diisolasi itik dengan program ClustalW di dalam software MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007). Selanjutnya hasil aligment diedit dan digunakan sebagai data untuk menyusun pohon filogenetik di dalam MEGA 4.0 dengan metode Neighbour Joining (NJ) tree menggunakan 1000 bootstrap replikasi dan Tamura-Nei93 (TN93) untuk model substitusi nukleotida. Analisis jarak pasangan nukelotida dilakukan dalam software Mega 4.0 mengunakan p-distance model dan 1000 bootsrap replikasi.

Real-time Reverse Transcription-PCR

Real time reverse transcription PCR (rRT-PCR) dilakukan pada sampel-sampel dari isolate H5N1-itik yang digunakan untuk sekuensing DNA. Uji ini dilakukan, sebelum sampel dikirim ke partner laboratorium sekuensing, untuk deteksi influenza type A (gen matrix MA) dan deteksi subtype H5 (gen HA) menggunakan Taqman rRT-PCR assay virus avian influenza dengan primer dan probe yang telah didesain oleh Australian Animal Health Laboratory (AAHL) Geelong, Australia. Metode dan kondisi reaksi uji rRT-PCR menggunakan prosedur yang telah dipublikasi sebelumnya (Heine et al., 2007).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Virus H5N1 dari kasus itik memiliki kekerabatan yang tinggi dengan virus clade 2.3.2.1 A/Hong Kong/6841/2010-like virus, khususnya grup VietNam C

Sebagaimana laporan WHO, virus H5N1 clade 2.3.2 telah mengalami evolusi yang cukup signifikan dari tahun 2008 (WHO, 2012). Penamaan clade 2.3.2.1 kemudian muncul sejak tahun 2011 dan virus virus dari clade ini telah terdeteksi menginfeksi burung-burung liar di China, Hong Kong, India dan Nepal, dan juga menyerang unggas di Bangladesh, Bhutan, China, India, Nepal and Viet Nam.  Berdasarkan keragaman genetik gen HA, clade ini terus berkembang dan mengalami evolusi dalam 2 tahun terakhir sehingga WHO membagi clade ini menjadi tiga grup virus yaitu  A/Hubei/1/2010-like,  A/barn swallow/Hong Kong/D10-1161/2010-like, dan A/Hong Kong/6841/2010-like (WHO, 2011).

Hasil analisis filogenetik menunjukkan bahwa virus-virus H5N1 yang diisolasi dari itik di daerah Jawa Tengah, Yogyakarta dan Jawa Timur memiliki kekerabatan genetik yang sangat berdekatan dengan virus-virus yang sebelumnya telah diindentifikasi sebagai A/Hong Kong/6841/2010-like viruses, lebih tepatnya grup VietNam C (Gambar 1).

WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group (WHO, 2008; WHO, 2012) telah membuat ketentuan klasifikasi H5N1 clade sebagai berikut: 1) Digolongkan sebuah clade baru jika memiliki rata-rata persentase jarak pasangan nucleotida antar spesies (average pairwise distance) lebih dari 1.5%  dari clade yang telah ada dan terdefinisi sebelumnya, 2)  Hasil  analisis phylogenetic dan keragaman HA sequence  menunjukkan sharing common ancestral node dengan nilai  bootstrap > 60% pada nodus phylogenetic yang menunjukkan clade (setelah 1000 neighbour-joining bootstrap replicates). Analisis sekuen nukleotida terhadap masing-masing grup virus di dalam A/Hong Kong/6841/2010-like viruses menunjukkan bahwa masing-masing grup memiliki rata-rata jarak susunan nukleotida (average pairwise distance within group) kurang dari 1.5% (Gambar 2). 

Walaupun rata-rata jarak susunan nukleotida antar grup (between group) virus H5N1 dari kasus itik hanya 0.8% dengan VietNam C, tetapi rata-rata jarak susunan nukleotida dengan A/Hong Kong/6841/2010 dan virus-virus lain grup yang serupa dengan A/Hong Kong/6841/2010 dari Nepal, Tyva, Mongolia, Jepang dan Korea berturut-turut adalah 2.1% dan 2.3% (Gambar 2). Hasil analisis ini menunjukkan bahwa isolat H5N1 dari kasus itik ini masih dalam satu grup dengan VietNam C. Namun, karena rata-rata jarak pasangan nukleotida antar grup dari VietNam C dan isolat virus H5N1 itik ini lebih dari 1.5% terhadap A/Hong Kong/6841/2010 dan virus-virus yang serupa dengannya (Nepal-1, Mongolia, Tyva, Jepang dan Korea), maka ada kemungkinan bahwa virus-virus H5N1 dari VietNam C dan dari kasus itik di Indonesia ini merupakan sebuah grup tersendiri atau sublineage baru dalam clade 2.3.2.

-->

Hasil pengujian real time RT-PCR (rRT-PCR)

-->

Tabel 1. Hasil pengujian rRT-PCR terhadap sampel-sampel yang digunakan untuk sekuensing DNA

 

-->

Virus isolat	Cycle threshold MA Flu-A		Cycle threshold Subtipe H5
	Jaringan	Cairan Alantois P1*	Jaringan	Cairan Alantois P1*
Duck/Sukoharjo/BBVW-1428-9	td	16.0	30.4	15.9
Duck/Bantul/BBVW-1443-9/2012	td	18.2	17.3	17.8
Duck/Sleman/BBVW-1463-10/2012	30.1	18.4	30.0	17.7
Duck/Wonogiri/BBVW-1730-11/2012	td	19.6	16.8	18.7
Duck/Blitar/BBVW-1731-11/2012	td	16.4	18.3	16.2
Duck/Tegal/BBVW-1727-11/2012	21.6	15.3	21.9	15.1
Muscovy duck /Tegal/BBVW-1732-11/2012	17.3	14.6	17.9	14.9

-->
-->

Keterangan:

Uji rRT-PCR menggunakan primer and probe yang didesai oleh AAHL, Geelong, Australia.

*Dari cairan alantois (P1) yang sama dengan sampel-sampel untuk sekuensing DNA.

td: tidak dilakukan

KESIMPULAN

Hasil analisis filogenetik menunjukkan bahwa virus-virus yang diisolasi dari itik saat terjadinya kasus penyakit di Jawa Tengah, Yogyakarta dan Jawa Timur termasuk dalam clade 2.3.2.1 dan memiliki tingkat kekerabatan genetik hemagglutinin yang tinggi dengan clade 2.3.2.1 grup VietNam C. Perlu dilakukan kajian mengenai asal-asal usul dan bagaimana introduksi clade 2.3.2.1 ini di Indonesia. Uji rRT-PCR menggunakan primer dan probe yang telah didesain oleh AAHL dan telah digunakan oleh Balai Besar Veteriner dan Balai Pengujian dan Penyidikan Veteriner mampu mendeteksi adanya infeksi virus-virus clade 2.3.2.1 ini.

UCAPAN TERIMA KASIH

Kami mengucapkan terima kasih kepada Dr Ken Inui (FAO) yang telah memberikan informasi sekuen rujukan, khususnya untuk gen HA1, dari virus-virus clade 2.3.2.1. Kami memperoleh data-data sekuen rujukan clade 2.3.2.1 ini dari sebuah email (tertanggal 11 Desember 2012, bertajuk: The spread of clade 2.3.2.1) dari Dr James McGrane (FAO) yang ditujukan kepada Bapak Direktur Kesehatan Hewan dan di cc-kan kepada Kepala Balai Besar Veteriner Wates, kepada penulis, dan kepada beberapa orang lainnya.

DAFTAR PUSTAKA

Heine, H., Trinidad, L., Selleck, P. &Lowther, S. (2007). Rapid detection of highly pathogenic avian infl uenza H5N1 virus by TaqMan reverse transcriptase-polymerase chain reaction Avian Dis 51: 370-372.i

Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. &Kumar, S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. . Molecular Biology and Evolution 24: 1596-1599.

WHO (2008). Toward a unified nomenclature system for highly pathogenic avian influenza virus (H5N1). Emerg Infect Dis 14(7): e1.

WHO (2011). Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness. http://www.who.int/influenza/resources/documents/2011_09_h5_h9_vaccinevirusupdate.pdf.

WHO (2012). Continued evolution of highly pathogenic avian influenza A (H5N1): updated nomenclature. WHO/OIE/FAO H5N1 Evolution Working Group. Influenza Other Respi Viruses 6(1): 1-5.

Wibawa, H., Prijono, W. B., Dharmayanti, N. L. P. I., Irianingsih, S. H., Miswati, Y., Rohmah, A., Andesyha, E., Romlah, Daulay, R. S. D. &Safitria, K. (2012). Investigasi wabah penyakit pada itik di Jawa Tengah, Yogyakarta, dan Jawa Timur: Identifikasi sebuah clade baru virus avian influenza subtipe H5N1 di Indonesia. Buletin Laboratorium Veteriner 4(12): 1-9.

Sumber : BBV Wates